JPH02119786A - Ｌ―カルニチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、高脂血症や心臓疾患の予防および治療に有用
なし一力ルニチンの製造法に関するものである。

［従来の技術］ Ｌ−カルニチンは、活性化した長鎖の遊離脂肪酸をミト
コンドリア膜から通過さぜる担体としての働きを有する
物質でヒタミンＢＴとも呼ばれている。

天然物中に存在するカルニチンは左旋性のＬカルニチン
であり、Ｄ−カルニチンは拮抗阻害を示す。

従来、ラセミ体のカルニチンか食欲昂進剤などに用いら
れてきたか、ラセミ体のカルニチンを長期間投与した場
合、心筋に対する副作用か認められることなどから、心
血管系疾患等の治療学的使用には、Ｌ−カルニチンのみ
を使用する方か効果的であることか明らかとなった。

カルニチンか化学合成法によって製造されることは、既
に知られているか化学合成法によると、ラセミ体か生成
するため、その化学分割のための工程か必要となり、製
造工程か煩雑となる。

３−デヒドロカルニチン、γ−ブチロヘタイン、クロト
ノベタイン、Ｏ−アシルカルニチンを前駆物質として、
微生物あるいはその微生物の生産する酵素により、Ｌ−
カルニチンを製造する方法も知られているが、いずれも
前駆物質か不安定であったり、前駆物質あるいは、補酵
素が高価であったり、前駆物質とＩ５−カルニチンの分
離か困難であるなどの問題を有している。

また、化学合成法による製造法、微生物あるいは酵素に
よる変換工程を含む半合成法による製造法を用いて生産
される■、−カルニチンは合成品であり、医薬外への利
用は認められていない。

合成品以外のし一カルニヂンの調製法としては、乳ある
いは乳製品より分離調製する方法が知られている（特開
昭６２−６３５５３号）が、乳中には多量の無機塩か存
在しており、それを除去するため精製工程か煩雑となる
。

他に、微生物を用いてＬ−力ルニチンを、製造する方法
も知られている（特開昭６０−２１４８９０号）。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、上記微生物を用いる製造方では、用いる
微生物か、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属
する微生物てあり、伝統的な発酵食品に利用されている
微生物てはないため医薬外の目的で、生産されたし一カ
ルニヂンを用いる場合、安全性なとの点で問題とノぼる
。

木発明者は医薬外の目的のためにも使用可能なＬ−カル
ニチンを発酵法により有利に製造する方法を得る目的で
、鋭意努力した結果、従来より発酵食品に利用されてき
た酵母、カヒ等の微生物の中からＬ−カルニチン高生産
株を得ることにより、本発明を完成した。

木発明は、従来より発酵食品に利用されてきた酵母、カ
ヒ等の微生物を使用し、Ｌ−カルニチンを発酵法により
製造する方法を得ることを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 木発明に係るＩ、−カルニチンの製造法は、リゾプス　
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、
アクチノムコール（八ｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、ノイ
ロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属またはペニシリウ
ム属（Ｐｅｎｉ＋ｊｌｌｉｕｍ）　に属するし一カルニ
ヂンの生産能力を有する微生物の少なくとも一種を培養
し、Ｌ−カルニチンを生成蓄積させた培養物よりＬ−カ
ルニチンを採取するものである。

本発明に用いられる微生物としては、リゾプス（Ｒｈｉ
ｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アクチノ
ムコール（八ｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、ノイロスポラ
（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属及びペニシリウム属（ＰＣ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）より／ｌる５属より選ばれた属に
属する少なくとも一種で、Ｌ−カルニチンを生産する能
力を有するものであれば、いずれも用いることができる
。

その例としては、例えは、リゾプス・オリゴスポラス（
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｌｉｇｏＳｐｏｒｕｓ）、ムコー
ル°ヒマリス・エフ・ヒーマリス（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅ
ｍａｌｉｓ　ｆｈｉｅｍａｌｉｓ）　、アクチノムコー
ル・エレガンス（八Ｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａ
ｎｓ）、ノイロスポラ・シトフィラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ
ｒａ　５ｉｔｏｐｈｉｒａ）、ペニシリウム９カゼイコ
ラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ
ｎ）　、ペニシリウム１０ツクフオルテイ（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）なとか挙げられ
る。

