FR2587362A1 - Procede pour la separation des corrinoides - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE SEPARATION DE CORRINOIDES PAR ADSORPTION SELECTIVE ETOU ELUTION SELECTIVE AU MOYEN D'UN ADSORBANT POLYMERIQUE AYANT UNE GRANDE SURFACE SPECIFIQUE, DANS LEQUEL: A.ON LIE LES CORRINOIDES COMPLETS SUR L'ADSORBANT A PARTIR D'UNE SOLUTION AQUEUSE OU D'UN MELANGE SOLVANT AQUEUX CONTENANT AU PLUS 20 EN VOLUME D'UN ALCOOL ALIPHATIQUE INFERIEUR MISCIBLE A L'EAU OU AU PLUS 5 EN VOLUME D'UNE CETONE ALIPHATIQUE INFERIEURE MISCIBLE A L'EAU, DONT LE PH A ETE AJUSTE A 8 A 11, EN PRESENCE D'IONS CYANURE OU SULFITE, OU DE COMPOSES CAPABLES DE FOURNIR DE TELS IONS, OU B.ON ELUE LES CORRINOIDES INCOMPLETS A PARTIR DES CORRINOIDES ADSORBES SUR L'ADSORBANT DE FACON CONNUE, AVEC UNE SOLUTION AQUEUSE OU UN MELANGE SOLVANT AQUEUX CONTENANT AU PLUS 20 EN VOLUME D'UN ALCOOL ALIPHATIQUE INFERIEUR MISCIBLE A L'EAU OU AU PLUS 5 EN VOLUME D'UNE CETONE ALIPHATIQUE INFERIEURE MISCIBLE A L'EAU, DONT LE PH A ETE AJUSTE A 8 A 11, EN PRESENCE D'IONS CYANURE OU SULFITE, OU DE COMPOSES CAPABLES DE FOURNIR DE TELS IONS.

Description

La présente invention concerne un nouveau procédé pour la séparation des

corrinoYdes. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la séparation de corrinoïdes incomplets à partir de corrinoides complets et pour la séparation ultérieure de divers corrinoïdes complets, au moyen d'un adsorbant polymérique ayant une grande surface spécifique. Les composés ayant un squelette "corrine", comme la vitamine B12 (5,6diméthylbenzimridazolyl-cyanocobamide), premier membre de cette

famille, et biologiquement le plus important, sont des composés pharmacolo-

giquement actifs bien connus. On les prépare par des procédés de fermen-

tation. Les divers microorganismes utilisés pour la fermentation peuvent produire différents composés de "corrine"; et le milieu de fermentation peut contenir des corrinoïdes qui sont à différents stades de biosynthèse lorsque la fermentation est terminée. Les cellules présentes dans le milieu de fermentation contiennent simultanément tant des corrinoïdes complets

(contenant un nucléotide) qu'incomplets (dépourvus de nucléotides).

Les corrinoïdes incomplets, p. ex. le combinamide et les acides

cobiniques, sont biologiquement inactifs et, dans certains cas, nocifs.

Leur présence rend difficile l'isolement et la cristallisation des corrinoTdes complets intéressants (cobalamines). Les corrinoïdes incomplets doivent être évités même dans les produits de vitamine B12 bruts (contenant un mélange de différents composés de "corrine"), qui sont généralement utilisés comme additifs de fourrage, car il est connu que p. ex. le cobinamide donné aux poulets comme additif alimentaire agit comme antagoniste de

la vitamine B12 (E.L. Smith: Vitamin B12, Methuen, Londres, 1960, p. 84).

Dans certains cas il peut également être nécessaire de séparer les uns des autres divers corrinoides complets. Ainsi, si la fermentation est conduite au moyen de microorganismes ayant une population mixte (voir p. ex. le procédé semi-continu décrit dans le brevet hongrois N 159 356), outre les corrinoïdes incomplets principalement ce qu'on appelle le facteur III (5-hydroxy-benzimidazolyl-cyanocobamide) contamine le produit de vitamine

B12. Lorsqu'on l'utilise comme additif au fourrage, le facteur III a essentielle-

ment la même activité que la vitamine B12, et donc dans ce but il n'est

pas nécessaire de les séparer l'un de l'autre. Cependant, pour les applica-

tions chez l'homme, seule la vitamine B12 cristalline pure peut être employée, et donc dans le cas d'une application à l'homme il faut séparer l'un de l'autre la vitamine B12 et le facteur III. Le facteur III séparé de la vitamine B12 peut être purifié plus avant, si on le désire, et utilisé comme additif

de fourrage en tant que tel.

