CH339323A

CH339323A - Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der B12-Gruppe unter Verwendung von Montmorillonit

Info

Publication number: CH339323A
Authority: CH
Inventors: Bernhauer Konrad Dr Prof; Dellweg Hanswerner D Dipl-Chem
Original assignee: Aschaffenburger Zellstoffwerke
Priority date: 1954-02-27
Filing date: 1955-01-22
Publication date: 1959-06-30

Description

Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der B12-Gruppe unter Verwendung von Montmorillonit
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der Bl2-Gruppe unter Adsorption an Montmorillonit und Elution der Montmorillonit Adsorbate, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Elutionsmittel wässrige Lösungen mit einempz3-Wert von 6-9 verwendet werden, die Sulfitionen enthalten, wobei saure Komplexverbindungen der Cobalamine mit den Sulfitionen gebildet werden.

Die Verwendung von Montmorilloniten, wie z. B.

Fullererde oder Bentonit, zur Adsorption von verschiedenen Vitaminen bei tiefen pH-Werten ist bereits seit langem bekannt. Es ist auch bekannt, dass die Elution solcher Montmorillonit-Adsorbate üblicher- weise im alkalischen Bereich vorgenommen wird.

Ferner ist auch bekannt, dass man Vitamin B12 an Montmorilloniten bei niedrigen pH-Werten, wie z. B.

2, 5, adsorbieren und sodann bei höheren pH-Werten, wie z. B. 6, 0 bis 9, 0, eluieren kann. Als Elutionsmittel benützt man dabei z. B. Mischungen von organischen Basen, wie z. B. Pyridin oder Picolin, mit Wasser (px Wert der 10% igen wässrigen Lösungen etwa 8, 0).

Schliesslich kann man die Elution auch mit wässrigen Lösungen vornehmen, die einen über 6, 0 liegenden p-Wert haben und ein Anion einer stickstoffhaltigen Säure, wie z. B. Cyanid-, Rhodanid-, oder Nitrit-Ionen enthalten ; dabei wird von der Adsorption an Bentonit oder Fullererde und der Elution mit einer wässrigen Lösung von pH 7-9, die Cyanid-oder Rhodanid-bzw.

Nitrit-Ionen enthält, Gebrauch gemacht.

Die Verwendung von wässrigen organischen Basen als Elutionsmittel besitzt mancherlei Nachteile, die bereits in der Technik bekannt sind und in der Literatur geschildert werden. Anderseits macht aber die bereits bekannte Verwendung von wässrigen Lösungen, die Cyanid-Ionen enthalten, nicht nur im Laboratoriumsmassstab, sondern vor allem auch im technischen Betrieb, besondere Schutzmassnahmen notwendig. Der bekannte mit Rhodanid-oder Nitrit-Ionen erzielbare Effekt ist zudem recht zweifelhaft und geringfügig, wie weiter unten noch näher gezeigt wird.

Die den geschilderten, bisher bekannt gewordenen Methoden zur Elution von vitamin-B12-haltigen Montmorillonit-Adsorbaten anhaftenden Nachteile können vermieden werden, wenn man gemäss der Erfindung solche Adsorbate mit wässrigen Lösungen vom PH 6, 0 bis 9, 0 eluiert, die Sulfitionen enthalten. Ein Verfahren, das auf der Anwendung solcher Sulfitionen enthaltender Lösungen zur Elution von vitamin-Bl2-haltigen Montmorillonit-Adsorbaten beruht, ist bisher nicht bekannt geworden. Die Sulfitionen wirken dabei weitaus stärker als die Rhodanid-oder Nitrit-Ionen bei den bereits bekannten Verfahren und sie übertreffen noch beträchtlich die Wirkung der Cyanid-Ionen enthaltenden Elutionsmittel.

Zu diesem Vorteil kommt noch hinzu, dass Sulfitionen in den zur Anwendung gelangenden Konzentrationen ganz ungefährlich sind, was die technische Anwendung dieses neuen Verfahrens-im Gegensatz zu einem mit Cyanid-Ionen arbeitenden Verfahren-völlig unbedenklich macht.

