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PROCEDE DE PRODUCTION DE STREPTOKINASE ET DE STREPTODORNASE PAR
FERMENTATION.
La présente invention se rapporte à la production de streptokinase et de streptodornase par fermentation.
Au cours des dernières années, la lyse de certaines matières à l'aide d'enzymes a pris un intérêt grandissant. Parmi les enzymes qui présen- tent le plus d'intérêt se trouvent la streptokinase et la streptodornase. La streptokinase agit indirectement sur la fibrine ou le fibrinogène en activant, dans le sérum humain, un enzyme fibrinolytique qui décompose la fibrine en fragments et provoque ainsi une rapide dissolution des caillots de sang et des exudats fibreux. La streptodornase agit directement sur la désoxyribonu- cléoprotéine et l'acide désoxyribonucléique qui sont les constituants princi - paux des noyaux et constituent 30-70% du sédiment d'exudats purulents.
La streptodornase décompose la nucléoprotéine en bases puriniques et en nucléosi- des pyrimidiniques et provoque ainsi une réduction notable de la viscosité d'exudats purulents.
Grâce aux propriétés mentionnées ci-dessus, des mélanges de strep- tokinase et de streptodornase se sont révélés utiles dans le traitement expé- rimental de certaines brûluresdans le drainage de sinus purulents, dans le traitement d'abcès infectés chroniques des os ou d'ostéomyélites, dans le drai- nage de sang coagulé de plaies internes et dans le drainage du bloc vertébral dans la colonne vertébrale, que l'on observe dans divers types de méningiteso De manière plus générale,des mélanges de ces deux enzymes sont utiles dans le traitement d'empyèmesµ d'hémothorax, d'hématomes et d'infections suppuran- tes chroniques.
L'emploi de streptodornase et de streptokinase a été limité, jus- qu'à présent, principalement à des essais expérimentaux étant donné que ces composés ne pouvaient pas encore être obtenus dans le commerce. Bien que les
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premières indications sur l'emploi de ces deux composés datent déjà de 1933, aucun procédé commercial pour leur production n'a été développé antérieurement à la présente invention. La titulaire a développé un procédé de production de mélanges de streptokinase et de streptodornase lequel permet de préparer ces enzymes avec leurs nombreuses propriétés désirables à l'échelle commerciale pour l'emploi général.
Sauf erreur, la seule méthode pratique de production de streptoki- nase et de streptodornase consiste à cultiver certaines souches de streptococci bêta-hémolytiques dans un milieu de fermentation. Les streptococci utilisés le plus fréquemment sont ceux des groupes Lancefield A, C "humain" et G, la souche C étant utilisée de préférence. De nombreux milieux de fermentation' ont été essayés et les résultats de la fermentation dans ces milieux sont re- latés dans la littérature. Suivant l'opinion unanime des spécialistes,ainsi qu'il ressort de la littérature, les milieux les plus favorables à la fermen- tation d'organismes producteurs de streptokinase et de streptodornase sont les mélanges aqueux de matières protéiniques animales partiellement hydroly- sées, par exemple de produits sanguins partiellement hydrolysés etc.
Les mi- lieux de fermentation comprenant des matières protéiniques animales partiel- lement hydrolysées du genre mentionné ci-dessus permettent d'obtenir de bons résultats dans la production à petite échelle, par exemple là où la fermenta- tion est effectuée dans des récipients de 30 litres. Par contre, dans la pro- duction à grande échelle, par exemple avec un volume de 380 litres, ces milieux ne donnent pas de résultats satisfaisants. Lorsqu!on emploie ces milieux dans des essais de production à grande échelle de mélanges de streptokinase et de streptodornase, les streptococci produisent des quantités d'enzymes beaucoup plus faibles.
Etant donné que seule la production à grande échelle permet de rendre accessibles les avantages de la streptokinase et de la streptodornase pour le public, il est évident quun milieu de fermentation convenant à la production à échelle commerciale serait très apprécié et constituerait un progrès considérable.
Suivant la présente invention, on propose d'utiliser un milieu de fermentation convenant à la culture de streptokinase et de streptodornase, ce milieu consistant en un milieu nutritif contenant de la caséine hydrolysée enzymatiquement, de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique, tel que l'acide thioglycolique, l'acide thiomalique ou la glutathione. On a trouvé qu'en utilisant des milieux de fermentation de ce genre,, il était possible de produire des mélanges de streptokinase et de streptodornase à l'échelle commerciale. De nombreuses fermentations productrices de mélanges de strepto- kinase et de streptodornase ont été effectuées en utilisant ces nouveaux mi- lieux de fermentation dans des cuves de 380 et même de 3800 litres, des ré- sultats très satisfaisants ayant été obtenus.
La caséine hydrolysée est l'ingrédient principal du nouveau milieu de fermentation et exerce la fonction de fournir de l'azote basique. On peut utiliser n'importe lequel des produits de caséine hydrolysée par fermentation du commerce. L'un de ces produits de caséine hydrolysée par des enzymes que l'on trouve dans le commerce et qui a été employé dans un grand nombre d'es- sais effectués par la titulaire, est le produit fabriqué par la "Sheffield Farms Company, Inc.", New York, et vendu sous le nom de "N-Z-Amine".
Ces pro- duits hydrolysés sont obtenus en formant une dispersion aqueuse de caséine et en y ajoutant des jus pancréatiques pour catalyser l'hydrolyse. Des détails précis concernant la préparation de produits de caséine hydrolysée enzymatique- ment se trouvent dans la littérature spéciale, par exemple dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n 2489.880 et 2.180.637.