Les spécialistes connaissent divers procédés pour la séparation de corrinoïdes complets d'avec les corrinoïdes incomplets, c'est-à-dire pour la séparation du combinamide et des acides cobiniques d'avec les cobalamines. D'autres procédés connus concernent la séparation de la

vitamine 812 et du facteur III.

Selon le brevet allemand N 930 651 les divers corrinoYdes sont séparés par chromatographie de partage avec un mélange d'eau et de n-butanol contenant des ions cyanure, sur une colonne remplie de poudre de cellulose. On précipite sur gel de silice le produit purifié obtenu à partir de l'eau usée, qui contient le facteur III et les corrinoïdes incomplets outre la vitamine B12, on sèche et on applique le produit obtenu à la colonne ci-dessus. L'ensemble du mode opératoire est essentiellement un procédé analytique, qui ne convient pas pour la séparation de quantités industrielles. De plus, tandis qu'on décrit la manière de séparer le facteur III d'avec les corrinoTdes incomplets, il n'est pas fait mention de la séparation

de ces composés d'avec la vitamine B12.

Selon le brevet britannique NJ 789 019 on isole la vitamine 612 d'un mélange contenant d'autres corrinoïdes également en extrayant

le concentré avec un mélange d'un solvant apolaire et d'un composé conte-

nant un hydroxyle phénolique, en adsorbant la vitamine B12 sur de l'alumine

provenant de la phase solvant et en la dissolvant avec de l'acétone.

Une version perfectionnée du procédé ci-dessus est décrite dans le brevet hongrois N 147 627, dans lequel on sépare le cobinamide

des cobalamines par extraction avec un mélange 1:6 de phénol et de chlo-

roforme, à partir d'un milieu ayant un pH de 4 à 5, après quoi on alcalinise la phase aqueuse à pH 8-9 et on extrait les cobalamines avec un mélange 1:5 de phénol et de chloroforme. On sépare ensuite l'un de l'autre la vitamine B12 et le facteur III dans un milieu acétonique, par chromatographie sur

une colonne d'alumine.

Le procédé décrit dans les deux brevets ci-dessus est désa-

vantageux en ce que pendant l'extraction avec un mélange de phénol et de chloroforme il existe une grande prédisposition à la formation d'une émulsion. Il s'ensuit qu'à grande échelle on ne peut séparer les phases solvant que par un séparateur à centrifugation. Naturellement, la formation de l'émulsion diminue l'efficacité de l'extraction. Un autre inconvénient est qu'il n'y a pas de solution économique pour la régénération des mélanges solvants. En outre, comme l'extraction du cobinamide dans ces conditions

n'est pas sélective, il y a une perte importante en cobalamines.

Selon le procédé décrit dans le brevet hongrois N0 150 555 on sépare les corrinoides incomplets d'avec un mélange de vitamine B12, de facteur III et de corrinoides incomplets provenant d'une solution aqueuse ou alcoolique aqueuse par adsorption sur oxycellulose, après quoi on extrait la vitamine B12 de la solution purifiée obtenue par un mélange 1:7-1:8 de phénol et de chloroforme, contenant du thymol. On lave la phase organique avec de l'eau, on ajoute de l'acétone et on libère du phénol la phase

aqueuse contenant la vitamine B12 par extraction avec du chloroforme.

On fait évaporer la solution et on cristallise la vitamine B12. On obtient le facteur III à partir de la phase aqueuse sous forme cristalline après une étape de purification conduite avec un solvant approprié. Cette dernière

étape de purification n'est pas décrite en détail dans la description du

brevet cité. L'application industrielle de ce procédé est limitée par la

faible capacité d'adsorption spécifique de l'oxycellulose. Un autre inconvé-

nient est que la régénération de l'oxycellulose est malaisée et assez coûteuse à grande échelle, car elle doit être conduite à une température de 60 à 70 C, avec une solution 0,1 N d'acide chlorhydrique. En outre, la séparation de la vitamine B12 et du facteur III fait intervenir l'utilisation de volumes considérables. Pour isoler 1 kg de cristaux de vitamine B12 on utilise dans ce procédé 2,4 m 3 du mélange phénol/chloroforme, et on suppose qu'une quantité analogue de solvant est requise pour l'isolement du facteur III d'avec la phase aqueuse. Comme il n'y a pas de procédé économique pour la régénération de la grande quantité de mélange

phénol/chloroforme/acétone, ceci est un grand inconvénient du procédé.

Aucun des procédés cités ci-dessus ne convient pour la

séparation économique sélective des corrinoides formés pendant la fermen-

tation conduite avec des cultures de microorganismes de populations mixtes,

à l'échelle industrielle.

L'objet de l'invention est de fournir un procédé économique industriellement applicable pour la séparation sélective des corrinoides incomplets d'avec les corrinoides complets, et des corrinoYdes complets,

principalement la vitamine B12 et le facteur III, les uns des autres.

