CH311407A - Procédé de fabrication d'un mélange de streptokinase et de streptodornase. - Google Patents

Description

  Procédé de fabrication d'un     mélange    de     streptokinase    et de     streptodornase.       La. présente invention se rapporte à la  fabrication d'un mélange de     streptokinase    et  de     streptodornase.     



  La     streptokinase    est une enzyme qui agit  indirectement sur la fibrine ou le fibrinogène  en activant, dans le sérum humain, une enzyme       fibrinoly    tique qui décompose la fibrine en  fragments et provoque     ainsi    une rapide disso  lution des caillots de sang et des     exsudats     fibrineux.

   La     streptodornase    est, une enzyme       (lui    agit directement.     sur    la.     désoxy        ribonucléo-          protéine    et l'acide désoxyribonucléique qui  sont les constituants principaux des noyaux  et constituent 30-70     1/o    du sédiment des exsu  dats purulents. La     streptodornase    décompose  la nucléoprotéine en bases     puriniques    et en       nucléosides        pyrimidiniques    et provoque     ainsi     une réduction notable de la viscosité des exsu  dats purulents.  



  Grâce aux propriétés mentionnées     ci-          clessu.s,    des mélanges de     streptokinase    et de       streptodornase    se sont révélés utiles dans le  traitement     expérimental    de certaines     brîilures,     dans le drainage des sinus purulents, dans le  traitement d'abcès infectieux chroniques des  os ou ostéomyélites, dans le drainage du sang  coagulé des plaies internes et dans le drai  nage du  bloc vertébral  de la colonne verté  brale, que l'on     observe    dans divers types de       méningites.    De manière plus générale, des       mélaiig,

  es    de ces-deux     enzymes    sont utiles dans  le traitement d'empyèmes, d'hémothorax,    d'hématomes et d'infections suppurantes  chroniques.  



  Sauf erreur, la seule méthode pratique de  production de     str        eptokinase    et de     streptodor-          nase    consiste à cultiver     certaines    souches de  streptocoques     bêta-hémolytiques    dans un mi  lieu nutritif approprié. Les streptocoques  utilisés le plus fréquemment sont ceux des  groupes     Lancefield    A, C  humain  et G, la  souche C étant utilisée de préférence. De nom  breux milieux nutritifs ont été essayés dans  ce but; ainsi qu'il     ressort    de la littérature, les  milieux les plus favorables sont les mélanges .

    aqueux de matières     protéiniques    animales,  telles que des produits sanguins partiellement  hydrolysés. Ces milieux nutritifs permettent  d'obtenir de bons     résultats        dans    la. production  à petite échelle, par     exemple    là où la fermen  tation est. effectuée dans des récipients de  30 litres. Par contre, dans la production à  grande échelle, par exemple avec un volume  de<B>380</B>     litres,    ces milieux ne donnent. pas de  résultats satisfaisants.

   Lorsqu'on emploie ces  milieux dans des essais de production à     grande          échelle    de mélanges de     streptokinase    et de       streptodornase,    les streptocoques produisent  des quantités d'enzymes beaucoup plus fai  bles.  



  La présente     invention    a pour objet un  procédé de fabrication d'un mélange de       streptokinase    et de     streptodornase    par culture  de bactéries dans un milieu nutritif, ce pro-      cédé étant     caractérisé    en ce qu'on utilise une  souche de streptocoques hémolytiques produc  trice de     streptokinase    et de     streptoclornase    et  un milieu nutritif contenant de la caséine  hydrolysée par des     ferments,    de la glycine  et un agent réducteur     sulfhydrylique,    tel que  l'acide     thioglycolique,

      l'acide     tbiomalique    ou  la     glutathione.    On a trouvé qu'en utilisant un  milieu nutritif de ce genre, il était possible  de produire un mélange de     streptokinase    et  de     streptodornase    à, l'échelle commerciale. Des  résultats très satisfaisants ont été obtenus en  utilisant ce nouveau milieu nutritif dans des  cuves de 380 et même de 3800 litres.  