A part la caséine hydrolysée qui constitue la partie majeure des nouveaux milieux de fermentation, deux autres ingrédients, la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique organique, sont également nécessaires. La quantité de glycine utilisée dans la préparation des nouveaux milieux de fer- mentation peut varier dans de larges limites, par-exemple entre 1,0 et 350 parties en poids de glycine pour 1000 parties en poids de la caséine hydroly- sée. On a trouvé que la quantité optimum est d'environ 100 à 200 parties de
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glycine pour 1000 parties de caséine hydrolysée.
La quantité de l'agent ré- ducteur sulfhydrylique organique employée dans le mélange de fermentation peut également varier dans de larges limites, par exemple entre 0,01 et 0,5 poids moléculaires (ou mols,si le poids de la caséine hydrolysée-est donné en gramme) d'agent réducteur sulfhydrylique pour 1000 parties en poids de caséine hydrolyséeo On a trouvé que le rapport optimum est de 0,03 à 0,07 poids moléculaires pour 1000 parties en poids de caséine hydrolysée. La fonc- tion de l'agent réduction est simplement de maintenir le milieu à l'état ré- duit. On peut utiliser n'importe lequel des agents réducteurs sulfhydryliques connus.
Le fait que des milieux de fermentation comprenant un produit de caséine hydrolysée enzymatiquement, de la glycine et un agent réducteur sulf- hydrylique permettent d'obtenir des résultats supérieurs est très surprenant, d'autant plus que des milieux comprenant des produits de caséine hydrolysée par des acides,qui ont été essayés dans la production de mélanges de strep- tokinase et de streptodornase, se sont révélés entièrement inefficaces dans la plupart des cas. Bien qu'on ne connaisse pas exactement les raisons de cet- te supériorité, c'est un fait qu'il n'est possible de produire de la strepto- kinase et de la streptodornase, à l'échelle commerciale, qu'en utilisant un milieu de fermentation comprenant de la caséine hydrolysée enzymatiquement, de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique.
L'avantage principal des nouveaux milieux de fermentation réside dans le fait qu'on peut obtenir des rendements augmentés dans la production à grande échelle. Jusquà présent, il était impossible d'obtenir, dans la production à grande échelle, des rendements suffisants d'enzymes qui auraient permis d'isoler un produit satisfaisant pour l'usage en clinique. Les nou- veaux milieux de fermentation suivant la présente invention permettent d'ob- tenir, en général, dans la production à grande échelle, par exemple dans des cuves de 380 litres, des rendements en streptokinase par partie en volume qui représentent presque le triple du rendement obtenu en utilisant un milieu de fermentation comprenant un hydrolysat de protéine animale, par exemple un produit séparé à partir de protéines sanguines.
En effet, les fermentations dans les milieux comprenant un produit de caséine hydrolysée enzymatiquement, de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique, effectuées dans des cuves de 380 litres, donnent des rendements en unités d'activité de streptokinase par partie en volume du milieu qui représentent presque le double du rendement des fermentations dans un milieu comprenant une matière protéinique animale dans des récipients de 30 litres, c'est-à-dire que, même à l'échelle commer- ciale, un milieu comprenant un produit de caséine hydrolysé enzymatiquement, de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique donne de bien meilleurs résultats qu'un milieu comprenant un produit protéinique animal, dans les mê- mes conditions optimales.
Bien que les avantages des nouveaux milieux de fermentation ne soient pas aussi apparents dans la production à petite échelle, étant donné que les milieux comprenant un produit protéinique animal donnent des rende- ments presqu'équivalents par unité d'azote de base dans ces conditions, les nouveaux milieux de fermentation présentent néanmoins des avantages même dans la production à petite échelle, ce qui ressortira clairement des paragraphes suivants dans lesquels sont décrits des avantages supplémentaires des nouveaux milieux de fermentation suivant la présente invention.
Outre l'avantage des rendements augmentés, on obtient encore d'au- tres avantages en employant un milieu de fermentation comprenant un produit de caséine hydrolysée. Ainsi, par exemple un milieu de fermentation compre- nant un produit de caséine hydrolysée enzymatiquement se prépare plus faci- lement qu'un produit de protéines animales telles qu'on les obtient à partir de sang. Le produit de caséine hydrolysée se laisse plus facilement manipu- ler, stériliser et disperser. Par conséquent, les frais de production des mi- lieux de fermentation sont notablement réduits. En plus, le prix des produits de caséine hydrolysée enzymatiquement est en général plus bas.
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Les produits de protéines animales du commercé contiennent de nom- breuses substances présentant approximativement les mêmes poids moléculaires et la même constitution que les enzymes,c'est-à-dire la streptokinase-et la streptodornase, que l'on veut préparero Ces substances protéiniques sont pré- cipitées par les mêmes procédés que le sont les enzymes recherchées et, en outre, possèdent des propriétés électrophorétiques analogues. Il en résulte de grandes difficultés dans l'obtention et la purification de la streptokina- se et de la streptodornase ainsi qu'une augmentation des quantités de réac- tifs nécessaires. Ces difficultés sont aggravées par les faibles rendements obtenus dans un milieu de fermentation comprenant un produit de protéines animales.
On a trouvé quil était impossible d'obtenir, par les méthodes de purification décrites dans la littérature spéciale ou même les méthodes per- fectionnées développées conjointement avec le nouveau procédé, un produit suffisamment pur pour l'usage en clinique,à partir de charges de fermenta- tion de 380 litres,en,utilisant un milieu de fermentation comprenant un produit de protéines animales, par exemple une préparation obtenue à partir de sang.