Die Durchführung des Verfahrens gestaltet sich z. B. wie folgt :
Ein in üblicher Weise hergestelltes vitamin-B12- haltiges Montmorillonit-Adsorbat wird in der 5-bis lOfachen Menge einer gepufferten wässrigen Lösung vom PH 7, 0 bis 9, 0, die 0, 05 bis 0, 25% an Sulfitionen enthält, aufgeschlemmt und unter Schütteln oder Rüh- ren bei Temperaturen zwischen etwa 20 bis 60 15 bis 30 Minuten lang belassen. Nach dem Abtrennen des Montmorillonits durch Filtrieren oder Zentrifugieren wird dieser Prozess erforderlichenfalls noch ein bis zweimal wiederholt. Die vereinigten Eluate enthalten praktisch die gesamte Menge an Vitaminen der B12- Gruppe.

Nachfolgend wird gezeigt, dass Sulfitionen allen andern eventuell in Frage kommenden Anionen überlegen sind und dass man bei deren Anwendung im Elutionsmittel die besten Ausbeuten an Vitaminen der Bl2-Gruppe erhält. Es wird dabei wie folgt verfahren :
20 Liter einer wässrigen Lösung mit einem Gesamtgehalt von etwa 50 mg Vitamin B12 (2, 5 y je cm3) werden mit 10% iger Schwefelsäure auf einen p-Wert von 2, 6 eingestellt. In diese Lösung werden unter Rühren bei etwa 18 125 g (= 0, 62%) Bentonit in 3 Anteilen in Intervallen von je 5 Minuten eingetragen. Nachdem noch eine halbe Stunde gerührt worden ist, wird zentrifugiert.

Das leicht opaleszierende Zentrifugat hat noch einen Vitamin-Bl2-Gehalt von etwa 0, 04 Gamma je cm3, was einem Vitamin-Bl2-Verlust von 1, 6% entspricht. Die Ausbeute an feuchtem Adsorbat beträgt 275g.

Das Adsorbat wird noch feucht in 25 Portionen von je 11 g geteilt, so dass jeder Anteil etwa 2 mg Vitamin B12 enthält. In gleicher Weise werden noch weitere Adsorbat-Portionen hergestellt, so dass insgesamt 64 Proben vorliegen.

Die Elution der einzelnen Anteile erfolgte mit den in der unten stehenden Tabelle angegebenen Lösungen, wobei stets die gleiche Arbeitsweise beachtet wird, und zwar : Die Adsorbat-Anteile werden mit je 50 cm3 des Elutionsmittels übergossen, erforderlichenfalls (Nr. 1, 5 und 8 der Tabelle) auf den gewünschten p-Wert eingestellt, in ein Wasserbad von 54 gebracht und genau 20 Minuten gerührt. Sodann wird zentrifugiert.

Von der überstehenden Lösung werden 20 cm3 entnommen ; Farbe und pH-Wert vermerkt und mit Schwefelsäure auf px 3 eingestellt. Nach einstündigem Stehen unter öfterem Umschütteln wird der pH-Wert wieder auf 7, 0 gebracht, die Proben mit 0, 2 cm3 einer 0, 2% igen Natriumcyanid-Lösung vom pH 7 versetzt und 1 Stunde bei 52 stehengelassen. Danach werden alle Proben mit Phosphatpuffer vom pH 7 auf 30 cm3 aufgefüllt. Im Beckman-Spectrophotometer Modell DU wird sodann das Absorptionsmaximum in der Nähe von 548 oder 361 m, u bestimmt, woraus sich die Ausbeute leicht ermitteln lässt.

Wie die untenstehende Tabelle zeigt, lässt sich mit einem Elutionsmittel, das etwa 0, 08% an Sulfiticnen enthält, bereits bei einmaliger Durchführung der Operation eine 82 bis 86% ige Elution von Vitamin B12 aus den Montmorillonit-Adsorbaten erreichen (Nr. 6a und b und 10 der Tabelle). Bei Erhöhung des Gehaltes an Sulfitionen im Elutionsmittel auf etwa 0, 4% (Nr. 9) ist die Elution bereits nach einer einzigen Operation praktisch quantitativ (95%). Bei Anwendung geringerer Mengen an Sulfitionen muss der Elutionsprozess wiederholt werden, um eine quantitative Elution zu erzielen.