On a trouvé expérimentalement que l'on peut séparer effica-

cement les cobalamines du cobinamide et des acides cobiniques en une seule étape, avec une pureté satisfaisante par adsorption sélective ou élution sur un adsorbant polymérique ayant une grande surface spécifique et, si on le désire, on peut enlever le facteur III de la vitamine B12 dans une étape ultérieure, par élution sélective, et on peut isoler la vitamine

B12 de façon connue.

Dans le procédé selon l'invention à partir d'une solution aqueuse ou à partir d'un mélange solvant aqueux contenant au plus 20% en volume d'un alcool aliphatique miscible à l'eau (de préférence le méthanol ou l'éthanol) ou au plus 5% en volume d'une cétone aliphatique inférieure

miscible à l'eau (de préférence l'acétone) contenant un mélange de corri-

noïdes complets et incomplets, p. ex. les cobalamines, le cobinamide et les acides cobiniques, on adsorbe les corrinoïdes complets sur un adsorbant polymérique ayant une grande surface spécifique, en présence d'ions cyanure ou sulfite ou de composés capables de fournir ces ions, à un pH de 8 à 11, de préférence de 9 à 10, lorsque des corrinoïdes incomplets restent

dans la solution.

Autre solution, on peut adsorber les corrinoïdes complets et incomplets sur l'adsorbant à partir d'une solution aqueuse ou organique aqueuse diluée, à un pH de 2 à 8 de façon connue, après quoi on peut éluer les corrinoïdes incomplets avec une solution aqueuse alcalinisée à un pH de 8 à 11, de préférence de 9 à 10, ou avec un mélange solvant aqueux contenant au plus 20% en volume d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau (de préférence le méthanol ou l'éthanol) ou au plus 5% en volume d'une cétone aliphatique inférieure miscible à l'eau (de préférence l'acétone), en présence d'ions cyanure ou sulfite ou de composés capables de fournir de tels ions, à la température ambiante, tandis que les corrinoïdes

complets restent liés sur la colonne.

Si l'on doit séparer l'un de l'autre la vitamine B12 et le facteur III, dans les deux variantes du procédé on élue le facteur III de la colonne avec un mélange solvant aqueux ajusté à pH 8 à 11, de préférence 9 à 10, contenant de 20 à 40% en volume d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau (de préférence le méthanol ou l'éthanol) ou de 5 à 20% en volume d'une cétone aliphatique inférieure (de préférence l'acétone), en présence d'ions cyanure ou sulfite ou de composés capables de fournir de tels ions, à la température ambiante, après quoi on dissout la vitamine B12 à partir de la colonne de façon connue, p. ex. avec du

méthanol ou de l'acétone aqueuse.

S'il n'est pas nécessaire de séparer l'un de l'autre la vitamine B12 et le facteur III, on dissout les corrinoïdes complets à partir de la solution de façon connue, p. ex. avec du méthanol ou de l'acétone aqueuse

comme il est dit ci-dessus.

Comme adsorbant polymérique ayant une grande surface

spécifique, on peut employer par exemple une résine d'adsorption macro-

réticulaire non-ionique, non-polaire ou légèrement polaire, qui a une taille de pores de 10-8 à 10-7 m et une surface spécifique d'au moins m2 /g. De telles résines comprennent p. ex. l'Amberlite XAD 2, XAS 4,

XAD 7, XAD 8 (Rohm & Haas), Diaion HP 20, HP 21, SP 207, HP 2 MG (Mitsubishi).

Dans le procédé selon l'invention, on peut utiliser comme composés capables de fournir des ions sulfures p. ex. le bisulfite de sodium ou de potassium, le métabisulfite de sodium ou de potassium, le sulfite de sodium ou de potassium, une solution aqueuse d'anhydride sulfureux, des dialcoyl-sulfites, comme le diméthyl-sulfite. Les composés capables de fournir des ions cyanure comprennent p. ex. les cyanures métalliques,

comme le cyanure de potassium, le cyanure de sodium, et le cyanure d'ammo-

nium, l'acide cyanhydrique, etc. Les composés contenant le groupe cyanure sous une forme complexée (p. ex. ferrocyanure de potassium) ou liée à un atome de carbone (p. ex. cyanure de benzyle, benzonitrile) conviennent

également à cet effet.

On peut conduire l'adsorption en mélangeant l'adsorbant

employé avec la solution contenant les corrinoïdes. On peut verser l'adsor-

bant dans une colonne, on peut employer des techniques à lit fixe ou fluide et on peut faire passer les solutions à travers la colonne de haut en bas

ou de bas en haut.

