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PROCEDE DE PRODUCTION DE PREPARATIONS D'INSULINE A ACTION PROLONGEE.
La présente invention est'relative à un procédé de production de préparations d'insuline à action prolongée ou "insuline retard".
L'effet "retard" du dépôt ordinaire servant aux préparations d'insuline est dû à la présence ou à la formation d'insuline solide peu so- luble au pH sanguine L'insolubilisation de l'insuline est obtenue au moyen de substances étrangères à réaction basique, telles que-la protamine, glo- bine et surfène, lesquelles forment des composés peu solubles avec l'insu- line en milieu neutre.
Pour la formation du dépôt en vue de.l'obtention de préparations d'insuline, on estimait donc jusqu'ici nécessaire d'utiliser des procédés nécessitant l'intermédiaire et l'emploi de substances spéciales auxiliaires.
Suivant la présente invention, on a constaté qu'il était possible d'abandon- ner complètement ces principes- et de ne plus devoir utiliser de substances auxiliaires lesquelles compliquent la formation et l'utilisation clinique des préparations d'insuline.
Par conséquent, d'après la présente invention, il a été trouvé qu'il est possible d'obtenir des préparations d'insuline 'tretard" en uti- lisant de l'insuline pure à l'état cristallin- afin de former une suspension de cristaux d'insuline,laquelle- présente par litre une concentration en certains métaux, tels que le zinc, cobalt, nickel, cadmium, cuivre, manga- nèse ou fer, qui favorise la cristallisation de l'insuline, à plus-de 5 x A x 10-3 milliéquivalents, dans laquelle "A" indique le nombre d'unités in- ternationales d'insuline par millilitre de suspension.
Il est connu que Fisher et Scott (cfr. Journal of Pharmacology, 58, 93 - 104 (1936), après des recherches scientifiques sur'l'importance de la présence de zinc dans des préparations de protamine-insuline, ont pu
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obtenir une suspension de cristaux d'insuline dans de l'eau distillée, mais ont constaté que l'effet de l'injection sous-cutanée au lapin de la suspen- sion des cristaux d'insuline obtenue, ne présentait pas de différences ap- préciables avec l'effet de l'insuline dissoute.
Ceci résulte probablement du fait que les cristaux d'insuline ordinaire se dissolvent comparativement aisément à la valeur de pH 7,2 exis- tant dans le sang et dans les liquides tissulaires.
Par conséquent, si des cristaux d'insuline ordinaires sont mis en suspension dans l'eau distillée et la suspension est alors ajustée à pH = 7 par exemple à l'aide de soude caustique, les cristaux se dissolvent tota- lement ou pour la plus grande part. Par conséquent, les suspensions de cris- taux d'insuline dans l'eau distillée n'ont pas trouvé d'utilisation clinique.
Les essais biologiques et cliniques effectués par les inventeurs ont prouvé actuellement qu'il est possible d'obtenir, en utilisant les sus- pensions de cristaux d'insuline préparées d'après l'invention dans des injec- tions sous-cutanées ou intramusculaires, un degré d'effet "retard" équiva- lent, et même beaucoup plus grand que le degré de "retard" des préparations d'insuline connues jusqu'ici..
L'exemple suivant illustrera ce qui précède : une solution de cristaux d'insuline à la concentration de 40 unités internationales par millilitre,' à laquelle il a été ajouté 4 milligrammes de chlorure de zinc par 100 millilitres, ne possède pas d'effet "retard" appréciable.
D'autre part, la même solution aura un effet "retard" considé- rable, excédant 24 heures, après que son pH a été ajusté à la valeur de 5 et qu'elle a pu reposer, de manière à provoquer une cristallisation du dé- pôt d'insuline et la formation d'une suspension de ae corps.
La cause de l'effet "retard" présenté par les préparations éta- blies d'après l'invention n'a pas été déterminée avec certitude, mais peut être attribuée au fait que l'insuline s'y trouve à l'état cristallin et que les cristaux existant.dans la suspension mentionnée sont peu solubles au pH sanguin.