Bei Anwendung von Cyanid-Ionen (Nr. 4a und b) ist der Elutionsgrad deutlich etwas geringer (76 bis 82 , ó) als bei der Verwendung der etwa gleichen Konzentration von Sulfitionen (82 bis 86%). Nitrit-Ionen (Nr. 16 und 17) bewirken eine nur geringfügige Förderung des Elutionsprozesses (Ausbeute 43 bis 47%). Rhodanid Ionen (Nr. 19) haben praktisch keine Wirkung (39% ige Elution). Sehr gut eluieren auch Natriumdithionit (Nr. 11) und Kaliumpyrosulfit (Nr. 12), wobei deren Wirkung dadurch zu erklären ist, dass in wässriger Lösung freie Sulfitionen vorhanden sind.

Eluat Absorptions-Ausbeute
Farbe maximum ms % Wasser, pl3 : 8, 5.............. 7, 7 rot 548 30, 0 2a 2% NaHCOa 8, 3 rot 548 35, 5 2b 2% NaHCO3............. 8, 4 rot 548 36, 0 3 2% Na2HPO4 7, 3 rot 549 40, 0 4a 2% NaHCO3+0, 1% NaCN 8, 5 violett 548 82, 5 4b2% NaHCOg+0, l% NaCN......... 8, 8 violett 548 76, 0 5 2% NaCl+0, 1% NaCN, pe 8, 5.......

8, 6 violett 548 63, 0
6a 2% NaHCO3+0, 1% NaHSO3 7, 9 hellrot 542 86, 5 6b 2% NaHCO3+0, 1% NaHSO3 8, 3 hellrot 544 86, 0 7 2% Na2HPO4+0, 3% NaHSO3 6, 8 hellrot 540 82, 5 8 2% NaCl+0, 1% NaHSO3, pe 8, 5...... 8, 5 hellrot 542 73, 5 9 2% NaHCO3+0, 5% NaHSO3 7, 8 hellrot 540 95, 0 10 2% NaHCO3+0, 1% NazSO3 8, 5 hellrot 542 82, 5 11 2% NaHCO3+0, 1% Na-Dithionit 8, 5 hellrot 542 83, 5 12 2% NaHCO3+0, 1% K-Pyrosulfit hellrot 362 84, 0 13a 2% NaHCO3+0, 1% Thiosemicarbazid .... 8, 6 rot 364 62, 0 13b 2% NaHCO3+0,3% Thiosemicarbazid ....

8, 5 rot 364 69, 0 13c 2% NaHCO3+0,5% Thiosemicarbazid .... 8, 6 rot 364 73, 2 Eluat Absorptions- Ausbeute
Nr. Elutionsmittel pH Farbe maximum mÁ % 14 2% NaHCO3+0, 1% Thioglycolsäure... 8, 4 rot 363 54, 0 15 2% NaHCO3+0,1% Benzidin ........ rot 362 43,0 (1) 16 2% NaHCO3+0,1% Kaliumnitrit . 8, 5 rot 548 47, 5 17 2% NaHCO3+0, 1% Natriumnitrit... 8, 0 rot 548 43, 0 18 2% NaHCO3+0,1% o-Tolidin ....... rot 545 40,5 (1) 19 2% NaHCO3+0,1% Ammonrhodanid . 8,0 rot 548 39,0 20 2% NaHCO3+0,1% Ammonoxalat rot 535-552 35, 0 21 2% NaHCO3+0,1% Ammoniak . . rot 361 30, 0 22 2% NaHCO3+0, 1% Natriumoxalat.. 8, 5 rot 540-550 36, 5 23 2% NaHCO3+0,1% ¯thylenchlorhydrin . rot 361 31, 0 24 2% NaHCO3+0,1% ¯thylendiamin .....

rot 545-362 36, 0 25 2% NaHCO3+0, 1% Bernsteinsäure. rot 362 34, 0 26 2% NaHCO3+0,1% BorsÏure ..... rot 362 36, 0 27 2% NaHCO-E-0, 1% Calciumlactat... rot 362 32, 5 28 2% NaHCO3+0,1% Cystein rot 362 38, 5 29 2% NaHCO3+0, 1% Diphenylamin... rot 362 38, 5 30 2% NaHCO3+0, 1% Fumarsäure.. rot 362 31, 5 31 2% NaHCO3+0, 1% Formamid. rot 361 29, 0 32 2% NaHCO3+0,1% Glykokoll ..... rot 361 32, 5 33 2% NaHCO3+0, 1% Hexamethylentetramin rot 360 30, 0 34 2% NaHCO3+0, 1% Hydrazinsulfat... rot 361 35, 0 35 2% NaHCO3+0, 1% Hydroxylaminhydrat. rot 362 36, 0 36 2% NaHCO3+0,1% K-Ferricyanid ....

