CH351597A - Verfahren zur Herstellung von 21-Oxy-steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren     zur        Herstellung    von     21-Oxy-steroiden       Es ist bereits bekannt, mittels Enzymen aus Ne  bennieren, insbesondere mit deren     Homogenaten    oder  auch bei ihrer     Durchströmung        Hydroxylgruppen,    u. a.  in     21-Stellung    von Steroiden einzuführen. So interes  sant diese Funktion tierischer Enzyme vom theore  tischen Standpunkt aus ist, so vermag sie zur     präpa-          rativen    und speziell industriellen Gewinnung von     21-          Oxy-steroiden    nicht zu befriedigen.

   Mit mikrobiolo  gischen Methoden, die sich auch in grösstem Stile  anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher  nicht durchführbar gewesen.  



  Es wurde nun gefunden, dass man     21-Oxy-steroide     erhält, wenn man auf Steroide, die in     21-Stellung     ein     unsubstituiertes        C-Atom    aufweisen, durch     aerobe     Kulturen von     Pilzen    der     Art        Ophiobolus        herpotrichus     produzierte     Enzyme    einwirken lässt.

   Als Ausgangs  stoffe für das neue Verfahren     kommen    allgemein  Verbindungen der     Pregnan-,        Allopregnan-    oder     Iso-          pregnanreihe,    wie 14- oder     17-Isopregnane,    in Be  tracht sowie Homo- und     Nor-pregnane,    z. B.     A-Nor-,          D-Homo-    und     19-Nor-pregnane,    die in     21-Stellung          unsubstituiert    sind.

   Die Verbindungen können gesät  tigt oder ungesättigt     sein    und     beliebige        Substituenten          aufweisen.    Doppelbindungen befinden sich z. B, in  1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder     16-Stel-          lung.    Die Konfiguration der     Ausgangsstoffe    ist vor  zugsweise diejenige des     Pregnans,        5a-Pregnans,        17a-          Pregnans    oder entsprechender     Racemate,    wie sie bei  der Totalsynthese erhalten werden.

   Als     Substituenten     kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell ab  gewandelte     Hydroxyl-,        Oxo-    oder     Carboxylgruppen,     wie Ester-, Äther-,     Thioester-,        Thioäther-,        Thiol-    und       Thionester-,        Acetal-,        Mercaptal-,        Ketal-,        Hydrazon-,          Semicarbazon-    und     Enolgruppen,    z.

   B. in 2-, 3-, 6-,  7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19- und     20-Stellung,     ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor,  z. B. in 9- und     17-Stellung.        Spezifische    Ausgangs-    Stoffe sind u. a.

   Progesteron,     17a-Progesteron,        16a-          Oxy-progesteron,        17a-Oxy-progesteron,        11-Keto-pro-          gesteron,        11a-    sowie     llss-Oxy-progesteron,    9,11- oder       11,12-Dehydro-progesteron,        19-Oxo-progesteron,        11-          Keto-17a-oxy-progesteron,        11a-    sowie     llss-Oxy-17a-          oxy-progesteron,        9-Chlor-    oder     9-Fluor-11ss,

  17a-di-          oxy-progesteron,    l l     ss,18-Dioxy-progesteron,        11ss,17,          18-Trioxy-progesteron,        11ss-Oxy-18-oxo-progesteron,          9-Chlor-    oder     9-Fluor-llss-oxy-18-oxo-progesteron,          11,18-Dioxo-progesteron,        19-Nor-progesteron,    19  Nor-llss-oxy-18-oxo-progesteron,     Pregnenolon,    bzw.  ihre funktionellen Derivate.  



  Die verwendeten     Enzyme    sind mikrobiologischer       Herkunft    und durch     aerobe    Kulturen von     Pilzen    der       Art        Ophiobolus        herpotrichus    produziert.

   Zur Einfüh  rung der     Oxygruppe        inkubiert    man meist     direkt    die       Ausgangsstoffe    mit den unter an sich bekannten       aeroben    Bedingungen     submers    wachsenden Kulturen  der     genannten        Pilze.    Diese werden zweckmässig be  wegt, d. h.

   geschüttelt oder     gerührt,    und enthalten       assimilierbaren    Kohlenstoff, insbesondere Kohlen  hydrate sowie     gegebenenfalls        Wuchsstoffe,    beispiels  weise Maisquellwasser oder     Bierwürze,    und anorga  nische     Salze.    Es sind somit natürliche, synthetische  oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Im  folgenden ist das praktisch einfachste Verfahren ge  schildert: Man züchtet die Organismen in Appara  turen und unter     ähnlichen    Bedingungen, wie sie bei  der     Antibiotika-Fabrikation    als sog.     Tieftankverfah-          ren    bekannt sind.