  La caséine hydrolysée par des ferments  est l'ingrédient principal du nouveau milieu  nutritif; elle sert à fournir de l'azote basique.  On trouve de nombreux produits de ce (retire  dans le commerce. L'un de ces produits qui a  été employé avec succès dans un grand nom  bre d'essais effectués par la titulaire est le  produit marque      N-Z-Amine     fabriqué par  la  Sheffield     Farms    Company,     Inc. ,    New  York. Ces produits sont obtenus en formant.  une dispersion aqueuse de caséine et en y  ajoutant des jus     pancréatiques    pour catalyser  l'hydrolyse. Des détails concernant la prépa  ration de ces produits se trouvent par exem  ple     dans    les brevets des     LT.    S.

   A.     N -    2489880  et 2180637.  



  En revanche, oh a constaté que des  milieux nutritifs à base de caséine hydrolysée  par des acides, lorsqu'ils sont utilisés pour  produire des mélanges de     streptokinase    et de       streptodornase,    se sont révélés entièrement.  inefficaces dans la plupart des cas.  



  La quantité de glycine utilisée dans le nou  veau milieu nutritif petit varier dans de larges  limites, par exemple entre 1,0 et 350 g de gly  cine pour 1000 g     (le,    caséine hydrolysée, la  quantité     optimum    étant d'environ 100 à 200  de glycine pour 1000 g de caséine hydrolysée.  La quantité de l'agent réducteur     sulfhydry-          lique    employée dans le milieu nutritif peut  également varier dans de larges limites, par  exemple entre<B>0,01</B> et 0,5 mole d'agent réduc  teur     sulfhydrylique    pour 1000 g de caséine  hydrolysée, le rapport optimum étant de     0,013)       à. 0,07 mole pour 1000 g de caséine hydrolysée.

    La fonction de l'agent réducteur est simple  ment de maintenir le milieu à l'état réduit. On  peut utiliser     n'importe    lequel des agents ré  ducteurs     sulfhydryliques    connus.  



  L'avantage principal du nouveau milieu  nutritif réside dans le fait qu'on peut obtenir  des rendements     augmentés    dans la production  à grande échelle. Jusqu'à présent, il était. im  possible d'obtenir, dans la production à grande  échelle, des rendements suffisants d'enzymes  qui auraient permis     d1soler    un produit satis  faisant pour l'usage clinique.

   Le nouveau  milieu nutritif permet d'obtenir en général  dans la production à grande échelle, par  exemple dans des cuves de 380 litres, des  rendements en     streptokinase        par    partie en  volume du milieu     nutritif        qui        représentent     presque le triple du rendement obtenu en  utilisant un milieu nutritif     comprenant    un  hydrolysant de protéine animale, par exemple  un produit tiré de protéines sanguines.

   En  effet, les     fermentations    dans des milieux com  prenant de la caséine     hydrolysée    par des fer  ments, de la glycine et     ttn    agent réducteur       sulfhydrylique,    effectuées dans des cuves de  380 litres, donnent des rendements en unités  de     streptokinase    par partie en volume du  milieu nutritif qui représentent     presque    le  double du     rendement    des fermentations effec  tuées dans un milieu comprenant.

   une matière       protéinique    animale dans des récipients de  30 litres,     c'est-à.-dire    que, même à l'échelle       commerciale,    un milieu comprenant de la  caséine     hydrolysée    par des ferments, de la  glycine et un agent réducteur     sulfhydrvlique     donne de bien meilleurs résultats qu'un milieu  comprenant tin produit     protéinique    animal.  dans les mêmes conditions optimales.  



  Il est     souvent        avantageux    d'ajouter au  milieu nutritif divers autres     ingrédients,    en  plus de la. caséine     hydrolysée,    de la     glycine     et de l'agent réducteur     sulflivdrylique.    Ces  ingrédients supplémentaires, désignés par   ingrédients favorisant la     croissance ,    com  prennent des substances telles que des vita  mines, des substances minérales, des amino  acides et des     oligo-éléments.    Une     énumération         de ces substances et des quantités recomman  dées est donnée au tableau suivant.