On peut ajuster le pH avec une base appropriée, de préférence

l'hydroxyde d'ammonium ou l'hydroxyde de sodium.

On peut employer la technique de séparation selon l'invention en partant de milieux de fermentation bruts, mais elle convient également

dans le cas d'une solution purifiée.

Les principaux avantages du procédé selon l'invention sont les suivants: 1. La séparation est sélective et il n'y a pas de perte de cobalamines. 2. Le procédé convient également pour la séparation de corrinoïdes à partir de milieux de fermentation bruts après digestion de

cellules et pour le traitement de solutions contenant des corrino'des préala-

blement purifiées en une ou plusieurs étapes.

3. Le procédé fournit d'excellents résultats industriels

car les adsorbants polymériques employés ont une grande surface spéci-

ayant une grande surface spécifique ont une grande capacité d'absorption,

une bonne stabilité physique et chimique et l'adsorbant est facile à régé-

nérer après séparation de l'équipement d'adsorption.

4. Un avantage supplémentaire est que le procédé peut être conduit en présence d'ions sulfite ou de composés fournissant des ions sulfite seulement, c'est-à-dire que si on le désire on peut éviter les ions cyanure et les investissements qu'ils entraînent pour des raisons

de sécurité et d'environnement.

5. Si l'on élue la vitamine B12 avec de l'acétone, selon l'in-

vention on peut facilement cristalliser la vitamine B12 par addition d'une fraction supplémentaire d'acétone. Si l'on emploie d'autres solvants, décrits

dans les procédés de la technique antérieure, on peut précipiter la vita-

mine B12 sous forme cristalline après seulement une autre étape d'évaporation.

6. On peut utiliser le facteur III après séparation et, si on le désire, après élimination des sels, évaporation et séchage sous

forme de concentré d'additif de fourrage.

L'invention sera précisée plus en détail à l'aide des exemples

non limitatifs suivants.

Préparation des produits de départ a) On conduit la digestion du milieu de fermeptation contenant les souches Corynebacterium sp. (24 A1), Corynebacterium sp. (244 C1), Lactobacillus sp. (244 B C1) et Propionibacterium sp. (239 AI/6), déposé à la collection nationale hongroise de bactéries médicales, Institut national de la Santé (OKI) sous les N 76, 77, 78 et 79, respectivement (milieu de fermentation de population mixte producteur de méthane préparé par le procédé décrit dans le brevet hongrois N9 159 356), c'est-à-dire la dissolution des corrinoïdes présents dans la cellule selon le brevet hongrois N 171 339 comme suit:

A 1 m de milieu de fermentation contenant 24,2 g de coba-

lamines et 95,6 g de corrinoïdes incomplets on ajoute 1 litre d'une solution de cyanure de sodium à 10%, on alcalinise la solution à pH 9 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 20%, on chaufe le mélange à 70 C tout

en agitant, et on le maintient à cette température pendant 30 minutes.

On ajoute ensuite 50 litres d'une solution à 30% de chlorure de Fe(III)

(17,4 kg de FeC3. 6HZ O) au mélange, que l'on agite pendant 10 minutes.

On ajuste alors le pH du mélange à 8 avec une solution d'hydroxyde de sodium à 20%. Après avoir agité pendant encore 10 minutes on élimine le précipité du mélange par sédimentation par centrifugation. La solution obtenue contient 23 g de cobalamines et 88 g de corrinoïdes incomplets

pour 1 litre de solution.

b) On purifie le milieu de fermentation préparé selon l'étape a) cidessus comme il est dit dans l'exemple 1 de la demande de brevet britannique N 2 137 207, par séparation des impuretés présentes dans

le milieu de fermentation d'avec les cellules intactes contenant les corri-

noïdes par adsorption sur une résine d'absorption macroréticulaire, puis par digestion des cellules et dissolution des corrinoïdes. On conduit l'adsorption sélective ou l'élution sélective des corrinoïdes selon l'invention en partant de la solution à précipité obtenue. On purifie le milieu de fermentation comme suit: On purifie 1 m 3 d'un milieu de fermentation obtenu comme il est dit dans l'étape a) ci-dessus, qui contient 28 mg de vitamine B12 et 5,2 mg de facteur III avec 129 mg de corrinoïdes incomplets par litre, dans un système d'adsorption à lit fluide à deux éléments, dans lequel les éléments sont reliés en série. On fait passer de façon continue le limieu de fermentation non filtré à travers deux équipements ayant chacun un volume utile de 25 litres et on remplit avec 10 litres de résine d'adsorption Diaion SP207, à raison de 100 litres/heure. Pendant ce temps la majorité des impuretés cellulaires présentes dans le milieu de fermentation est adsorbée sur la résine. On lave ensuite les colonnes avec 100 litres d'eau, on ajoute 2500 ml d'une solution de métabisulfite de potassium à 10% au milieu de fermentation partiellement purifié obtenu, et on ajuste le pH

à 4 par addition continue d'une solution aqueuse à 50% d'acide sulfurique.

