CH310824A - Procédé de préparation de liquides stables enzymiques. - Google Patents

Description

  Procédé de préparation de liquides stables enzymiques.    La     présente    invention se rapporte à la  préparation de liquidés stables contenant des  enzymes amylolytiques, protéolytiques ou     pec-          tolytiques,    par culture de micro-organismes du  genre     Bacillus.     



  Il est connu de préparer de tels liquides       enzymiques    en laissant les     micro-organismes     se développer sous forme d'une pellicule super  ficielle dans des plateaux ou autres récipients  ne contenant qu'une couche peu profonde de  milieu nutritif, avec une épaisseur ne dépas  sant pas 2,5 cm.  



  Il est connu également (voir le brevet  U. S. A. N  2530210, déposé le 23 janvier 1947  et délivré le 14 novembre 1950) de réaliser la  production d'enzymes protéolytiques et     amylo-          lytiques    par culture de Bacilles subtilis et de  Bacilles     mesentiricus        dans    des réservoirs pro  fonds, au sein d'un milieu nutritif liquide  contenant une certaine proportion de fines       particules    de     grains    de céréales     concassés,    le  milieu liquide étant alimenté en oxygène ga  zeux et étant agité mécaniquement au cours  du processus.

   La quantité de grains de céréales       concassés        représente        au        moins        4,6        %        en        poids     du     milieu    nutritif.  



  L'expérience a montré que, pour la pro  duction des enzymes par culture des     bactéries     aérobies d'ans     dies    réservoirs profonds, il n'est  pas     nécessaire    d'utiliser des milieux contenant  des particules de     grains        concassés    de céréales ou  autres matières insolubles;

   en revanche, il est       nécessaire    que le milieu contienne dé petites  quantités de fer et de     manganèse.       L'invention a. pour objet un procédé de  préparation de liquides stables contenant des  enzymes     amylolytiques,    protéolytiques ou       pectolytiques,    par culture de micro-organismes  du genre     Bacillus    dans un milieu nutritif  aqueux en cuve profonde. Ce procédé est  caractérisé en ce que le milieu nutritif con  tient un hydrate de carbone et une     protéine     ou une protéine dégradée et de petites quan  tités de fer et de     manganèse.     



  On remarquera, avant de décrire le pro  cédé suivant     l'invention,        que    tous les micro  organismes du     genre        Bacillus    ne     donnent    pas  les résultats désirés et que l'efficacité du pro  cédé dépend     du    choix     d'espèces    convenables,  telles que le     Bacillus        subtilis    (Bacilles     mesen-          tericus)    et plus particulièrement de     souches    à  haut rendement,

   qui peuvent être obtenues par  les moyens connus     d'isolement    à partir de  sources naturelles ou par les     techniques    con  nues de mutation. Les souches de     micro-          organismes        utilisables    pour exécuter le pro  cédé peuvent être isolées de sources diverses,       terre    ou pain, en     particulier    si celui-ci a ten  dance à avoir une consistance onctueuse. Le       micro-organisme    doit être maintenu en culture  pure par les méthodes couramment utilisées à  cet effet.  



  Par ailleurs, toutes     les    souches de l'espèce  Bacilles     subtilis    ne possèdent pas la même  faculté de sécréter     les        enzymes    désirées. Il est  toutefois possible de procéder à un essai     simple     de triage des diverses souches pour     s'assurer     qu'elles conviennent en les     ensemençant    dans      dés milieux convenables (milieu à la caséine  pour déterminer la faculté de sécréter la     pro-          téase    et milieu à l'amidon pour déterminer la  faculté de sécréter l'amylase).  



  Comme milieu de culture, on peut utiliser  des solutions d'extraits de malt, d'extraits de       levure,    de mélasses, d'extraits solubles du  maïs, ou des mélanges de ces substances.  L'extrait de malt fournit une solution relative  ment     riche    en hydrate de carbone, mais pauvre  en protéine ou en protéine dégradée, alors que  c'est l'inverse que l'on constate avec     l'extrait     de levure, et bien qu'il soit possible d'obtenir  des rendements moyens en enzymes désirées à  l'aide de l'une ou l'autre de ces substances  seule, on obtient de meilleurs résultats en uti  lisant un mélange approprié des deux subs  tances.  