Le tableau suivant indique les degrés de pureté qu'il a été pos- sible d'obtenir sous des conditions équivalentes à partir d'un milieu compre- nant un produit de protéines animales type et d'un milieu comprenant un pro- duit de caséine hydrolysée enzymatiquement type, respectivement. Le produit de protéines animales était une préparation commerciale préparée par les "Difco Laboratories" à Détroit, Michigan, et vendue sous le nom de "Neopepto- ne". Le "Néopeptone" a été chaudement recommandé comme source d'azote de base dans différents articles sur la production de streptokinase et de streptodor- nase. Le produit de caséine hydrolysée enzymatiquement utilisé était égale- ment une préparation commerciale mise en vente par la "Sheffield Farms Compa- ny, Inc" à New York, sous le nom de "N-Z-Amine".
Le degré de pureté est in- diqué en unités de streptokinase par gamma d'azote total.
TABLEAU 1
EMI4.1
<tb> Milieu <SEP> Pureté
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> litres <SEP> 380 <SEP> litres
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "Néopeptone" <SEP> 12 <SEP> u/gamma <SEP> + <SEP> 10 <SEP> u/ <SEP> gamma <SEP> +
<tb>
EMI4.2
TIN-Z-Amine" 100 u/gamma + 100 u/ganma +
Il ressort du tableau qu'en utilisant un milieu comprenant une préparation de caséine hydrolysée enzymatiquement, on peut obtenir un pro- duit approximativement 10 fois plus pur qu'un produit obtenu par les métho- des antérieures.
Il est souvent avantageux d'ajouter au milieu de fermentation di- vers autres ingrédients, en plus de la préparation de caséine hydrolysée., de la glycine et de l'agent réducteur sulfhydrylique. Ces ingrédients supplémen- taires, désignés par "ingrédients favorisant la croissance", comprennent des substances telles que des vitamines, des substances minérales., des aminoaci- des et des éléments de trace. Une énumération de ces substances et des quan- tités recommandées est donnée au tableau suivant.
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TABLEAU II.
EMI5.1
<tb>
Agent <SEP> favorisant <SEP> la <SEP> Parties <SEP> en <SEP> poids <SEP> pour
<tb>
<tb> croissance <SEP> 1000 <SEP> parties <SEP> de <SEP> diges-
<tb>
<tb> tion <SEP> de <SEP> caséine
<tb>
EMI5.2
--------------------------------------------------------------------
EMI5.3
<tb> KH2PO4 <SEP> 80 <SEP> - <SEP> 160
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KHCO3 <SEP> 50 <SEP> - <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Uracile <SEP> 0,2 <SEP> - <SEP> 0,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'adénine <SEP> 0,2 <SEP> - <SEP> 0,6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0902 <SEP> - <SEP> 0,06
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pyridoxine <SEP> 0,03 <SEP> - <SEP> 0,07
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tryptophane <SEP> 0,4 <SEP> - <SEP> 1,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,
1 <SEP> - <SEP> 03
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hydrochlorure <SEP> de <SEP> thiamine <SEP> 0,05 <SEP> - <SEP> 0,15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Riboflavine <SEP> 0,01 <SEP> - <SEP> OeO3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cystine <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 6 <SEP>
<tb>
Les éléments de trace sont généralement ajoutés sous forme d'un mélange de sels destiné à fournir de très petites quantités d'ions de métaux tels que le fer, le magnésium, le cuivre, le zinc, etc.. Il est souvent avantageux de préparer un "mélange de sels" à partir de sels des mé- taux énumérés ci-dessus et d'ajouter une petite quantité du mélange à chaque charge de fermentation.
Le tableau suivant se rapporte à la composition dun mélange de sels qui, lorsqu'on l'utilise en quantités de 40 à 150 cm3 par kg de préparation de caséine, donne des résultats satisfaisants.
TABLEAU III.
EMI5.4
<tb>
Substance <SEP> Quantité
<tb>
EMI5.5
-------------------------------------------------------------------
EMI5.6
<tb> MgSO4 <SEP> 11,5 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CuSO4.5H2O <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ZnSO4.7H2O <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> MnCl4.4H2O <SEP> 0,02 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> FeSO4.7H2O <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> HCl <SEP> 1,0 <SEP> litre
<tb>
Eau, en quantité suffisante pour obtenir 100 litres.
Le tableau suivant montre les résultats de fermentations effec- tuées au moyen d'une souche de streptococci hémolytiques productrice de streptokinase et de streptodornase, en utilisant premièrement un milieu de fermentation comprenant la préparation "N-Z-Amine" et ensuite un milieu de fermentation comprenant la préparation "Néopeptone". Les deux milieux ont été préparés de manière que la concentration en azote de base soit la même pour les deux milieux. Les mêmes quantités de différents agents favorisant la croissance étaient présentes dans tous les cas. Les résultats de fermen- tations effectuées dans des cuves de 30 litres et de 380 litres respective- ment sont indiqués dans le tableau suivanto
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TABLEAU IV.
EMI6.1
<tb>
"N-Z-Amine" <SEP> "Néopeptone"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 30 <SEP> litres <SEP> 380 <SEP> litres <SEP> 30 <SEP> litres <SEP> 380 <SEP> litres
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> 28xl09/cm3 <SEP> 19x109/cm3 <SEP> 32x10/cm3 <SEP> 40x109/cm3
<tb>
<tb>
<tb> Streptokinase/cm3 <SEP> 600 <SEP> u/cm3 <SEP> 1170 <SEP> u/cm3 <SEP> 600 <SEP> u/cm3 <SEP> 430 <SEP> u/cm3
<tb>
<tb>
<tb> Rendement <SEP> total <SEP> 18 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 385 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 18 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 150 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
On constatera que le milieu comprenant la préparation "N-Z-Ami- ne",de la glycine et un agent réducteur sulfhydrylique, dans des cuves de 30 litres, donne d'aussi bons rendements que le milieu comprenant la pré- paration "Néopeptone" et des rendements bien supérieurs dans des cuves de 380 litres.