Ainsi, si des cristaux d'insuline connus sont mis en suspension par exemple à la concentration de 40 unités internationales par millilitre, dans une solution de chlorure de zinc ajusté à une valeur de pH d'environ 7 et contenant par exemple 0,008 % de zinc, de l'insuline dissoute ne sera pas décelable dans le milieu en- suspension.
Si le milieu dans lequel se fait la suspension est préparé sui- vant l'invention et présente une valeur de pH d'environ 7 ou est ajusté à cette valeur, on peut faire la constatation étonnante que les-cristaux sé- parés d'insuline obtenus présentent à l'analyse une concentration accrue de métal par rapport à la concentration initiale-(environ 0,4 % pour-le zinc).
L'effet "retard" constaté pour les préparations faites suivant l'invention peut par conséquent être attribué également à la présence ou for- mation de cristaux d'insuline à concentration métallique accrue. Par consé- quent l'effet "retard" recherché peut être- obtenu par suspension- de cristaux d'insuline- à concentration métallique accrue dans un milieu ne contenant pas- lui-même le métal dont les cristaux présentent une- concentration accrue.
Afin d'obtenir l'effet "retard" recherché, il suffit que le mi- lieu dans lequel se fait la suspension présente ces conditions à la valeur du pH existant dans le sang et les liquides tissulaires et que- les cristaux montrent une concentration métallique accrue.
En concordance avec ces conditions, le procédé de la présente invention présente comme caractéristiques supplémentaires que-la composition du milieu de suspension est telle que les cristaux d'insuline en suspension- montrent une teneur accrue du métal en question, pourvu que le milieu en suspension ait une valeur de pH d'environ 7 ou est amené à cette valeur.
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En utilisant les cristaux d'insuline connus contenant environ 0,4 % de zinc ou une quantité correspondante d'un autre métal, le milieu de suspension doit présenter une concentration des métaux considérés, telle que les cristaux d'insuline en suspension possèdent, lorsque ce milieu se trouve à un pH 7, une concentration métallique excédant approximativement 0,10 milliéquivalent par gramme de cristaux.
Cependant, afin d'obtenir un effet "retard" prononcé pour des préparations faites d'après l'invention, il a été trouvé intéressant de pré- parer les cristaux avec- une concentration métallique dépassant environ 0,20 milliéquivalent par gramme de cristaux, c'est-à-dire environ 0,65 % de zinc, lorsque ce métal est utilisé, en supposant que l'insuline est amenée à l'é- tat cristallin au moyen de zinc.
Lorsque les cristaux présentent par exemple une teneur en zinc de 1 %, la préparation obtenue présente un effet "retard" qui n'est pas in- férieur à celui des préparations de protamine-zinc-insuline connues. Il sera possible d'obtenir un effet "retard" plus prononcé avec une concentration accrue en zinc.
Pour ce qui concerne la concentration métallique nécessaire dans le milieu de suspension aqueux, il y a lieu-de noter en premier lieu que, pour obtenir des cristaux d'insuline à concentration métallique prédétermi- née et accrue,il est nécessaire d'utiliser un milieu à suspension ayant é- galement une concentration plus forte en métal et en insuline.
Si la concen- tration en insuline du milieu de suspension est portée à 40 unités interna- tionales par millilitre, des cristaux d'insuline à concentration zincique d'environ 2,3 % seront donc.obtenus lorsque le pH du milieu sera ajusté à 7 au moyen d'hydroxyde alcalin et que sa concentration en zinc sera de 0,008 %, tandis que des cristaux à environ 2,6 % de zinc seront formés lorsque' le mi- lieu contiendra 10 unités internationales d'insuline par millilitre et des cristaux d'insuline à 1,8 % de zinc se formeront avec une concentration de 80 unités internationales d'insuline par millilitre, le toutà condition que les cristaux aient contenu-,environ 0,4 % de zinc préalablement à la sus- pension.
Avec une concentration prédéterminée de cristaux d'insuline par unité de volume de milieu de la suspension, une augmentation de concentra- tion de métal dans ce milieu provoquera une augmentation de la concentration métallique des cristaux obtenus.
