Procédé de préparation d'antibiotiques La présente invention a pour objet un procédé de préparation de néospiramycines à partir de spiramy- cines correspondantes.
Par spiramycines on entend: la spiramycine pro prement dite ou spiramycine totale, telle qu'elle est produite par exemple par fermentation de la souche de streptomyces S-3486 (NRRL No 2420) par le procédé décrit dans le brevet suisse No 321334, ses trois constituants, spiramycines I, II et III (qu'on peut séparer par exemple comme indiqué dans le brevet français No 1211310 ayant pour titre Nou veaux antibiotiques et leurs procédés de prépara tion ), ou des mélanges de ces trois constituants.
Les, nouveaux antibiotiques sont désignés ci-après par le terme néospiramycines ; à la spiramycine et aux spiramycines I, II et III correspondent la néo- spiramycine et les néospiramycines I, II et III. Ce sont des substances basiques solubles dans les sol vants chlorés, les alcools, les hydrocarbures aroma tiques, les cétones, l'acétate d'éthyle et l'acétate d'amyle.
Les caractéristiques, physiques principales des produits homogènes purs néospiramycines 1, II et III sont résumées dans le tableau I ci-dessous
EMI0001.0021
Tableau <SEP> I
<tb> Néospiramycine <SEP> I <SEP> I <SEP> Néospiramycine <SEP> III <SEP> Néospiramycine <SEP> III
<tb> C0/0 <SEP> ............................. <SEP> 61,2 <SEP> 60,9 <SEP> 61,9
<tb> Composition <SEP> élémentaire <SEP> H <SEP> o/ <SEP> -- <SEP> --. <SEP> .....-....-.-..-..-.. <SEP> 9,3 <SEP> 8,65 <SEP> 8,9
<tb> O'o/o <SEP> ............................. <SEP> 25,85 <SEP> 26,55 <SEP> 26
<tb> N'o/o <SEP> <B>...................... <SEP> .......</B> <SEP> 3,75 <SEP> 3,70 <SEP> 3,65
<tb> Equivalent <SEP> neutre <SEP> <B>...........................</B> <SEP> .<B>......... <SEP> ..............</B> <SEP> __...
<SEP> 370 <SEP> 380 <SEP> 390
<tb> pK <SEP> ..........................._.........-..._............................................... <SEP> 7,9 <SEP> 7,9 <SEP> 7,8
<tb> P. <SEP> F. <SEP> (bloc <SEP> Maquenne) <SEP> .... <SEP> .............................................. <SEP> 119-120o <SEP> 116-1180 <SEP> 117-1180
<tb> [a] <SEP> D <SEP> (c= <SEP> 1 <SEP> 9/0, <SEP> méthanol) <SEP> <B>.... <SEP> ...... <SEP> .....</B> <SEP> ..<B>................ <SEP> .....</B> <SEP> -57o <SEP> -56o <SEP> -520
<tb> Spectre <SEP> ultraviolet <SEP> (en <SEP> solution <SEP> dans <SEP> l'éthanol).
<tb> Longueur <SEP> d'onde <SEP> du <SEP> maximum <SEP> d'absorption... <SEP> 232 <SEP> ml, <SEP> 232 <SEP> m[, <SEP> 232 <SEP> m#t
<tb> Ei%mà <SEP> 232m, <SEP> .................................................................
<SEP> 361 <SEP> 362 <SEP> 366
<tb> Spectre <SEP> infrarouge <SEP> ....................... <SEP> .............................. <SEP> .... <SEP> voir <SEP> tableau <SEP> III
<tb> Chromatographie <SEP> sur <SEP> papier <SEP> (1) <SEP> Rf <SEP> <B>__ <SEP> ....................</B> <SEP> 0,02 <SEP> 0,10 <SEP> 0,18
<tb> (1) <SEP> Chromatographie <SEP> sur <SEP> papier <SEP> Whatman <SEP> No <SEP> 1 <SEP> imprégné <SEP> de <SEP> tampon <SEP> 9 <SEP> (P04HNa2, <SEP> 12 <SEP> H20 <SEP> à <SEP> 23,8 <SEP> g/1) <SEP> avec <SEP> comme
<tb> solvant <SEP> de <SEP> développement <SEP> la <SEP> phase <SEP> légère <SEP> du <SEP> mélange <SEP> cyclohexane, <SEP> méthylisobutylcétone, <SEP> eau <SEP> <B>(85:</B> <SEP> 15 <SEP> :
<SEP> 25 <SEP> en <SEP> volumes)
<tb> - <SEP> Technique <SEP> descendante <SEP> - <SEP> Déplacement <SEP> du <SEP> front <SEP> de <SEP> solvant <SEP> de <SEP> 40 <SEP> cm <SEP> en <SEP> 4 <SEP> heures <SEP> à <SEP> 25o <SEP> - <SEP> Révélation <SEP> biologique
<tb> sur <SEP> plaque <SEP> de <SEP> gélose <SEP> ensemencée <SEP> au <SEP> B. <SEP> subtilis.