On chauffe alors le milieu de fermentation à 110 C dans un système continu, avec un temps de séjour de 10 minutes, dans lequel les cellules sont digé- rées et les corrinoïdes sont dissous dans le milieu de fermentation. On refroidit alors le milieu de fermentation à une température inférieure à 30 C en le faisant passer à travers un échangeur de chaleur. La solution obtenue contient 27 mg de vitamine B12, 5 mg de facteur III et 118 mg de

corrinoïdes incomplets par litre.

c) A partir du milieu de fermentation obtenu dans l'étape a) on obtient un concentré aqueux contenant des corrinoides tant complets qu'incomplets en suivant les procédés décrits dans les demandes de brevet britanniques N 2 137 207 et 2 149 407 de la façon suivante: On fait passer le milieu de fermentation purifié et digéré comme il est dit dans l'étape b) à travers deux colonnes reliées en série contenant chacune 10 litres de résine Diaion SP 207, de bas en haut, en utilisant une technique de lit fluide. Dans cette étape les corrinoides complets et incomplets sont adsorbés sur la résine. On enlève des colonnes par lavage à l'eau les débris cellulaires et le impuretés organiques et inorganiques, dans le même sens que celui adopté pour l'adsorption. On applique ensuite aux colonnes 20 litres de solution aqueuse contenant au total 3 g de cyanure de potassium, de bas en haut pour former la forme cyano des corrinoides. Après avoir laissé reposer pendant 10 minutes on enlève l'eau contenant le cyanure de potassium des colonnes, qu'on lave ensuite avec 100 litres d'eau. On dissout les cyanocorrinoïdes à partir de la résine avec 100 litres d'une solution de méthanol à 90% en volume, qu'on fait passer à travers les colonnes de façon continue de haut en bas. A Partir de l'éluat méthanolique on élimine le méthanol par évaporation à 50 C. On obtient 10 litres d'un concentré aqueux contenant 23 g de

vitamine B12, 4 g de facteur III et 99,7 g de corrinoïdes incomplets.

Le procédé selon l'invention est précisé par les exemples

de traitement suivants.

EXEMPLE 1

On ajuste à pH 9,5 avec une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium un concentré aqueux préparé à partir de 1 m3 de milieu de fermentation selon l'étape c) ci-dessus, qui contient 27 g de cobalamines et 99,7 g de corrinoïdes incomplets, après quoi on ajoute à la solution g de métabisulfite de potassium. On fait alors passer la solution à travers une colonne d'adsorption de 100 x 100 mm préparée à partir de 5 litres de résine Diaion HP-20, à raison de 5 litres/heure, on lave la colonne avec 5 litres d'eau alcalinisée à pH 9,5 avec une solution concentrée

d'hydroxyde d'ammonium et contenant 1 g/litre de métabisulfite de potassium.

On lave alors la colonne à neutralité avec de l'eau. La solution passée à travers la résine et les solutions de lavage aqueuses contiennent la quantité totale de corrinoldes incomplets présente dans la solution de départ, tandis que les cobalamines sont adsorbées sur la résine. On élue les cobalamines avec 2 litres de méthanol aqueux à 90% en volume de façon connue. Après évaporation du méthanol, la solution aqueuse contient g de cobalamine. Rendement: 92,6% par rapport à la teneur en cobalamine

du concentré de départ.

EXEMPLE 2

A 15 litres de concentré aqueux obtenu à partir de 1,5 m3 d'un milieu de fermentation selon l'étape a) décrit en liaison avec la préparation des produits de départ, contenant 40,5 g de cobalamines et 177 g de corrinoïdes incomplets ainsi que 5% de méthanol résiduel (après enlèvement par évaporation du volume principal de méthanol), on ajoute 150 ml d'une solution à 10% de cyanure de potassium. On ajuste le pH à ,0 avec une solution 2 N d'hydroxyde de sodium. On fait passer la solution obtenue à travers une colonne préparée à partir de 6 litres de résine d'adsorption Amberlite XAD-2 à raison de 6 litres/heure, après quoi on lave la colonne à fond avec 10 litres d'eau. La solution passée à travers la colonne et la liqueur de lavage contiennent la totalité des corrinoïdes incomplets. On élue les cobalamines adsorbées sur la résine avec 6 litres

d'une solution aqueuse à 80% en volume de méthanol de façon connue.

On fait évaporer le méthanol pour donner une solution aqueuse contenant 36,45 g de cobalamine. Rendement, par rapport à la teneur en cobalamine

du concentré aqueux de départ: 90%.