Lorsque le milieu de suspension se trouve ou est ajusté à un pH d'environ 7 dans des conditions normales, il se combinera à raison de 7 % pour ce qui concerne le zinc, ce qui correspond au nombre de groupes acides dans la molécule d'insuline. Des conditions similaires sont applicables à d'autres métaux.
Pourvu que le milieu à suspension ne contienne pas de substance ayant une plus grande affinité pour les métaux cités que les cristaux d'in- suline et que ceux-ci aient une concentration métallique normale, le milieu devrait contenir au moins l'un des métaux cités en une concentration par litre d'au moins 5 x A x 10-3 milliéquivalent, "A" indiquant le nombre d'u- nités internationales d'insuline ajoutées par millilitre de milieu.
A l'aide de la concentration d'insuline de 40 unités interna- tionales par millilitre, qui est la plus fréquemment utilisée en pratique, d'un milieu à suspension à teneur en zinc d'environ 0,002 % et de cristaux d'insuline à environ 0,4 % de zinc, on obtiendra des cristaux d'insuline en suspension à 1,1% de zinc à un pH de 7.
Pour un milieu à suspension à 0,004 % de zinc, on obtiendra des cristaux à 1,7 % de zinc, tandis que. dans un milieu à 0,008 % de- zinc, les cristaux d'insuline obtenus contiendront 2,2 % de zinc.
Si les cristaux d'insuline en suspension doivent être saturés de zinc, c'est-à-dire en contenir environ 2,7 %, le milieu à suspension devra contenir beaucoup plus de zinc, c'est-à-dire environ 0,3% pour une
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concentration en insuline de 40 unités internationales par millilitre, les conditions dont question ci-dessus étant maintenues.
Le pH du milieu à suspension est l'un des facteurs ayant une in- fluence décisive sur la solubilité des cristaux d'insuline dans ce milieu ainsi que sur la concentration métallique accrue des cristaux obtenus.
A condition que le milieu ne contienne pas de substances ayant la propriété spécifique de supprimer la solubilité des cristaux, il n'est pas possible, dans les préparations destinées à l'usage pratique, d'empê- cher que tous les cristaux d'insuline se dissolvent lorsqu'ils sont mis en suspension dans un milieu ayant une valeur de pH supérieure à 9.
De plus, au-dessus de cette valeur de pH, il est difficile de faire des préparations ayant une conservation suffisante. Il n'est égale- ment pas possible dans des conditions normales d'éviter que les cristaux se dissolvent lorsque le pH du milieu à suspension est inférieur à 3 - 4.
Par conséquent, si le milieu à suspension ne contient pas de substances ayant la propriété spécifique de réduire la solubilité de l'insuline, il est nécessaire de maintenir la valeur du pH du milieu dans les limites renseignées.
Il résulte de ce qui a été établi ci-dessus, que le milieu à suspension ne contient des cristaux d'insuline à concentration métallique accrue lorsque son pH est d'environ 7,que pour autant que ce milieu ne contienne pas de substances ayant une plus grande affinité pour les métaux utilisés que les cristaux d'insuline. La concentration métallique accrue diminue avec l'abaissement de la valeur du pH et ne peut être obtenue dans des conditions normales à un pH de 4-5 ou moins.
Pour obtenir l'effet "retard" désiré il n'est pas nécessaire que la suspension préparée in vitro contienne des cristaux d'insuline à concentration métallique accrue. Il suffit que cette concentration métal- lique accrue soit obtenue dans la suspension en amenant la valeur de son pH à 7. Ceci est probablement dû au fait que la modification de la valeur du pH à environ 7 se produit lors de l'injection d'une telle suspension, par laquelle les cristaux d'insuline à concentration métallique accrue se forment in vivo.
Il résulte donc de tests cliniques que deux suspensions de com- position autrement identique dont l'une est ajustée à un pH 4,5 et l'autre à un pH 7, produisent le même effet "retard". L'analyse de la concentration métallique des cristaux d'insuline en suspension dans les deux milieux mon- tre que la concentration métallique des cristaux se- trouvant dans le milieu à pH 4,5 est restée la même, tandis que ceux du milieu à, pH 7 ont une con- centration métallique accrue.
