CH309037A

CH309037A - Milieu nutritif pour des bactéries productrices de streptokinase et de streptodornase.

Info

Publication number: CH309037A
Authority: CH
Inventors: Company American Cyanamid
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1951-06-08
Filing date: 1952-05-24
Publication date: 1955-08-15

Description

Milieu nutritif pour des bactéries productrices de streptoliinase et de streptodornase. La. présente invention se rapporte à un milieu nutritif pour des bactéries produc trices de streptokinase et de streptodornase.

lia. streptokinase est une enzyme qui agit indirectement sur la fibrine ou le fibrinogène en activant, dans le sérum humain, une enzyme fibrinolytique qui décompose la fibrine en fragments et provoque ainsi une rapide disso lution des caillots de sang et des exsudats fibrineux.

La streptodornase est une enzyme qui agit directement sur la. désoxyribonucléo- protéine et l'acide désoxyribonucléique qui sont les constituants principaux des noyaux et constituent 30-70 % du sédiment des exsu- dats purulents.

La streptodornase décompose la nucléoprotéine en bases puriniques et en nucléosides py rimidiniques et provoque ainsi une réduction notable de la viscosité des exsu dats purulents.

Grâce aux propriétés mentionnées ci-dessus, des mélanges de streptokinase et de strepto- clornase se sont révélés utiles dans le traite ment expérimental de certaines brûlures, dans le drainage de sinus purulents, dans le traite ment d'abcès infectieux chroniques des os ou ostéomyélites, dans le drainage clu sang coa gulé des plaies internes et dans le drainage du bloc vertébral de la colonne vertébrale, que l'on observe dans divers types de ménin gites. De manière plus générale, des mélanges de ces deux enzymes sont utiles dans le traite ment d'empyèmes, d'hémothorax, d'hématomes et d'infections suppurantes chroniques.

L'emploi de streptodornase et de strepto- kinase a été limité, jusqu'à présent, principale ment à. des essais expérimentaux, étant donné que ces composés ne pouvaient pas encore être obtenus dans le commerce. Bien que les premières indications sur l'emploi de ces deux composés datent déjà de 1933, aucun procédé commercial pour leur production n'a été déve loppé antérieurement à la présente invention.

Sauf erreur, la seule méthode pratique, de production de streptokinase et de streptodor- nase consiste à cultiver certaines souches de streptocoques bêta-hémolytiques dans un mi lieu nutritif approprié. Les streptocoques uti lisés le plus fréquemment sont ceux des groupes Lancefield A, C hiunain et G, la souche C étant utilisée de préférence. De nombreux milieux nutritifs ont été essayés dans ce but.

Ainsi qu'il ressort de la littéra ture, les milieux les plus favorables sont les mélanges aqueux de matières protéiniques animales, telles que des produits sanguins, par tiellement hydrolysées. Ces milieux nutritifs permettent d'obtenir de bons résultats dans la production à petite échelle, par exemple là où la fermentation est effectuée dans des réci pients de 30 litres.

Par contre, dans la pro duction à grande échelle, par exemple avec un volume de 380 litres, ces milieux ne don nent pas de résultats satisfaisants. Lorsqu'on emploie ces milieux dans des essais de produc tion à grande échelle de mélanges de strepto- kinase et de streptodornase, les streptocoques produisent des quantités d'enzymes beaucoup plus faibles.

La présente invention a pour objet un nouveau milieu nutritif pour des bactéries productrices de streptokinase et de strepto- dornase, ce milieu étant caractérisé en ce qu'il. contient de la caséine hydrolysée par des ferments, de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique, tel que l'acide thioglyeolique, l'acide thiomalique ou la, glutathione. En utili sant un milieu nutritif de ce genre, il est,

pos sible de produire des mélanges de strepto- kinase et de streptodornase à l'échelle com merciale. Des résultats très satisfaisants ont été obtenus en utilisant ce nouveau milieu nutritif dans des cuves de 380 et même de 3800 litres.

La. caséine hydrolysée par des ferments est l'ingrédient principal du nouveau milieu nutritif; .elle sert. à fournir de l'azote basique. On trouve de nombreux produits de ce genre dans le commerce. L'un de ces produits, qui a été employé avec succès dans un grand nombre d'essais effectués par la. titulaire, est. le pro duit marque N-Z-Amine , fabriqué par la Sheffield Farms Company, Inc. , New York. Ces produits sont obtenus en formant. une dispersion aqueuse de caséine et en y ajoutant des jus pancréatiques pour catalyser l'hydro lyse.

Des détails concernant la préparation de ces produits se trouvent par exemple dans les brevets des Etats-Unis d'AmériqueNI," 2489880 et 2180637.