  L'extrait de malt est une solution aqueuse  filtrée de malt écrasé, judicieusement concen  trée par évaporation; on le trouve couramment  dans le commerce. L'extrait de levure est une  solution des principes solubles de la levure  obtenue en chauffant la levure à des tempé  ratures de 30 à 50  C, en laissant s'opérer la  liquéfaction et en éliminant la partie insoluble.  



  On peut utiliser un milieu contenant 10 %  en poids d'extrait de malt du commerce addi  tionné de levure en proportion correspondant  à 0,5 % de levure sèche, un milieu contenant  2 % d'extrait de malt du commerce et de la  levure en proportion correspondant à 5 % de  levure sèche, ou un milieu contenant de  l'extrait de malt et de l'extrait de levure en  des proportions comprises entre ces rapports.  On peut, bien entendu, utiliser d'autres mé  langes.  



  Quand le milieu contient une certaine pro  portion de protéine ou de protéine dégradée,  l'hydrate dé carbone peut être ajouté     sous    des  formes autres que l'extrait de malt, par exem  ple de mélasses, de sucre de canne, de sucre  inverti, du glucose, d'amidon, de dextrine ou  de sirops provenant de la conversion de  l'amidon.  



  Pour assurer la présence de petites quan  tités de fer et de manganèse     dans    le milieu,  on peut ajouter des sels de fer et de manga-         nèse    de manière à obtenir une concentration  de 20 parties par million de fer et de 2,5 par  ties par million de manganèse.  



  On a, également. constaté que les suspen  sions aqueuses de son de froment. constituent  des milieux propres à la production d'enzymes  bactériennes. On utilise le son à l'état de sus  pensions cuites, auxquelles on ajoute des phos  phates solubles; ceux-ci se comportent comme  des     agents    nutritifs des bactéries et des agents  stabilisateurs du pH des milieux au cours de la  prolifération.  



  Pour la mise en     oeuvre    du procédé, on  utilise d'ordinaire un réservoir du type géné  ral de ceux utilisés dans les fermentations pro  fondes; ce réservoir est muni d'une double  paroi en vue du chauffage par la. vapeur ou  du refroidissement à l'aide d'eau et d'un dis  positif de réglage à main ou thermostatique,  de façon que la température du milieu de  culture     puisse    être judicieusement maintenue  à la valeur voulue, laquelle., pour obtenir les  résultats les meilleurs, doit être de l'ordre de  35 à 38  C. La. cuve est munie d'un agitateur  du type à palettes monté au centre par une  couronne et exerçant une poussée vers le bas.

    On envoie de l'air dans la cuve par la cou  ronne; cet air peut s'échapper à travers le  milieu de culture et hors de la cuve par un  clapet. d'évacuation qui est réglé de préfé  rence de manière qu'il règne une pression  positive de 0,35 à<B>1,75</B>     kg/cm=    à     l'intérieur    de  la cuve. La vitesse de l'agitation et le débit  de l'air ou de l'oxygène sont en relation mu  tuelle et dépendent en outre d'autres     facteurs     comme la forme de la cuve. Il est préférable  que la vitesse de l'agitateur soit d'environ  300     tours/minute    et que le débit. de l'air,  mesuré à, la température et sous la pression  normales, soit de 18,6 litres pour un litre de  milieu et par heure.

   On peut utiliser au lieu  d'air de l'oxygène stérile ou des mélanges  stériles d'air et d'oxygène: il faut alors un       volume    relativement. moindre de gaz que lors  qu'on utilise de l'air seul. L'utilisation d'un  moindre volume de gaz permet, de remédier  aux difficultés créées par le     moussage,    mais  il n'améliore pas le rendement en     enzyme.         L'application d'un taux d'aération plus faible  ralentit un peu la croissance du micro  organisme, de sorte qu'il faut plus de temps  pour atteindre la même valeur de produc  tion de l'enzyme.  