Par conséquent, une caractéristique supplémentaire de la pré- sente invention réside dans le fait que le milieu à suspension aqueux pré- sente une réaction acide ou est amené à une telle réaction.
L'ajustement du milieu à suspension à la valeur du pH désiré peut être effectué d'après l'invention à l'aide d'une substance tampon ou d'un mélange de substances tampon. Des exemples de cette opération sont donnés plus loin.
Il y a,lieu de tenir compte d'un autre fait lors du choix de la substance tampon ou du mélange tampon. Il a été constaté que la pré- sence de certains anions dans le milieu à suspension influence'l'effet' "retard" des préparations d'insuline, probablement par suite de l'influen- ce de ces anions sur la solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu, ainsi que sur la propriété de ces cristaux d'absorber du métal contenu, dans le milieu à suspension ou de maintenir la concentration accrue de ce métal.
Donc si à titre d'exemple, des cristaux ordinaires d'insuline sont mis en suspension dans une solution aqueuse contenant 0,008 % de chlorure de zinc, du phosphate de sodium 1/120 molaire et porté à un pH 5, et si le milieu à suspension est alors ajusté à un pH 7, on constate que les cristaux se
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dissolvent entièrement ou partiellement sans se combiner au zinc. Il en est de même si le tampon au phosphate est remplacé par un tampon au citrate. Ce- pendant si on utilise du nickel au lieu de zinc avec un tampon au phosphate, les cristaux ne seront pas dissous en portant le pH à 7 et absorberont du nickel du milieu à suspension.
Il est à supposer que les ions phosphate ont une plus grande af- finité pour le zinc que pour les cristaux d'insuline et se combinent donc avec le zinc en milieu neutre, alors que ces ions phosphate ne peuvent se combiner aux ions nickel de telle manière qu'ils ne sont pas disponibles pour les cristaux d'insuline.
De ce fait, lorsqu'on désire obtenir un effet "retard" le plus' grand possible et qu'on utilise une substance tampon pour ajuster la valeur du pH du milieu à suspension,.-il faudra que l'anion de celle-ci ne se combi- ne pas au.métal employé en milieu neutre.
D'autre part, il peut être utile d'avoir une certaine solubili- té des cristaux d'insuline, étant donné qu'il est possible d'obtenir des préparations d'insuline donnant partiellement un effet "initial" d'insuline et partiellement un effet "retard".
Il est possible de donner au milieu à suspension une composition et une acidité telles que celui-ci contienne ou contiendra de l'insuline à l'état dissous ou amorphe et précipité.
-La présence d'insuline dissoute ou d'insuline amorphe précipitée peut être obtenue soit en ajoutant d'avance- ou en faisant dissoudr.e une par- tie des cristaux d'insuline qui sera-précipitée ensuite à l'état amorphe.
D'accord avec ces observations, une caractéristique importante de l'invention permet d'employer un milieu à suspension contenant d'avance- de l'insuline dissoute ou précipitée à l'état amorphe ou dans lequel ces corps peuvent être formés à partir des cristaux d'insuline ajoutés.
L'effet "initial" d'insuline peut ainsi être obtenu en ajoutant des anions, lesquels favorisent la¯ solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu à suspension à pH neutre.
En faisant varier la concentration du zinc ou de métaux similai- res dans le milieu à suspension, son pH, sa concentration en anions et sa teneur en insuline dissoute ou précipitée, il est possible- d'après l'inven- tion de fabriquer des préparations d'insuline ayant à la fois un effet "re- tard" d'une durée prédéterminée et un effet d'insuline dissoute à un degré également prédéterminé.
La présente invention est basée en outre sur l'observation que l'effet "retard" des suspensions de cristaux d'insuline dépend de la dimen- sion des cristaux.
Des essais biologiques faits en concordance avec l'invention sur des chiens privés de pancréas ont montré que des cristaux d'insuline me- surant environ 10# dans une suspension contenant du zinc, ont,dans des con- ditions comparables le même effet "retard" que ceux de protamine-zinc-insu- line, tandis que-les cristaux d'insuline ayant une dimension de 25-100- présentent toujours un effet "retard" plus intense.