さらに具体的には、リゾプス・オリゴスポラス・サイ１
〜−ＩＦ０８６３１、アクチノムコール・エレカラスＩ
ＦＯ６４０８、ノイロスポラ・シトフィラＩＦＯ４５９
６、ペニシリウム・カゼイコラム・ハイニエルＩＦＯ５
８４０、ペニシリウム・ロックフォルティ・トムＩＦＯ
４６２２てあり、これらは財団法人発酵研究所（Ｔ　Ｐ
Ｏ）発行のリスト・才ブ・カルヂャーズ第７版、１９８
４年（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｏ　Ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ　０ｓａｋａ　Ｌｉ５ｔｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｓ、＋９８４．Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている。

ムコール・ヒーマリス・エフ・ヒーマリスは具体的には
、ムコール・ヒーマリス・エフ・ヒーマリス（Ｍｕｃｏ
ｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ、　ｈｉｅｍａｒｉｓ）　Ｓ
　Ｉてあり、これは微工研菌寄第９９６６号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託済みである。

ムコール・ヒーマリス・エフ・ヒーマリスＳ】について
は、木菌は、発酵食品より分離された糸状菌てあり、木
閑の菌学的性状か、ボテトデキストロース寒天培地に生
育させた場合、典型的糸状菌であり、菌糸には隔膜が認
められず、子ノウ胞子を形成する。胞子ノウは多胞性で
あり、直径は１０〜２５μｍである。子ノウ胞子は約３
×４５μｍで表面平滑な楕円形である。気菌糸は生育初
期は無色であり、後期には淡黄褐色を呈す。胞子ノウ柄
には突起は認められず、まれに胞子ノウより比較的離れ
た位置で分岐する。生育は２５〜２９℃で良好てあり、
４０℃て生育は認められない これらの性状をスタディーズ・イン・マイコロシー４号
、１９７３年（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｍｙｃｏｌｏｇ
ｙ　Ｎｏ。

４．１９７３）の中のジッパ−（Ｍ八、Ａ　５ｈｉｐｐ
ｅｒ）著、ア・スタデイ−・オン・ヴアリアヒリティ・
イン・ムコール・ヒーマリス・アンド・リレイティドス
ビイシーズ（八５ｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｖｒｉａｂｉｌｉｔ
ｙ　ｉｎ　Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓ　ａｎｄ　ｒｅ
ｌａｔｅｄ　５ｐｅｃｉｅｓ）の項および、タムシュ（
Ｋ、Ｈ，Ｄｏｍｓｃｈ）らの編集によるコンベンゾイウ
ム・オン・ソイル・ファンシアイ、１巻１９８０年（Ｃ
ｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　５ｏｉｌ　Ｆｕｎｇｉ、ｖ
ｏｌ、１．１９８０）に記載の性状と対比した結果、発
酵食品より分離した本糸状菌は、ムコール・ヒーマリス
・エフ・ヒマリスと同定された。

リンブス属、ムコール属、アクチノムコール属、ノイロ
スポラ属あるいはペニシリウム属に属する菌は、微生物
の一般的性質として自然的にまたは変異剤によって変異
を起し得る。

そこで、用いる微生物を通常用いられる応用微生物的手
段により、変異させることにより、より生産性を向上す
ることも可能である。

たとえは、Ｘ線、カンマ−線、紫外線等の放射線の照射
、更には、単胞子分離、種々の薬剤による処理または薬
剤を含有する培地での培養、その他の手段で変異させて
得られる多くの変異体、あるいは自然に得られた突然変
異体等であっても、Ｌ−カルニチンを生産する性質を有
するものはすべて本発明の方法に利用し得る。