En effet,la production de streptokinase par unité de volume dans le milieu contenant le "Néopeptone" accuse une forte baisse lorsqu'on substi- tue à la charge de fermentation de 30 litres une charge de 380 litres, tan- dis que la production de streptokinase par unité de volume dans un milieu comprenant la préparation "N-Z-Amine" est presque doublée lorsqu'on effectue la fermentation avec une charge de 380 litres au lieu de 30 litres. Ce phé- nomène est très surprenant vu le fait que le nombre de bactéries dans la charge de fermentation de 380 litres comprenant le "Néopeptone" était supé- rieur au double du nombre de bactéries dans la charge de fermentation de 380 litres comprenant la préparation "N-Z-Amine".
Les rendements supérieurs en enzymes obtenus avec le milieu com- prenant la "N-Z-Amine" sont bien plus avantageux qu'il semble à première vue, étant donné que, plus le nombre d'unités de streptokinase par unité de volu- me du milieu de fermentation est réduite plus le problème de l'isolement et de la purification de la streptokinase devient difficile. Cette difficulté réside dans le fait que la streptokinase est une substance analogue aux pro- téines et doit être séparée d'un mélange contenant de nombreuses autres pro- téines. Les méthodes de séparation disponibles pour ce genre de purifications sont accompagnées de très fortes pertes, particulièrement lorsque les substan- ces de nature protéinique que l'on veut séparer sont présentes en très fai- ble quantité.
En effet, la teneur en streptokinase du mélange de fermenta- tion contenant un milieu de fermentation au "Néopeptone" dans une cuve de 380 litres était si faible en comparaison de la quantité de résidus bactériens et d'autres impuretés qu'il était impossible d'isoler un produit suffisamment pur pour l'emploi en clinique.
La quantité de préparation de caséine par unité de volume du mi- lieu de fermentation peut varier entre de larges limites. Si la pureté du produit constitue le facteur principal, il est recommandable d'utiliser de faibles concentrations de préparation de caséine, par exemple de 2 à.6 parties en poids de la préparation pour 300 parties en volume de milieu de fermenta- tion,particulièrement lorsqu'on veut obtenir un produit destiné à être uti- lisé pour des injections intraveineuses. D'autre part, si on désire obtenir un rendement total en streptokinase par unité d'azote de base utilisé aussi haut que possible,il est recommandable d'utiliser de hautes concentrations en préparation de caséine, par exemple 10 à 20 parties en poids de la prépa- ration pour 300 parties en volume de milieu de fermentation.
Les résultats de plusieurs fermentations effectuées avec des char- ges de 380 litres en utilisant des quantités différentes de préparation de caséine (N-Z-Amine) sont indiqués au tableau suivant. Les chiffres figurant dans la colonne "Pureté" représentent le nombre d'unités de streptokinase par gamma d'azote dans le précipité actif non purifié.
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TABLEAU V.
EMI7.1
<tb> Parties <SEP> en <SEP> volume <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Unités <SEP> de <SEP> Pureté <SEP> du
<tb>
<tb> "N-Z-Amine" <SEP> pour <SEP> 300 <SEP> bactéries <SEP> streptoki-
<tb>
<tb> parties <SEP> en <SEP> volume <SEP> de <SEP> nase <SEP> par <SEP> cm3 <SEP> précipité
<tb>
<tb> milieu
<tb>
EMI7.2
----------------------------------------------------------------
EMI7.3
<tb> 4,0 <SEP> 20 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> 400 <SEP> 50 <SEP> u/gamma..
<tb>
<tb> 8,7 <SEP> 40-60x10 <SEP> 1200 <SEP> 20-40 <SEP> u/gamma
<tb>
<tb> 16,0 <SEP> 80 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> 2200 <SEP> 5-25 <SEP> u/gamma
<tb>
On peut déduire de ce qui précède que la quantité optimum de préparation de caséine hydrolysée enzymatiquement varie suivant que lon envisage en premier lieu la pureté du produit ou un rendement maximum..
Le milieu de fermentation peut se préparer par une méthode com- prenant les stades suivants : dissolution de la quantité voulue de prépara- tion de caséine hydrolysée enzymatiquement dans environ 5 fois son poids d'eau chaude, stérilisation par traitement dans l'autoclave ou par filtra- tion, addition de solutions de glycine et de l'agent réduction sulfhydryli- que, addition de solutions d'agents favorisant la croissance et ajustement du pH à environ 7 - 8. Le milieu est ensuite prêt à être inoculéo La métho- de décrite ci-dessus peut, naturellement, être modifiée. Ainsi, par exemple, si on stérilise le milieu par filtration, tous les ingrédients peuvent être ajoutés avant la stérilisation,et si on stérilise le milieu par traitement à l'autoclave, la glycine peut être ajoutée avant la stérilisation.
Du point de vue de la pureté du produit, il est quelquefois avantageux de refroidir le milieu à 20 C ou au-dessous avant le filtrage. Cependant, si un rende- ment maximum est plus important, il n'est pas recommandable de refroidir le milieu.
Pour obtenir la préparation d'inoculation, on met en suspension une culture de bactéries sèches dans quelques litres d'un milieu du genre décrit précédemment, contenant en outre 20-70 parties en poids d'un sucre pour 1000 parties d'azote de base, et on cultive les germes à une température de 35-39 C pendant environ 8 heures de manière à obtenir un nombre de bac- téries d'environ 2 x 109 à 2 x 1010 par cm3.