On pourra donc tenir compte de cette propriété en utilisant des cristaux d'insuline d'une dimension définie. La dimension désirée peut être obtenue en réglant les conditions de cristallisation et/ou en broyant ou concassant les cristaux obtenus.
Les cristaux d'insuline obtenus par une méthode de cristallisa- tion quelconque peuvent être utilisés dans la fabrication des nouvelles pré- parations d'insuline.
Cependant la méthode dite au citrate est préférable, (cfr. par exemple le brevet danois n 70270). Une autre méthode intéressante a été établie par Scott, (cfr. Biochemical J. 28, 1592 1934} ainsi que d'autres
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plus récentes dérivées de celle-ci.
Le milieu à suspension contenant l'un des métaux cités peut être ' obtenu en dissolvant simplement un sel de ce métal dans l'eau distillée. Pour des raisons cliniques, il est cependant plus avantageux d'utiliser un milieu isotonique qui peut être obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de glucose, de chlorure de sodium ou de glycérine.
Ces substances ne-sont données qu'à titre d'exemples, d'autres sont citées dans la littérature relative-à ce sujet.
Pour la conservation des préparations d'insuline, il est avanta- geux d'ajouter l'un ou l'autre agent conservateur utilisés pour les liquides à injections par exemple le phénol et ses dérivés, le p-hydroxybenzoate de méthyle (nipagine), le p-hydrobenzoate de propyle- (nipasol) et l'acétate phényl-mercurique.
Différents exemples de milieux aqueux à suspension utilisables pour l'obtention de préparations d'insuline conformes à l'invention et contenant des métaux cités sont décrits ci-dessous.
EXEMPLE 1 -
On mélange un milieu à suspension constitué par une solution iso- tonique d'un corps conservateur et une autre solution d'un des métaux cités précédemment, de manière à obtenir la composition suivante :
0,9 % de chlorure de sodium 0,1 % de nipagine 0,004 % de zinc (chlorure)
En ajustant ce milieu à suspension à une valeur de pH intermé- diaire à 6 et 7, les cristaux ordinaires d'insuline s'y dissolvent beaucoup plus difficilement que dans l'eau pure et, en y "suspendant" les cristaux, il y a formation de cristaux à teneur accrue en zinc.
Si les cristaux contiennent environ 0,4 % de zinc avant d'être mis en suspension, et si on en ajoute au milieu à suspension de manière que celui-ci contienne 40 U.I./ml. les cristaux formés contiendront environ 1,7% de zinc.
En utilisant des cristaux d'insuline sensiblement plus grands que 10# il est avantageux d'ajouter un stabilisant au milieu, lequel aug- . mente la viscosité du milieu servant à la suspension de telle sorte que les cristaux restent en suspension un certain temps après avoir agité l'ampoule.
Comme stabilisateur de suspension on peut utiliser un polysaccha- ride macromoléculaire, mais la présente invention n'est pas limitée à cette utilisation. D'autres stabilisateurs peuvent être utilisés à condition d'ê- tre. inertes, dans les circonstances données, vis-à-vis des cristaux d'insu- line et des autres constituants du milieu à suspension.
EXEMPLE 2 -
On forme un milieu à suspension en mélangeant une solution aqueu- se isotonique, un agent conservateur, un des métaux mentionnés ci-dessus et un stabilisateur de suspension de manière à obtenir la. composition suivante : 0,9% chlorure sodique
0,2% tricrésol 0,005% nickel (chlorure)
5% dextranum dépolymerisatum
Le pH est ajusté entre 6 et 7 à l'aide de soude caustique.
Si les cristaux d'insuline ne contenant pas de nickel y sont mis en suspension en quantité telle que le milieu de suspension contienne 40 U.I./ml,
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les cristaux en suspension contiendront du nickel.
