CH323467A - Procédé de préparation de stéroïdes 11B-hydroxylés - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    de stéroïdes     11p-hydroxylés       L'invention est relative à un procédé pour  convertir un stéroïde non substitué en position  11 en dérivé     11(3-hydroxylé    de ce stéroïde à  l'aide de cultures choisies de micro-organismes.  



  La préparation de composés stéroïdes       hydroxylés    à la position 11 du noyau est très  désirable et il est souvent     difficile    d'en obtenir  la synthèse. Certains composés     biologiquement     actifs, notamment le composé F de Kendall       (17a-hydroxy-corticostérone)    et le composé E  de Kendall     (17a-hydroxy-11-déhydro-cortico-          stérone)    appartiennent à     ce    groupe de com  posés.  



       Le        composé    S de Reichstein     (17a-hydroxy-          11-désoxy-corticostérone)    peut être préparé  suivant certaines méthodes connues en partant  de matières initiales facilement disponibles, tel  les que des stérols de fèves de soja et d'autres  substances de ce genre. La conversion dudit  composé S de Reichstein en composé F de Ken  dall est une application importante du procédé  selon l'invention ; elle peut se faire plus aisé  ment et d'une manière relativement économi  que, comparativement aux méthodes chimi  ques.  



  D'autres méthodes ont été proposées pour  convertir ledit composé S en composé F à  l'aide de micro-organismes différents de ceux  décrits ci-dessous et utilisés pour le procédé    faisant     l'objet    de l'invention.     Dans    le brevet  suisse No 322066, on a décrit, à cet effet, l'uti  lisation de certains micro-organismes du genre       Curvularia.    Dans le brevet USA No 2602769,       accordé    le 8     juillet    1952, on propose l'usage  du     Cunninghamella        blakesleena,    et dans le  Journal of the     American        Chemical    Society  (Vol. 74, p.

   2381, 1952) on cite, à cet effet,  l'usage du Streptomyces     fradiae.     



  On a découvert maintenant qu'on peut  convertir un stéroïde non substitué en position  11 en dérivé     11(3-hydroxylé    de ce stéroïde si  l'on met le stéroïde en contact avec des enzy  mes oxydantes produites par     un    micro-orga  nisme     Pycnosporium,    espèce     QM   <I>703,</I> ou ses  mutantes.

       Le    genre     Pycnosporium    est de l'or  dre des     Sphaeropsidales    qui appartient à la  classe des     Fungi        Imperfecti.    On peut se pro  curer l'organisme particulier, qui s'est montré  comme étant extrêmement avantageux, auprès  du     Philadelphia        Quartermaster    Corps, Dépôt  de l'armée américaine, sous le numéro de  culture     QM   <I>703.</I> Il est à noter que l'on peut       utiliser    non seulement les organismes qui cor  respondent exactement à la     description    du       QM   <I>703,

  </I> mais également les espèces mutantes  de ces organismes.  



  On a découvert, en mettant en contact un  composé stéroïde non substitué en position 11      avec des cultures vivantes de     Pycnosporium    de  l'espèce     QM   <I>703</I> ou avec des extraits appro  priés ou des     mycèles    de     cet    organisme, que le  composé stéroïde est converti en un dérivé       11P-hydroxylé    de ce stéroïde. La réaction con  vient     particulièrement    bien à la conversion du  composé S ou de ses mono- ou di-esters (par  exemple le di-acétate ou le 17- ou     21-mono-          acétate)    en composé F.

   En général, la réaction  doit se     faire    dans des conditions d'aérobiose.  Si l'organisme est cultivé dans des solutions  nutritives et si le substratum du stéroïde est  ajouté au début de la croissance du micro  organisme ou après que la croissance a débuté,  on obtient une conversion rapide du stéroïde en  un dérivé 11     [3-hydroxylé    de ce stéroïde.  



  Une variété de stéroïdes peut être utilisée  comme matière initiale pour le procédé selon  l'invention. Ces composés peuvent comporter  des substituants en diverses positions du noyau  tels que des     chaînes    latérales en     position    17 et  des groupements     céto    ou hydroxyle, ou des  groupements hydroxyle protégés en position 3.  Des doubles liaisons peuvent être présentes  dans le noyau, par exemple en position 3 (4)  ou 5 (6).