On utilise ensuite un volume de cette préparation d'inoculation pour inoculer le milieu de fermentation de manière à obtenir un nombre de bactéries d'environ 6 x 107 à 8 x 108 par cm30
Pour stimuler des bactéries du type décrit ci-dessus à produire des quantités maximum de streptokinase et de streptodornase, il faut les cul- tiver en présence de grandes quantités d'un sucre pendant une partie de la période de fermentation. L'introduction de ce sucre dans le milieu de fermen- tation constitue une source de difficultés et donne naissance à deux problè- mes très ardus.
En premier lieu, suivant une règle générale, la croissance des bactéries est interrompue, si la composition d'un milieu de fermentation est modifiée radicalement, et une période d'acclimatation est nécessaire a- vant que la croissance normale reprenneo Par conséquent, lorsqu'on ajoute de grandes quantités d'un sucre au milieu de fermentation dans lequel on cultive des bactéries productrices de streptokinase et de streptodornase, le change- ment subi de milieu provoque une interruption temporaire de la croissance nor- male. Le second problème est relatif à la production d'acide par les bacté- ries. Lorsqu'on cultive des bactéries productrices de streptokinase et de streptodornase dans un milieu contenant de grandes quantités d'un sucre, les bactéries produisent un acide qui empêche leur croissance.
Pour remédier aux difficultés occasionnées par ces deux problèmes, il était d'usage, jusquà présent, d'intercaler une période de transition d'environ 10 heures avant d'ajouter de grandes quantités de sucreo Pendant catte période les bactéries étaient cultivées dans un milieu ne contenant que de très faibles quantités de sucre.
Pendant cette période de transition les bactéries se propagent ra-
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pidement et atteignent des concentrations d'environ 30 x 109 par cm3 de mi- lieu,c'est-à-dire des concentrations se rapprochant de-très près du maximum que l'on peut obtenir,, Ainsi, lorsqu'on ajoute de grandes quantités de sucre au milieu de fermentation,un grand nombre de bactéries est déjà présent et, par conséquent, on obtient des quantités satisfaisantes de streptokinase et de streptodornase, bien que la croissance rapide ultérieure des bactéries soit quelque peu entravée. Cette méthode présente le désavantage d'une très longue période de fermentation. Par le procédé suivant la présente invention, il est possible non seulement de supprimer la période de transition mais aussi d'obtenir des résultats notablement supérieurs.
Suivant la présente inventionon ajoute au milieu de fermenta- tion, avant que la période de fermentation ait atteint 10 heures, 1500 à 1600 parties en poids d'un sucre pour 1000 parties en poids de matière azo- tée de base dans ledit milieu et on ajoute au moins 8 % dudit sucre avant que la durée de fermentation ait atteint 4 heures, le pH du milieu de fermen- tation étant maintenu entre 6,0 et 8,5 durant la fermentation. Suivant un mode préféré de mise en oeuvre du procédé,on ajoute la quantité entière de sucre avant même que la fermentation ait commencé.
Cette nouvelle méthode présente de nombreux avantages. Première- ment, la longue période de transition est supprimée. Par conséquent, on ob- tient une augmentation de la production quotidienne et une réduction des frais de production. La nouvelle méthode permet aussi d'économiser la matière azotée de base. L'avantage le plus important réside cependant dans le fait surprenant que l'on obtient des rendements bien supérieurs en streptokinase et en streptodornase par cm3 de milieu, ce qui ne pouvait certes pas être pré- vu. A titre d'explication possible, on peut supposer que les bactéries, lors- qu'elles se sont accoutumées à un milieu contenant de grandes quantités de sucre, se propagent aussi bien qu'avant et produisent de la streptokinase et de la streptodornase.
En effet, il semble que les bactéries se propagent plus rapidement dans un milieu présentant une haute concentration en'sucre, pour autant que l'acide formé est éliminé par neutralisation, que dans un milieu ne présentant qu'une faible concentration en sucre, puisque par le nouveau procédé suivant la présente invention, on obtient un nombre de bactéries fi- nal supérieur.
Le rendement augmenté en enzymes est important non seulement du point de vue économique mais aussi pour d'autres raisons. L'une de ces rai- sons réside dans la facilité avec laquelle on peut obtenir un produit relati- vement pur à partir d'une solution de fermentation présentant une concentra- tion relative élevée. La cause de cette facilité doit être recherchée dans la nature même des méthodes de purification disponibles et nécessaires pour la séparation des enzymes d'avec les autres constituants du milieu de fermen- tation, ces méthodes de purification étant d'une nature telle que leur effi- cacité diminue au fur et à mesure que la concentration relative des enzymes diminue.
Le tableau suivant indique les résultats de deux fermentations effectuées dans des conditions comparables, sauf que dans l'une de ces fer- mentations on a intercalé une période de transition, conformément aux pro- cédés antérieurs, et que dans l'autre on a commencé d'ajouter du sucre bien- tôt après l'inoculation. Dans tous les essais le milieu de fermentation était le même. Le sucre utilisé dans tous les essais était le glucose. La quantité de sucre utilisée était basée sur la quantité d'alcali requise pour maintenir le pH du milieu entre les limites opératives.
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TABLEAU VI.