En revanche, on a constaté que des mi lieux nutritifs à base de caséine hydrolysée par des acides, lorsqu'ils sont utilisés pour produire des mélanges de streptokinase et de streptodornase, se sont révélés entièrement inefficaces dans la plupart des cas. Les pro priétés qui distinguent ce produit. de la caséine hydrolysée par des ferments sont indiquées par exemple dans Industrial and Engineering Chemistry , volume 44, pages 1257-1268, juin 1952, et en particulier pages 1265 et 1267, tableau IV et fig. 6.

La quantité de caséine hydrolysée par unité de volume du milieu nutritif peut varier entre de larges limites. Si la pureté des en zymes qu'il servira à préparer constitue le facteur principal, par exemple lorsqu'on veut obtenir un produit pour injection intravei neuse, il est. indiqué d'utiliser de faibles con centrations de caséine hydrolysée, par exem ple de 2 à 6 parties en poids pour 300 parties en volume de milieu nutritif. Par contre, si on désire obtenir un rendement total en streptokinase par unité de matière azotée aussi haut que possible, il est- indiqué d'utiliser de plus hautes concentrations en caséine hydrolysée, par exemple 10 à 20 parties en poids pour 300 parties en volume de milieu nutritif.

La quantité de glycine présente dans le nouveau milieu nutritif peut varier dans de larges limites, par exemple entre 1,0 et 350 parties en poids de glycine pour 1000 parties en poids de caséine hydrolysée, la. quantité optimum étant d'environ 100 à. 200 parties de glycine pour 1000 parties de caséine hydro lysée. La quantité de l'agent réducteur sulf- hydrylique présente dans le milieu nutritif peut également varier dans de larges limites, par exemple entre 0,01 et 0,5 mol. d'agent réducteur sulfhydrylique pour 1000 parties en poids de caséine hydrolysée.

Si ces parties en poids sont. comptées en grammes, les quan tités indiquées de l'agent réducteur seront comptées en molécules/grammes. La fonction de l'agent réducteur est simplement de main tenir le milieu à l'état réduit. On peut utili ser n'importe lequel des agents réducteurs sulfhydryliques connus.

L'avantage principal du nouveau milieu nutritif réside dans le fait. qu'on peut obtenir des rendements augmentés dans la. production à grande échelle; par exemple, dans des euves de 380 litres, on obtient des rendements par unité de volume qui représentent presque le triple du rendement obtenu en utilisant dans ces mêmes cuves un milieu nutritif connu comprenant un hy drolysat de protéine ani male, et presque le double du rendement ob tenu dans un même milieu connu en. utilisant des récipients de 30 litres. L'augmentation du rendement en enzymes est importante non seulement du point de vue économique, mais aussi polir d'autres raisons.

L'une de ces raisons réside dans la facilité avec laquelle on peut obtenir un produit rela tivement pur à partir d'une solution de fer mentation présentant une concentration rela tivement élevée. La cause de cette facilité doit être recherchée dans la nature même des méthodes de purification disponibles et néces saires pour la séparation des enzymes d'avec les autres constituants du milieu de fermen tation, ces méthodes de purification étant. d'une nature telle que leur efficacité diminue au fur et à mesure que la concentration rela tive des enzymes diminue.

Un autre avantage réside dans 1e fait qu'un milieu nutritif comprenant de la caséine hydrolysée par (les ferments se prépare plus facilement qu'un milieu à. base de protéines animales, telles qu'on les obtient. à partir de sang, et qu'il se laisse plus facilement mani puler, stériliser et disperser. Par conséquent, les frais de production des milieux nutritifs sont, notablement réduits. En plus, le prix du milieu à. base de caséine hydrolysée par des ferments est en général plus bas.

Les milieux connus à base de protéines animales contiennent de nombreuses substances présentant approximativement les mêmes poids moléculaires et la même constitution que les enzymes, c'est-à-dire la. streptokinase et la. streptodornase, qu'ils servent. à préparer.

Ces substances protéiniques sont précipitées en même temps que les enzymes recherchées et, en outre, possèdent des propriétés électropho- rétiques analogues. Il en résulte de grandes difficultés dans l'extraction et la purification de la streptokinase et. de la. streptodornase ainsi qu'une augmentation des quantités de réactifs nécessaires.

On a constaté qu'il était impossible d'obtenir, par les méthodes de puri fication décrites clans la littérature spéciale ou même par des méthodes perfectionnées, Lin produit suffisamment pur pour l'usage clini que, à partir de charges de fermentation de 380 litres, en utilisant un milieu nutritif connu à base de protéines animales, par exemple une préparation obtenue à partir de sang.