   Le rendement en dérivé     11(3-hy-          droxylé    obtenu par le procédé varie jusqu'à un  certain degré avec la nature du stéroïde utilisé,  avec les conditions choisies pour la réaction,  telles que la température, la durée, le<I>pH,</I> le       milieu        nutritif    et le moment auquel le composé  est ajouté au milieu. Toutefois, ces diverses  conditions peuvent être réglées et les conditions  optima peuvent être déterminées, pour un sté  roïde donné, par un minimum d'essais usuels.  



  La fermentation sous des conditions d'aéro  biose à une température d'environ     25-30o    pen  dant au moins un jour environ après l'addition  du stéroïde, et l'usage d'un     milieu    fournissant  des hydrates de carbone, des matières favo  risant la croissance, une source d'azote et des  sels inorganiques, sont     particulièrement    favo  rables.  



  Les produits obtenus par le     procédé    peu  vent être analysés aisément, par exemple à  l'aide des méthodes     utilisant    du papier     chroma-          tographique.    Cette analyse permet l'étude de    la variation des conditions sur une petite  échelle puisque des échantillons très petits des  produits peuvent être analysés de la manière en  question. Des méthodes de ce genre sont déjà  connues et des détails à leur sujet sont indiqués  dans le brevet USA No 2602769, dont il est  question plus haut, et dans un article de     Shull     et autres publié dans la revue des Archives of       Bioehemistry,    Vol. 37; p. 186, 1952.  



  Diverses matières peuvent faire partie du  milieu nutritif utilisé pour la culture de l'espèce       Pycnosporium    dont on se sert pour le procédé.  Les matières nutritives comprennent les hy  drates de carbone, tels que le glucose, le sac  charose, le maltose et d'autres sucres et ami  dons. Des matières industrielles,     connues     comme contenant des substances nutritives tel  les que la farine de soja, la farine d'arachides,  les liqueurs de macération de maïs et d'autres  substances de ce genre, peuvent également être  utilisées avec avantage. Divers sels, y compris  des nitrates, des sulfates et des phosphates,  ainsi que des composés métalliques, tels que  des composés du potassium, du sodium et du  magnésium, peuvent être utilisés pour former  des constituants supplémentaires du milieu.

   En  général, on préfère que la fermentation ait lieu  à une température d'environ 24 à 30 . La crois  sance du micro-organisme se fait généralement  en un à trois jours. Comme indiqué plus haut,  le stéroïde peut être ajouté quand la fermenta  tion débute ou il peut être ajouté après que la  croissance a nettement commencé, par exem  ple après 16 à 24 heures. Suivant une variante,  on peut enlever le mycélium formé pendant la  croissance du micro-organisme dans le milieu  nutritif, on peut le laver à l'eau, si on le désire,  ou le remettre en suspension dans de l'eau con  tenant le stéroïde. Une agitation de ce mélange  en présence d'air donne lieu à la formation du  stéroïde     hydroxylé    désiré.  



  Les 11     [3-hydroxy-stéroïdes        fôrmés    confor  mément à l'invention peuvent être isolés par  plusieurs méthodes différentes. La méthode la  plus avantageuse est l'extraction du mélange de  fermentation contenant le produit à l'aide de  certains solvants non miscibles à l'eau. Parti-           culièrement    utiles sont les hydrocarbures infé  rieurs halogénés, tels que le chloroforme, le  chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène,  etc.

   D'autres solvants non miscibles à l'eau, tels  que des alcools aliphatiques comme le     butanol,     le     pentanol,    etc., des cétones telles que la     mé-          thyl-isobutyl-cétone,    et des esters tels que l'acé  tate de butyle, peuvent être utilisés à cet effet.  Les extraits obtenus de cette manière peuvent  être concentrés jusqu'à siccité pour obtenir un  produit brut solide. Toutefois, dans de nom  breux cas, il peut être désirable de purifier da  vantage ce produit, par exemple par     recristalli-          sation    hors d'un solvant approprié, tels que des  hydrocarbures halogénés inférieurs, des alcools  inférieurs et des esters.