Leurs- réactions colorées sont identiques et données dans le tableau II
EMI0002.0001
Tableau <SEP> II
<tb> Réaction <SEP> de <SEP> Tollens <SEP> .<B>......................</B> <SEP> Négative
<tb> <SEP> de <SEP> Fehling <SEP> .._. <SEP> <B>-----------</B> <SEP> . <SEP> ..... <SEP> Négative
<tb> n <SEP> de <SEP> Folin-Denis <SEP> <B>------ <SEP> -------</B> <SEP> Positive
<tb> <SEP> de <SEP> Seliwanoff <SEP> .......... <SEP> ..... <SEP> Négative
<tb> Wheeler <SEP> Tollens <SEP> ............ <SEP> Positive <SEP> (Coloration <SEP> orangé <SEP> brun)
<tb> Tollens-Alens <SEP> <B>-----------------</B> <SEP> Positive <SEP> (Coloration <SEP> jaune <SEP> faible)
<tb> <SEP> des <SEP> hexosamines <SEP> <B>------------</B> <SEP> Positive
<tb> à <SEP> l'acide <SEP> périodique <SEP> ...
<SEP> Négative
<tb> de <SEP> Sakaguchi <SEP> <B>.........</B> <SEP> .<B>--------</B> <SEP> Négative
<tb> à <SEP> la <SEP> ninhydrine <SEP> ............ <SEP> Négative
<tb> de <SEP> Nelson <SEP> .. <SEP> .........<B>---------</B> <SEP> Positive
<tb> à <SEP> l'acide <SEP> sulfurique <SEP> ...... <SEP> Positive <SEP> (Coloration <SEP> rose <SEP> avec <SEP> maximum <SEP> d'absorption <SEP> à <SEP> 478 <SEP> et <SEP> 524 <SEP> mu) Les spectres d'absorption infrarouge de ces néo- spiramycines I, II et III ont été déterminés.
Dans le tableau III, on indique les principales bandes d'absorption pour les trois produits.
Tableau III <I>Spectres d'absorption infrarouge</I> <I>des</I> néospiramycines <I>bases 1, 11 et III</I> Le spectre est mesuré sur le produit solide en comprimés avec du bromure de potassium. Position des principales bandes d'absorption exprimées en cm-t.
EMI0002.0008
Base <SEP> I <SEP> I <SEP> Base <SEP> II <SEP> I <SEP> Base <SEP> III
<tb> I
<tb> 3450F <SEP> 3450 <SEP> m <SEP> 3450 <SEP> m
<tb> 2930F <SEP> 2930F <SEP> <B>2930F</B>
<tb> 1742 <SEP> ép.
<tb> <U>1725F</U> <SEP> 1737F <SEP> <B>1735F</B>
<tb> 1453 <SEP> m <SEP> 1453 <SEP> m <SEP> <U>1460 <SEP> m</U>
<tb> 1377 <SEP> m <SEP> <B>1373F</B> <SEP> 1377 <SEP> m
<tb> <U>1319 <SEP> m</U> <SEP> 1319 <SEP> ép.tf <SEP> 1322f
<tb> <U>1300 <SEP> m <SEP> 1300 <SEP> m</U>
<tb> 1270 <SEP> m <SEP> 1270 <SEP> ép.
<SEP> 1272 <SEP> f
<tb> <U>1232F</U> <SEP> 1238 <SEP> f
<tb> 1175 <SEP> ép. <SEP> 1185 <SEP> ép.
<tb> 1165F <SEP> 1165F <SEP> 1165F
<tb> 1121F <SEP> 1121F <SEP> 1122F
<tb> <U>1065 <SEP> t <SEP> F</U> <SEP> 1055t <SEP> F <SEP> 1055 <SEP> t <SEP> F
<tb> 1006 <SEP> m <SEP> 1006 <SEP> m <SEP> 1005 <SEP> m
<tb> 990F <SEP> i <SEP> 990F <SEP> <B>990F</B>
<tb> 938 <SEP> ép. <SEP> t <SEP> f <SEP> <U>938 <SEP> m</U> <SEP> 940 <SEP> ép.