   Nach     Entwicklung    der Kulturen  gibt man einen der genannten Ausgangsstoffe     in    fei  ner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Me  thanol, Aceton oder     Äthylenglykol    zu und     inkubiert     weiter. Schliesslich trennt man vom     Mycel    ab, extra  hiert das Filtrat und/oder die     Mycehnasse    und iso  liert aus dem Extrakt das Reaktionsprodukt in an  sich bekannter Weise, z.

   B. durch Entmischungsver-      fahren,     Adsorption,        Chromatographie,    Kristallisation,       Überführung    in funktionelle Derivate, wie     Girard-          Verbindungen    und dergleichen. Dieselben Umsetzun  gen lassen sich aber auch durchführen, indem man  die wirksamen     Enzyme    aus entsprechenden     aeroben     Kulturen von     Pilzen    der Art     Ophiobolus        herpotrichus     zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden  Kulturen verwendet.  



  Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel  Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu  ihrer Herstellung dienen. Von grösstem praktischem  Interesse sind z. B.     Cortison,        Hydrocortison,    Reich  steins Substanz S,     Aldosteron    sowie die z. B. aus Pro  gesteron,     Pregnenolon    und     11-Keto-progesteron    ent  stehenden entsprechenden     21-Oxy-Verbindungen.     



  In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempe  raturen     in    Celsiusgraden angegeben.  



  <I>Beispiel 1</I>  4 Liter     70proz.    Bierwürze werden in     einem    Schüt  telgefäss sterilisiert     (pu    5,6) und mit einer Kultur von       Ophiobolus        herpotrichus    beimpft. Nach 3tägigem  Schütteln bei 26  gibt man zur gut entwickelten Kul  tur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1,0 g  Progesteron in 25 cm- Aceton und schüttelt weiter  bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das       Mycel    abgetrennt. Man schüttelt das     Kulturfiltrat     dreimal mit je 1 Liter Essigester aus und wäscht die  Extrakte mit In Salzsäure, In     Natriumhydrogencar-          bonat-Lösung    und Wasser.

   Die über Natriumsulfat  getrocknete     Essigester-Lösung    wird im Vakuum bei  40  eingedampft. Der Rückstand (1,2 g) wird an  15g     Silicagel        chromatographiert,    wobei zuerst mit       Methylenchlorid,    dann mit Chloroform und schliess  lich mit     Chloroform-Aceton-Gemischen    mit steigen  dem     Acetongehalt        eluiert    wird. Die einzelnen Frak  tionen (je 100     ems)    werden eingedampft und     papier-          chromatographisch    untersucht.

   Die     Methylenchlorid-          Fraktionen    und die ersten mit Chloroform     eluierten     Fraktionen enthalten neben Verunreinigungen nur  Ausgangsmaterial, während in den     letzten        Chloro-          form-Fraktionen    sowie in den     Chloroform-Aceton-          Eluaten    (95:5 und 90: 10)     Cortexon        (11-Desoxy-          corticosteron)    anwesend ist. Diese Fraktionen werden  vereinigt und eingedampft.

   Der zur Hauptsache aus       Cortexon    bestehende Rückstand (0,8l g) wird aus  Äther     umkristallisiert,    wobei farblose Platten vom  F. =     140-142     erhalten werden. Diese     Kristalle    be  sitzen eine     optische    Drehung von     -E-175     und zeigen  im     Gemisch    mit authentischem Material keine       Schmelzpunktserniedrigung.    Ebenso sind ihre Infra  rot- und     Ultraviolett-Spektren    identisch     mit    denjeni  gen von     Cortexon.     



  <I>Beispiel 2</I>  150 cm?, einer Nährlösung, enthaltend im Liter  50 g Rohglukose, 20     cm3    Maisquellwasser     (Corn-          steep-liquor)    und 10 g     Ammoniumtartrat    und im  übrigen Leitungswasser, werden in     einem    Erlen  meyerkolben von 500     cm3    Fassungsvermögen sterili  siert und mit einer Kultur von     Ophiobolus    herpo-         trichus    beimpft.

   Nach 2tägigem Schütteln bei 26   hat sich die Kultur gut entwickelt, und man gibt unter  sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg     11-          Keto-progesteron    in 1,5 cm?- Aceton zu, worauf wei  tere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt  wird. Dann wird das     Mycel    abgetrennt. Man schüttelt  das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm?, Essigester  aus und arbeitet die Extrakte wie in Beispiel 1 be  schrieben auf. Der Rückstand (40 mg) wird     papier-          chromatographisch    untersucht und besteht zur Haupt  sache aus     17-Dehydro-corticosteron        (Kendalls        Com-          pound    A).

   Dieses kann nach     chromatographischer     Reinigung in kristalliner Form erhalten werden.  



