Procédé de préparation de stéroïdes 11(3-hydroxylés L'invention est relative à un procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(i-hydroxylé de ce stéroïde à l'aide de cultures choisies de microorganisrnes. Une réaction particulièrement utile, qui peut être effectuée par ce procédé, est la conver sion du composé S de Reichstein (17a-hydroxy- 11-désoxy-corticostérone) en composé F de Kendall (17a-hydroxy-corticostérone).
La préparation de stéroïdes biologiquement actifs, tels que la cortisone et le composé F, se fait avec de nombreuses difficultés sérieuses.- Un des problèmes les plus difficiles est l'intro duction d'atomes d'oxygène en des positions essentielles du noyau stéroïde, surtout en po sition 11 de ce noyau. Le composé S peut être obtenu par des voies synthétiques connues, à partir de divers stéroïdes de départ, d'origine naturelle et relativement économiques, tels que des stéroïdes du type végétal.
Par contre, le composé F est beaucoup plus difficile à obtenir et est un composé de grande valeur, qui est particulièrement utile pour le traitement de l'arthritisme rhumatismal et de certains états du corps humain. Tout procédé par lequel le composé S peut être converti en composé F avec un bon rendement et sans dépenses exces- sives a une valeur importante pour l'industrie pharmaceutique et pour le public en général.
Des méthodes ont déjà été proposées pour convertir le composé S en composé F au moyen de micro-organismes tout différents de ceux décrits ci-dessous pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet E. U.
A., no 2602769 on a décrit l'usage de Cunninghamella blakesleena (de l'ordre des Mucorales) et dans un article paru dans le Journal of the American Chemical Society (Vol. 77, p. 2381, 1952) on décrit un procédé dans lequel on utilise le Streptomyces fradiae. Un grand nombre de microorgansmes ont été essayés en ce qui concerne leur efficacité pour convertir le composé S en composé F.
La plu part des microorganismes ne donnent aucune réaction relative à la 11(3-hydroxylation. Un nombre considérable de cultures de microorga nismes, de l'ordre des Mucorales, ont été es sayées pour la même réaction mais quelques- unes seulement de celles-ci permettaient d'ob tenir un degré réduit de conversion.
Contrai rement aux méthodes publiées jusqu'ici et aux pauvres résultats obtenus avec les microorga nismes étudiés jusqu'ici, les microorganismes du genre Curvularia ont donné des résultats très favorables en ce qu'ils permettent de pré- parer des produits, tels que le composé F, avec des rendements atteignant 40 % ou davantage. Par ailleurs, on peut effectuer les réactions dans des conditions telles que les produits puissent être isolés assez aisément avec un de gré de pureté élevé.
Ceci permet, pour la pre mière fois, la préparation pratique, sur une grande échelle et par des méthodes biochimi ques, de substances telles que le composé F.
On a découvert qu'en mettant en contact sous des conditions d'aérobiose un composé stéroïde non substitué en position 11 avec des enzymes oxydantes produites par certains mi croorganismes choisis, on peut obtenir la 11(3- hydroxylation sélective de ces composés sté roïdes. Les organismes en question sont des souches oxygénantes de champignons du genre Curvularia, ce genre appartenant à l'ordre des Moniliales de la classe des Fungi imperfecti. Ces indications sont basées sur la classification de Saccardo, P.
A., Sylloge Fungorum, Vol. 8. Une valeur particulière ont les souches des es pèces Curvularia falcata, C. brachyspora, C. lunata, C. pallescens et d'autres espèces de ce genre. D'autres microorganismes du genre Cur- vularia peuvent être choisis pour effectuer le procédé, faisant l'objet de l'invention, en fai sant des essais simples qui sont décrits en dé tail plus loin.
On peut se procurer plusieurs de ces organismes dans les collections de culture publiques et d'autres peuvent être isolés à partir de matières naturelles, telles que du ter reau, par des méthodes normalisées bien con nues par les mycologues.
Comme décrit plus haut, on peut se ser vir du procédé faisant l'objet de l'invention pour convertir le composé S en composé F.