    
EMI0003.0001     
  
    <I>Tableau <SEP> 1:</I>
<tb>  Parties <SEP> en <SEP> poids
<tb>  Agent <SEP> favorisant <SEP> la <SEP> croissance <SEP> pour <SEP> ioooparties
<tb>  de <SEP> caséine
<tb>  hydrolysée
<tb>  K112P04 <SEP> 8<B>0</B>-160
<tb>  KI3C03 <SEP> 50-100
<tb>  Gracile <SEP> 0,\'-0,6
<tb>  Sulfate <SEP> d'adénine <SEP> 0,2-0,6
<tb>  Acide <SEP> nicotinique <SEP> 0,02-0,06
<tb>  Pyridoxine <SEP> 0,03-0,07
<tb>  Tryptophane <SEP> 0,4-1,0
<tb>  Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,1-0,3
<tb>  Hydrochlorur <SEP> e <SEP> de <SEP> thiamine <SEP> 0,05-0,15
<tb>  Riboflavine <SEP> 0,01-0,03
<tb>  Cvstine <SEP> <B>2-6</B>       Les     oligo=éléments    sont généralement ajou  tés sous forme d'un mélange de sels destinés  à     fournir    de très petites quantités d'ions de  métaux tels que le fer,

   le     magnésium,    le     euivre,     le zinc,     ete.    Il est souvent avantageux de pré  parer     d'avance    un mélange de sels des mé  taux énumérés ci-dessus et d'ajouter une pe  tite quantité de ce mélange à chaque charge  de fermentation.

   Le tableau suivant se rap  porte à la composition d'un mélange de sels  (lui, lorsqu'on l'utilise en quantités de 40 à  
EMI0003.0008     
  
    <I>Tableau <SEP> III:</I>
<tb>  Milieu <SEP> nutritif <SEP> (A) <SEP> (B)
<tb>  volume <SEP> 3o <SEP> litres <SEP> <B>380</B> <SEP> litres <SEP> 3o <SEP> litres <SEP> 38o <SEP> litres
<tb>  Nombres <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> 28 <SEP> X <SEP> 109/em3 <SEP> 19 <SEP> X <SEP> 109/em3 <SEP> 32 <SEP> X <SEP> 109/cm3 <SEP> 40 <SEP> X <SEP> 109/cm3
<tb>  Streptol;

  inase/em3 <SEP> 600 <SEP> u/em3 <SEP> 1170 <SEP> u/ems <SEP> 600 <SEP> u/em3 <SEP> 430 <SEP> u/em3
<tb>  Rendement <SEP> total <SEP> 18 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 385 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 18 <SEP> X <SEP> 106 <SEP> 7.50 <SEP> X <SEP> 106
<tb>  (unités <SEP> de <SEP> streptokinasé)       (>n constatera que le milieu (A), dans des       cuves    de 30     litres,    donne d'aussi bons     rende-          nients    que le milieu (B) et des rendements  bien supérieurs dans des     euves    de 380 litres.  En effet, la production de     streptokinase    par    150     em3    par kg de caséine hydrolysée,     donne     des résultats satisfaisants.

    
EMI0003.0017     
  
    <I>Tableau <SEP> II:</I>
<tb>  Substance <SEP> Quantité
<tb>  MgS0.4 <SEP> 11,5 <SEP> kg
<tb>  CuSO4-5H20 <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>  ZnS04 <SEP> # <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>  MnC12 <SEP> - <SEP> 41120 <SEP> 0,02 <SEP> kg
<tb>  FeS04 <SEP> # <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> kg
<tb>  HCl <SEP> 1,0 <SEP> litre
<tb>  Eau, <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante
<tb>  pour <SEP> obtenir <SEP> <B>100</B> <SEP> litres.

         Le tableau suivant montre les résultats de       fermentations    effectuées au moyen d'une sou  che de streptocoques hémolytiques productrice  de     streptokinase    et de     streptodornase,    en  utilisant premièrement un milieu nutritif (A)  comprenant le produit marque      N-Z-Amine      précité et ensuite, à titre de comparaison,  un     milien    nutritif (B) comprenant une pré  paration connue à base de protéines animales.  Les deux milieux ont. été préparés de manière  que leur concentration en azote de base soit la  même. Les mêmes quantités de différents  agents favorisant la croissance étaient pré  sentes dans tous les cas.

