DEC0010928MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 16. März 1955 Bekanntgemacht am 31. Oktober 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Es ist bereits bekannt, mittels Enzymen aus Nebennieren, insbesondere mit deren Homogenaten, oder auch bei ihrer Durchströmuhg Hydroxylgruppen, unter anderem in 17 α-Stellung von Steroiden, einzuführen. So interessant diese Funktion tierischer Enzyme νοϊη theoretischen Standpunkt aus ist, so vermag sie zur präparativen und speziell industriellen Gewinnung von Vj a-Oxy-steroiden nicht zu befriedigen. Mit mikrobiologischen Methoden, die sich auch ih größtem Stile anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher nicht durchführbar gewesen.

Es wurde nun gefunden, daß Sauerstoff in Steroide durch Bebrütung mit Kulturen oxydierend wirkender Pilze oder den durch diese erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen eingeführt werden kann, wenn man Verbindungen der Pregnanreihe, die in 17-Stelhmg ein Wasserstoffatom aufweisen, der biologischen Oxydation mit Pilzen der Arten Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica, Thielaviä terricola in bekannter Weise unterwirft und die erhaltenen 17-Oxy-

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verbindungen der Pregnanreihe in bekannter Weise isoliert. Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind allgemein Verbindungen der Pregnanreihe mit einem Wasserstoffatom in 17-Stellung, worunter gesättigte und ungesättigte, beliebig konfigurierte und substituierte Derivate des 10, i3-Dimethyl-i7-äthyl-cyclopentano-polyhydrophenanthrens sowie seiner höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-, D-Homo-, 19-Nor-, 21-Nor- und 21-Homoverbindungen, verstanden sind. Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 14-, 15- und/oder 20-Stellung. Die Konfiguration der Ausgangsstoffe ist vorzugsweise diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, I7ct-Pregnahs oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden. Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, z. B. in 3-, 7-, 11-, 12-, 16-, 18-, ig-, 20- und 21-Stellung. Spezifische Ausgangsstoffe sind unter anderem Cortexon (n-Desoxycorticosteron), 9, 11- oder 11, 12-Dehydrocortexon, i6a-Oxycortexon, 18-Oxo- und 18-Oxycortexon, Corticosteron, 11-Epi-corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, 18-Oxy-corticosteron, 1,4-Pregnadien-3, 11, 20-trion-2i-ol, 1, 4~Pregnadien-3, 20-dionn/3, 21-diol, Progesteron, I7a-Progesteron, ii-Ketoprogesteron, 11 α- sowie ii/3-Oxyprogesteron, 9, 11- oder 11, 12-Dehydroprogesteron, 19-Oxoprogesteron, 19-Norprogesteron-, Pregnenolon-, 21-Oxypregnenolon, . Aldosteron bzw. ihre funktioneilen Derivate.

Die verwendeten Enzyme sind mikrobiologischer Herkunft und durch aerobe Kulturen von Pilzen der obengenannten Arten produziert. Zur Einführung von Sauerstoff inkubiert man meist direkt die Ausgangsstoffe mit den unter an sich bekannten aeroben Bedingungen submers wachsenden Kulturen der genannten Pilze. Diese werden zweckmäßig "bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder' Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu und inkubiert weiter'.

Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung, in funktioneile Derivate, wie Giraid-Verbindungen. Dieselben Umsetzungen lassen sich aber auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen von Pilzen der obengenannten Arten zuerst abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet. ,

Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von größtem praktischem Interesse sind z. B. Cortison, Hydrocortison, 1, 2-Dehydrocortison, 1, 2-Dehydröhydrocortison, Reichsteins Substanz S, i7a-Oxy-aldosteron sowie, die z. B. aus Progesteron, Pregnenolon und ii-Ketoprogesteron entstehenden polyoxygenierten Derivate.

Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Zwischen Gewichtsteil und Volumteil besteht die gleiche Beziehung wie zwischen Gramm und Kubikzentimeter.

Daß man durch Pilze oder durch Pilze abgesonderte Enzyme Sauerstoffunktionen in ein Steroid einführen kann, wurde bereits in der USA-.-Patentschrift 2 602 769 offenbart, welche ein Verfahren zur ii-Hydroxylierung von Steroiden mittels Pilzen der Ordnung Mucorales beschreibt. Durch die vorliegende Anmeldung wird nun der Stand der Kenntnisse durch die Lehre bereichert, daß zweckmäßig-ausgewählte Pilzarten, wie die hierin genannten, selektive Oxydation eines Steroides im Sinne der 17-Hydroxylierung bewirken können.