  Le milieu de composition désirée étant  placé clans la cuve à double paroi, le pH est  réglé de telle sorte que, après stérilisation et  refroidissement, il soit de l'ordre de 6,3 à 6,5.  Il est préférable à cet effet de faire appel à  la soude caustique, mais il est également pos  sible d'utiliser de l'ammoniaque, du bicarbo  nate de sodium ou du carbonate de sodium.  On peut également utiliser le carbonate de  calcium, la présence de calcium ayant une  action stabilisante sur les     enzymes    produites,  mais il est     habituellement        nécessaire    d'utiliser  en outre une des bases que l'on vient d'indi  quer pour augmenter le pH.  



  On chauffe alors le milieu à l'aide de va  peur, que l'on envoie dans la double paroi ou  le serpentin de la cuve. Si le milieu contient  de l'amidon, il est bon d'ajouter un peu  d'amylase, de façon que, quand l'amidon se  gélifie, il soit liquéfié par     l'enzyme    présente  et converti en hydrate de carbone soluble.  



  On     stérilise    le milieu en le chauffant sous       pression    de manière à le débarrasser de tous  les micro-organismes vivants; cette opération  s'effectue en chauffant à la température de  12l  C, sous la pression atmosphérique nor  male pendant dix minutes. On refroidit alors  le milieu vers 40  C, puis on l'ensemence à  l'aide d'une culture du micro-organisme désiré.  



  Pour obtenir un inoculum, on prépare une  sous-culture dans des ballons contenant des  milieux semblables à ceux qui ont été décrits  ci-dessus pour la préparation industrielle des  enzymes. On introduit dans les ballons une  quantité de milieu suffisante pour obtenir  une profondeur d'environ 2,5 cm, et on     laisse     incuber pendant trois à quatre jours à 35  C.  Il est également possible d'opérer avec une  plus grande profondeur de liquide d'ans     les     ballons et d'y agiter le liquide après ense  mencement en secouant doucement, tout en  maintenant la température à 35  C.

   Cette  agitation aère le     milieu    et permet la crois-    sauce des micro-organismes dans toute la pro  fondeur du liquide au lieu d'être limitée à une  couche     superficielle,    comme ce serait le cas si  l'on ne secouait pas le ballon. La quantité  d'inoculum utilisée n'est pas critique, et on a  constaté que l'on pouvait utiliser une partie  d'inoculum pour ensemencer 500 parties ou  plus de milieu de culture.  



  On laisse alors fermenter à une tempéra  ture comprise entre 28 et 38  C jusqu'à ce que  la quantité désirée d'enzyme ait été produite.  Il     est    préférable de     laisser    fermenter à 35  C,  car des températures plus élevées ont ten  dance à donner des rendements en enzymes  plus faibles, les températures plus faibles ten  dant de leur côté à prolonger la période de  culture nécessaire.  



  Il est nécessaire parfois de refroidir de  temps en temps le milieu de fermentation en  envoyant de l'eau dans le serpentin ou la  double paroi de la cuve, car la chaleur pro  duite par le micro-organisme peut provoquer  une élévation importante de la température:  On envoie de l'air stérile dans la     cuve,-          comme        indiqué,    et on ajoute également, si  nécessaire, un agent.     antimousse.    Cet agent est  ajouté ordinairement au moment de l'inocula  tion, mais des additions ultérieures peuvent  être     ensuite    effectuées.

   Il est naturellement  essentiel que la. \solution ou la     suspension    de  l'agent     antimousse    soit exempte de     micro-          organismes    vivants et qu'elle soit ajoutée dans  des conditions aseptiques, car la présence de  micro-organismes indésirables abaisserait nota  blement le rendement en enzyme obtenu.

       Dés     recherches ont montré qu'il était possible d'uti  liser, à titre d'agent     antimousse,    le     polydimé-          thylsiloxane,    sous forme d'une     suspension-          d'une    partie de     polydiméthylsiloxane    dans  neuf parties de paraffine liquide. Il est égale  ment possible d'utiliser de l'alcool     cétylique     ou de     1'octadécanol.     