   Les résultats de fer  mentations effectuées dans des cuves de  30 litres et de 380 litres respectivement sont  indiqués dans le tableau suivant.    unité de volume dans le milieu (B) accuse  une forte baisse lorsqu'on substitue à la  charge de fermentation de 30 litres une charge  de 380 litres, tandis que la production de       streptokinase    par unité de volume dans un      milieu (A) est     presque    doublée lorsqu'on  effectue la fermentation avec une charge de  380 litres au lieu de 30 litres. Ce phénomène  est. très surprenant vu le fait. que le nombre  de bactéries dans la charge de fermentation  de 380 litres comprenant le milieu     (B)    était  supérieur au double du nombre de bactéries  dans la charge de fermentation de 380 litres  comprenant le milieu (A).  



  La quantité de caséine     livdrolysée    par  unité de volume du milieu nutritif peut va  rier entre de larges limites. Si la.     pureté    du  produit à. obtenir constitue le facteur     priii-          eipal,    il est. recommandable d'utiliser de fai  bles     concentrations    de caséine, par     exemple    2  à 6 parties en poids pour 300 parties en vo  lume de     milieu    nutritif, particulièrement lors-  
EMI0004.0010     
  
    <I>Tableau <SEP> IV:</I>
<tb>  Parties <SEP> en <SEP> volume <SEP> de <SEP> produit'
<tb>  marque <SEP>  :

  \T-Z-Amine  <SEP> pour <SEP> Nombre <SEP> Unités <SEP> de <SEP> Pureté <SEP> du
<tb>  3oo <SEP> parties <SEP> en <SEP> volume <SEP> de <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> streptolcinase <SEP> précipité
<tb>  milieu <SEP> nutritif <SEP> par <SEP> cm3 <SEP> par <SEP> cm-'
<tb>  4,0 <SEP> 20 <SEP> X <SEP> 109 <SEP> -100 <SEP> 50 <SEP> u'gamnia
<tb>  8,7 <SEP> 40-60 <SEP> X <SEP> 109 <SEP> 1200 <SEP> 20---10 <SEP> u;gamma
<tb>  16,0 <SEP> 80 <SEP> X <SEP> 109 <SEP> 2200 <SEP> <B>5-</B>25 <SEP> u! < ,.amma       On petit déduire de ce qui précède que la  quantité optimum de caséine hydrolysée varie  suivant. que l'on     envisage    en premier lieu la  pureté du produit ou un rendement maximum.  



  Le milieu nutritif peut se préparer par  une méthode comprenant les stades suivants:  dissolution de la quantité voulue de caséine       hydrolysée    par des ferments dans environ  5 fois son poids d'eau chaude, stérilisation  par traitement dans     l'autoclave    ou par filtra  tion, addition de     solutions    de     glycine    et de  l'agent réducteur     sulfhydrylique,    addition de  solutions     d'agents    favorisant la croissance et       ajustement    du pH à     environ    7-8.

   Le milieu  est ensuite prêt à être     inoculé.    La méthode  décrite ci-dessus peut, naturellement, être mo  difiée.     Ainsi,    par exemple, si on stérilise le  milieu par filtration, tous les     ingrédients    peu  vent être ajoutés avant la stérilisation, et si  on     stérilise    le milieu par traitement à l'auto-    qu'on veut obtenir un produit destiné à être  utilisé pour des injections intraveineuses.

   En  revanche, si on désire obtenir un rendement  total en     streptokinase    par     -unité        d'azote    de  base aussi haut. que possible, il est recom  mandable     d'utiliser    de     hautes    concentrations  de caséine     hydrolysée,    par     exemple    10     à'20    par  ties en poids pour 300     parties    en     volume    de  milieu nutritif.  



  Les     résultats    de plusieurs fermentations  effectuées avec des charges de     3R0    litres en  utilisant des quantités     différentes    de caséine       hydrolysée    (produit marque      N-Z-Amine )     sont. indiqués au tableau suivant. Les     chiffres          figurant    dans la- colonne  pureté      représentent     le nombre d'unités de     streptokinase    par     gamma     d'azote dans le précipité actif non purifié.    clave, la     glycine    petit être ajoutée avant la  stérilisation.

   Dit point. de vue (le la pureté du  produit, il est quelquefois     avantageux    de re  froidir le milieu à 20  C ou au-dessous avant.  la filtration. Cependant, si un rendement  maximum est plus important. il     n'est    pas  recommandable de     refroidir    le     milieu.     