gelb nicht auswertbar 37 2% NaHCO3+0, 1% K-Perrocyanid.. gelb nicht auswertbar 38 2% NaHCO3+0,1% Kaliumjodid . . . rot 362 35, 0 39 2% NaHCO3+0, 1% Kaliumjodat... rot 362 35, 0 40 2% NaHCO3+0,1% Kaliumtellurit . . 8, 7 rot54836, 5 41 2% NaHCO3+0, 1% Kaliumtetrathionat. rot 362 25, 5 42 2% NaHCO3+0,1% Magnesiumperchlorat . rot 362 23, 5 43 2% NaHCO3+0,1% Natriumacetat. rot 361 20, 0 44 2% NaHCO3+0, 1% Natriumarsenit... 8, 7 rot 548 36, 5 45 2% NaHCO3+0, 1% Natriumformiat 6, 2 rot 550-560 42, 0 46 2% NaHCO3+0, 1% Natriumhypophosphit durch Eigenabsorption nicht auswertbar 47 2% NaHCO3+0, 1% Natriumkampfersulfonat.

rot 362 24, 5 48 2% NaHCO3+0,1% Natriumnitroprussiat gelb nicht auswertbar 49 2% NaHCO3+0, 1% Natriumphosphit.. rot 362 29, 0 50 2% NaHCO3+0, 1% Natriumselenit. 8, 5 rot 548 35, 0 51 2% NaHCO3+0, 1% Natriumsulfid rot 550-365 29, 0 52 2% NaHCO3+0, 1% Natriumthiosulfat 8, 5 rot 548 38, 5 53 2% NaHCO3+0,1% 8-Oxychinolin gelb nicht auswertbar 54 2% NaHCO3+0,1% o-Phenylendiamin . . braun nicht auswertbar 552% NaH'COg+0, l% m-Phenylendiamin... violett 362 (40) 56 2% NaHCO3+0, 1% o-Phthalsäure... rot 545 25, 5 57 2% NaHCO3+0, 1% Pyridin rot 361 21, 5 58 2% NaHCO3+0, 1% Salicylsäure.

rot 361 28, 0 59 2% NaHCO3+0, 1% Semicarbazid.... 8, 6 rot 362 27, 0 60 2% NaHCO3+0,1% Thioharnstoff . . rot 362 28, 0 61 2% NaHCO3+0,1% TriÏthylamin ..... rot 362 25, 5 62 2% NaHCO3+0,1% TrichloressigsÏure . . . rot 362 24, 6 63 2% NaHCO3+0,1% WeinsÏure ..... rot 362 23, 5 64 2% NaHCO3+0,1% XanthogensÏure (K-Salz) gelb nicht auswertbar 65 2% NaHCO3+0,1% ZitronensÏure .... rot 361 20, 0 (1) Adsorbat blau gefärbt
Thiosulfationen (Nr. 52) haben keinen Effekt.

Eine noch deutlich erhöhte Elutionsfähigkeit besitzen die Verbindungen Thiosemicarbamid (Nr. 13 a, b und c) mit 62 bis 73% und Thioglycolsäure (Nr. 14) mit 54%. Alle übrigen verwendeten Elutionslösungen ergeben Ausbeuten, die zwischen 20 und 40% liegen.

In diesen Fällen ist ein zusätzlicher Effekt gegenüber reinem Wasser oder den reinen Pufferlösungen ohne Zusatz nicht deutlich ersichtlich.

Mit Wasser allein (Nr. 1), dessen Px-Wert vorher auf 8, 5 eingestellt worden war, entstand ein stark getrübtes Eluat, das aber auf Zusatz von 2% Natriumchlorid geklärt werden konnte. Aus diesem Grunde wurde in den Versuchen Nr. 5 und 8, die ohne Anwesenheit eines Puffers durchgeführt wurden, der Elu 2% NaHCO3
Eluat Menge Ausbeute
Nr. cm3 mg Vit. B12% 1 100 0, 89 19, 6
2 100 0, 91 20, 3
3 50 0, 37 8, 2
4 50 0, 34 7, 6
300 cm3 2, 51 mg 55, 7 %
Die Erklärung des Effektes der Sulfitionen bei diesem Prozess ist nicht ganz einfach. Man könnte z.