EXEMPLE 3

On fait passer un mélange aqueux contenant les corrinoldes, d'autres matières dissoutes pendant la digestion des cellules et des débris cellulaires obtenus comme il est dit dans l'étape b) ci-dessus à partir de 1000 litres de milieu de fermentation, qui contient 32 -g de cobalamines, 118 g de corrinoïdes incomplets et a un pH de 4,0, à travers une colonne remplie de 20 litres de résine d'adsorption Diaion SP 207 de bas en haut, à raison de 200 litres/heure. Dans cette étape tous les corrinoïdes sont adsorbés sur la résine. On enlève par lavage de la colonne de résine les débris cellulaires et les impuretés organiques et inorganiques dans le même sens que celui o s'est faite leur adsorption. On fait ensuite passer 200 litres d'une solution aqueuse de haut en bas 'à travers la colonne, contenant 0,1% de cyanure de potassium, 4% en poids d'acétone et a un pH de 9,5. On lave alors la colonne avec 200 litres d'eau. La totalité des corrinoïdes incomplets présents dans le mélange de départ est présente dans la liqueur de lavage alcaline contenant le cyanure de potassium et dans la liqueur de lavage aqueuse ultérieure. On élue les cyanocobalamines de la résine d'adsorption de façon connue, avec une solution aqueuse d'acétone à 60% en volume. Après évaporation de l'acétone, on obtient une solution aqueuse contenant 28,5 g de cobalamine. Rendement, par rapport à la teneur en cobalamine du milieu de fermentation de départ purifié et digéré:

89%.

EXEMPLE 4

On ajuste à 9,0 avec de l'hydroxyde de sodium le pH de 1000 litres du milieu de fermentation obtenu comme il est dit en liaison avec la préparation des produits de départ dans l'étape a), contenant 23 g de cobalamines et 88 g de corrinoides incomplets, et qui a été digéré et libéré du précipité par centrifugation. On dissout 50 g de cyanure de sodium dans le milieu, que l'on fait alors passer de bas en haut à travers une colonne remplie de 40 litres de résine d'adsorption Diaion SP 207, en utilisant une technique de lit fluide, pour lier les cobalamines. Dans ces

conditions les corrinoïdes incomplets ne sont pas adsorbés sur la résine.

On lave l'adsorbant avec de l'eau, à nouveau de bas en haut, en utilisant une technique de lit fluide, après quoi on élue les cyanocobalamines avec une solution de méthanol à 90% de façon connue. L'éluat contient 20,24 g de cyanocobalamines. Rendement, par rapport à la teneur en cobalamine

du milieu de fermentation digéré de départ: 88%.

EXEMPLE 5

On alcalinise à pH 9,5 avec une solution aqueuse 1 N d'hydroxyde de sodium 10 litres d'une solution aqueuse purifiée et transformée en un composé cyvano comme il est dit en liaison avec la préparation des produits de départ dans l'étape c), contenant 27 g de cobalamines et

99,7 g de corrinoïdes incomplets. On dissout 50 g de méta-

bisulfite de potassium dans la solution, que l'on fait alors passer à travers 4 litres d'une colonne de résine Diaion HP2MG ester acryliquepolymère

légèrement polaire. On lave alors la colonne à neutralité avec de l'eau.

La solution passée à travers la colonne et la liqueur de lavage alcaline contient la totalité des corrinoides incomplets présents dans le produit de départ. On élue alors les cobalamines de la résine d'adsorption avec une solution d'éthanol à 65%, de facon connue. L'éluat contient 23,2 g de cobalamines. Rendement, par rapport à la teneur en ingrédient actif

du concentré aqueux de départ: 86%.

EXEMPLE 6

On suit essentiellement le procédé décrit dans l'exemple 1, en partant de 10 litres d'un concentré aqueux contenant 23 g de vitamine B12, 4 g de facteur III et 99,7 g de corrinoides incomplets, sauf que les cobalamines adsorbées sur la résine sont éluées sélectivement et non ensemble. On le fait en faisant passer 10 litres d'eau contenant 10% en volume d'acétone (o sont dissous 2 g de cyanure de potassium après ajustement du pH à 9,5 avec de l'hydroxyde d'ammonium) à travers une colonne remplie de 5 litres d'adsorbant Diaion HP 20 de bas en haut, à

raison de 5 litres/heure. On lave ensuite la colonne avec 5 litres d'eau.