Toutefois, le procédé peut également être utilisé pour la 11(3-hydroxylation d'une variété d'autres stéroïdes non substitués en position 11 du noyau. Diverses chaînes latérales peuvent être présentes en position 17 du noyau et des groupements céto ou hydroxyle peuvent se trouver en position 3 du noyau. Les stéroïdes, utilisés comme supports pour la réaction, peu vent également comporter des liaisons doubles carbone-carbone en divers points du noyau, par exemple aux positions 3, 4 ou 5, 6.
Il est à noter que le rendement en produit hydroxylé varie, jusqu'à un certain degré, avec la nature du stéroïde utilisé comme matière initiale, avec la souche particulière de Curvularia utilisée et avec les conditions adoptées pour la réaction, c'est-à-dire la température, la durée, le<I>pH,</I> le milieu nutritif, le moment auquel le composé est ajouté au microorganisme, etc.
Par ailleurs un microorganisme oxygénant donné, appar tenant à l'espèce préférée, peut avoir des ef fets très variables sur des stéroïdes différents, c'est-à-dire qu'un bon rendement en dérivé 11(3-hydroxylé correspondant peut être obtenu quand on se sert d'une souche oxygénante don née et d'un stéroïde déterminé, alors qu'un autre stéroïde utilisé dans des conditions qui, à part cela, sont absolument identiques, se transforme en composé désiré avec un rendement qui est seulement modéré ou fai ble.
La présence d'un groupement hydroxyle en position 21 d'un stéroïde du type prégnène peut être particulièrement utile pour fournir un bon rendement en composé 11(3-hydroxy. Comme les stéroïdes du type cortical possè dent un tel groupement hydroxyle, le procédé est particulièrement utile pour préparer les composés 11(3-hydroxylés de cette série.
Parmi les produits qui peuvent être convertis en pro duits 11(3-hydroxylés correspondants on peut citer le composé S et la 11-désoxy-corticosté- rone. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour déterminer la quantité des produits ob tenus par ces procédés. Par exemple, si l'on se sert d'un stéroïde avec une chaine latérale ap propriée, la proportion du produit obtenu peut être évaluée en déterminant l'effet sur des sou ris adrénalectomisées ou en se basant sur le nombre d'éosinophiles qui se trouvent dans le sang des animaux ayant servi aux essais.
Par ailleurs, les produits purs, obtenus par la réac tion d'hydroxylation, peuvent être isolés com me décrit ci-dessous.
L'efficacité d'un microorganisme particu lier pour le procédé faisant l'objet de l'inven tion, peut être déterminée en cultivant le mi- coorganisme dans un milieu nutritif approprié contenant des hydrates de carbone, des sels, des sources d'azote organique, etc. Le stéroïde, à l'état solide ou en solution dans un solvant approprié tel que l'acétone ou l'éthanol, est ajouté, dans des conditions stériles, .au micro organisme cultivé et le mélange est agité et aéré pour provoquer la croissance du micro organisme et l'oxydation du stéroïde. Le sté roïde peut être ajouté quand le milieu est en semencé, dans des conditions stériles, avec une culture du microorganisme ou après que la croissance de l'organisme a commencé.
Dans certains cas il peut être bon d'ajouter le sté roïde après que la croissance du microorga nisme a commencé dans le milieu nutritif et sous des conditions d'aérobiose. Ceci convient tout particulièrement quand, pendant les pha ses initiales de la croissance du microorga nisme, il existe une tendance à la formation de sous-produits non voulus à partir du sté roïde de départ. L'acétate ou un autre ester du stéroïde peut être utilisé à la place de l'al cool lui-même bien que ceci puisse parfois être la cause d'une diminution appréciable du ren dement en produit hydroxylé.
Suivant une variante, on peut utiliser des préparations d'enzymes obtenues à partir de la culture d'un organisme approprié du genre Curvularia pour la mise en oeuvre du procédé. Une autre méthode, très efficace, consiste à cultiver le microorganisme sur un milieu nu tritif approprié dans des conditions d'aérobiose et en l'absence du stéroïde. La culture mycé- lienne peut ensuite être séparée par filtration du bouillon et peut, si on le désire, être lavée à l'eau distillée. Le mycélium est alors mis en suspension dans de l'eau distillée contenant le stéroïde de départ.
