CH331974A - Verfahren zur Herstellung von ungesättigten 17-Keto-steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von ungesättigten     17-Keto-steroiden            fxn,--enstand    der vorliegenden Erfindung ist  ein Verfahren zur Herstellung von wenigstens  im Ring A ungesättigten     1.7-Keto-steroiden     durch Abbau der Seitenkette von Verbindun  gen der     Pregnan-    oder     Allopregnanreihe    und  gleichzeitige Einführung mindestens einer  Doppelbindung im Ring A auf biochemischem  Wege.  



  Das Verfahren ist dadurch     gekennzeichnet,     dass man auf Verbindungen der     Pregnan-    oder       Allopregnanreihe,    die in     3-Stellung    und in  einer der Stellungen 17 und 20 eine freie oder       @,eschützte        Oxy-    oder     Oxogruppe    aufweisen,  die Kultur eines     Eumyceten    oder entspre  chende Enzyme einwirken lässt,     derart,    dass  einerseits die     17-Seitenkette    abgespalten und  anderseits im Ring A wenigstens eine Dop  pelbindung gebildet wird.

   Besonders geeignet  sind Kulturen folgender Arten von     Eumyce-          ten:        Fusarium        solani,        Fusarium        caucasicum,          Rhizopus        suinits,        Venturia        chlorospora    oder       Venturia        linieerae    bzw. entsprechende En  zyme.  



  Zur Kultivierung der genannten Pilze eig  nen sich die an sich     hiefür    bekannten Medien,  z. B. solche mit Zuckern, wie Glucose oder       Lactose,    mit     Peptonen,        Maisquellwasser,    Soja  produkten und dergleichen, sowie mit Mineral  salzen oder aber synthetische Nährlösungen.  Man arbeitet insbesondere unter     aeroben    Be  dingungen, beispielsweise in Schüttelkultur  oder bei untergetauchtem Wachstum unter  Rühren und Luftzufuhr. Die     Eumyceten    un-         tersehciden    sich von andern     Mikroorganismen,     z. B. den Bakterien, durch gutes Wachstum  unter verhältnismässig einfachen Zuchtbedin  gungen.

   Die Reaktion findet in der beschrie  benen Pilzkultur bzw. mit Hilfe der abge  trennten Enzyme statt, also zum Beispiel in  einer     Aufschlämmung    des abgetrennten Pilz  mycels, des homogenisierten     Pilzmy    Gels oder  in Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten  davon.  



  Als Ausgangsstoffe für das neue Verfah  ren kann man     gesättigte    oder. ungesättigte  Verbindungen der     Pregnan-    oder     Allopreg-          n.anreihe        verwenden,    z: B.

   Progesteron,     11-          Dehydro-progesteron,        11-Keto-progesteron,     11-, 12- oder     14-Oxy-progesterone,   <B>A5-</B> oder       44-Pregnen-3-ol-20-one,        d5-Pregnen-3,20-diole,          11-Desoxy-corticosteron,        Corticosteron,        11-De-          hydro-corticosteron,        Pregnan-3,20-dion,        Preg-          na.n-3-ol-20-on,        Allopregnan-3,20-dion,    3ss  Acetoxy-allopregnan-20-on bzw.

   entsprechende  Verbindungen mit geschützten     Oxy-    oder       Oxogruppen.    Als geschützte     Oxygruppen     kommen zum Beispiel mit einer     aliphatischen,     aromatischen oder     heterocyclischen        Carbon-          säure,    beispielsweise Essigsäure,     Propionsäure,          Benzoesäure    oder     Fiuanearbonsäure,        ver-          esterte    oder     verätherte        Oxygruppen,    z.

   B. die       Tetrahydropyranyl-oxy-,        Benzyloxy-    oder     Tri-          phenylmethoxygruppe,    in Betracht und als  geschützte     Oxogruppen    vorteilhaft     ketalisierte          Oxogruppen,    abgeleitet insbesondere von  einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylen-           dioxygruppe.    Im übrigen können die Aus  gangsstoffe Doppelbindungen, z.