本発明方法の培養に用いられる培地は、用いられる菌株
を利用し得る栄養瀞を含むものなら、液状でも固状ても
よい。また天然培地でも合成培地ても良く、培地には必
要とする炭素源、窒素源、無機物質、微量宋養素か適宜
配合される。もちろんｐＨを調節する目的で無機または
有機の酸、アルカリ類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡
の目的で油脂類、表面活性剤等の適量が添加される。

培養の手段は固定培養、静置＋＠養、振盪培養あるいは
通気攪拌培養法等の手段を用いてもよい。

培養の条件は培地の状態、組成、菌株の種類、培養の手
段等によって一定しないのは当然であるが、本発明に用
いる属に属する菌株の場合、通常線１５℃〜３７℃の温
度で、初発ｐＨ約３〜８付近に選択するのがよい。好ま
しくは２０℃〜３０℃、初発ｐ１１４〜６である。培養
期間も前記諸条件により異なるか、し−力ルニチン濃度
か最大となるまで培養するのかよい。これに要する時間
は、固体培地を用いる場合は、２〜１０日間程度であり
、液体培地を用いる振盪培養または通気攪拌培養の場合
は、通常３〜１２日間程度である。

生成したし一カルニヂンは、液体培養の場合は、主とし
て培養濾液中に存在するので、培養物を遠心分離あるい
は濾過によって上澄液と菌体とに分離し、その上清液か
ら精製するのか有利である。しかし培養物から直接に精
製することも可能である。

方、固体培養の場合、培地中に生成したＬカルニチンを
水にて抽出し、遠心分離あるいは濾過によって上澄液と
、不溶物あるいは蛋白質などを分離し、その上清液から
精製する方法、または酸性蛋白変性剤を用いて、Ｌ−カ
ルニチンを抽出し、塩基性物質にて中和したのち遠心分
離あるいは濾過によフて、上澄みと不溶物を分離し、そ
の上清液から精製する方法なども可能であるが、この場
合、酸性蛋白変性剤としては、１〜５％の過塩素酸、塩
基性物質として、水酸化カリウムを用いるのか好ましい
。

さらに、このＬ−力ルニチンを採取するには、微生物が
生産する代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を
適宜利用することか出来る。たとえは遠心分離によって
、菌体を除去したのち、その濾液から一般に有効物質を
分離、採取、精製する方法を用いる。

すなわち適当な溶媒に対する溶解性および溶解度の差、
溶液からの析出法および析出速度の差、種々の吸着親和
力の差、イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフ
ィー、あるいは減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結晶、
乾燥などの手段が単独あるいは、任意の順序に組合わゼ
で、または反復して利用される。

その−例を示すと次のとおりである。すなわち、培養終
了後培養液、あるいは培養抽出液を遠心分離して得られ
る上澄みを強塩基性揚イオン交換樹脂、例えは、ダイア
イオン５ＫＴＢ（Ｈ”″）（日木錬水株式会社製）のカ
ラムに通ず。吸着物を樹脂から溶出するためには、アン
モニア水、アルカリ水、鉱酸または無機塩の水溶液を使
用することかてきる。以降の操作を簡素化する意味では
、アンモニア水を用いることが望ましい。し−カルニチ
ンを含む溶出液を濃縮したのち、強酸性陰イオン交換樹
脂たとえばダイアイオンＳＡＩ　ＯＡ　（○Ｈ−）に通
ずと、非吸着画分にＬ−カルニチンを回収することかて
きる。色素などが混入している場合は活性炭に吸着除去
することにより、■、−カルニチンの粗精製物が得られ
る。これをさらに精製するために、強塩基性揚イオン交
換樹脂たとえはタイアイオン５ＫＩＢをｐｌ＋３．５〜
４３好ましくはｐ＋＋４．０の緩衝液を用いて平衡化し
たものを用いる。粗精製物の溶液をカラムに通し、吸着
物をｐＨ５０以上、好ましくはｐＨ５，５の緩衝液にて
溶出させ、Ｌ−カルニチンを含む部分を濃縮する減圧濃
縮の際、除去し得る塩を選択することにより、以降の脱
稿操作は不要である。Ｌ−カルニチンはアルコールある
いはアルコール−アセトン溶液より結晶化できる。