<SEP> t <SEP> f
<tb> 902 <SEP> m <SEP> 902m <SEP> 901 <SEP> m
<tb> i <SEP> 887 <SEP> f
<tb> 872 <SEP> f
<tb> 863 <SEP> f <SEP> <U>858 <SEP> m</U> <SEP> 864 <SEP> m
<tb> 837 <SEP> m <SEP> 837 <SEP> m <SEP> 837 <SEP> m
<tb> 807 <SEP> t <SEP> f <SEP> 808 <SEP> f <SEP> 806 <SEP> m
<tb> 688 <SEP> m
<tb> 659 <SEP> m <SEP> <U>679 <SEP> m</U>
<tb> t <SEP> F <SEP> = <SEP> absorption <SEP> très <SEP> forte
<tb> F <SEP> = <SEP> absorption <SEP> forte
<tb> m <SEP> = <SEP> absorption <SEP> moyenne
<tb> f <SEP> = <SEP> absorption <SEP> faible
<tb> t <SEP> f <SEP> = <SEP> absorption <SEP> très <SEP> faible
<tb> ép.
<SEP> = <SEP> épaulement Les nouveaux antibiotiques sont préparés selon l'invention en amenant à un pH compris entre 3 et 5 des solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooli- ques des spiramycines et en maintenant lesdites solu tions à une température comprise entre 20 et 50 jusqu'à ce que leur activité antibactérienne reste pra tiquement constante. La durée de réaction est varia ble et d'autant plus longue que la température est plus basse et le pH plus élevé. Une méthode pratique consiste à opérer en milieu aqueux sulfurique à pH 4 à une température de 35-40 pendant une dizaine de jours.
Dans ces conditions on observe une évolution de l'activité antibactérienne de la solution sur Bacil- lus subtilis ATCC 6633, évolution qui dans le cas de la spiramycine totale est montrée dans le ta bleau IV
EMI0002.0021
Tableau <SEP> IV
<tb> Temps <SEP> jours <SEP> % <SEP> activité <SEP> conservée
<tb> 0 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 89
<tb> 2 <SEP> 83
<tb> 3 <SEP> 79
<tb> 5 <SEP> 77
<tb> 8 <SEP> 76
<tb> 10 <SEP> 75 Cette activité après avoir diminué jusqu'au cin quième jour reste ensuite pratiquement constante ce qui montre l'existence d'une substance active diffé rente du produit de départ. Cette substance active peut être
extraite de la solution rendue alcaline, par un solvant non miscible à l'eau [tel qu'un hydro carbure aromatique (de préférence le benzène), un hydrocarbure chloré (chloroforme, dichloréthane), une cétone (méthylisobutylcétone), un ester (acétate d'éthyle ou d'amyle) ou un éther (oxyde d'éthyle ou d'isopropyle)j et isolée par évaporation du solvant à température inférieure à 40-50 puis séchage sous vide à une température de 45,1.
Dans le cas des néospiramycines I, II et III, le produit obtenu peut être purifié par cristallisation, par exemple dans l'éther. Après extraction au benzène les eaux-mères alca lines ne présentent plus aucune activité antibacté rienne et de ces eaux-mères on a pu isoler un produit inactif qui est le même dans tous les cas et possède les caractéristiques suivantes C /o =51,8 H 1)/o = 8,90<B>0</B> a/0 = 39,35 Poids moléculaire (cryoscopie, méthode de Rast) = 162 Point de fusion (bloc Maquenne) = 130-135,) M24 (c=4%,
eau) = -31 11 Les néospiramycines I, II et III peuvent être préparées directement à partir des spiramycines cor respondantes, mais on peut également les obtenir à partir de néospiramycine totale provenant de l'action d'un acide sur la spiramycine totale, ou à partir de mélanges de néospiramycines préparés par action d'un acide sur un mélange de spiramycines.
Pour cette séparation, différentes méthodes peu vent être utilisées : un premier procédé consiste à appliquer la méthode de séparation par distribution à contre-courant par exemple dans un appareil de CRAIG (A. Weissberger - Technique of organic chemistry - Interscience Publishers - New York - Tome IIl, page 286).