   Suivant une variante, le  produit peut être soumis à une purification par  des méthodes telles que la chromatographie.  L'usage des colonnes contenant un gel de silice  traité avec un alcool inférieur, tel que l'éthanol  (l'usage d'un gramme     d'éthanol    par gramme de  gel de silice convient très bien) est particuliè  rement efficace. Le produit peut être amené sur  une colonne     chromatographique,    en solution  dans un hydrocarbure aliphatique halogéné in  férieur et la colonne peut ensuite être dévelop  pée avec des quantités additionnelles du même  solvant ou d'un solvant similaire contenant une  proportion minime, par exemple de 1 à 5 0/0,  d'un alcool aliphatique inférieur (méthanol ou  éthanol).

   On constate souvent qu'une partie de  la matière initiale n'est pas convertie pendant  le procédé usuel. Cette partie peut être récu  pérée hors de la colonne et peut être utilisée  dans d'autres préparations. Le produit peut  ensuite être obtenu en le lavant avec un solvant,  tel qu'indiqué plus haut, en choisissant des  fractions appropriées, par une analyse à l'aide  de papier     chromatographique.    La concentration  des solutions du produit procure un produit  purifié solide, généralement à l'état cristallisé  et avec une grande pureté. Certains     sous-          produits    peuvent être formés par la réaction et  ceux-ci peuvent être séparés par la méthode de  chromatographie sur colonne.

   Ces sous-pro  duits contiennent parfois certains autres com  posés plus fortement oxydés. En général, des       rendements        d'au        moins        25        %        environ        ou        plus       élevés peuvent être obtenus, pour le produit       hydroxylé    désiré, à l'aide du procédé faisant  l'objet de l'invention.  



  <I>Exemple 1</I>  Une culture du     micro-organisme    de l'es  pèce     Pycnosporium        QM   <I>703</I> a été cultivée dans  des éprouvettes sur un     milieu    de culture à base       d'agar.    L'organisme est séparé, par rinçage, de  la souche     d'agar    dans des conditions stériles et  est cultivé dans un     milieu    stérile ayant la com  position suivante         extrait        de        malt    . . . . . . . 5     %     saccharose . . . . . . . . 1  nitrate de sodium. . . . . . . 0,2  chlorure de potassium . . . . .

   0,05       sulfate    de magnésium     heptahydraté    . 0,05       sulfate    ferreux     heptahydraté    . . . 0,05       diphosphate    acide de potassium . . 0,1  eau distillée,  le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,0 avec du       KOH.     



  Des portions de 100 ml de ce milieu sont  versées dans des flacons de 300 ml. Le contenu  d'un     flacon,    après une croissance de 7 jours,  est ajouté à deux     litres    d'un     milieu    stérile ayant  la composition suivante       saccharose    . . . . . . . .     1%          tryptone        Difco    . . . . . . . 1  nitrate de sodium . . . . . . 0,2       biphosphate    acide de potassium . 0,1       sulfate    de magnésium     heptahydraté.    0,05  chlorure de potassium . . . . 0,05       sulfate    ferreux     heptahydraté    . . .

   0,001  le<I>pH</I> de ce mélange est réglé à 7,0 à l'aide  d'acide     sulfurique.     



       On        ajoute        0,25        %        de        carbonate        de        calcium     avant que le mélange soit stérilisé.

   Au     milieu     inoculé on ajoute 0,5 g de composé S dissous       dans        20        ml        d'éthanol    à     95        %.        Le        mélange        est     ensuite aéré avec un débit d'environ 1 volume  d'air par volume de solution et par minute, à  environ     28(l,    pendant 24 heures. Un agitateur  mécanique, fonctionnant à environ 1500 t/min.,  travaille     dans    la cuve de fermentation. La fer  mentation est poursuivie pendant 24 heures.

        L'ensemble du bouillon de fermentation et  du mycélium est sorti de la cuve et est extrait  trois fois avec un tiers en volume de chlorure  de méthylène. Les phases organiques     sont    mé  langées,     filtrées    et concentrées sous vide jusqu'à  avoir un volume de quelques millilitres.