L'agitation et l'aération du mélange sont continuées pendant une période comprise entre environ 12 et 48 heures après quoi on récupère les produits résultant de la réaction. Ce procédé présente l'avantage que le stéroïde peut être aisément récupéré car les diverses matières nutritives, utilisées à l'origine, pour obtenir la croissance du microorganisme sont alors absentes ainsi que les diverses matiè res excrétées par les organismes, au cours de leur croissance, pendant la période initiale.
Avec certaines souches du genre Curvularia on obtient, par cette méthode, des rendements totaux, encore meilleurs en produits hydroxy- lés que dans le cas où le stéroïde est ajouté, au début ou à une période intermédiaire détermi née, à l'ensemble du bouillon de fermentation. D'autres méthodes, bien connues des chimistes qui s'occupent des enzymes, peuvent être utili sées pour la mise en oeuvre du procédé d'oxy dation en question. La proportion des produits et la vitesse d'oxydation ainsi que la nature des sous-produits formés peuvent varier suivant que l'on se sert de l'ensemble du bouillon de fermentation ou du mycélium lavé et isolé.
En général, une concentration qui ne dé passe pas 1 à 2 % en poids de produit de dé part est adoptée pour la mise en oeuvre du pro cédé, mais parfois on peut juger qu'il est plus favorable d'utiliser d'autres concentrations. Comme la solubilité de la matière initiale dans l'eau est très limitée, un excès de la matière peut être lentement converti en produit hy- droxylé. Toutefois, le degré de substitution du stéroïde, quand il est ajouté au système d'oxy dation, c'est-à-dire au microorganisme en cours de croissance ou aux enzymes,, ne paraît pas affecter fortement le rendement et la nature des produits dans des conditions qui, à part cela, restent identiques.
Si l'on ajoute une so lution du stéroïde dans un solvant miscible à l'eau au système de fermentation aqueux, le stéroïde est généralement précipité à l'état fi nement divisé en présence d'un grand excès d'eau. Ceci ne paraît pas améliorer d'une ma nière appréciable la vitesse de la réaction com parativement à celle obtenue par l'addition de cristaux secs et relativement grands du sté roïde.
Quand le traitement d'oxydation est termi né, le produit peut être récupéré hors du mé lange par extraction à l'aide d'un solvant ap proprié et non miscible à l'eau. Des hydro carbures inférieurs chlorés, des cétones et des alcools peuvent être utilisés à cet effet. Ceux-ci comprennent le chloroforme, le chlorure de méthylène, le trichloroéthane, le dichlorure d'éthylène, etc. L'usage du dichlorure d'éthy lène chaud, c'est-à-dire à une température comprise entre environ 40o et environ 800, convient tout particulièrement à l'extraction des stéroïdes.
L'extrait du produit oxydé et des matières initiales n'ayant pas réagi peuvent être concentrés jusqu'à un faible volume ou jusqu'à siccité pour obtenir un produit solide. La purification du produit peut se faire de dif férentes manières. La plus efficace est là sépa ration, par chromatographie, du produit d'avec les matières initiales et d'avec d'autres pro duits, tels que des substances plus fortement oxydées, qui peuvent être formés au cours de la réaction. Des adsorbants, tels que du gel de silice ou d'autres matières adsorbantes ap propriées, sont particulièrement utiles à cet ef fet.
On a découvert qu'une colonne de gel de silice traité avec un alcool inférieur, plus spé cialement l'éthanol, est particulièrement utile pour la séparation des stéroïdes.
Les stéroïdes bruts peuvent être amenés sur des colonnes d'adsorbants, tels que du gel de silice, en solution concentrée dans du chloro forme ou du chlorure de méthylène. La colonne peut ensuite être lavée avec des quantités addi tionnelles du solvant pour enlever certaines impuretés telles que des graisses et des pig ments. Le mélange adsorbé est ensuite séparé par l'addition graduelle d'un mélange du sol vant et d'un faible pourcentage, par exemple de 1 à 5 0/0, d'un alcool inférieur (méthanol, éthanol, etc.). Les matières peuvent être sé parées et les composés séparés peuvent être récupérés graduellement hors de la colonne en utilisant des mélanges de solvants qui ont une polarité graduellement croissante.
Par exemple un mélange de chlorure de méthylène et une quantité réduite mais graduellement croissante d'éthanol est très utile.