   B. in     4-,    5-,  6-, 7-, 8-, 9 :11-, 11- oder     14-Stellung,-oder    zu  sätzliche     Substituenten    aufweisen, wie freie  oder geschützte     Oxy-,        Oxo-    oder     Carboxyl-          gruppen,        ferner        Epoxygruppen    oder Halogen  atome, beispielsweise in     4-,    5-, 6-, 7-, 8-, 9-,  11 -, 12-,     l4-,    15- oder     21-Stellung.    Als Aus  gangsstoffe kommen auch Verbindungen der       Nor-    oder     Homo-Reihen    in Betracht.

   Das Ver  fahren lässt sich auch mit     Substanzgemischen     durchführen, die einen oder mehrere der oben  genannten Ausgangsstoffe enthalten. So er  hält man zum Beispiel, ausgehend von dem  bei der     Cholesterinoxydation    gebildeten Neu  tralteil, insbesondere nach anschliessender     De-          hydrierung    der     3-Oxygruppe,    u. a. das     41,4-          Androstadien-3,17-dion.     



  Die Isolierung der Verfahrensprodukte  lässt sieh nach bekannten. Methoden vorneh  men. Ihre Abtrennung kann zum Beispiel  durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit  einem organischen Lösungsmittel, z. B.     Me-          thylenchlorid    oder Essigester, erfolgen. Für  die weitere Reinigung des so erhaltenen Ex  traktes eignen sich besonders     Chromatogra-          phie,    z. B. an Aluminiumoxyd oder     Silicagel,          Anwendung    von Verteilungsmethoden, z. B.

    dem Gegenstromverfahren, oder die Tren  nung mittels     Girard-Reagentien,    wie     Tri-          methy        lammonium-    oder     Pyridinium    -     essig-          säurehydrazid.    Anschliessend an eine solche  Reinigung oder an ihrer Stelle wird schliess  lich vorzugsweise aus organischen oder     wäs-          serig-organischen    Lösungsmitteln umkristalli  siert.  



  Mit dem neuen biochemischen Verfahren  lässt sich zum Beispiel das Progesteron wie  auch     d        5-Pregnen-3,8-ol-20-on    oder     11-Desoxy-          corticosteron    unter     Verwendung    zum Beispiel  von     Fusarium        solani    in nur einer Verfahrens  stufe und mit hoher Ausbeute in d     1#4-Andro-          stadien-3,17-dion    überführen. Diese Umwand  lung ist chemisch sonst nur in einem vielstu  figen Verfahren mit     wesentlich    niedrigerer  Gesamtausbeute möglich.

   Das genannte Reak  tionsprodukt stellt ein wichtiges Ausgangs  material für die Synthese von     Oestron    dar, das    daraus in einer     einzigen        Verfahrensstufe    er  hältlieh ist.  



  Die     Verfahrensprodukte    können als     Ileil-          mittel    oder als Zwischenprodukte zu deren  Herstellung dienen.  



  <I>Beispiel 1</I>  Liter einer Nährlösung, bestehend aus  30     cnis        31aisquellwasser,    50 g     Pepton,        '?00        in-          'J    und Leitungswasser, werden     gleieh-          mässig    in 13     Erlenmeyerkolben    von je 1 Liter  Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert.  Das     p1;    dieser Lösungen     beträgt    6,4.

   Sie wer  den mit einer     Kultur    des Pilzes     Fusarium          solani    beimpft und bei 25  mechanisch     ge-          sehüttelt.    Nach 48     Stunden    hat sich der Pilz  stark vermehrt. Auf die 13     Erlenmeyerkolben     verteilt man unter sterilen Bedingungen eine  Lösung von 1,0 g Progesteron in 45     eins        Aee-          ton.        3lan        sehüttelt    noch weitere 48 Stunden  bei obiger Temperatur und filtriert dann vom       Mycel    ab.

   Das     pr,    des Kulturfiltrates beträgt.  jetzt 7,9.  