  Pour obtenir la. préparation d'inoculation,  on met en suspension une culture de bactéries  sèches dans quelques litres d'un milieu     du     genre décrit     précédemment,        contenant    en outre  20-70 parties en poids     d'un        sucre    pour  1000 parties d'azote de base, et on cultive les       germes    à. une température de<B>35-39'</B> C pen  dant environ 8 heures, de manière à. obtenir       -Lui    nombre de bactéries d'environ 2     :

  109    à  2     \,101o    par     ema.    On utilise ensuite cette  préparation     d'inoculation    pour inoculer le  milieu de fermentation de manière à obtenir      un nombre de bactéries d'environ 6 X 107 à  8 X<B>1.08</B> par     em3.     



  Pour stimuler des bactéries du type décrit  ci-dessus à produire des quantités maximum  de     streptokinase    et de     streptodornase,    il faut.  les cultiver en présence de grandes quantités  d'un sucre pendant. une partie de la période  clé fermentation. L'introduction de ce sucre  dans le milieu de fermentation constitue une  source de difficultés et. donne naissance à deux  problèmes très ardus. En premier lieu, suivant  une     rè-le    générale, la croissance des bactéries       est    interrompue si la composition d'un milieu  de fermentation est modifiée     radicalement,    et  une période d'acclimatation est nécessaire  avant que la croissance normale reprenne.

   Par  conséquent, lorsqu'on ajoute de grandes quan  tités d'un sucre au milieu de fermentation  clans lequel on cultive des     bactéries    produc  trices de     streptokinase    et de     streptodornase,     le changement. subit de. milieu provoque une  interruption temporaire de la croissance nor  male. Le second problème est. relatif à la  production d'acide par les bactéries.

   Lors  qu'on cultive des bactéries productrices de       str#eptokinase    et de     streptodornase    dans un  milieu contenant. de grandes quantités d'un       sucre,    les bactéries produisent un acide qui  empêche     leur        croissance.    Pour remédier aux       difficultés    occasionnées par ces deux pro=       blèmes,    il était. d'usage,     jusqu'à    présent,     d'in-          terealer    une période de transition     d'environ     <B>10</B> heures avant d'ajouter de grandes quantités  clé sucre.

   Pendant cette période, les bactéries  étaient cultivées dans un milieu ne contenant  crue de très faibles quantités clé sucre. Pendant  cette période de transition, les bactéries se  propagent rapidement et atteignent des con  centrations d'environ 30 X<B>199</B> par cm-' de  milieu, c'est-à-dire des concentrations se rap  prochant de très près du maximum     qu        e    l'on  peut obtenir. Ainsi, lorsqu'on ajoute de       ,grandes    quantités de sucre au milieu de fer  mentation, un -rand nombre de bactéries est  déjà présent et, par conséquent, on obtient  des quantités satisfaisantes de     streptokinase     et.

   (le     streptodornase    bien que la croissance  rapide     ultérieure    des bactéries soit quelque    peu entravée. Cette méthode présente le dés  avantage d'une très longue période de     fernien-          tation.     



  En appliquant un mode d'exécution du  procédé suivant. la présente invention, il de  vient possible non seulement de supprimer la  période de transition, mais     aussi    d'obtenir des  résultats notablement supérieurs. Il suffit  pour cela d'ajouter au milieu nutritif, avant  que la. période de fermentation ait.     atteint.     10 heures, 1500 à 1600 g d'un sucre pour  1000 g de matière azotée-de base dans ledit  milieu. De préférence, on ajoute au moins 8      /o          dudit    sucre avant. que la     durée    de fermenta  tion ait atteint. 4 heures, le     pli    du     milieu    de  fermentation étant maintenu entre 6,0 et 8,5  durant la fermentation.

   Suivant un mode  préféré de mise en     oeuvre,    on ajoute la. quan  tité entière de sucre avant même que la fer  mentation ait commencé.  