Il a été indiqué au préalable que le milieu à suspension devra contenir une substance-tampon ou un mélange de substances-tampon tant pour régler et maintenir la valeur du pH du milieu que pour régulariser l'effet initial de la préparation in vivo. A titre d'exemples de substances-tampon utilisables, il faut citer le tampon acétique, au borate, au citrate, au barbiturate diéthylique, au phosphate, au malate et leurs mélanges. Parmi les tampons cités, ceux au phosphate et au citrate sont les plus intéressants pour la régularisation de l'effet "initial" des préparations.
EXEMPLE 3 -
Un mélange d'une solution aqueuse isotonique, d'un agent conser- vateur, d'un des métaux cités et d'une substance tampon pour stabiliser le pH du milieu aura la- composition sttivante
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine 0,008% zinc (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire
Le pH est ajusté approximativement à 4,5 à l'aide de HCL.
Les cristaux ordinaires d'insuline sont aussi peu solubles dans ce milieu de suspension que dans celui décrit dans l'exemple 1. En y mettant en suspension des cristaux d'insuline contenant environ 0,4% de zinc en quan- tité telle qu'il contienne 40 U.I./ml et si le pH de la suspension est porté à 7 à l'aide de NaOh, les cristaux obtenus contiendront environ 2,2% de zinc.
EXEMPLE 4 -
Le milieu à suspension aqueux ayant la même acidité que le liqui- de tissulaire humain et étant isotonique avec le sang, aura la composition suivante :
1,3 volume % glycérine
0,1% nipagine
0,002% zinc (chlorure)
Acide diéthylbarbiturique 1/120 molaire.
Le pH est ajusté approximativement à 7,2 par NaOH.
Ce milieu dissout moins de 2 unités internationales d'insuline par ml. Si les cristaux d'insuline mis ensuspension contiennent environ 0,4% de zinc de manière que le milieu contienne 40 U.I./ml, les cristaux résul- tants contiendront environ 1,1% de zinc.
EXEMPLE 5 -
Le milieu aqueux à suspension à réaction faiblement alcaline au- ra la composition suivante
1,3 volume % glycérine
0,1% nipagine 0,016 % zinc (chlorure)
Acide borique 1/120 molaire.
Le pH est ajusté approximativement à 8 par NaOH.
Ce mmlieu à suspension dissout également moins de 2 U.I./ml d'in- suline. En plaçant en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline con- tenant environ 0,4% de zinc en quantité telle qu'un ml contienne 40 U.I./ml et en ajustant le pH à 7, avec HCl par exemple, les cristaux, d'insuline con- tiendront environ 2,5 % de zinc.
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EXEMPLE 6 -
Le milieu aqueux à suspension contiendra :
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine
0,001% zinc (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire. et le pH est ajusté à 5 par HCl.
Si des cristaux d'insuline contenant environ 0,4 % de zinc sont introduits dans ce milieu en proportion telle que celui-ci contiénne 40 U.I./ml, les cristaux en suspension contiendront environ 0,8% de zinc, pour autant que le pH aura été ajusté à 7 avec NaOH.
EXEMPLE 7 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
0,8% chlorure de sodium
0,1% nipagine
0,008% nickel (chlorure)
Phosphate sodique 1/120 molaire et on ajuste cette solution à pH 7 avec HCl.
Si on introduit dans cette solution des cristaux d'insuline con- tenant environ 0,3% de nickel en quantité telle qu'elle contient 40 U.I./ml, les cristaux d'insuline en suspension obtenus présentent une concentration en nickel accrue.
EXEMPLE 8 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
1,3 vol. % glycérine-
0,2 % tricrésol 0,014 % cadmium (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire. et on ajuste la solution à pH 5 avec HCl.
Lorsqu'on place des cristaux d'insuline contenant environ 0,4 % de zinc dans ce milieu de manière à obtenir une suspension à 40 U.I./ml, les cristaux obtenus contiendront environ 3% de cadmium, pour autant que le pH de la suspenion soit amené à 7 avec NaOH.
EXEMPLE 9 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine 0,006% de cuivre (chlorure)
Acétate sodique : 1/120 molaire et on ajuste la solution à pH 6 avec HCl.