Des fractions de la matière récupérée hors des colonnes chromatographiques peuvent être examinées, en ce qui concerne la nature du produit, en soumettant des petites portions des solutions à des analyses sur papier chromato- graphique. Des méthodes qui sont particuliè rement utiles pour effectuer ce genre de sépa ration et d'analyse sont décrites en détail dans le brevet E. U. A. no 2602769 et dans un arti cle de Shull et autres publié dans les Archives of Biochemistry, Vol. 37 p. 186 (1952). Ces méthodes sont également très utiles pour es- Bayer des nouvelles souches de microorganis mes en vue de déterminer leur efficacité pour le procédé faisant l'objet de l'invention.
La fermentation peut se faire sur une petite échel le, avec le stéroïde, par exemple le composé S ou un dérivé approprié du composé S comme support et l'extrait total du mélange de fer mentation peut être concentré et soumis à l'essai au papier chromatographique. En utili sant des échantillons connus du composé S, du composé F ou d'autres produits apparentés, à titre de comparaison, il est possible de dé terminer si le microorganisme choisi convient au procédé en question.
Des chromatogrammes décroissants sur pa pier, obtenus à l'aide de papier traité avec une solution à 35 % de glycol propylénique et dé- veloppé avec un mélange de 78 volumes de to luène et 22 volumes de dioxane, peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide de diverses souches des microorganismes préférés.
Une telle séparation peut être terminée en une pé riode aussi courte que trois heures et le chro- matogramme sur papier, après avoir été séché, peut être examiné à la lumière ultraviolette pour déterminer la position des diverses ma tières, telles que les composés S et F, par leur fluorescence. Les zones dans lesquelles les di verses substances se présentent, peuvent être marquées et découpées dans la feuille ou bande de papier. La matière peut ensuite être récu pérée à l'aide d'un solvant, tel que l'éthanol, et obtenue sous la forme d'une matière solide et pratiquement pure par évaporation. Une ana lyse quantitative d'un mélange de ce genre peut être faite de cette manière.
La quantité des pro duits isolés peut être déterminée, par exemple, en mesurant le spectre d'absorption dans l'ul tra-violet de solutions de ces matières. Parti culièrement utiles sont les caractéristiques d'absorption de ces composés quand ils sont dissous dans l'acide sulfurique concentré.
Après séparation des produits de réaction par chromatographie à l'aide d'une colonne, les fractions désirées peuvent être mélangées et concentrées jusqu'à un petit volume. Le pro duit peut ensuite être cristallisé dans un solvant approprié, tel que l'acétate d'éthyle. Un pro- duit, préparé par l'application du procédé en question, peut être comparé à des échantillons d'un composé F authentique et on a constaté qu'ils sont identiques à tous les points de vue. De la corticostérone, préparée par le procédé selon l'invention, a également été comparée à un échantillon normalisé et on a constaté qu'elle est identique à celui-ci.
Les exemples ci-dessous illustrent l'inven tion.
<I>Exemple 1</I> Un microorganisme provenant de la col lection du Quartermaster Corps à Philadel phie et désigné là-bas comme Curvularia fal- cata QM <I>120 h,</I> a été cultivé sur un milieu de culture à base d'agar. La titulaire ayant toute fois établi que cet organisme appartient à l'es pèce C. lunata plutôt qu'à l'espèce C.
falcata, elle le désignera ci-après par Curvularia lunata (QM <I>120 h.).</I> Une culture vivante de cet or ganisme a été déposée à la Fermentation Divi sion of thé Northern Régional Research Labo- ratory à Peoria (Illinois) et y a été enregistrée sous la référence NRRL-2380. L'organisme est séparé, par rinçage,
de la souche d'agar dans des conditions stériles et cultivé dans un mi lieu stérile ayant la composition suivante
EMI0005.0022
extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 5 <SEP> 0/0
<tb> saccharose <SEP> 1
<tb> nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,1 Eau distillée réglée à un<I>pH</I> de 7,0 avec de la potasse caustique, reste.