［作用］ 本発明においては、このようにして得られたり。

カルニチンは心疾患の治療（基礎と臨床１８巻６号１４
７頁１９８４年　１ｎｔ、Ｊ、Ｔｉ５ｓ、１ｌｅａｃ、
１１巻１７５頁１９８２年）、脂質代謝改善（［、ａｎ
ｃｅｔ２巻８０５頁１９７８年　Ｊ　ｏ　ｈ　ｎ　ｓ　
ｔｌ　ｏ　ｐ　ｋ　ｉ　ｎ　ｓ　Ｍ　ｅ　ｄ　、　、１
１５０巻５１頁１９７６年）の目的で用いられている。

また、高カロリー輸液（外科と代謝栄養１７巻１号８２
頁１９８３年−特開昭５４−１５４５１２号）として用
いられていることが知られている。

「実施例」 以下に本発明の一実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例１ 可溶性デンプン５０ｇ、硝酸ナトリウム１０ｇ、リン酸
−カリウム１０ｇを含む水道水１℃と小麦フスマＩＫｇ
を混合したフスマ培地に、リゾプス・オリコスボラス・
サイト−ＩＦ０８６３１、アクチノムコール・エレガン
スＴ　Ｆ　Ｏ６４’０８、ムコール・ヒーマリス・エフ
・ヒーマリスＳ１　（微工研菌寄第９９６６号）、ノイ
ロスポラ・シ［−フィシＩＦＯ４５９６のいずれかを接
種し、シャレ内て２５℃にて、各々順に、７日間、４日
間、６日間、４日間珀養した。培養終了後３．５　、Ｃ
の２％１１　ＣＩ　Ｏ、にて２度抽出を行ない、抽出液
をガーセ濾過にて回収した。この濾液に、水酸化カリウ
ムを加え中和したのち、３，０００　Ｘ　ｇ、１５分間
の遠心分離を行い６℃の上澄みを得た。

」二を登みをタイアイオン５ＫＩＢ（Ｈ”）（φ４０ｘ
　６０　ｃｍ）に通し、水洗後１．５　Ｎアンモニア水
にて溶出し、■、−カルニヂンを含む溶出部分を集めた
。

Ｌ−カルニチン含量の測定は、ＤＴＮＢ法（Ｍｅｔｂ、
　ｉｎ　Ｅｎ７ｙｍｏｌ　、　１４号、６１２頁＋９６
９）を用い、内部標品には再結晶後の市販し一カルニヂ
ンを用いた。濃度の割算には、分子吸光係数１３６００
　Ｍ−・ｃｍ−を採用した。

Ｌ−力ルニチンを含む溶出液約１５犯を減圧濃縮し、ア
ンモニアを除いた後、１００ｍ１水溶液とした。

このｍン夜をタイアイオンＳＡ　１０Ａ　（ＯＨ−）（
φ４．５　Ｘ　３９　ｃｍ）　　に通し、水で洗浄する
と、素通り部分にＬ−カルニチンが回収された。回収後
約４５０ｍ１を減圧乾固し、１００ｍ１の０．１Ｎ酢酸
アンモニウム緩衝液（ｐ＋＋４．ｏ）に溶解した。これ
に２ｇの活性炭を加え攪拌後部液を得た。

この１慮？夜を０．Ｉ　Ｎ酢酸−アン千ニウム緩衝７夜
（ｐｌ＋４．０）で平衡化したタイアイオン５ＫＩＢ（
φ２、Ｏｘ　３０　ｃｍ）に通し、４００ｍ１の平衡化
緩衝液て洗浄後、４００ｍ１の０．Ｉ　Ｎ酢酸−アンモ
ニウム緩衝液（ｐｕ５．ｓ）にてＬ−カルニチンを溶出
した。