B. an eine Schutzwirkung der Sulfitionen gegenüber einer eventuellen Zerstörung des Vitamins B12 bei den in Frage kommenden B-Werten denken. Dies ist aber unwahrscheinlich, da Vitamin Bis bei den betreffenden pH-Werten von 7, 0 bis 9, 0 noch ausreichend beständig ist. Ferner gelingt es auch ohne Zusatz von Sulfit, eine fast völlige Elution zu erzielen, wenn der Prozess ge nügend oft durchgeführt wird. Man muss daher annehmen, dass das in Gegenwart von Sulfitionen bei höheren px-Werten entstehende Sulfito-Cobalamin leichter eluierbar ist, als das Aquo-bzw. Hydroxo Cobalamin.

Auch die Tatsache, dass die Adsorption nur bei tiefen px-Werten vorgenommen werden kann, deutet darauf hin, dass das bei tiefen px-Werten vorwiegende Aquo-bzw. Hydroxo-Cobalamin stärker adsorbiert wird als andere Komplexformen des Vitamins B.

Die Elution muss dagegen deshalb bei hohen px-Wer- ten vorgenommen werden, weil unter diesen Bedingungen-je nach den vorhandenen Anionen-andere Komplexformen des Vitamins B12 gebildet werden, unter denen der Cyano-und Sulfito-Komplex besonders leicht eluierbar ist.

Ferner wurde gefunden, dass sich ein besonderer Effekt in der Weise erzielen lässt, dass man das bei der Elution des Montmorillonit-Adsorbates anfallende Eluat mit einem andersartigen Adsorptionsmittel, wie vor allem Aktivkohle, behandelt. Durch die Anwendung von zwei Adsorptionsmitteln mit verschiedenartigem Adsorptionsvermögen gelingt es, eine weitaus bessere Reinigung der Vitamine der B12-Gruppe zu erzielen. Zu tionslösung von vornherein 2% Natriumchlorid zugesetzt.

Ein weiterer Versuch soll die Wirkung von Pufferlösungen mit und ohne Natriumbisulfit noch verdeutlichen :
6 Liter Wasser, in denen 9 mg Vitamin B12 gelöst waren, werden mit 10% iger Schwefelsäure auf pH 2, 5 eingestellt und mit 40 g Bentonit eine halbe Stunde gerührt. Das durch Zentrifugieren erhaltene Adsorbat wird in zwei gleiche Hälften geteilt. Die eine Hälfte wird mit 2% iger wässriger Natriumbicarbonatlösung, die zweite Hälfte mit der gleichen Lösung unter Zusatz von 0, 1 Natriumbisulfit eluiert. Der Prozess wird viermal hintereinander mit je 100, 100, 50 und 50 cm3 bei 54 ausgeführt.

2% NaHCO, +0, l% NaHSO
Eluat Menge Ausbeute
Nr. cm3 mg Vit. Bl2% 1 100 2, 42 53, 6
2 100 1, 09 24, 2
3 50 0, 44 9, 9
4 50 0, 31 6, 8
300 cm3 4, 26 mg 94, 5 % diesem Vorteil kommt noch dazu, dass man auf diese Weise in zwei Adsorptions-und Elutionsschritten sogleich auf den hundertsten Teil des ursprünglichen Volumens kommt.

Die ausserordentliche Wirksamkeit des zweistufigen Adsorptions-und Elutionsprozesses lässt sich dadurch zeigen, dass man in diesem Falle nicht genötigt ist, das nach der Kohleelution anfallende Eluat erst mit 60% Ammonsulfat zu fällen, die Fällung anschliessend mit Alkohol zu extrahieren und erst diesen Extrakt einer Behandlung mit Trichloräthylen- Phenol zu unterwerfen, sondern dass man das Kohleeluat sogleich mit Trichloräthylen-Phenol extrahieren kann, wobei man direkt eine für die Vitamine der B12- Gruppe charakteristische rein rot bis rot violett gefärbte Lösung erhält, die man mit besonderem Vorteil auf kristallisierte Vitamin-Bl2-Präparate weiter verarbeiten kann.