Des portions de cent millilitres de ce milieu sont versées dans des flacons de trois cents mil lilitres. A chaque flacon on ajoute 50 mg de composé S dissous dans un petit volume d'acé tone. Pendant ces opérations, le mélange de fermentation est maintenu sous des conditions stériles. Le mélange est ensuite agité pendant une période de sept jours à une température d'environ 28,). Les contenus des flacons sont mélangés et le mélange est extrait avec plu sieurs portions de bichlorure d'éthylène en se servant chaque fois d'un cinquième du volume de la phase aqueuse.
Le mélange des extraits au bichlorure d'éthylène est séché sur du sul fate de sodium anhydre et concentré sous vide, jusqu'à un volume de 1 à 2 ml ; un échantillon de cette solution est chromatographié sur pa pier en se servant d'un premier système de sol- vants contenant 50 % en volume d'éther et 50 % en volume
d'hexane et d'un second sys- tème de solvants formé par un mélange eau- benzène. -On a constaté que le produit obte nu contient le composé F en comparant avec des chromatogrammes sur papier obtenus avec un échantillon d'un composé F authentique, utilisé comme repère.
On a également obtenu des indications au sujet de la présence de produits plus fortement oxydés.
Le concentrai au dichlorure d'éthylène est placé sur une colonne chromatographique cons tituée par du gel de silice mélangé avec un petit volume d'éthanol (un ml de solvant par g de gel de silice). La colonne est développée à l'aide d'un mélange de 97 volumes de chlo rure de méthylène et 3 volumes d'éthanol à 95 0/0. Le produit fourni par la colonne est re cueilli sous la forme de petites fractions, ayant un même volume, qui sont examinées périodi quement à l'aide de papier chromatographique afin de séparer les fractions contenant le pro duit désiré.
Toutes ces fractions sont combinées et concentrées sous vide jusqu'à siccité pour obtenir le produit solide. On a constaté que ce produit est le composé F en le comparant à un échantillon connu de la même matière. <I>Exemple 2</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> est cultivée dans des flacons contenant le même milieu que celui décrit dans l'exem ple 1.
Cent ml de cet inoculum sont ajoutés à deux litres du milieu suivant
EMI0005.0067
Saccharose <SEP> 1 <SEP> 0/0
<tb> Tryptone <SEP> Difco <SEP> 1
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,2
<tb> Biphosphate <SEP> acide <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,1
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,05
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 0,05
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,001 Le<I>pH</I> de ce mélange est rendu égal à 7 avec de l'acide sulfurique et 0,25 fl/o de carbonate de calcium sont ajoutés avant que le mélange soit stérilisé.
Le milieu inoculé est aéré avec un débit d'environ 0,5 à 1 volume d'air par volume de solution et par minute à 27-280 pendant 24 heures. Pendant cette période, le mélange est agité à une vitesse d'environ 1700 Vin. Un demi-gramme du composé S, non estérifié, est dissous dans 20 ml d'éthanol à 95 0/0. La solution est ajoutée au mélange de fermentation dans des conditions stériles. La culture est ensuite poursuivie pendant en core 24 heures, exactement dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut.
La totalité du mélange de fermentation est sortie de la cuve de fermentation. Le mélange est extrait deux fois avec un volume égal de bichlorure d'éthylène à 700. Les extraits sont mélangés et évaporés jusqu'à siccité. Les ma tières solides sèches sont dissoutes dans un pe tit volume de chlorure de méthylène et la so lution est amenée sur une colonne de gel de silice. Cette colonne a été préparée préalable ment en traitant chaque gramme de gel de silice avec 1 ml d'éthanol à 95 0/0.
Ce mé lange est mis en suspension dans du chlorure de méthylène et est versé dans une colonne chromatographique. Après que le stéroïde brut a été introduit dans la colonne il est lavé avec plusieurs portions de chlorure de méthylène, pour enlever les graisses et les pigments. La colonne est ensuite développée en y ajoutant un mélange de 97 volumes de chlorure de méthy lène et 3 volumes d'éthanol. Le produit récu péré est subdivisé en une série de petites frac tions. Des portions de celles-ci sont analysées par chromatographie sur papier et les fractions contenant le même composé sont combinées. On a constaté que la matière qui sort en pre mier lieu de la colonne est le composé S récu péré. Cette matière peut être isolée et utilisée à nouveau.