Il est souvent avantageux d'ajouter au milieu nutritif divers autres ingrédients, en plus de la. caséine hydrolysée par des ferments, de la glycine et de l'agent réd\ticteur sulf- hydrylique. Ces ingrédients supplémentaires, qui favorisent la croissance des bactéries, comprennent des substances telles que des vitamines, des substances minérales, des amino acides et (les oligo-éléments. Une énumération de ces substances et des quantités recomman dées est donnée au tableau suivant:

EMI0003.0030

Tableau <SEP> 1:
<tb> Agent <SEP> favorisant <SEP> la <SEP> Parties <SEP> en <SEP> poids
<tb> croissance <SEP> pour <SEP> iooo <SEP> parties <SEP> de
<tb> caséine <SEP> hydrolysée
<tb> IÇH.PO.l <SEP> 80-160
<tb> KIIC0@ <SEP> 50-100
<tb> Uracile <SEP> 0,2 <SEP> -0,6
<tb> Sulfate <SEP> d'adénine <SEP> 0,2 <SEP> -0,6
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0,02-0,06
<tb> Pyridoxine <SEP> 0,03-0,07
<tb> Try <SEP> ptophane <SEP> 0,4 <SEP> -1,0
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,1 <SEP> -0,3
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> thiamine <SEP> 0,05-0,15
<tb> Riboflavine <SEP> 0,01-0,03
<tb> Cy <SEP> stine <SEP> -6 Les oligo-éléments sont généralement ajou tés sous forme d'un mélange de sels destinés à fournir de très petites quantités d'ions de métaux tels que le fer, le magnésium,

le cuivre, le. zinc, etc. Il est souvent avantageux de pré parer une solution de sels en dissolvant des sels des métaux énumérés ci-dessus et d'ajou ter une petite quantité de cette solution à chaque charge de fermentation. Le tableau suivant se rapporte à la. composition d'une solution de sels qui, lorsqu'on l'utilise à rai son de 40 à. 150 cm3 par kg de caséine hydro- lysée, donne des résultats satisfaisants.

EMI0004.0005

Tableau
<tb> Substance <SEP> Quantité
<tb> MgS04 <SEP> 11,5 <SEP> kg
<tb> CuSO4 <SEP> - <SEP> 511.0 <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb> ZnS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> kor
<tb> -#'1nC12 <SEP> - <SEP> 41120 <SEP> 0,02 <SEP> kg
<tb> FeS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb> HCl <SEP> 1,0 <SEP> litre
<tb> Eau <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffi sante <SEP> pour <SEP> obtenir <SEP> 100 <SEP> litres Le milieu nutritif petit se préparer par une méthode comprenant. les stades suivants:

dissolution de la quantité voulue de caséine hydrolysée par des ferments dans environ 5 fois son poids d'eau chaude, stérilisation par traitement en autoclave ou par filtration, addition de solutions de glycine et de l'agent réducteur sulfhydry ligue, addition éventuelle de solutions d'agents favorisant. la croissance et ajustement du pH à environ 7-8. Le milieu est ensuite prêt à, être inoculé.

La méthode décrite ci-dessus peut, naturellement, être mo difiée. Ainsi, par exemple, si on stérilise le milieu par filtration, toits les ingrédients peu vent être ajoutés avant la stérilisation, et si on stérilise le milieu par traitement en auto clave, la. glycine peut être ajoutée avant. la. stérilisation. Du point, de vue de la pureté du produit, il est quelquefois avantageux de re froidir le milieu à 20 C ou au-dessous avant la filtration. Cependant, si 1m rendement maximum est plus important, il. n'est pas re commandable de refroidir le milieu.

Les exemples suivants montrent comment on peut préparer le milieu nutritif suivant la présente invention.

Exemple 1: A 50 litres d'eau distillée, on ajoute 10,17 kg de caséine hydrolysée par des fer ments (produit marque -Z-Amine ). La tem pérature est élevée à J.00 C et maintenue jus qu'à. ce que la solution de caséine hydrolysée soit limpide. On refroidit rapidement à 15 C et on filtre la. solution refroidie à. travers du papier filtre grossier. On ajoute une petite quantité de toluène comme agent de conserva tion et on laisse reposer la. solution à 2 C pendant 4 jours. La solution est. ensuite fil trée pour éliminer toute matière insoluble.