In diesem Fall kann man z. B. wie folgt vorgehen : Eine verdünnte und stark verunreinigte vitamin-Bl2- haltige Lösung wird, wie bereits beschrieben, mit 0, 5% Montmorillonit behandelt. Das daraus gewonnene vitamin-Bl2-haltige Montmorillonit-Adsorbat wird, wie gleichfalls bereits beschrieben, in Gegenwart von Sulfitionen eluiert. Das nach dem Abtrennen des Montmorillonits anfallende wässrige Eluat (etwa 1/"des Volumens der Ausgangslösung) vom PH 8 bis 9 wird auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt. Sodann wird diese Lösung unter Rühren bei einer Temperatur von 10 bis 20 mit 0, 5 bis 0, 8% eines geeigneten andern Adsorptionsmittels, wie z. B. Aktivkohle, versetzt.

Nach etwa 1/2 stündigem Rühren wird das Adsorp tionsmittel abgetrennt. Das in dieser Weise gewonnene vitamin-Bl2-haltige Adsorbat wird nun mit insgesamt etwa 1% des Volumens der ursprünglichen Ausgangslösung (=-10% des Montmorillonit-Eluates) an wäss- rigem Alkohol in 3 bis 4 Einzelprozessen bei 60 bis 80 eluiert. Als alkoholische Elutionsmittel kommen z. B.

Mischungen von Wasser mit 8% n-Butanol, mit 50% Isopropanol oder 70% Äthanol in Frage. Nach dem jeweiligen Abfiltrieren oder Abzentrifugieren des Adsorptionsmittels erhält man schliesslich ein Konzentrat, das die Vitamine der Bl2-Gruppe enthält und nur noch 1/1"des Ausgangsvolumens ausmacht. Nach dem Abdestillieren des Alkohols wird die wässrige Lösung mit einer Lösung von Phenol in einem apolaren Lösungs- mittel extrahiert. Dieses Konzentrat wird in üblicher Weise auf kristallisierte Vitamin-Bl2-Faktoren verarbeitet.

Beispiel 1
28 Liter einer wässrigen Lösung von Vitamin B12 mit einem Gesamtgehalt von 22 mg werden aufpH 2, 5 eingestellt und an 140 g (0, 5%) Frankinol KL adsorbiert. Frankinol KL ist ein Montmorillonitvom Bentonit-Typus. Es handelt sich um ein Markenprodukt. Das Adsorbat wird abgeschleudert und mit einer Lösung von 2% Natriumbicarbonat und 0, 1% Natriumbisulfit in Wasser bei 50 unter Rühren eluiert. Zum ersten Eluat werden 1, 5 Liter, zum zweiten 1 Liter und zum dritten 0, 5 Liter dieser Lösung verwendet.

Man erhält 2, 9 Liter einer Vitamin-Bl2-Lösung, deren Wirkstoff nach Sättigen mit 60% Ammonsulfat in 1 Liter Butanol von dort wieder in 400 cm3 Wasser überführt wird. Die Lösung wird mit p-Chlorphenol gefällt und das so erhaltene und getrocknete Produkt an Whatman-Pulver chromatographiert. Die Ausbeute berechnet sich aus dem Spektrum zu 20, 4 mg, entsprechend 92, 7%.

Beispiel 2
30 Liter Faulschlammfiltrat werden mit 20% iger Schwefelsäure aufpx 2, 6 eingestellt und die entstehende Flockung abzentrifugiert. In das klare Zentrifugat werden dann in der Kälte 350 g Frankonit 5 (ein Mont morillonit-Präparat, Markenprodukt) eingerührt. Nach 11/2 stündigem Rühren wird zentrifugiert. Die Elution des erhaltenen Adsorbates erfolgt mit einer Lösung von 2% Natriumbicarbonat und 0, 1% Natriumbisulfit in Wasser bei 50 bis 60 unter Rühren. Das erste Eluat beträgt 3, das zweite 2, 5 und das dritte Eluat 2 Liter.