On peut opérer à une tem pérature comprise entre 0 et 500, mais il est préfé rable de travailler vers 20-250. On utilise comme solvant les deux phases séparées d'un mélange oxyde d'isopropyle, alcool isopropylique, solution tampon pH environ 8, ou d'un mélange de benzène (ou dichloréthane ou autres solvants non miscibles à l'eau), avec une solution tampon pH 5 à 8.
On peut également opérer la séparation par chro matographie sur alumine en utilisant une solution du mélange des néospiramycines dans un solvant con venable.
Le tableau V ci-après., qui donne, pour un certain nombre de germes, les activités antibactériennes com parées de la spiramycine et de la néospiramycine, montre que cette dernière est en général plus active que la spiramycine.
EMI0003.0041
Tableau <SEP> V
<tb> <I>Activités <SEP> antibactériennes <SEP> de <SEP> la <SEP> néospiramycine <SEP> comparativement <SEP> à <SEP> la <SEP> spiramycine</I>
<tb> (en <SEP> milieu <SEP> liquide)
<tb> Concentration <SEP> minimum
<tb> inhibitrice
<tb> Germes <SEP> exprimée <SEP> en <SEP> mcg/cm3
<tb> Néospiramycine <SEP> I <SEP> Spiramycine
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> <B>................</B> <SEP> .....-<B>........</B> <SEP> ....
<SEP> 1,5 <SEP> 1,4
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Beaujon <SEP> No <SEP> <B>3 <SEP> ... <SEP> ------- <SEP> --------- <SEP> _</B> <SEP> 2,2 <SEP> 1,6
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 10.031 <SEP> <B>------------- <SEP> ----</B> <SEP> 18 <SEP> 33
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> -... <SEP> ... <SEP> .. <SEP> ............... <SEP> 3,1 <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> pseudo <SEP> diphtericum <SEP> .. <SEP> - <SEP> <B>-------------</B> <SEP> 2 <SEP> 3,5
<tb> Mycobacterium <SEP> species <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> ........ <SEP> ... <SEP> .... <SEP> ..... <SEP> 85 <SEP> 85
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> ...<B>..........</B> <SEP> ...-<B>......................</B> <SEP> .. <SEP> 0,06 <SEP> 0,2
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> <B>............. <SEP> ....... <SEP> ............</B> <SEP> ..._ <SEP> ....
<SEP> 0,18 <SEP> 0,5
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 9790 <SEP> <B>------------------------</B> <SEP> 0,6 <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> <B>.... <SEP> ......................... <SEP> ....................</B> <SEP> 0,5 <SEP> 3,1 Dans le tableau VI figurent les activités antibactériennes des néospiramycines I, II et III vis-à-vis des mêmes germes.
EMI0003.0043
Tableau <SEP> VI
<tb> <I>Activité <SEP> antibactérienne <SEP> des <SEP> néospiramycines <SEP> en <SEP> milieu <SEP> liquide</I>
<tb> Concentration <SEP> minimum <SEP> inhibitrice
<tb> Germes <SEP> exprimée <SEP> en <SEP> mcg/cm3
<tb> Néospiramycine <SEP> I <SEP> I <SEP> Néospiramycine <SEP> II <SEP> I <SEP> Néospiramycine <SEP> III
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> .. <SEP> . <SEP> --- <SEP> . <SEP> .... <SEP> ................ <SEP> . <SEP> 1,3 <SEP> 2,1 <SEP> 1,9
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus. <SEP> Beaujon <SEP> No <SEP> 3 <SEP> .... <SEP> . <SEP> ............ <SEP> ... <SEP> 1,5 <SEP> 2,9 <SEP> 2,1
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> ATCC <SEP> 10.031 <SEP> .......... <SEP> 15 <SEP> 15 <SEP> 37
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> <B>........ <SEP> .. <SEP> .............. <SEP> ......... <SEP> ..
<SEP> .</B> <SEP> ..... <SEP> .... <SEP> 1,8 <SEP> 4,5 <SEP> 2,8
<tb> Corynebacterium <SEP> pseudo <SEP> diphtericum <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> ... <SEP> . <SEP> 1,2 <SEP> 3,2 <SEP> 1,8
<tb> Mycobacterium <SEP> species <SEP> ATCC <SEP> 607 <SEP> .... <SEP> 112 <SEP> 112 <SEP> 69
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> ... <SEP> . <SEP> 0,07 <SEP> 0,06 <SEP> 0,03
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> .. <SEP> ... <SEP> .. <SEP> . <SEP> ....... <SEP> ....... <SEP> <B>-------- <SEP> -</B> <SEP> 0,15 <SEP> 0,20 <SEP> 0,10
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 9790 <SEP> .... <SEP> ..... <SEP> ...... <SEP> .... <SEP> 0,5 <SEP> 0,7 <SEP> 0,4
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> . <SEP> - <SEP> ...... <SEP> ... <SEP> ................. <SEP> ................