Ｌ−カルニチンを含む溶出液を減圧乾固し、更に真空乾
燥し、■−−カルニヂンを得た。得らねたＬ−カルニチ
ン量は表１に示した。

表１　微生物によるし一力ルニチン生産り一カルニヂン
の純度をシリカケル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒
　メタノール／２８％アンモニア水−７５／２５、検出
：沃素、硫酸メタノール、ニンヒドリン、等）にて検討
したところ不純物は認められなかった。

更にＬ−カルニチンをエタノール−アセトンより結晶化
した。

ムコール・ヒーマリス・エフ・ヒーマリスＳ１の生成す
るＬ−カルニチンの結晶を用いて、質量分析（２次イオ
ンマススペクトロメタ−）を行ったところ第１図のよう
な結果を得た（スペクトルは２次イオンマススペクトル
（ＳＩＭＳ）法にて測定したため、分子量ピークは、分
子■＋１で表示されている）。

図に示すように、分子量が１６１であり、カルニチンで
あることか確認された。

同じ標品の旋光度を測定したところ ［α］尋−２１１°　（ｃｍ０．２、水）てあり、標品
が左旋性を有するし一体であることか確認された。

他の菌株の生産するＬ−カルニチンの標品についても同
様の結果を得た。

実施例２ リゾプス・オリゴスポラス・サイト−・ＩＦＯ８６３１
をポテトデキストロース１２０ｇ、硫酸アンモニウム１
５ｇ、リン酸−カリウム１０ｇを含む培地５℃に植菌し
、ｐ）１５．０に調節し、２５℃で、１７０時間通気攪
拌培養した。培養液をカーゼ濾過し、得られた濾液を実
施例１に記した精製工程て精製し１４．２ｍｇのＬ−カ
ルニチンを得た。旋光度を測定したところ ［α］２ｏ　　２０．５　（ｃ　＝０．５水）てあった
。

実施例３ 実施例１に示した方法て、ペニシリウム・カゼイコラム
・バイニエルＩＦ０５８４０あるいはペニシリウム・ロ
ックフォルティ・トムＩＦＯ４６２２を各々７日間及び
５日間培養したところ、ペニシリウム・カゼイコラム・
パイニエルＩＦＯ５８４０は１２　　ｍｇ／Ｋｇ小麦フ
スマ、ペニシリウム・ロックフォルティ・トムＩ　ＦＯ
４６２２は２８ｍｇ／Ｋｇ小麦フスマのし一カルニヂン
を生産した。

［発明の効果］ 本発明は以上説明したとおり、本発明により、従来化学
合成によるＬ−カルニチンの製造にみられるようなりＬ
一体から、Ｌ一体を分離する煩雑な操作を行なうことな
く、培養物に含まれるしカルニチンを容易に抽出するこ
とか可能である。

用いる培地成分を天然物あるいは食品添加物より選択す
ることか可能てあり、また用いる菌株を従来発酵食品に
用いられて来た株より選択し得ることから、化学、合成
品を原料として微生物変換を用いる生化学合成手段によ
り得られるし一カルニヂンとも異なり、純粋なＬ−カル
ニチンを精製する必要もなく、天然のヒタミンＢＴとし
て、食品、化粧品にも容易に適用てきるという効果かあ
る。

更に発酵によりＬ−カルニチンを生産する場合、用いる
微生物を通常用いられる応用微生物的手段により、変異
させることにより、より生産性を向上することも期待で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図はムコール・ヒーマリス・エフ・ヒーマリスＳ１
の生産したＬ−カルニチンの結晶のマススペクトルを示
す線図である。 代理人　弁理士　佐　藤　正　年

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏ
   ｒ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）
   属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属またはペ
   ニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属するＬ−
   カルニチンの生産能力を有する微生物の少なくとも一種
   を培養し、Ｌ−カルニチンを生成蓄積させた培養物より
   Ｌ−カルニチンを採取することを特徴とするＬ−カルニ
   チンの製造法。