  Après ensemencement du milieu, on     laisse     fermenter pendant environ 20 à 30     heures;     on constate que le rendement en     protéase    est  alors maximum et si c'est là     l'enzyme    voulue,  on vide la cuve quand on a atteint ce stade.  Si, d'autre part, on désire obtenir de l'amy-      lase, on laisse la fermentation se poursuivre  pendant 60 heures au total; on constate alors  une forte diminution de la quantité de     pro-          téase    et une augmentation de la quantité  d'amylase.

   On vide la cuve à ce stade, mais il  peut être avantageux dans certains cas de  disposer de solutions d'une activité     amylolyti-          que    plus grande. C'est ainsi que si l'on désire  ultérieurement     sécher    par pulvérisation ou  concentrer d'une autre manière la préparation  étendue d'amylase, il est avantageux que la  teneur en amylase soit la plus élevée possible  au départ. On peut y parvenir en ajoutant  de     nouvelles    quantités de solution stérile  d'hydrate, de carbone au milieu de fermenta  tion. On peut ainsi ajouter, soixante heures  après le début de la fermentation, une nou  velle quantité d'hydrate de carbone de 1 kg  par hectolitre de milieu, en ajoutant égale  ment de l'antimousse si nécessaire.

   On laisse  la fermentation se poursuivre pendant encore  24 heures et on renouvelle l'addition d'hydrate  de carbone. On arrête -la fermentation  24 heures plus tard. On constate que ces addi  tions     successives    de sucres peuvent entraîner  une augmentation du rendement en amylase  de 50 à 100 % par rapport au rendement que  l'on obtient quand on arrête le processus au  bout de soixante heures. L'addition de nou  velles quantités d'hydrates de carbone est  également favorable pour la     suppression    des  mousses, car elle tend à empêcher le pH de  devenir trop élevé.  



  La cuve ayant été vidée, la solution d'en  zyme (protéase, amylase ou un mélange des  deux) est débarrassée des micro-organismes  aussi rapidement que possible par filtration,  centrifugation ou les deux. Pour lui conférer  une plus grande stabilité, on peut l'addition  ner d'un agent stabilisant, par exemple un  antiseptique tel que le phénol à raison de  0,6 0 % ou le chlorure de sodium à raison de  10 à 15 %.  



  Les exemples suivants illustrent l'invention.    Exemple 1:  Dans un autoclave d'une capacité de  450 litres, on place 22,5 kg     d'extrait    de malt         (sirop)    et 5,5 kg d'extrait de levure autolyse  avec environ 114 litres d'eau. On mélange soi  gneusement la solution et on règle le pH à 7,3  au moyen de soude caustique, puis on étend  l'ensemble die la solution     jusqu'à    230 litres  environ. On procède également à une addition  de     sulfate    ferreux et de sulfate de manganèse,       respectivement    en une proportion de 50 par  ties par million et de 10 parties par million.  On ferme alors l'autoclave et on en stérilise  le contenu sous pression, comme indiqué.  



  On refroidit le milieu nutritif à 35  C et  on ajoute environ 570     cm3    d'une culture de       Bacillus        subtilis    en même temps que l'agent       antimousse    choisi. On fait passer de l'air dans  le milieu avec un débit de 12,5 litres par litre  et par heure, et au bout de 24 à 36 heures,  quand le pH a atteint environ 7, le rendement  en     protéase    est maximum.

   On arrête alors la  fermentation en enlevant. la     masse    des micro  organismes du liquide par filtration et on       stabilise    par réglage du     pH    à 7, si     nécessaire,     et addition éventuelle de 500 parties par mil  lion de chlorure de calcium anhydre dissous  dans une petite quantité d'eau et 10 à     151/o     de chlorure de sodium. De la. solution stable       ,obtenue,    on peut précipiter l'enzyme ou on  peut sécher cette solution par un moyen connu.  <I>Exemple 2:</I>  On utilise 22 litres de milieu contenant  12 kg d'extrait, de malt et 27 kg de levure       autolysée    et filtrée.

   On règle le pH à 7 par  addition de soude caustique et. l'on procède       aux    additions de sulfate ferreux et. de sulfate  de manganèse comme dans     l'exemple    1. On  effectue la, fermentation comme dans l'exem  ple 1, mais pendant une     durée    de 50 à  60 heures; le rendement. en amylase est     alors     maximum et. le pH du milieu est, de 7,5 envi  ron.  