<SEP> 0,3 <SEP> 0,6 <SEP> 0,4 Les néospiramycines présentent, d'autre part, une toxicité nettement inférieure à celle des spiramycines ; sous forme de sulfate, par voie sous-cutanée, chez la souris, la dose léthale pour 50 % des animaux (DL50) est de 3 à 4 g par kg, alors que la DL,;
" cor respondante pour la spiramycine est de 1,5 à 2,5 g/kg.
Elles sont douées, de plus, d'une activité très grande sur les infections expérimentales de la souris par différents germes, en particulier par les germes Gram-positifs ; des doses très inférieures à la dose léthale 50 fl/o administrées aussi bien par voie sous- cutanée que per os sont capables d'assurer la survie des souris auxquelles on a injecté par voie intrapéri- tonéale des quantités très supérieures à la dose mor telle minimum 100 b/o de suspensions de strepto coques, de pneumocoques et de staphylocoques viru lents.
Exemple 1 <I>Préparation de</I> néospirmnycine <I>à partir</I> <I>de</I> spirarnycine 100 g de spiramycine sous forme de base sont mis en suspension dans 1 litre d'eau distillée et le pH amené à 4 par addition de 225 cm3 de solution normale d'acide sulfurique ce qui a pour effet de solubiliser la spiramycine sous forme de sulfate. La solution ainsi obtenue est conservée pendant 10 jours à la température de 37 .
La solution aqueuse faiblement colorée en jaune est diluée par de l'eau distillée pour amener le volume à 5 litres, le pH est ajusté à 10 par addition de 125 cm3 de solution de soude à 5 '% et la substance active extraite successivement par 5 litres, 2 litres et 1 litre de benzène.
Les extraits benzéniques sont réu nis et concentrés sous pression réduite jusqu'à environ 100 cm3 sans que la température dépasse 40". Le concentrai est ensuite séché pendant 15 heures sous 2 mm à 450.
On obtient ainsi 73 g de produit actif à l'état de base sous forme de poudre blanche qui est la néo- spiramycine.
La néospiramycine présente les caractéristiques suivantes Composition: C'% = 61,9 H % = 9,1 <B>0</B> 0/0 = 25,6 N % = 3,6 [a]D (c = 1 @/0, méthanol) _ -52 Equivalent neutre<B>:
</B> 380 Spectre ultraviolet (déterminé à partir d'une solu tion dans l'éthanol) longueur d'onde du maximum d'absorption 232 mh <B>(El'/-=</B> 362) La chromatographie sur papier Whatman No 1 imprégné de tampon à pH 9 (POlHNa., 12 H.,O à 23,8 g/l) avec comme solvant de développement la phase légère du système cyclohexane, méthylisobutyl- cétone, eau (85 : 15 :
25 volumes) en utilisant la tech nique descendante avec un développement de 4 heu res à 25o montre, après révélation sur plaque de gélose ensemencée par B. subtilis la présence de trois produits caractérisés par les Rf suivants Constituant I - Rf = 0,02 appelé néospiramy- cine I Constituant II - Rf = 0,10 appelé néospiramy- cine II Constituant III - Rf = 0,
18 appelé néospiramy- cine III La détermination de la composition a également été faite par distribution à contre-courant en utilisant un appareil de CRAIG (Technique of Organic Che- mistry - Arnold Weissberger - Interscience Pu- blishers - New York - Tome III, page 286) com portant 60 cellules ayant chacune une contenance totale de 20 cm?.
On emploie comme solvant les deux phases séparées du mélange suivant à la tem pérature de 250.
Oxyde d'isopropyle 98 volumes Alcool isopropylique 2 volumes Solution tampon à pH 8,05 (PO4HNa., 12<U>MO:</U> 22,7 g PO4H_,K : 4,04 g eau q. s. 1 litre) .... .......... ........... . ........ 100 volumes 50 mg de base à étudier sont dissous dans 10 cm3 de la phase légère et la distribution effectuée selon la technique habituelle à ce type d'analyse.