Beispiel 1

2000 Volumteile einer 'sterilisierten Czapek-Dox-Nährlösung (pro Liter Wasser: 2 g NaN O₃,1 g K₂ H P O₄, 0,5 g K Cl, 0,5 g Mg S O₄ ■ 7 H₂O, 0,02 g Fe aO₄· 7 H₂O, 50 g Glukose; p_H der Lösung = 7) werden mit einer Kultur von Trichothecium roseum beimpft und 5 Tage bei 27° geschüttelt. Dann gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von-0,5 Gewichtsteilen Cortexon in 15 Volumteilen. Aceton zu und schüttelt bei 27⁰ weiter. Nach 4 Tagen nutscht man ab, wäscht den Rückstand einige Male mit Wasser und extrahiert das Kulturfiltrat dreimal mit je 1200 Volumteilen Essigester. Dip Essigester-Lösungen werden mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 1 n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und bei 40 bis 50⁰ im Vakuum eingedampft. Der 0,62 Gewichtsteile betragende Rückstand wird an 10 Gewichtsteilen Silicagel chromatographiert, wobei zuerst mit Chloroform allein, dann mit Chloroform-Aceton-Gemischen, mit steigendem Acetongehalt eluiert wird. Mit Chloroform und Chloroform—Aceton (95 ^: 5) werden wenig Cortexon enthaltende Verunreinigungen eluiert. Die ersten Chloroform-Fraktionen mit 10 °/₀ Aceton geben beim Eindampfen einen Rückstand, der mit konzentrierter Schwefelsäure die für Substanz S (i7a-Oxy-cortexon) charakteristische karminrote Färbung gibt. Dieser Rückstand wird aus Aceton-Äther-Gemischen umkristallisiert, wobei reine Substanz S vom F. = 202 bis 213° und der spezifischen Drehung [d\f = +132⁰ (in Äthanol) erhalten wird. Zur Acetylierung werden 0,02 Gewichtsteile der reinen Substanz mit 0,2 Volumteilen Pyridin und 0,4 Volumteilen Acetanhydrid 15 Stunden bei 20⁰ stehengelassen. Das Gemisch versetzt man mit- Wasser, dampft im Vakuum ein und kristallisiert den Rückstand aus Aceton um, wobei 4-Pregnen-i7«, 2i-diol-3, 20-dion (Reichsteins Substanz S-acetat) vom F. = 239 bis 241° erhalten wird. · ■ .■-,-.-

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Die weiteren Chloroformeluate mit ι ο % Aceton geben beim Eindampfen eine etwas stärker polare Verbindung, die mit konzentrierter Schwefelsäure zuerst eine rötliche, dann braungelbe Färbung mit grüner Fluoreszenz zeigt. Diese Substanz kristallisiert aus Aceton in klaren Prismen, die beim Erwärmen ab etwa 130° verwittern und bei 202 bis 212⁰ schmelzen und im Gemisch mit Substanz S eine starke Depression des Schmelzpunktes ergeben. Die bei 135⁰ im Hochvakuum getrockneten Kristalle geben Analysen-Werte, die mit der Bruttoformel C₂₁H₃₀ O₄ gut übereinstimmen. Da die Substanz im Ultraviolett absorbiert und alkoholische Silberdiamin-Lösung reduziert, handelt es sich hier um ein neues Oxycortexon, das von Substanz S verschieden ist.

An Stelle der im obigen Beispiel verwendeten Czapek-Dox-Nährlösung können auch mit Wasser verdünnte oder unverdünnte Bierwürze oder andere Nährmedien verwendet werden, die auf je 2000 Volumteile Wasser die folgenden Zusätze enthalten:

Lösung A: 20 Gewichtsteile Glukose, 8 Gewichts-, teile sekundäres Ammoniumphosphat, 10 Gewichtsteile Natriumchlorid, 4 Gewichtsteile sekundäres Kaliumphosphat, 2 Gewichtsteile kristallisiertes Magnesiumsulfat, o_;8 Gewichtsteile Calciumchlorid, 0,04 Gewichtsteile kristallisiertes Eisen (II)-sulfat, 0,02 Gewichtsteile kristallisiertes Mangan (Il)-sulfat.

Lösung B: 40 Volumteile Maisquellwasser (Cornsteepliquor), 20 Gewichtsteile Rohglukose, 4 Gewichtsteile sekundäres Kaliumphosphat.

Lösung C: 20 Gewichtsteile Pepton, 200 Gewichtsteile Glukose, 4 Gewichtsteile primäres Ammoniumphosphat, 4 Gewichtsteile Kaliumnitrat, 1 Gewichtsteil kristallisiertes Magnesiumsulfat, 0,2 Gewichtsteile Calcium-

chlorid. · "

Lösung D: 20 Gewichtsteile Pepton, 7 Gewichtsteile Fleischextrakt, 80 Gewichtsteile Glukose, 15 Gewichtsteile Natriumchlorid.