EMI9.1
<tb>
Sans <SEP> période <SEP> de <SEP> Avec <SEP> période <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> transition <SEP> transition
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Durée <SEP> de <SEP> crois-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sance <SEP> en <SEP> heures <SEP> 7 <SEP> 24
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sucre <SEP> 15 <SEP> litres <SEP> de <SEP> glucose <SEP> 9 <SEP> litres <SEP> de <SEP> glucose
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptokinase <SEP> 1400 <SEP> unités/cm3 <SEP> 600 <SEP> unités/cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptodornase <SEP> 620 <SEP> unités/cm3 <SEP> 290 <SEP> unités/cm3
<tb>
Le tableau montre que dans le procédé suivant la présente in- vention la période de fermentation nécessaire est inférieure à un tiers'de la période
de fermentation des procédés antérieurs et que néanmoins on ob- tient un rendement en enzymes plus que doubléo
On peut utiliser tout autre sucre de type commun, y compris les monosaccharides et les polysaccharides. Le choix d'un sucre est en général déterminé par des considérations de commodité et d'économie. Comme disaccha- ride on peut utiliser le sucrose et le maltose et comme monosaccharidé on peut utiliser le glucose et le mannose. Les quantités de sucre que l'on peut ajouter avec avantage pendant la fermentation sont comprises dans une gamme relativement étendue, par exemple entre environ 1500 et 4000 parties en poids pour 1000 parties de matière azotée basique.
Un excès raisonnable de sucre n'a pas d'effet préjudiciable, contrairement à ce qu'on supposait' jusqu'à présent. On peut utiliser jusqu'à 5000 à 6000 parties de sucre pour 1000 parties de matière azotée de base, bien que cela ne soit pas recomman- dable pour des raisons d'économie. La quantité optimum de sucre dépend de plusieurs facteursmais, en général, elle sera comprise entre 2000 et 3000 parties en poids de sucre pour 1000 parties de matière azotée de base.
Sui- vant un mode de travail très satisfaisant, on détermine approximativement la quantité optimum en déterminant la quantité de base, calculée comme volume équivalent d'hydroxyde de sodium 5-n, qui est nécessaire pour maintenir le milieu de fermentation à un pH de travail satisfaisant, et en ajoutant 110 à 125 % de ce volume d'une solution de sucre à 50 % ou de son équivalent.
Pour obtenir des résultats particulièrement bons,il est recomman- dable de commencer d'ajouter le sucre aussitôt que possible au début de la fermentation. Lorsque les bactéries ont commencé de se propager en présence de grandes quantités de sucre, il y a toutefois lieu de contrôler soigneuse- ment le pH du milieu de fermentation étant donné que ce dernier a la tendance de devenir rapidement acide. Il ne faudrait pas laisser tomber le pH au-des- sous de 6,0 et, de préférence, pas au-dessous de 6,5. Un mode d'opération très satisfaisant consiste à ajouter une base lorsque le pH tombe au-dessous d'environ 6,7 pour 1-'élever à environ 7,50.
Il y a lieu, toutefois,de ne pas élever le pH au-dessus d'environ 8,5 et, de préférence, pas au-dessus de 8,0, étant donné que les valeurs de pH supérieures ont la tendance d'entraver la croissance des bactéries. En effet, si on élève le pH au-dessus d'environ 9,0, non seulement la croissance des bactéries sera entravée mais encore la strep- tokinase déjà formée sera inactivée irréversiblement. La température du li- quide de fermentation est également importante et devrait être maintenue en- tre environ 32 et 40 C et, de préférence, entre environ 36 et 38 C.
L'opération de fermentation devrait être poursuivie pendant au moins 3 heures après la première addition de sucre ou jusqu9à ce que la con- centration en streptokinase ait atteint un minimum d'environ 300 unités par cm3 de milieu de fermentationo D'une manière générale, l'opération de fermen- tation devrait, bien entendu, être poursuivie jusqu'à ce que la concentration en streptokinase et en streptodornase cesse d'augmenter ou, en d'autres ter-
<Desc/Clms Page number 10>
mes, pendant 4 - 8 heures après la première addition de sucre, étant donné qu'en général on est intéressé à obtenir la quantité maximum d'enzymes par cm3 de milieu de fermentation. On peut obtenir une économie de temps en in- terrompant la fermentation aussitôt que cette concentration maximum d'enzymes est atteinte.
Lorsque ce maximum est atteint, la concentration ne diminue ce- pendant que très lentement et, par conséquent, une prolongation de la durée de fermentation n'a pas d'effet excessivement préjudiciable. Pour cette rai- son, il est quelquefois utile de poursuivre l'opération de fermentation pen- dant la nuit ou pendant environ 16 heures au maximum.
Ainsi qu'il a déjà été dit, un mode d'opération préféré consiste à ajouter la quantité de sucre entière au milieu de fermentation avant de l'inoculer avec les bactéries. Antérieurement à la présente invention, on croyait que la présence d'un grand excès de sucre dans le milieu de fermen- tation à n'importe quel moment et en particulier au début de la fermentation devait avoir un effet préjudiciable grâce au changement de conditions radi- cal auquel les bactéries étaient soumises, ce qui devait rendre nécessaire une période d'acclimatation avant que la croissance normale reprenne. Par conséquent, il est très surprenant que des résultats aussi satisfaisants puis- sent être obtenus par le présent procédé.
Ce mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon la présente invention permet d'introduire le sucre en même temps que les autres ingré- dients nécessaires à la préparation du milieu de fermentation. A part l'avan- tage d'une importante économie de temps et d'efforts, ce mode d'opération présente l'avantage de supprimer la filtration stérile au cours de la fermen- tation. Suivant l'ancien procédé, une solution de sucre était préparée sépa- rément et filtrée de manière stérile avant d'être ajoutée au milieu de fermen- tation. Dans le nouveau procédé, par contre, on peut ajouter le sucre non sté- rilisé au milieu de fermentation non stérilisé et ensuite stériliser ce mé- lange par une seule filtration avant de l'inoculer.
En effet, c'est unique- ment à cause de cet avantage qu'il est possible d'augmenter le volume des fer- mentations de 380 litres à 3800 litres.