On combine l'éluat et la liqueur de lavage et à partir du mélange obtenu on prépare un produit contenant le facteur III approprié pour application comme additif de fourrage, de la façon suivante: On combine i'éluat acétonique alcalin et la liqueur de lavage aqueuse, on ajuste le pH à 4 avec une solution aqueuse à 10% d'acide sulfurique et on ajoute de l'eau jusqu'à ce que la teneur en acétone soit inférieure à 5% en volume. On fait alors passer la solution à travers une colonne remplie de 0,5 litre de résine Diaion HP 20, pour adsorber le facteur III. On lave l'adsorbant avec 5 litres d'eau, et on élue le facteur III avec 1 litre d'une solution de méthanol à 90%. L'éluat contient 3,7 9 de facteur III. Rendement: 92,5%. Après évaporation du méthanol et séchage de la solution aqueuse par pulvérisation, on utilise le produit comme additif

de fourrage.

Après l'élution du facteur III et le lavage aqueux, on lave la colonne de résine avec 1,5 litre d'une solution 0,1 N d'acide acétique puis avec de l'eau jusqu'à ce qu'elle devienne neutre. On dissout la vitamine B12 à partir de la colonne avec 2 litres d'une solution aqueuse à 70% en volume d'acétone. A partir de la solution obtenue on cristallise la vitamine B12 de façon connue, en ajoutant de l'acétone. Rendement: 19,3 g de vitamine

B12, 84% par rapport au concentré aqueux de départ.

EXEMPLE 7

On traite 15 litres d'un concentré aqueux préparé à partir de 1,5 m 3 de milieu de fermentation tel que décrit dans l'étape c) du procédé décrit ci-dessus en liaison avec la préparation des produits de départ, contenant 5% en volume de méthanol, 34,5 g de vitamine B12, 6 g de facteur III et149,6 g de corrinoïdes incomplets, comme il est dit dans l'exemple 2, sauf qu'on dissout séparément la vitamine B12 et le facteur III adsorbés sur la résine, de la façon suivante: On fait passer 30 litres d'eau contenant 30% en volume de méthanol (on ajuste le pH à 9,0 avec une solution 1 N d'hydroxyde de sodium), o l'on a dissous 0,01% de cyanure de potassium, à travers 6 litres d'une colonne d'Amberlite XAD 2, à raison de 6 litres/heure. On lave alors la colonne à fond avec 6 litres d'eau. On combine l'eau de lavage avec l'éluat. La solution obtenue contient 5,4 g de facteur III. On ajuste le pH à 4 à 4,5 avec une solution aqueuse à 10% d'acide chlorhydrique, et on ajoui de l'eau à la solution jusqu'à ce que sa teneur en méthanol soit inférieure à 10% en volume. On fait alors passer la solution à travers 1 litre d'une colonne de résine Amberlite XAD 2 pour adsorber le facteur III, on lave la colonne avec 5 litres d'eau, après quoi on élue le facteur Ill avec 2 litres d'une solution de méthanol à 90%. On fait évaporer le méthanol et on sèche par pulvérisation la solution aqueuse résiduelle

pour donner un produit que l'on peut utiliser comme additif de fourrage.

Après l'élution du facteur III et le lavage à l'eau, on lave la colonne de résine avec des quantités supplémentaires d'eau jusqu'à ce que l'eau déchargée soit neutre. On fait ensuite passer 2,5 litres d'une solution de méthanol à 90% à travers la solution pour dissoudre la vitamine

B12. Après avoit laissé reposer pendant 10 minutes on décharge l'éluat.

On répète deux fois le traitement ci-dessus avec des fractions d'1 litre de méthanol à 90% en volume à chaque fois. L'éluat combiné contient

31,4 g de vitamine B12. A partir de la solution aqueuse obtenue après évapo-

ration du méthanol on obtient de façon connue 31 g de vitamine B12 cris-

talline brute, en ajoutant une quantité 7 fois plus importante d'acétone.

Le produit brut contient 28,9 g de vitamine B12. Par cristallisation de ce produit à partir de l'eau de façon connue on obtient 30,2 g de cristaux de vitamine B12, répondant aux exigences de la VIe Pharmacopée hongroise et ayant une teneur en vitamine B12 de 96%. Rendement: par rapport à

la vitamine B12 présente dans le concentré aqueux de départ: 84%.

EXEMPLE 8

On traite un milieu de fermentation obtenu par purification et digestion de 1000 litres d'un milieu de fermentation de départ tel que décrit dans l'étape b) du procédé présenté en liaison avec la préparation des produits de départ, contenant 27 g de vitamine B12, 5 g de facteur III et 118 g de corrinoïdes incomplets, comme il est dit dans l'exemple 3, sauf qu'après l'élution sélective de corrinoïdes incomplets, on élue le facteur III à partir de la colonne avec 30 litres d'eau ajustée à pH 9,5 avec une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de sodium contenant 15% en volume d'acétone et 0,01% de cyanure de potassium, après quoi on lave la colonne avec 5 litres d'eau. L'éluat et la liqueur de lavage combinés contiennent 4,3 g de facteur III. Rendement, par rapportrr à la teneur

en facteur III du milieu de fermentation digéré de départ: 86%.