  Die Lösung wird einmal mit. 1500     em3,     zweimal mit. je 1000     em3    und schliesslieb  zweimal mit je 500 eins     Methylenehloric1     ausgeschüttelt. Der Extrakt wird zweimal  mit je 300     em3        0,1-n.Salzs'äure,    zweimal  mit je 300 eins     lo/oiger        Natriumbiearbo-          nat-Lösung    und dreimal mit je 300     cm3     Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge  trocknet und im     Vakuum    eingedampft.

   Den  teilweise kristallinen Rückstand (1,14 g)     Ihro-          rnatogra.phiert    man an einer mit 30 g Alumi  niumoxyd     bereiteten    Säule in     Benzol-Pet.rol-           < ither    - (6 : 4) -Lösung nach der     Durehlauf-          methode.     



  Die     Benzol-Petroläther-    und     Benzol-Eluate          werden    vereinigt und aus einem     Aeeton-Petrol-          äther-Gemiseh    kristallisiert.     plan    erhält     pa-          pierehromatographiseh    einheitliche farblose,  rhombische Platten vom F.<B>=</B>     145-146 ;        10,1n     =     -f-110         +        -1         (CI1C13),    +     113           40    (Alko  hol).

   Diese Verbindung stellt das bekannte       :11,4-Anclrostadien-3,17-dion    dar. Ausbeute       etwa        80        %.     



  Wird an Stelle der     Progesteron-Lösung     eine Lösung von 1 g     11-Desoxy-eorticosteron    in      15     em3    Aceton einer analogen Kultur von       1-'usar@ium        solani    zugesetzt, die Kultur in der       oben    beschriebenen Weise behandelt und auf  gearbeitet, so erhält man das     _31,4-Androsta-          dien-3,17-dion    ebenfalls in hoher Ausbeute.  



  Ersetzt man im obigen Beispiel die Kultur  von     Fusarium        solani    durch eine auf gleichem  Nährboden hergestellte Kultur von     Fusarium          eaueasieum,    so wird Progesteron mit gleich  hoher Ausbeute in     41.4-Androstadieri-3,17-          dion    übergeführt.  



  <I>Beispiel</I>  Zu 4 Liter einer Kultur von     Fusarium    so  lani, die wie in Beispiel 1 beschrieben her  gestellt wurde, gibt man unter sterilen     Be-          (ihigungen    eine Lösung von 1,0g     45-Pregnen-          3ss-o1.-20-on    in 37     em3    Methanol. Die Kultur  wird weitere 48 Stunden bei 260 geschüttelt,       (        cris        31ycel    darauf     abfiltriert    und das Kultur  filtrat wie in Beispiel 1 beschrieben mit     Me-          tl)yienehlorid    extrahiert.  



  Den Extraktionsrückstand     chromatogra-          phiert    man an einer mit 30g Aluminiumoxyd       bereiteten    Säule in einer Lösung von     Benzol-          1'eti-oläther-Gemiseh    (8 :2) nach der Durch  laufmethode. Die ersten     Benzol-Petroläther-          Fraktionen    werden vereinigt (etwa 140 mg)  und aus einem Gemisch von Aceton und     Pe-          trolä.ther        kristallisiert.    Die erhaltenen rhom  bischen Platten vom F. = 145-1460 stellen  das     j        1.4-Androstadien-3,17-dion    dar.

   Einzelne  weitere Fraktionen des     Chromatogramms    ent  halten in kleiner Menge das d     5-Androsten-          3ss-ol-17-on.     



  <I>Beispiel 3</I>  Eine Lösung von 20 g des bei der Chrom  säureoxydation des     Cholestery        lacetat-dibro-          mids        @ebikleten,        entbromten,        hydrolysierten     und anschliessend nach der Methode von     Op-          henauer    dehydrierten     Neutralteils,    in 700     em3          _ieeton    gibt man zu 40 Liter einer Kultur von       Fusarium        solani,    dargestellt nach Beispiel 1  in einem     üblichen    Kulturtank unter Rühren und  Belüften.