Après l'inoculation, on laisse fermenter le milieu de fermenta- tion à une température d'environ 32 - 40 C et, de préférence, de 36 - 38 C, jusqu'à ce que la concentration en streptokinase ait atteint un minimum d'en- viron 200 unités par cm3 et, de préférence, jusqu'à ce que le nombre de bac- téries ait atteint un maximum. Il y a lieu de maintenir le pH entre environ 6,0 et 8,5 pendant cette fermentation. Etant donné que le pH a la tendance de se déplacer du côté acide pendant la fermentation et particulièrement lors- qu'on commence d'ajouter de grande quantités de sucre, il est nécessaire d'ef- fectuer fréquemment des déterminations de pH et d'ajouter de l'alcali pour maintenir le pH entre les limites opératives.
Les exemples suivants montrent comment on peut réaliser le procé- dé suivant la présente invention.
EXEMPLE 1
A 50 litres d'eau distillée, on ajoute 10,17 kg de caséine hydro- lysée enzymatiquement (N-Z-Amine). La température est élevée à 100 C est maintenue jusqu'à ce que la solution de caséine hydrolysée soit limpide. On refroidit rapidement à 15 C le récipient et on filtre la solution refroi- die à travers du papier filtre grossier. On ajoute une petite quantité de to- luène comme agent de conservation et on laisse reposer la solution à 2 C pendant 4 jours. La solution est ensuite filtrée pour éliminer toute matière insoluble.
On ajoute les ingrédients suivants à la solution de caséine hy- drolysée : 1165,0 g de KH2PO4 dissous dans 8 litres d'eau distillée; 35,0 g de cystéine dans environ 800 cm3 de HCl à 10 % (la quantité minimum de HCl à 10 % requise pour obtenir une solution limpide); 35 g de glycine dissous dans 100 cm3 d'eau distillée ; g de dextrose dissous dans 2 litres d'eau distillée; 3,5 g d'uracile dissous dans 1 litre d'eau.distillée; 3,5 g de
<Desc/Clms Page number 11>
sulfate d'adénine dans 1 litre d'eau distillée ; 0,35 g d'acide nicotinique dissous dans'35 cm3 d'eau distillée ; 0,59 g de pyridoxine dissous'dans'59- cm3 d'eau distillée; 7,0 g de tryptophane dissous dans-1 litre d'eau distil- lée;
1,75 g de pantothénate de calcium dissous dans 70 cm3 d'eau distillée; 0,875 g d'hydrochlorure de thiamine dissous dans 87,5 cm3 d'eau distillée, 0,175.g de riboflavine dissous dans 1000 cm3 d'eau distillée; 700 cm3 d'un mélange de sels; 55,65 cm3 d'acide thioglycolique dans 100 cm3 d'eau. distil- lée; 700 g de KHCO3 dans 500 cm3 d'eau distillée. Le pH du milieu est ensuite ajusté à 7,2 et stérilisé par filtration.
Le milieu stérilisé est ensuite inoculé avec 11 litres d'une pré- paration d'inoculation présentant un nombre de bactéries d'environ 20 billions par cm3. La fermentation est effectuée à 37 C, sans ajustement du pH, aéra- tion ou autre modification, pendant 14 heures.Ensuite, on ajoute 320 cm3 de dextrose à 50 %. A partir de ce moment, le pH est ajusté à 7,0 au moyen d'hy- droxyde de sodium 5,0-n toutes les 15 minutes. On note la quantité volumétri- que nécessaire pour la neutralisation. On ajoute 115% de ce volume de solu- tion de dextrose à 50 % après chaque ajustement de pH. Au bout d'environ 8 heures l'augmentation du nombre des bactéries cesse et la fermentation est terminée.
Le milieu de fermentation contient alors environ 1000 unités de streptokinase par cm3.
EXEMPLE 2
On prépare un milieu de fermentation en utilisant les ingrédients suivants :
EMI11.1
<tb> caséine <SEP> hydrolysée <SEP> ("N-Z-Amine") <SEP> 10169,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KH2PO4 <SEP> 1165,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cystine <SEP> 35,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycine <SEP> 35,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 300,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Uracile <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'adénine <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0,35 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pyridoxine <SEP> 0,595 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tryptophane <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1,
75 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hydrochlorure <SEP> de <SEP> Thiamine <SEP> 0,875 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Riboflavine <SEP> 0,175 <SEP> g <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> thioglycolique <SEP> 52,5 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KHC03 <SEP> 700,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Solution <SEP> de <SEP> sels <SEP> (Tableau <SEP> III) <SEP> 700,0 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 350,0 <SEP> litres
<tb>
On dissout la caséine hydrolysée dans environ 5 volumes d'eau et on stérilise ensuite cette solution par traitement dans l'autoclave.
A- près refroidissement à la température ambiante, on ajoute des solutions stériles des autres ingrédients et on étend ensuite la solution avec de l'eau distillée stérileo Le pH de la solution est ajusté à environ 7,0 et la température est portée à environ 37 C. Le milieu est ensuite inoculé avec environ 11,0 litres d'une préparation d'inoculation contenant environ 16 x 109 de streptococci bêta-hémolytiques Lansfield, groupe C, par cm3.
L'inoculation est effectuée à environ 9 heures du matin.. Le ta- bleau suivant indique le temps., les quantités de sucre et de base ajoutées
<Desc/Clms Page number 12>
et le pH avant et après l'addition. Le sucre est ajouté sous forme d'une solu- tion aqueuse stérile contenant 50 g de sucre pour 100 cm3 de solution.