On ajoute les ingrédients suivants à la .solution de caséine Hydrolysée: 1165,0 g de FH2P04 dissous dans S litres d'eau distillée; 35,0 o, de eystine clans environ 800 ems de HCl à 10% (la. quantité minimum de HCI à 101/o requise pour obtenir une solution limpide.); 35 g de glycine dissous dans 100 em3 d'eau distillée;

300 1- de dextrose dissous dans 2 litres d'eau distillée; 3,5 g d'uracile dissous dans 1 litre d'eau distillée, 3,5 g de sulfate d'adénine dissous dans 1 litre d'eau distillée; 0,35 g d'acide nicotinique dissous dans 35 em3 d'eau distillée; 0,59 g de pyridoxine dissous dans 59 cm-' d'eau distillée; 7,0 g de trypto- phane dissous dans 1 litre d'eau distillée;

1,75 g de pantothénate de calcium dissous dans 70 em3 d'eau distillée; 0,87.5 g de chlor- hydrate de thiamine dissous dans 87,5 cm3 d'eau distillée; 0,175 g de riboflavine dissous dans 1000 em3 d'eau distillée; 700 ctn3 d'une solution de sels (voir tableau 2);

55,65 cm- d'acide thiogly colique dissous dans 100 cm3 d'eau distillée; 700 g de KHC03 dissous dans 500 ems d'eau distillée. Le pH du milieu est ensuite ajusté à 7,2 et le milieu est, stérilisé par filtration.

Ce milieu peut être utilisé comme suit: il est. inoculé avec. 11 litres d'une préparation d'inoculation présentant un nombre de baeté- ries d'environ 20 billions par ems. La fer mentation est effectuée à 37 C, sans ajuste ment. du pli, aération ou autre modification, pendant 14- heures. Ensuite, on ajoute 320 cma (le dextrose à 50 1/o. A partir de ce moment, 1 epH est ajusté à 7,0 au moyen cl'hy clr oxyde de sodium 5N toutes les 1.5 minutes.' On note la quantité volumétrique nécessaire polir la neutralisation.

On ajoute 1150/û, de ce volume de solution de dextrose à 50 % après chaque ajustement du pH.-Au bout d'environ 8 heures, l'augmentation du nombre des bactéries cesse et la fermentation est terminée. Le milieu de fermentation contient alors environ 1000 uni tés de streptokinase par cm-3.

Exemple 2: On prépare un milieu nutritif en utilisant les in---rédients suivants: Caséine hydrolysée (produit marque N-Z-Amine ) . 10169,0 g KH-PO4 . . . . . . . 1165,0 g Cystine . . . . . . . . 35,0 g Glycine . . . . . . . . 35,0 g Dextrose . . . . . . . 300,0 g Uracile . . . . . . . . 3,5 g Sulfate d'adénine . . . . 3,5 g Acide nicotinique . . . . 0,35 g Pyridoxine . . . . . . . 0,595 g Try ptophane . . . . . . 3,5 g Pantothénate de calcium . . 1,75 g Chlorhydrate de thiamine 0,875 g Riboflavine . . . . . .

0,175 g Acide thioglycolique . . . 52,5 cm? IiHCO? . . . . . . . . 700,0 g Solution de sels (tableau 2) 700,0 em3 Eau distillée en quantité suffi- saute pour faire . . . . 350,0 litres On dissout la. caséine hydrolysée dans environ 5 volumes d'eau et on stérilise en suite cette solution dans un autoclave. Après refroidissement à la, température ambiante, on ajoute des solutions stériles des autres ingrédients et on étend ensuite la solution avec de l'eau distillée stérile.

Le pH de la solution est ajusté à environ 7,0 et la tempé rature est. portée à environ 37 C.

Le milieu peut ensuite être inoculé avec environ 11,0 litres d'une préparation d'inocu lation contenant environ 16 X109 de strepto- coeei P-hémolytiques Lansfield, groupe C, par cm3.

Exemple 3: On prépare un milieu nutritif en utilisant les mêmes quantités des mêmes ingrédients que dans l'exemple 2, sauf que la quantité de dextrose est de 22,5 g au lieu de 300 g.

Claims

REVENDICATION: Milieu nutritif pour des bactéries produc trices de streptokinase et de streptodornase, caractérisé en ce qu'il contient de la. caséine hydrolysée par des ferments, de la, glycine et un agent réducteur sulfhydrylique. SOUS-REVENDICATIONS 1.

Milieu nutritif suivant la revendication, caractérisé en ce qu'il est constitué par une solution de 1000 à 10 000 parties en poids de caséine hydrolysée par des ferments pour 150 000 parties en volume d'eau, contenant, pour 1000 parties en poids de ladite caséine hydrolysée, de 1 à 350 parties en poids de glycine et de 0,01 à 0,5 mol. dudit agent réducteur. 2. Milieu nutritif suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient de100 à 200 parties en poil,, clé glycine pour 1000 parties en poids de ladite caséine hydrolysée. 3.

Milieu nutritif suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient de 0,03 à 0,07 mol. dudit agent réducteur pour 1000 parties en poids de ladite caséine hydrolysée.