Die vereinigten Eluate werden nach Zusatz von 60% Ammonsulfat mit insgesamt 1 Liter Butanol extrahiert.

Aus dem Butanolextrakt werden die Vitamine der Bl2-Gruppe wieder in 500 cm3 Wasser übergeführt.

Nach Entfernen des Alkohols im Vakuum wird die Lösung mit insgesamt 250 cm3 einer 25% igen Lösung von Phenol in Trichloräthylen ausgezogen. Nach Zusatz von 15% Isopropanol lassen sich die Vitamine der B12-Gruppe daraus wieder in Wasser überführen.

Anschliessend wird unter Zusatz von Kieselgur mit p
Chlorphenol gefällt und an Whatman-Pulver mit Butanol chromatographiert. Das Gesamteluat beträgt 500 cm3 und ergibt durch Ausmessung des Spektrums einen Gehalt von 8, 3 Gamma Vitamin B12 pro cm3, was einer Ausbeute von 4, 15 mg entspricht.

Beispiel 3
110 Liter Faulschlammfiltrat mit einer getesteten Vitamin-B12-Aktivität von insgesamt 33 mg werden mit 20% iger Schwefelsäure aufpH 2, 4 eingestellt. Nach Zugabe von 0, 5% (0, 55 kg) Frankinol KL wird 1/2 Stunde gerührt und dann der Ansatz über Nacht bei etwa 10 stehengelassen. Das Adsorptionsmittel hat sich am andern Tag so gut abgesetzt, dass 95 Liter der überstehenden Flüssigkeit angehebert werden kön- nen. Der Rest von 15 Liter wird zentrifugiert. Die Eluation des Adsorbates wird mit insgesamt 10, 5 Liter einer wässrigen Lösung von 2% Natriumbicarbonat und 0, 1 % Natriumbisulfit bei 54 in 3 Anteilen durchgeführt.

1. Eluat 5 Liter mit insgesamt 23, 3 mg Vitamin B12 2. Eluat 3 Liter mit insgesamt 3, 8 mg Vitamin B12 3. Eluat 2, 5 Liter mit insgesamt 2, 4 mg Vitamin B12
29, 5 mg
Um eine völlig klare Lösung zu erhalten, werden die Eluate über Kieselgur angenutscht, anschliessend wird auf px 7, 0 eingestellt und mit 2 g Natriumcyanid zur Aktivierung und zum Schutze des Vitamins Bl2ver- setzt. In diese Lösung werden 0, 8% Kohle eingerührt, die Kohle abzentrifugiert und mit insgesamt 1, 5 Liter 70% igem Äthanol in der Siedehitze eluiert. Das Gesamteluat wird zur Entfernung von Alkohol im Vakuum auf 250 cm3 eingeengt und anschliessend mit Trichloräthylen + 25% Phenol ausgezogen.

Nach Zusatz von Alkohol kann das Vitamin B12 aus der organischen Phase wieder in Wasser überführt werden. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und ergibt nach spektrophotometrischer Untersuchung einen Gesamtgehalt von 27, 9 mg Vitamin B12.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der B12- Gruppe unter Adsorption an Montmorillonit und Elution der Montmorillonit-Adsorbate, dadurch gekennzeichnet, dass als Elutionsmittel wässrige Lösungen mit einem p : E-Wert von 6-9 verwendet werden, die Sulfitionen enthalten, wobei saure Komplexverbindungen der Cobalamine mit den Sulfitionen gebildet werden.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Sulfitionen im Elutionsmittel etwa 0, 08 bis 0, 4% beträgt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dal3 als Sulfitionen abgebende Substanzen schweflige Säure SO2, Sulfite, Bisulfite, Dithionit oder Pyrosulfit verwendet werden.

3. Verfahren nach den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Elutionsmittel durch einen Puffer, wie Natriumbicarbonat oder sec. Natri umphosphat, auf einem-pn-Wert von 7-9 gehalten oder mittels Natronlauge auf diesen p-Wert eingestellt wird.

4. Verfahren nach den Unteransprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Eluat auf einen p,- Wert von etwa 7 eingestellt und mit einem andern Adsorptionsmittel, vorzugsweise Aktivkohle, behandelt und das nach der Elution des Adsorbates erhält- liche Eluat auf kristallisierte Vitamin-Bl2-Faktoren verarbeitet wird.