  Cette nouvelle méthode présente de nom  breux avantages. Premièrement., la longue pé  riode de transition est supprimée. Par consé  quent, on obtient une augmentation de la pro  duction quotidienne et une réduction des frais  de production. La, nouvelle méthode permet  aussi d'économiser la matière azotée de base.  L'avantage le     plus    important. réside cepen  dant dans le fait. surprenant que l'on obtient  des rendements bien supérieurs en     strepto-          kitase    et. en     streptodornase    par     em3    de milieu,  ce qui ne pouvait. certes pas être prévu.

   A     titre     d'explication possible, on peut     supposer    que  les bactéries, lorsqu'elles se sont accoutumées  à un milieu contenant de     grandes    quantités  de sucre, se propagent     aussi    bien qu'avant et  produisent de la,     streptokinase    et de la     strepto-          dornase.    En effet, il semble que les bactéries  se propagent plus rapidement     dans    un milieu  présentant une haute concentration en sucre,  pour autant que l'acide formé soit éliminé  par neutralisation, que dans un milieu ne  présentant qu'une faible concentration en  sucre, puisque, dans ce mode     d'exécution,

      on  obtient un nombre de     bactéries    final supé  rieur.  



  Le tableau suivant. indique les     résultats     de deux fermentations effectuées dans des           conditions    comparables, sauf que dans     l'une     clé ces fermentations on a intercalé une pé  riode de transition, conformément. aux pro  cédés     antérieurs,    et que     dans    l'autre on a  commencé d'ajouter du sucre bientôt après  l'inoculation.

   Dans tons les essais, le milieu  
EMI0006.0005     
  
    <I>Tableai4 <SEP> Z':</I>
<tb>  Sans <SEP> période <SEP> de <SEP> transition <SEP> Avec <SEP> période <SEP> de <SEP> transition
<tb>  Durée <SEP> de <SEP> croissance
<tb>  en <SEP> heures <SEP> "r <SEP> '?-1
<tb>  Sucre <SEP> 15 <SEP> litres <SEP> clé <SEP> glucose <SEP> à <SEP> 50 <SEP> 0/0 <SEP> 1) <SEP> litres <SEP> clé <SEP> glucose <SEP>  < i <SEP> 50 <SEP> %
<tb>  Streptohinase <SEP> 1400 <SEP> unités;cma <SEP> 600 <SEP> unités;!em3
<tb>  Streptodornase <SEP> 620 <SEP> iinités'emÏ <SEP> 290 <SEP> unités.\em#       Le tableau montre que, sans période de  transition, la période de fermentation néces  saire est. inférieure à     tut    tiers de la période  de fermentation des procédés antérieurs et.

    que, néanmoins, on obtient un rendement en       enzymes        plus    que doublé.  



  On peut. utiliser tout autre sucre commun,  y compris les     monosaccharides    et les     poly-          saccharides.    Le     choix    d'un sucre est en géné  ral déterminé par des considérations de com  modité et     d'économie.    Comme     disaccharide    on  peut utiliser le saccharose et le maltose et  comme     monosaccharide    on     petit    utiliser le       glucose    et le     mannose.    Les quantités de sucre  que l'on peut ajouter avec avantage pen  dant la fermentation sont     comprises    dans une  gamme relativement étendue,

   par exemple  entre environ 1500 et. 4000 parties en poids  pour 1000 parties de matière azotée basique.  Un excès raisonnable de sucre n'a. pas d'effet  préjudiciable, contrairement à ce qu'on suppo  sait jusqu'à. présent. On peut. utiliser     jusqu'à     5000 à 6000 parties de sucre     pour   <B>1000</B> parties  de matière azotée, bien que cela. ne soit pas       recommandable    pour des raisons d'économie.  La quantité optimum de sucre dépend de       plusieurs    facteurs, mais, en général, elle sera.  comprise entre 2000 et 3000 parties en poids  de sucre pour 1000     parties    de matière azotée.

    Suivant. un mode de travail très     satisfaisant,     on peut connaître approximativement la quan-    de     fermentation    était le même. Le sucre utilisé  dans tous les essais était. le glucose. La. quan  tité de sucre utilisée était basée sur la. quan  tité d'alcali     requise    pour maintenir le     pll    du  milieu entre les limites opératoires.

      Lité     optimum    en déterminant le volume       cl'hpdi@oxvcle    de sodium     5N,    qui est     nécessaire     pour maintenir le milieu clé fermentation à  un     pH    de travail satisfaisant, et en ajoutant  7.10 à     1\35 /o    de ce volume d'une solution de  sucre à 50 0/0 ou son     équivalent.     