Lorsqu'on introduit des cristaux d'insuline d'une teneur en zinc d'environ 0,4 % dans ce milieu de manière-à obtenir une concentration de 40 U.I./ml, l'insuline en suspension contiendra du cuivre.
Les milieux à suspension pour cristaux d'insuline décrits dans les exemples mentionnés ont une composition telle que les cristaux y sont
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pratiquement insolubles. Ces préparations d'insuline obtenues se distinguent surtout par leur effet "retard". D'autre part, des préparations ayant par- tiellement un effet "retard" et partiellement un effet d'insuline "initial" peuvent également être fabriquées.
EXEMPLE 10 -
On prépare une solution contenant :
1,3 vol. % de glycérine
0,1 % nipagine 0,008% de chlorure de zinc
Acétate sodique 1/120 molaire et on ajuste le pH à 4 par HCl.
Lorsque des cristaux d'insuline contenant environ 0,4% de zinc sont mis en suspension en proportion de 40 U.I./ml, 1/3 des cristaux d'in- suline se dissolveront au point que le milieu à suspension contiendra 12- 14 U.I. d'insuline dissoute/ml. Lors d'injections sous-cutanées ou intramus- culaires de la suspension résiduaire, on obtient un effet "initial" dû à l'insuline dissoute et ensuite un effet "retard" résultant des cristaux d'insuline restés en suspension.
EXEMPLE 11 -
Dans une solution chlorhydrique contenant :
1,3 vol. % de glycérine
0,1% nipagine 0,008 % de chlorure de zinc de l'acide diéthylbarbiturique 1/120 molaire
0,087 % d'insuline (23 U.I. par milligramme) dissous dans HCl, on ajuste le pH à ¯ 7 avec NaOH, ce qui précipite quantitativement l'insuli- ne à l'étatamorphe (20 U.I./ml). En mettant des cristaux d'insuline en sus- pension dans ce milieu, celui-ci donnera un effet "initial" et "retard" par injection sous-cutanée ou intramusculaire de la suspension.
Dans les exemples ci-dessus, les métaux sont ajoutés sous forme de leurs chlorures. Ceux-ci peuvent être utilisés sous d'autres formes inor- ganiques ou organiques telles que sulfate, nitrate, acétate, citrate, hydro- xyde, oxyde ou complexes métalliques, ou le métal lui-même, à condition que le métal ou le composé métallique employé soit présent dans des conditions permettant son absorption par les cristaux d'insuline.
En outre, il est à noter que la modification du pH après suspen- sion des cristaux d'insuline dans le milieu dont il est question dans diffé- rents exemples doit uniquement être considérée comme auxiliaire analytique.
Les milieux à suspension peuvent être utilisés à la valeur de pH à laquelle ils ont été ajustés lorsqu'ils sont préparés.
Dans les exemples précédents, les cristaux d'insuline sont pré- parés séparément par cristallisation aseptique, et les cristaux sont ensuite ajoutés à un milieu aqueux à suspension stérile en utilisant les conditions d'aseptie nécessaires.-
D'après l'invention, il est ainsi possible de faire cristalliser l'insuline dans le milieu à suspension préparé comme- il est décrit dans les exemples ci-dessous.
EXEMPLE 12 -
174 milligrammes d'insuline pure sont dissous dans 20 millili- tres de HCl O,Oln, on ajoute ensuite dans-l'ordre indiqué :
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20 ml d'une solution à 4% de chlorure de sodium
10 ml d'une solution d'acétate de soude 1/12 molaire
50 ml d'une solution contenant 0,004% de zinc et
0,2% nipagine
La valeur du pH est ensuite ramenée à 5 à l'aide de HCl et la suspension est ensuite versée dans une ampoule. Après un repos déterminé, l'insuline précipitée passe à l'état cristallin..
D'après l'invention, l'eau-mère de la cristallisation d'insu- line peut être utilisée comme milieu à suspension en y ajoutant les sub- stances nécessaires, telles que isotoniques, le zinc ou les métaux similai- res, stabilisateurs de suspensions et les correcteurs de pH.