Beispiel 2

50 Volumteile einer sterilisierten Czapek-Dox-Nährlösung werden mit Trichothecium roseum beimpft und 5 Tage bei 27⁰ geschüttelt. Die gut entwickelte Kultur versetzt man unter sterilen Bedingungen mit einer Lösung von o.,oi Gewichtsteil ii-Dehydrocorticosteron (ii-Ketocortexon) in 0,5 Volumteilen Aceton und schüttelt bei 27⁰ weiter. Nach 3 Tagen wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, abgenutscht und extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung neben wenig Ausgangsmaterial zur Hauptsache Cortison (ii-Keto-I7a-oxycortexon), das sich nach an sich bekannten Methoden isolieren und reinigen läßt. Eine analoge Umsetzung erhält man nach 6-tägiger Inkubation des n-Dehydrocorticosterons.

Beispiel 3

Eine wie im Beispiel 2 bereitete Trichötheciumroseum-Kultur wird mit einer Lösung von 0,01 Gewichtsteil Corticosteron in 0,5 Volumteilen Aceton versetzt und 3 Tage bei 27⁰ inkubiert und analog den Angaben des Beispiels 2 aufgearbeitet. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktes zeigt, daß der Ausgangsstoff größtenteils in Reichsteins Substanz M (^a-Oxy-corticosteron) ungewandelt ist.

Werden analog den obigen Angaben an Stelle von Corticosteron, Progesteron, ii-Ketoprogesteroh oder Pregnenolon inkubiert, so erhält man nach der Aufarbeitung ebenfalls größtenteils höherpolare Verbindungen.

Beispiel 4

Eine wie im Beispiel 2 bereitete Kultur von Trichothecium roseum wird mit einer Lösung von 0,01 Gewichtsteil i, 4-Pregnadien-2i-ol-3, 11, 20-trion in 0,5 Volumteilen Aceton versetzt und 3 Tage bei 27⁰ inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgt analog den Angaben im Beispiel 2. Die Untersuchung des Extraktes mittels Papierchromatographie zeigt, daß der Ausgangsstoff größtenteils in 1, 4-Pregnadien-i7a,2i-diol-3, ii, 20-trion (i-Dehydro-cortison) umgewandelt worden ist.

Wird analog den obigen Angaben an Stelle von i, 4-Pregnadien-2i-ol-3, 11, 20-trion das 1, 4-Pregnadien-ii/3, 21-0Ü0I-3, 20-dion inkubiert, so erhält man nach der Aufarbeitung zur Hauptsache das i, 4-Pregnadien-ii/3, 17 a, 2i-triol-3, 20-dion (i-Dehydrohydrocortison).

Wird im obigen Beispiel an Stelle der Kultur von Trichoteheeium roseum eine solche von Leptosphaeria maculans verwendet, so enthält der Extrakt des Kulturfiltrates ebenfalls das i,4-Pregnadien-i7a,2idiol-3, 11, 20-trion (i-Dehydrocortison) bzw. das 1,4-Pregnadien-ii/?, 17a, 2i-triol-3, 20-dion (i-Dehydrohydrocortison).

Das Ausgangsmaterial, für dessen Herstellung im Rahmen vorliegender Erfindung Schutz nicht begehrt wird, kann folgendermaßen gewonnen werden:

i, 4-Pregnadien-2i-ol-3, 11, 20-trion

2000 Volumteile sterilisierte Bierwürze werden mit einer Kultur von Calonectria decora geimpft und bei 27⁰ geschüttelt. Nach 3 Tagen werden unter sterilen Bedingungen zu der gut entwickelten Kultur 0,5 Gewichtsteile 11-Dehydrocorticosteron (Verbindung A), in 15 Volumteilen Aceton zugegeben;- sodann wird das Gemisch bei derselben Temperatur für 3 weitere Tage geschüttelt. Das-Mycel wird abfiltriert, und das Kultürfiltrat wird wie im Beispiel 1 extrahiert. Der Extraktionsrückstand wird an einer Säule von 15 Gewichtsteilen Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) chromatographiert, wobei zuerst mit Chloroform, sodannmit Chlorof orm-Aceton-Mischungen mit steigendem Acetongehalt eluiert wird. Jede Fraktion (50 Volumteile) wird papierchromatographisch untersucht. Mit Chloroform und Chloroform—Aceton (95'^: 5) werden einige Verunreinigungen und etwas Ausgangsmaterial eluiert. Die Chlorof orm-Aceton-(90: 10) Fraktionen enthalten jedoch hauptsächlich eine Substanz, welche im Papierchromatogramm etwas langsamer läuft als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um das 1, 4-Pregnadien-2i-ol-3, 11, 20-trion. Es wird aus Aceton—"Äther umkristallisiert und schmilzt dann bei 200 bis 215⁰, je nach Heizgeschwindigkeit. Im Ultraviolett zeigt die Verbindung eine Absorptionsbande mit Maximum bei 2441x1/6 und im Infrarot-