  Pour obtenir des résultats particulièrement  bons, il est indiqué de commencer d'ajouter le  sucre aussitôt. que possible au début de la  fermentation.     Lorsque    les bactéries ont com  mencé de se     propager    en     présence    (le     grandes     quantités     (le    sucre, il y a     toutefois    ,lieu de  contrôler soigneusement le pli (lu milieu de  fermentation, étant donné que ce dernier a  la tendance de devenir rapidement acide. Il  ne faudrait pas laisser tomber le pH     au-dessous     de 6,0 et, de préférence, pas     au-dessous    de 6,5.

    Un mode d'opération très     satisfaisant    consiste  à ajouter une base lorsque le pH tombe     au-          dessous    d'environ 6,7     pour    l'élever à envi  ron 7,5. Il y a lieu, toutefois, de ne pas élever  le<B>pi,</B>     au-dessus    d'environ     h,5    et, de préférence,  pas au-dessus de 8,0, étant donné que les  valeurs de<B>pi,</B> supérieures ont la tendance  d'entraver la croissance des     bactérie-.    En effet,  si on élève le pH au-dessus d'environ 9,0, non  seulement la croissance des bactéries sera       entravée,

      mais encore la     streptokinase    déjà  formée sera inactivée     irréversiblement.    La  température du liquide de fermentation est  également. importante et devrait être mainte-      nue entre environ 32 et.     40     C et, de préfé  rence, entre environ 36 et     381,   <B>C.</B>  



  L'opération de fermentation devrait être  poursuivie pendant.     gui    moins 3 heures après  la. première addition de- sucre ou jusqu'à ce  que la concentration en     st.reptokinase    ait  atteint un minimum d'environ 300 unités par       em3    de milieu de fermentation.

   D'une manière  générale, l'opération de fermentation     devrait,     bien entendu, être poursuivie jusqu'à ce que  la concentration en     streptokinase    et en     strepto-          dornase    cesse d'augmenter ou, en d'autres  termes, pendant.     4-8    heures après la. pre  mière addition de sucre, étant donné qu'en  général on est     intéressé    à obtenir la. quantité       maximum        d'enzymes    par     cin3    de milieu de  fermentation.

   On peut. obtenir une économie  de temps en interrompant la fermentation  aussitôt que cette concentration     maximum     d'enzymes est atteinte. Lorsque ce maximum  est     a;teint.,    la. concentration ne diminue cepen  dant que très lentement et, par conséquent,       iine    prolongation de la durée de fermenta  tion n'a pas d'effet     excessivement.    préjudi  ciable. Pour cette raison, il est quelquefois  utile (le poursuivre l'opération de fermenta  tion pendant- la. nuit. ou pendant environ  16 heures au maximum.  



  L'exemple suivant montre comment on  peut réaliser le procédé suivant la présente  invention.  



  <I>Exemple:</I>  A 50 litres d'eau distillée, on ajoute  <B>10,17</B> kg de caséine hydrolysée par des     fer-          nients    (produit marque      N-Z-Amine ).    La  température est. élevée à 100  C et. maintenue       jusqu'à    ce que la solution de caséine     hydro-          Ivsée    soit limpide. On refroidit rapidement à  1.5  C le récipient et on filtre la, solution  refroidie à. travers du papier filtre grossier.  On ajoute une petite quantité de toluène  comme     agent.    de conservation et on     laisse     reposer la. solution à 2  C pendant 4 jours.

    La solution est     ensuite    filtrée pour éliminer  toute matière insoluble.  