  <I>Beispiel 3</I>  Gibt man zu einer analogen     Schüttel-Kultur    von       Ophiobolus        herpotrichus,    wie sie in Beispiel 2 be  schrieben wurde, an Stelle des     11-Keto-progesterons     eine Lösung von 30 mg     17a-Oxy-progesteron    in  1,5     cm3    Aceton, so erhält man nach analoger Inku  bation und Extraktion ein rohes Reaktionsprodukt,  das zu Hauptsache aus     17u-Oxy-cortexon    (Reich  steins Substanz S) besteht. Dieses kann nach     chro-          matographischer    Reinigung in kristalliner Form er  halten werden.  



  <I>Beispiel 4</I>  Zu 4 Liter einer Schüttelkultur von     Ophiobolus          herpotrichus,    die wie in Beispiel 1 beschrieben ge  züchtet wurde, gibt man unter sterilen Bedingungen  eine Lösung von 1 g     1-Dehydro-progesteron        in     25     cm3    Aceton. Man schüttelt 3 Tage bei 27  und  trennt dann das     Mycei    ab. Das Kulturfiltrat wird  mehrere Male mit insgesamt 3 Liter Essigester ausge  schüttelt. Die Extrakte wäscht man mit     1/1()n    Salz  säure, In     Natriumhydrogencarbonatlösung    und Was  ser.

   Die über Natriumsulfat getrocknete Essigester  lösung wird im Vakuum eingedampft und der so er  haltene Rückstand (1,1 g) an 30 g     Silicagel        chromato-          graphiert,    wobei mit Chloroform und mit     Chloro-          form-Aceton-Gemischen    steigenden     Acetongehaltes          eluiert    wird. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm?,)  werden eingedampft und     papierchromatographisch     untersucht.

   In den     Chloroform-Fraktionen    befindet  sich neben Verunreinigungen etwas Ausgangsmate  rial, während die mit     Chloroform-Aceton-(95:5)-          Gemischen        eluierten    Anteile (710 mg) zur Haupt  sache aus     1-Dehydro-cortexon    bestehen. Dieses wird  aus einem     Aceton-Petroläther-Gemisch    kristallisiert.  F. = 185-192 , [a]22 =     -E-120         (CHC13).     



  <I>Beispiel 5</I>  Wird im obigen Beispiel an Stelle der Lösung  von     1-Dehydro-progesteron    eine solche von 1 g     1-          Dehydro-ll-keto-17a-oxy-progesteron    in 25     cm3     Aceton zur Kultur zugegeben und wird in der be  schriebenen Weise aufgearbeitet und     chromatogra-          phiert,    so bestehen die     Chloroform-Aceton-(1:1)-          Fraktionen    zur Hauptsache aus     1-Dehydro-cortison,     das aus     Aceton-Äther-Gemischen    kristallisiert wird.  F. = 231-233 .

        <I>Beispiel 6</I>  Wird im Beispiel 4 an Stelle der Lösung von       1-Dehydro-progesteron    eine solche von 1 g     1-De-          hydro-llss,17a-dioxy-progesteron    in 25     cm3    Metha  nol zur Kultur zugegeben und wird in der beschrie  benen Weise aufgearbeitet und     chromatographiert,     so bestehen die     Chloroform-Aceton-(1    :     1)-Fraktionen     zur Hauptsache aus     1-Dehydro-hydrocortison.    Es  wird aus     Aceton-Äther-Gemischen    kristallisiert.  



  F. = 239-242 .  



  <I>Beispiel 7</I>  In einem     Erlenmeyerkolben    von 500     cm3    Fas  sungsvermögen werden 120     cm3    Bierwürze     sterilisiert     und mit     Ophiobolus        herpotrichus    beimpft. Nach     4-          tägigem    Schütteln bei 26  gibt man zur gut entwickel  ten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung  von 30 mg     d,1-44-3,20-Diketo-llss-oxy-pregnen-18-          säure-lakton-(18-@    l     1ss)    in 1,5     cm3    Aceton zu und  lässt weitere 3 Tage bei 26  schütteln.

   Dann wird,  wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben,  mit Essigester extrahiert. Der Rohextrakt wird an  Papier     präparativ        chromatographiert    (System     Propy-          lenglykol-Toluol),    wobei eine Substanz abgetrennt  wird, die im Vergleich zum Ausgangsmaterial höher  polar ist und alkalische     Silberdiamin-Lösung    rasch    und stark reduziert. Sie wird aus     Aceton-Äther    kri  stallisiert und stellt das     d,1-44-3,20-Diketo-11ss,21-          dioxy-pregnen-18-säure-lakton-(18->llss)    dar.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 21-Oxy-steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf Steroide, die in 21-Stellung ein unsubstituiertes C-Atom auf weisen, durch aerobe Kulturen von Pilzen der Art Ophiobolus herpotrichus produzierte Enzyme einwir ken lässt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Progesteron verwendet. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man 11-Keto-progesteron ver wendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man 17a-Oxy-progesteron ver wendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man 41,4-Pregnadiene verwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteran spruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man 1-De- hydro-progesteron verwendet.