La matière qui quitte la colonne en deuxième lieu est un stéroïde non identifié. La matière quittant la colonne en troisième lieu est récupérée et on constate qu'il s'agit du com posé F. En séparant le solvant des fractions mélangées contenant le composé F on obtient un rendement dépassant 35 % d'un produit sec qui peut être facilement purifié davantage.
<I>Exemple 3:</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> comme celle utilisée pour l'exemple 1, est cultivée sur le même milieu que celui dé crit dans l'exemple 1 sous des conditions d'aé robiose. Le mycélium fourni par deux litres de ce mélange et obtenu après une croissance de 22 heures est filtré, il est lavé avec un pe tit volume d'eau distillée et est ensuite mis en suspension dans deux litres d'eau distillée.
On ajoute un demi-gramme du composé S à ce mélange. Cette préparation est agitée et aérée avec un débit d'un demi volume d'air par volume de mélange et par minute pendant 16 heures. Le mélange est ensuite extrait trois fois avec un demi volume de chloroforme. Le mélange des extraits au chloroforme est con centré jusqu'à un petit volume et le mélange des stéroïdes est séparé par chromatographie sur une colonne de gel de silice.
On obtient un rendement d'environ 35 % en composé F pur. En outre, environ 10 % du composé S, utilisé comme matière initiale, sont récupérés à l'état pur.
<I>Exemple 4:</I> Une culture, fournie par les Philadelphia Laboratories du Quartermaster Corps sous la désignation Curvularia sp QM <I>371d,</I> est cul tivée dans des flacons sous des conditions d'aérobiose sur le milieu décrit dans l'exem ple 1.
Cet organisme a par la suite été défini tivement identifié comme appartenant à l'es pèce C. pallescens et sera donc désigné ci- après comme étant le Curvularia pallescens (QM 371d). Une culture vivante de cet orga nisme a été déposée à la Fermentation Division of thé Northern Régional Research Laboratory à Peoria (Illinois) et y a été enregistrée sous le no NRRL - 2381.
Après une période de crois sance de 24 heures, on utilise 100 ml de ce mélange pour ensemencer deux litres du milieu décrit dans l'exemple 2. Après que le mélange de deux litres a continué à croître sous des conditions d'aérobiose pendant 24 heures, on ajoute un demi-gramme du composé S au mé lange de fermentation dans des conditions sté riles. Le mélange est agité à 28o pendant en core 20 heures en étant aéré et remué dans toute sa masse. Le mélange est sorti du réci pient dans lequel la fermentation a eu lieu et est extrait trois fois, avec un demi volume de chloroforme chaque fois. Les extraits sont mélangés et concentrés jusqu'à un petit vo lume. Le mélange est alors placé sur une co lonne de gel de silice qui a été préparée de la manière indiquée plus haut.
La colonne de gel de silice est lavée avec du chlorure de mé thylène et est ensuite développée avec une so lution d'éthanol dans du chlorure de méthy lène. On récupère d'abord un peu de matière initiale (composé S) puis le produit 11(3-hy- droxyte, c'est-à-dire le composé F. Le produit isolé est purifié et son point de fusion, ainsi que ses autres propriétés physiques, sont comparés à ceux d'un échantillon synthétique pur. On constate que ces matières sont identiques.
Par ailleurs, le composé F préparé de cette ma nière est essayé en ce qui concerne son activité biologique en déterminant la teneur en glyco- gène du foie de souris adrénalectomisées. On constate qu'il est très efficace, ce qui est une autre preuve de la nature du produit. <I>Exemple S</I> Une culture de Curvularia lunata (QM <I>120 h)</I> est cultivée comme décrit dans l'exem ple 1 excepté que l'on utilise la 11-désoxy-cor- ticostérone à la place du composé S.
Quand la fermentation est terminée, le produit brut est extrait à l'aide de méthyl-isobutyl-cétone et le solvant est ensuite chassé sous vide. Le pro duit résiduel est essayé en ce qui concerne son activité biologique, en déterminant la teneur en glycogène du foie de souris adrénalecto- misées et le résultat positif montre l'introduc tion d'un groupe 11(3-hydroxyle dans le sté roïde. La purification par chromatographie sur colonne, comme décrite plus haut, donne avec un rendement approximatif de 28 % un composé cristallisé ; on constate qu'il s'agit de la corticostérone par ses constantes physi ques.