  On ajoute les ingrédients suivants à 1a  solution de caséine hydrolysée: 1165,0 g de       KH=PO-1        dissous    dans 8 litres d'eau     distillée;       35,0 g de     cystéine        dissous    dans environ       800        cm3        de        HCl    à     10        %        (la        quantité        mini-          mum    de     HCl    à 10% requise pour obtenir une  solution limpide) ;

   35 g de glycine dissous dans  100     cm3    d'eau distillée; 300 g de dextrose       dissous    dans 2 litres d'eau distillée; 3,5 g       d'uracile        dlss'ous.    dans 1 litre d'eau     distillée;     3,5 g de sulfate     d'adénine        dissous    dans 1 litre  d'eau     distillée;    0,35 g d'acide     nicotiniqu-te    dis  sous     dans    35     cm3    d'eau     distillée;    0,59 g de  pyridoxine dissous dans 59     em3    d'eau distillée;

    'I,0 g de     tryptophane    dissous dans 1 litre  d'eau distillée; 1,75 g de     pantothénate    de cal  cium dissous dans 70     ems    d'eau distillée;  0,875 g     d'hydrochlorure    de     thiamine    dissous  dans 87,5     em3    d'eau distillée; 0,175 g de ribo  flavine dissous dans 1000     em3    d'eau distillée;

    700     em3    d'un mélange de sels mentionné ci  dessus; 55,65     em3    d'acide     thioglycolique    dis  sous dans 100     ems    d'eau distillée; 700 g de       KHC03    dissous dans 500     em3    d'eau distillée.  Le pH du milieu est     ensuite    ajusté à 7,2 et  le milieu stérilisé par     filtration.     



  Le milieu stérilisé est.     ensuite    inoculé avec  11 litres d'une préparation d'inoculation pré  sentant un nombre de bactéries     d'environ     20 billions par     ems.    La fermentation est effec  tuée à 37  C, sans ajustement du pH, aération  ou autre modification, pendant 14 heures.  Ensuite, on ajoute 320     em3    de dextrose à  50 0/0. A     partir    de ce moment, le pH est  ajusté à 7,0 au moyen     d'hydroxyde    de sodium  5,0-n toutes les 15 minutes.

   On note la quan  tité     volumétrique    nécessaire pour la     neutrali-          sation.        On        ajoute        115        %        de        ce        volume        de          solution        de        dextrose    à     50        %        après        chaque     ajustement de pH.

   An bout d'environ 8 heures,  l'augmentation du nombre des bactéries cesse  et la fermentation est terminée. Le milieu de  fermentation contient alors environ 1000 uni  tés de     streptokinase    par     em3.  

Claims (1)

1. REVENDICATION: Procédé de fabrication d'un mélange de streptokinase et de streptodornase par cul ture de bactéries dans un milieu nutritif, caractérisé en ce qu'on utilise une souche de streptocoques hémolytiques productrice de streptokinase et de streptodornase et un mi lieu nutritif contenant de la caséine hydro lysée par des ferments, de la glycine et un agent réducteur sulfhydryliduë. SOUS-REVENDICATIONS. 1.

   Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on utilise un milieu nutritif constitué par une solution aqueuse de 1000 à 10 000 g de caséine hydrolysée par des fer ments pour 150 litres d'eau, contenant, pour 1000 g de ladite caséine hydrolysée, de 1 à 350 g de glycine et de 0,01 à, 0,5 mole dudit agent réducteur. 2. Procédé suivant la revendication et, la sous-revendieation 1, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu nutritif contenant de 100 à. 200 g de glycine pour 1000 g de ladite caséine hydrolysée. 3. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise un milieu nutritif contenant de 0,03 à.

   0,07 mole dudit agent réducteur pour 1000 g de ladite caséine hydrolysée. 4. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce qu'on ajoute au milieu nutritif, avant que la durée de fermentation ait atteint 10 heures, de 1500 à 6000 g d'un sucre pour 1000 g de matière azotée basique dans ledit milieu, qu'on ajoute au moins 8 % dudit sucre avant que la durée de fermentation ait atteint 4 heures et qu'on maintient le pli dudit milieu entre 6,0 et 8,5 pendant la fermentation.

   5. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que le pli est maintenu entre 6.5 ou 8,0. 6. Procédé suivant la revendieation et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que ladite quantité de sucre ajoutée avant que la durée de fermentation ait atteint 4 heures se monte à au moins 160 g de sucre pour 1000 g de matière azotée basique. 7. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que la quantité entière de 1500 à 6000 g de sucre est ajoutée au milieu nutritif avant que la fer mentation commence. 8.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce qu'on ajoute de 2000 à 3000 g de sucre pour l_000 de matière azotée basique. J. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 4, caractérisé en ce que ledit sucre est du dextrose.