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Spektrum Banden bei 5,99, 6,14 und 6,23 μ, welche charakteristisch für in 1,4-Stellung ungesättigte S-'Ketöne sind.

i, 4-Pregriadien-ii/?, 2i-diöl-3, 20-diöii

Zu 2000 Volumteile einer Kultur von Calonectria decora, welche wie oben dargestellt ist, werden unter sterilen Bedingungen 0,5 Gewichtsteile Corticosteron in 15 Volumteilen Aceton gegeben. Die Züchtung, Extraktion und Chromatographie an »Silicagel« werden, wie oben angegeben, ausgeführt. Die Chloroform und Chloroform-Aceton- (90 : 10) Fraktionen enthalten Verunreinigungen und etwas Ausgangsmaterial. Die Hauptverbindüng, welche in den Chloroform-Aceton-(90 : 10 und 80 : 20) Fraktionen enthalten ist, läuft im Papierchromatogramm etwas langsamer als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um i, 4-Pregnadien-Tiß, 2i-diol-3, 20-dion, das aus Aceton umkristallisiert wird. Es schmilzt bei 216 bis 220⁰

ao (unter Zersetzung) und besitzt die optische Drehung + 158⁰ (Äthanol); im Ultraviolettabsorptionsspektrum weist es ein Maximum bei 244 m/t (e 15300) und im Infrarotabsorptionsspektrum Banden bei 2,76, 2,86, 5,84, 5,99, 6,14, 6,22, 7,44, 8,73, 9,22, 9,38 und 9,63 μ auf.

Beispiel 5

50 Volumteile sterilisierte 70°/_Oige Bierwürze werden mit Leptosphaeria maculans geimpft und 4 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexori in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27⁰ geschüttelt. Nach • 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papier chromatographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17 α-Oxy cortexon (Substanz S von Reichstein), Welches wie im Beispiel ι isoliert und kristallisiert wird.

Beispiel 6

50 Volumteile Sterilisierte 7o°/₀ige Bierwürze werden mit Cucurbitaria laburni geimpft und 5 Tage bei 27⁰ geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt. Nach 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papierchromätographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich I7a-Oxycoftexon (Substanz S von Reichstein), Welches wie im Beispiel ι isoliert und kristallisiert wird.

Beispiel 7

50 Volümteile sterilisierte 7o°/₀ige Bierwürze werden mit Acrospeira levis geimpft und 3 Tage bei 27⁰ geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eifie Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volurhteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben; und das Gemisch wird weiter bei 27⁰ geschüttelt. Nach 3 Tagen wird dasMycel abfiltriert und dasKulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Extraktiönsrückstand enthält, wie die papierchromatographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17 a-Oxycortexon (Substanz S Von Reichstein), welches wie im Beispiel I isoliert und kristallisiert wird.

Beispiel 8

50 Volurnteile sterilisierte 7O°/_Oige Bierwürze werden mit Lophotfichus hartinii geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von ö,oi Gewichtsteilen Cortexön in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt. Nach 2 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturnitrat, wie im Beispiel i beschrieben, extrahiert. Der ao Extraktionsrückstand enthält, wie diepäpierchromato-, graphische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17 a-Oxycortexon (Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel ι isoliert und kristallisiert wird.

Beispiel 9

50 Volumteile sterilisierte 70°/_Oige Bierwürze werden mit Melanospora pafasitica geimpft und 3 Tage bei 27⁰ geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt. Nach

2 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturnitrat, wie im Beispiel i beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papierchromatographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17 a-Oxycortexon (Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel I isoliert und kristallisiert wird.

Beispiel 10

50 Volumteile sterilisierte 70°/_Oige Bierwürze werden mit Thielavia terricola geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27⁰ geschüttelt. Nach

3 Tagen wird das Mycel abfiltriert Und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie diepapierchfomatographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmateriäl hauptsächlich .17 a-Oxycortexon (Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel ι isoliert und kristallisiert wird.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide durch Bebrütung mit Kulturen oxydierend wirkender Pilze oder den durch diese erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen unter aerober. Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Pregnanreihe, die in 17-Stellung ein Wasserstoff atom aufweisen, der biologischen Oxydation mit Pilzen der Arteli Trichotheciurn

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   roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica, Thielavia terricola in bekannter Weise unterwirft und die erhaltenen 17-Oxyverbindungen der Pregnanreihe in bekannter Weise isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pregnanverbindungen Progesteron, ii-Keto-progesteron, Pregnenolon, Cortexon, Corticosteron, ii-Dehydro-corticosteron, i, 4-Pregnadien-2i-ol-3,11, 20-trion oder 1, 4-Pregnadien-ii/?, 2i-diol-3, 20-dion verwendet.