   Nach der in Beispiel 1 beschriebenen  Inkubation und Aufarbeitung gewinnt man  <B>5,21</B> g 41,4-     Androstadien-3,1.7-dion.       <I>Beispiel 4</I>  Drei     Erlenmeyerkolben    von je 200     cm3     Fassungsvermögen, enthaltend je 50 cm-' der  in Beispiel 1 beschriebenen,     sterilen    Nähr  lösung werden mit     Fusarium        solani        beimpft     und 48 Stunden, bei 260 mechanisch geschüt  telt. Dann gibt man zu jeder Kultur eine Lö  sung von je 10 mg     Allopregnan-3,20-dion    in  0,5     em3    Aceton und schüttelt weiter bei 260.

    Nach 7 Tagen wird die Kultur filtriert und  wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert. Der       Extraktionsrückstand    wird     papierchromato-          graphisch    untersucht. Er enthält     41.4-Andro-          tadien-3,17-dion.     



  Gibt man im obigen Beispiel an Stelle von       Allopregnan-3,20-dion    eine analoge Lösung  von     3ss-Acetoxy-allopregnan-20-on    zu, findet  man im Extrakt nach siebentägiger Inkuba  tion ebenfalls     41,4-Androstadien-3,17-dion.            Beispiel   <I>5</I>  Vier     Erlenmeyerkolben    von je 200     cm3     Fassungsvermögen, die je 50     em3    der in Bei  spiel 1 beschriebenen, sterilen     Nährlösiuig    ent  halten, werden mit     Fusarium        solani    beimpft  und 48 Stunden bei 260 mechanisch geschüt  telt.

   Dann trennt man das     Mycel    der vier Kul  turen einzeln ab und wäscht es mit Wasser.       Die        3Iy        cele    von zwei Kulturen werden direkt  in zwei     Erlenmeyerkolben    in je 50 cm- destil  liertem     Wasser    suspendiert, während die  andern zwei     Mycele    einzeln zuerst in  einem     Homogenisator    mit 50 cm- destil  liertem Wasser zerkleinert und erst dann in  je einen     Erlenmeyerkolben    transferiert wer  den.

   Zu den zwei     Mycelatifschlämmungen    und  den zwei     Mycelhomogenaten    gibt man je eine  Lösung von 10 mg Progesteron in 0,5     cm3     Aceton und lässt die mit Watte verschlossenen       Erlenmeyerkolben    bei 26  mechanisch schüt  teln. Nach 36 Stunden werden eine     Mycelauf-          schlämmnng    und ein     Mycelhomogenat    filtriert  und wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert.  Die     papierchromatographigche    Untersuchung  zeigt, dass die Extraktionsrückstände neben  wenig Progesteron zur Hauptsache d     1A-An-          drostadien-3,17-dion    enthalten.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von wenigstens im Ring A ungesättigten 17-Keto-steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf Ver bindungen der Pregnan- oder Allopregnan- reihe die in 3-Stellung und in einer der Stel lungen 17 und 20 eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe aufweisen, die Kultur eines Eumyceten oder entsprechende Enzyme einwirken lässt, derart, dass einerseits die 17- Seitenkette abgespalten und anderseits im Ring A wenigstens eine Doppelbindung gebil det wird. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Fusarium solani oder darin enthaltene Enzyme verwendet. 2. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Fusarium caucasicum oder darin enthal tene Enzyme verwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Rhizopus suinus oder darin enthaltene Enzyme verwendet. 4.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Venturia chlorospora oder darin enthal tene Enzyme verwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Venturia linicerae oder darin enthaltene Enzyme verwendet. 6. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, dass man Q14- oder A 5-Verbindungen der Pregnanreihe als Ausgangsstoffe verwen det. 7.

   Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, dass man als Ausgangsstoff Progeste ron verwendet. B. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüehen 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, da.ss man als Ausgangsstoff d J-Preg- nen-3ss-ol-20-on verwendet. 9. Verfahren nach Patentanspi-Lieh und Unteransprüehen 1 bis 6, dadurch -ekenn- zeichnet, dass man als Ausgangsstoff 11-Des- oxy-corticosteron verwendet. 10.

   Verfahren nach Patentansprueh und Unteransprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, dass man als Ausgangsstoff Allo- pregnan-3,20-dion verwendet.