EXEMPLE 13 -
174 milligrammes d'insuline cristalline sont dissous dans 20 ml de HCl 0,01n, on ajoute ensuite 20 ml d'une solution de chlorure de sodium et 10 ml d'une solution d'acétate.de sodium 1/12 molaire.
Le pH du mélange est ensuite ramené à 5,5.
Lorsque la cristallisation est terminée, on ajoute 50 millili- tres d'une solution contenant 0,016% de zinc et 0,2% de nipagine. Le pH de la suspension obtenue est à ajuster si c'est nécessaire. Gomme il résulte de ce qui a été énoncé précédemment, conformément à l'invention, le métal peut être ajouté avant aussi bien qu'après avoir formé la suspension des cristaux d'insuline dans le milieu. Il est donc possible de commencer par mettre des cristaux d'insuline aseptiques en suspension dans un milieu a- queux et d'y ajouter ensuite le métal choisi.
EXEMPLE 14 -
174 milligrammes de cristaux d'insuline sont mis en suspension dans 50 ml d'un milieu aqueux à suspension contenant : 1,6 % de chlorure de sodium 0,2 % de nipagine et de l'acétate de sodium 1/60 molaire et on amène à un pH de valeur 5,5 par addition de HCl.
A cette suspension on ajoute 50 ml d'une solution de zinc de même acidité et contenant 0,016 % de zinc. Une solution zincique d'une autre acidité que le milieu à suspension peut être utilisée, mais dans ce cas l'ajustement de la valeur du pH de la suspension finale doit être effectué si c'est nécessaire. En portant la valeur du pH du milieu à sus- pension à 7, les cristaux d'insuline de la suspension contiendront envi- ron 2,2 % de zinc à condition que la concentration initiale des cristaux ait été de 0,4 % de zinc.
Pareillement, la concentration en métal de la suspension peut être préparée complètement ou partiellement en utilisant des-cristaux ayant une concentration métallique accrue.
EXEMPLE 15 -
On prépare une solution contenant :
1,3 vol. % de glycérine 0,1 % de nipagine de l'acétate de sodium 1/120 molaire et dont la valeur du pH est ajustée à 5 par HCl.
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En ajoutant 1,7 gramme de cristaux d'insuline contenant environ 2 % de zinc à 1 litre de cette suspension, les cristaux restent insolubles; mais une partie du zinc passe en solution dans le milieu à suspension ; celui- ci contient alors du zinc.
Dans l'exemple ci-dessus, le'métal en question est ajouté au milieu à suspension par l'intermédiaire des cristaux pendant la mise en sus- pension. Ceci peut s'obtenir également en mettant en suspension des cris- taux à concentration métallique normale, tout en ajoutant simultanément le métal en question.
Les exemples cités ci-dessus l'ont été uniquement afin d'illus- trer des applications de l'invention, dont les caractéristiques principales consistent dans les possibilités de la mise en suspension des cristaux d'in- suline, lesquels ont une concentration métallique plus forte que celle des particules d'insuline avant la mise en suspension.
La portée de l'invention comporte donc ainsi la mise en suspen- sion de cristaux d'insuline à concentration accrue en l'un des métaux men- tionnés dans un milieu utilisable en injection-et ne montre pas des concen- trations des métaux après que les cristaux y ont été mis en suspension. A titre d'exemple, de tels milieux, on peut citer l'eau distillée et des hui- les végétales, telles que celle d'olives, de sésame et d'arachide.
Il y a enfin lieu de noter que les préparations d'insuline obte- nues d'après l'invention peuvent être mises sur le marché en deux ampoules dont l'une contient le milieu à suspension et l'autre les cristaux d'insu- line auxquels si'on le désire on a pu donner.une concentration métallique accrue.
REVENDICATIONS.
1/ Procédé de production de préparations d'insuline à action pro- longée ou effet 'retard", caractérisé par la production d'une suspension de cristaux d'insuline présentant par litre une concentration en certains mé- taux comme le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manga- nèse ou le fer telle qu'elle favorise la cristallisation de l'insuline, cet- te concentration étant supérieure à 5 x A x 10-3 milliéquivalents, où "A" représente le nombre d'unités internationales d'insuline par millilitre de la suspension.