   La so  lution est amenée sur une colonne contenant  du gel de silice préparé en traitant du gel de  silice anhydre avec un millilitre d'éthanol à       95        %        par        gramme        de        matière        solide.        La        co-          lonne    de gel de silice, contenant les stéroïdes,

    est développée à l'aide d'une solution de trois       volumes        d'éthanol    à     95        %        dans        97        volumes        de     chlorure de méthylène. Des portions de la ma  tière, prélevées dans la colonne, sont analysées  à des intervalles réguliers par chromatographie  sur papier. La     première    fraction, fournie par  la colonne, est un peu du composé S récupéré.  Une solution de cette fraction est concentrée  jusqu'à ce qu'on obtienne le composé S à l'état  solide pour être utilisé à nouveau. Dans les  fractions suivantes, on trouve le produit cor  respondant au composé F.

   Des matières addi  tionnelles, qui peuvent être plus fortement oxy  dées ou qui sont oxydées à une position diffé  rente, sont également formées au cours de la  fermentation et sont séparées par purification       chromatographique.    On obtient un rendement       d'environ        27        %        en        composé        F        cristallisé,        par     concentration des produits sélectionnés, fournis  par la colonne, et par évaporation jusqu'à sic  cité.

   Le produit peut être recristallisé dans de  l'acétate d'éthyle ou d'autres solvants appro  priés et ses propriétés sont identiques aux  échantillons normalisés du composé F.  



  <I>Exemple 2</I>  Une culture de l'espèce     Pycnosporium          QM   <I>703</I> est ajoutée à une portion stérile de  100 ml du milieu suivant dans un     flacon    à  300 ml       saccharose    . . . . . . . .     1%          tryptone        Difco    . . . . . . . 1  nitrate de sodium . . . . . . 0,2       biphosphate    acide de potassium . 0,1       sulfate    de magnésium     heptahydraté.    0,05  chlorure de potassium . . . . 0,05       sulfate    ferreux     heptahydraté    . . 0,001    Au flacon, on ajoute 50 mg de progesté  rone.

   Le mélange de fermentation est agité à  une température de 280 dans des conditions  stériles pendant 7 jours. Le mélange est sorti  du     flacon    et est extrait trois fois avec un     demi-          volume    de     dichlorure    d'éthylène chauffé à       70().    Les couches de solvant sont mélangées et  concentrées sous vide jusqu'à siccité. Les ma  tières solides résiduelles sont dissoutes dans un  petit volume d'éthanol et un échantillon de cette  matière est soumis à la chromatographie sur  papier. Cette analyse montre la présence de       11(3-hydroxy-progestérone    et celle d'un peu de  progestérone n'ayant pas réagi et d'autres pro  duits oxydés.  



  <I>Exemple 3</I>  L'expérience décrite dans l'exemple 2 est  répétée en utilisant 50 mg de     désoxycortico-          stérone    à la place de la progestérone. Le pro  duit obtenu est soumis à la chromatographie  sur papier qui montre que la matière initiale a  été     hydroxylée    à la position 11 pour former la       corticostérone.  

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11 P-hydr- oxylé de ce stéroïde, caractérisé en ce qu'on met le stéroïde en contact avec des enzymes oxydantes produites par un micro-organisme Pycnosporium, espèce QM <I>703,</I> ou ses mu tantes. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on fait croître une culture de Pycnosporium, espèce QM <I>703,</I> dans des con ditions d'aérobiose, dans un milieu nutritif aqueux contenant le stéroïde à oxyder. 2.

   Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on met le stéroïde en contact avec le micro-organisme, pendant la croissance de celui-ci, à une température comprise entre 25() et 30,1 et pendant au moins un jour, dans un milieu nutritif contenant des hydrates de carbone, des substances favorisant la crois sance du micro-organisme, une source d'azote et des sels inorganiques. 3. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on utilise comme stéroïde de dé part le composé S de Reichstein. 4. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on utilise comme stéroïde de départ la progestérone. 5.

   Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on utilise comme stéroïde de dé part la désoxycorticostérone. 6. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce que le produit 11p-hydroxylé est isolé par extraction avec un solvant.