       Exemple   <I>3:</I>  On introduit 225 litres d'eau et 2,25 kg  de phosphate     disodique    hydraté et 22,5 kg de  son de froment dans une cuve de fermenta  tion de     dimensions    convenables. On agite soi  gneusement le mélange, on stérilise le milieu  qui contient également de petites quantités de      fer et de manganèse, on le refroidit et on       l'ensemence    comme décrit     ci-dessus,    puis ou  laisse la, fermentation se poursuivre avec  aération pendant 60 heures. Le rendement en  amylase est alors maximum et la solution  peut être filtrée et traitée comme dans l'exem  ple 1.  



  Exemple 4:  Le milieu utilisé est constitué par 11,25 kg  d'extrait de malt et 22,5 kg d'extrait de levure  autolysée, filtré et étendu jusqu'à 225 litres à  un pH de 7; il contient aussi de petites quan  tités de fer et de manganèse. On laisse la  fermentation se     poursuivre    comme dans  l'exemple 2, mais, au bout de 60 heures, on  procède à une addition de 2,25 kg d'extrait  de malt stérile convenablement étendu d'eau  en opérant dans des conditions aseptiques. On  renouvelle cette addition 24 heures plus tard  avec la même quantité d'extrait de malt et,  24 heures après, on filtre la solution et on la  stabilise comme décrit dans l'exemple 1. La  solution peut     être    séchée par pulvérisation si  désiré.  



  Exemple 5:  Le milieu est exactement celui de l'exem  ple 3, mais on peut ajouter de     l'extrait    de  malt, de  ou du glucose stériles au  bout de 60 et de 84 heures de fermentation,  comme indiqué dans l'exemple 4. On obtient  un rendement élevé en amylase, et la solution  peut être concentrée et séchée sous vide à la  température ambiante.  



  Les solutions d'enzymes préparées confor  mément à l'invention sont stables pour une  année ou plus long, et si la solution est séchée,  la poudre est stable pour plusieurs années.  



  Les enzy mes amylolytiques peuvent être  utilisés pour le désencollage de textiles encol  lés avec de l'amidon et pour la conversion des  amidons en dextrines et sucres dans la prépa  ration d'adhésifs, de sirops et de colles et  d'apprêts textiles.  



  Les enzymes protéolytiques peuvent être  utilisés pour le désencollage de textiles encol  lés avec de la gélatine ou d'autres matières  protéiniques et pour le tannage, c'est-à-dire  pour enlever les cheveux, pour la récupéra-    tion de la laine des peaux et pour la liquéfac  tion de colles et d'autres matières protéiniques.  



  Les enzymes     pectolytiques    peuvent être       utilisés    dans le traitement de jus de     fruits     pour la     destruction    de la pectine, en vue  d'une amélioration de la filtration et de la  clarification.

Claims (1)

1. REVENDICATION: Procédé de préparation de liquides stables contenant des enzymes amylolytiques, protéo lytiques ou pectolytiques, par culture de micro organismes du genre Bacillus dans un milieu nutritif aqueux en cuve profonde, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient un hydrate de carbone et une protéine ou suie protéine dégradée et de petites quantités de fer et de manganèse. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant un extrait de malt et un extrait de levure. 2.

   Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, une mélasse. 3. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mé langeant à un produit comprenant une pro téine ou une protéine dégradée, dit sucre de canne. 4. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, du sucre inverti. 5.

   Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, du glucose. 6. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, de l'amidon. 7. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, de la dextrine. 8.

   Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé en mélan geant à un produit comprenant une protéine ou une protéine dégradée, un sirop obtenu à partir d'amidon converti. 9. Procédé suivant la revendication, dans lequel le milieu nutritif est préparé à partir d'une suspension cuite de son de froment additionnée de phosphates solubles. 10. Procédé suivant la revendication, dans lequel on envoie dans la cuve de traitement. un gaz stérile comprenant de l'oxygène et on entretient une agitation constante au cours de la culture. 11.

   Procédé suivant la. revendication, dans lequel: le milieu est maintenu à une tempé rature comprise entre 28 et 38 C.