Après l'élution du facteur III et le lavage à l'eau, on lave la colonne de résine avec de l'eau jusqu'à ce que l'eau déchargée devienne neutre. On dissout ensuite la vitamine B12 adsorbée sur la résine dans litres d'une solution d'acétone à 70% en volume. A l'éluat on ajoute

le même volume d'acétone pour obtenir la vitamine 812 sous forme cristalline.

Par recristallisation des cristaux bruts obtenus à partir de l'eau, de façon connue on obtient 21,6 g d'un produit cristallin, contenant 96% de vitamine B12 (20,7 g). Rendement, par rapport à la teneur en vitamine B12 du milieu

de fermentation purifié et digéré: 76,8%.

EXEMPLE 9

A Partir de 10 litres de la solution aqueuse obtenue au point a) en liaison avec la préparation des produits de départ, contenant 23 g de vitamine B12, l g de facteur III et 99,7 g de corrinoYdes incomplets, on adsorbe sélectivement la vitamine B12 et le facteur III comme il est

dit dans l'exemple 5, en utilisant 4 litres d'une colonne de résine d'adsorp-

tion Diaion HP2MG. Apres lavage de la résine avec de l'eau, on fait passer 5 litres d'eau contenant 0,02% de cyanure de potassium, % en poids de méthanol et ajustée à pH 10,0 avec une solution aqueuse à 10% d'hydroxyde de sodium, à travers la colonne, qu'on lave alors avec 5 litres d'eau. L'éluat et la liqueur de lavage combinés contiennent 3,4 g de facteur III. On lave alors la résine à neutralité avec de l'eau, et on élue la vitamine B12 à partir de l'adsorbant de façon connue, en utilisant une solution de méthanol à 90% en volume. On fait évaporer le méthanol et on ajoute à la solution aqueuse une colonne sept fois plus importante d'acétone, pour donner 23,57 g de cristaux bruts contenant 80% de vitamine B12. Par recristallisation à partir de l'eau de façon connue on obtient

17,6 g de vitamine B12 (teneur en B12: 96,5%) de qualité pharmacopéique.

Rendement, par rapport au concentré aqueux de départ: 74%.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Procédé de séparation de corrinoïdes par adsorption sélective et/ou élution sélective au moyen d'un adsorbant polymérique ayant une grande surface spécifique, dans lequel a) on lie les corrinoïdes complets sur l'adsorbant à partir d'une solution aqueuse ou d'un mélange solvant aqueux contenant au plus % en volume d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau ou au plus % en volume d'une cétone aliphatique inférieure miscible à l'eau, dont le pH a été ajusté à 8 à 11, en présence d'ions cyanure ou sulfite, ou de composés capables de fournir de tels ions, ou b) on élue les corrinoides incomplets à partir des corrinoïdes adsorbés sur l'adsorbant de façon connue, avec une solution aqueuse ou un mélange solvant aqueux contenant au plus 20% en volume d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau ou au plus 5% en volume d'une cétone aliphatique inférieure miscible à l'eau, dont le pH a été ajusté à 8 à 11, en présence d'ions' cyanure ou sulfite, ou de composés capables de fournir de tels ions, et si on le désire, on élue les corrinoYdes complets liés sur l'adsorbant de façon connue, de préférence avec un solvant organique miscible à l'eau contenant éventuellement de l'eau, ou si on le désire, on élue le facteur III de l'adsorbant avec un mélange solvant aqueux contenant de 20 à 40% en volume d'un alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau ou de 5 à 20% en volume d'une cétone aliphatique inférieure, dont le pH a été ajusté à 8 à 11, en présence d'ions cyanure ou sulfite ou de composés capables de fournir de tels ions, et on élue la vitamine B12 à partir de l'adsorbant de façon connue, de

préférence avec un solvant organique miscible à l'eau, contenant éventuel-

lement de l'eau.

2. Procédé selon la revendication 1, o le pH des solutions utilisées dans les étapes a), b) ou employées pour l'élution du facteur III est ajusté

à 9 à 10.

3. Procédé selon la revendication 1, étapes a) et b), o l'on emploie comme alcool aliphatique inférieur miscible à l'eau le méthanol ou l'éthanol,

et comme cétone aliphatique inférieure miscible à l'eau l'acétone.

4. Procédé selon la revendication 1, o l'on emploie comme composé capable de fournir des ions cyanure ou sulfite le cyanure de potassium ou de sodium

ou le métabisulfite de potassium ou de sodium.