Le nom- bre d'unités de streptokinase et le nombre de bactéries contenus dans 1 cm3 de milieu à différents moments sont également indiqués dans le tableau sui- vanta
EMI12.1
<tb> Temps <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> solu- <SEP> PH <SEP> PH <SEP> SK <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> bac- <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> NAOH <SEP> 5n <SEP> tion <SEP> de <SEP> dex- <SEP> avant <SEP> après <SEP> unités/ <SEP> téries <SEP> en
<tb>
<tb>
<tb> ajoutés <SEP> trose <SEP> à <SEP> 50% <SEP> cm3 <SEP> billions/cm3
<tb>
<tb>
<tb> ajoutés
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9h45- <SEP> 7,1 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> 10h10 <SEP> - <SEP> - <SEP> 699 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10h35 <SEP> 600 <SEP> 660 <SEP> 6,7 <SEP> 6,9 <SEP> - <SEP> 12,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11h00 <SEP> 1500 <SEP> 1650 <SEP> 6,4 <SEP> 7,
05
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11h25 <SEP> 800 <SEP> 880 <SEP> 6,6 <SEP> 6,9 <SEP> 234 <SEP> 18,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11h45 <SEP> 2500 <SEP> 2650 <SEP> 6,4 <SEP> 7,5 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12h30 <SEP> 2500 <SEP> 2650 <SEP> 6,4 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12h50 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> 286 <SEP> 33,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h05 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h20 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h30 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h50 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,7 <SEP> 572 <SEP> 46,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h10 <SEP> - <SEP> 800 <SEP> 6,9 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h15 <SEP> 1800 <SEP> 1980 <SEP> 6,
7 <SEP> 7,45 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h30 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> 780
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h45 <SEP> 1800 <SEP> 2200 <SEP> 6,7 <SEP> 7,5 <SEP> - <SEP> 54,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15h00 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> 832
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15h20 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,5 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15h40 <SEP> 1800 <SEP> 2200 <SEP> 6,7 <SEP> 7,45 <SEP> 1170 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 15h55 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,5 <SEP> - <SEP> 57,7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16h15 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7955 <SEP> 1450 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 16h35 <SEP> 1600 <SEP> 1760 <SEP> 6,8 <SEP> 7,5 <SEP> - <SEP> 65,
2
<tb>
Total 30900 35030
A 16h45 environ les bactéries étaient détruites et la fermen- tation était terminée.
EXEMPLE 3
On prépare un milieu de fermentation en utilisant les ingrédients suivants
EMI12.2
<tb> caséine <SEP> hydrolysée <SEP> ("N-Z-Amine") <SEP> 10169,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> KHZP04 <SEP> 1165,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cystine <SEP> 35YO <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycine <SEP> 35,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 22,5 <SEP> g
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb> Uracile <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'adénine <SEP> 3,5 <SEP> g <SEP> . <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0935 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pyridoxine <SEP> 0,595 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tryptophane <SEP> 3,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1,75 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hydrochlorure <SEP> de <SEP> thiamine <SEP> 0,875 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Riboflavine <SEP> Oyl75 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acide <SEP> thioglycolique <SEP> 52,5 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> KHC03 <SEP> 700,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> Solution <SEP> de <SEP> sels <SEP> (Tableau <SEP> III) <SEP> 700,0'cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée, <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante
<tb>
<tb>
<tb> pour <SEP> faire <SEP> 350,0 <SEP> litres
<tb>
Le milieu est préparé et inoculé de la manière décrite dans l'exemple 1.
L'inoculation est effectuée à 8h45 du matin. Le tableau sui- vant indique le temps ainsi que la quantité des additions de base et le nombre d'unités de streptokinase contenues dans 1 cm3 de milieu à des temps différents. '
EMI13.2
<tb> Temps <SEP> cm3 <SEP> de <SEP> pH <SEP> pH <SEP> SK <SEP> SD <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> bactéries
<tb>
<tb> NaOH <SEP> 5n <SEP> avant <SEP> après <SEP> unités/ <SEP> unités/ <SEP> en <SEP> billions/cm3
<tb>
<tb>
<tb> ajoutés <SEP> cm3 <SEP> cm3 <SEP> en <SEP> billions/cm3
<tb>
EMI13.3
------------------------------------------------------------------
EMI13.4
<tb> 9h25 <SEP> 600 <SEP> 6,75 <SEP> 7,1 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10h25 <SEP> 400 <SEP> 6,8 <SEP> 7,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 10h50 <SEP> 600 <SEP> 6,7 <SEP> 7905 <SEP> 6,
7
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 11h30 <SEP> 2000 <SEP> 6,8 <SEP> 7,05 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12h00 <SEP> 1200 <SEP> 6,9 <SEP> 7,3 <SEP> 390
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12h25 <SEP> 1500 <SEP> 6,75 <SEP> 7,45 <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 12h45 <SEP> 1600 <SEP> 6,7 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13hl5 <SEP> 2000 <SEP> 6,5 <SEP> 7,4 <SEP> 1300 <SEP> 28,3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h35 <SEP> 1800 <SEP> 6,6 <SEP> 7,0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1000 <SEP> - <SEP> 7,5 <SEP> 2370
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13h55 <SEP> 1400 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h05 <SEP> 1600 <SEP> 6,7 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h20 <SEP> 1400 <SEP> 6,8 <SEP> 7,4 <SEP> - <SEP> - <SEP> 54,9
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h35 <SEP> 1700 <SEP> 6,
7 <SEP> 7,4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 14h45 <SEP> 1800 <SEP> 6,6 <SEP> 7,3 <SEP> - <SEP> 1000
<tb>
Total 20600
A 15h00 environ les bactéries étaient détruites et la fermentation était terminée.