Après distribution les cellules sont vidées et la substance active rassemblée dans la phase aqueuse par distil lation du solvant sous pression réduite et la quantité présente d'antibiotique déterminée par dosage biolo gique. La courbe représentant la concentration en fonction du rang de chaque cellule présente trois maxima qui sont caractérisés par les coefficients de partage suivants des trois constituants
EMI0004.0114
Cellules <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> partage
<tb> présentant <SEP> le <SEP> maximum <SEP> <I>Conc. <SEP> dans <SEP> la <SEP> phase <SEP> solvant</I>
<tb> de <SEP> concentration <SEP> <I>Conc.
<SEP> dans <SEP> la <SEP> phase <SEP> aqueuse</I>
<tb> Néospirarnycine <SEP> I <SEP> 3 <SEP> 0,056
<tb> <B>--------------------- <SEP> ..........................</B> <SEP> . <SEP> 12 <SEP> 0,25
<tb> Néospiramycine <SEP> II <SEP> <B>0</B>
<tb> Néospiramycine <SEP> III <SEP> ..... <SEP> <B>---------</B> <SEP> .<B>----</B> <SEP> ... <SEP> .... <SEP> . <SEP> ..... <SEP> I
<tb> ...
<SEP> 1 <SEP> 27 <SEP> 0,82 10 g de néospiramycine base sont transformés en sulfate par mise en suspension de la base dans 40 cm3 d'eau et addition de solution 2 N d'acide sulfurique jusqu'à ce que le pH atteigne 5, ce qui amène la dissolution de la néospiramycine sous forme de sul- fate. La solution aqueuse est ensuite lyophilisée, ce qui fournit 11 g de sulfate de néospiramycine. S040/010,9 [a121 (c = 2 0/0, méthanol) -45 Il est également possible de préparer d'autres sels tels que chlorhydrate, nitrate, phosphate, tartrate,
oxalate selon la même méthode.
Exemple 2: <I>Préparation de</I> néospiramycine <I>I à partir</I> <I>de</I> spiramycine <I>I</I> 25 g de spiramycine I purifiée sont dissous dans 250 cm3 d'eau en présence de la quantité nécessaire d'acide sulfurique pour amener le pH à 4. La solu tion est traitée et extraite au benzène comme dans l'exemple 1.
On obtient ainsi<B>:</B> néospiramycine I brute<B>:</B> 15,8 g. La néospiramycine I brute est dissoute à l'ébul lition dans 35 cm3 d'éther saturé d'eau, la solution est refroidie lentement à -I- 5 et conservée 15 heures en chambre froide. Les cristaux formés sont essorés, lavés par 3 cm3 d'éther et séchés.
On isole ainsi 9,1 g de néospiramycine I qui est recristallisée suivant le même processus dans 25 cm3 d'éther saturé d'eau.
On obtient finalement 6,2 g de néospiramycine I ayant les caractéristiques suivantes Composition : C % = 61,2 H o/o = 9,3 <B>0</B> o/o = 25,85 N % = 3,75 Equivalent neutre:
370 Point de fusion (au bloc Maquenne) 119-120 [ ]D (c = 1 0/0, méthanol) -570 Spectre ultraviolet (déterminé à partir d'une solu tion dans l'éthanol) longueur d'onde du maximum d'absorption : 232 m#t (El, /%l = 361) La chromatographie sur papier effectuée dans les conditions utilisées dans l'exemple 1 indique la pré sence d'un seul produit caractérisé par un Rf de 0,02.
2 g de néospiramycine I base sont transformés en chlorhydrate par mise en suspension dans 10 cm3 d'eau et addition de solution normale d'acide chlor hydrique en quantité suffisante pour amener le pH à 5 ce qui amène la dissolution de la néospiramy- cine I sous forme de chlorhydrate.
La solution aqueuse est lyophilisée ce qui fournit 2,2 g de chlor- hydrate de néospiramycine I ayant les propriétés ci- dessous Cl Vo 8,5 [ ]21 (c = 2 %, méthanol)
- 51 0 Exemple 3 <I>Préparation de</I> néospiramycine <I>II à partir</I> <I>de</I> spiramycine <I>II</I> 25 g de spiramycine II cristallisée sont transfor més en néospiramycine II par traitement dans l'eau à pH 4 et extraction au benzène selon la méthode décrite dans l'exemple 2.
On obtient ainsi<B>:</B> néospiramycine II brute 18 g. La néospiramycine II brute est cristallisée une première fois dans 80 ce d'éther saturé d'eau et recristallisée une seconde fois dans 40 cm3 dù même solvant comme indiqué dans l'exemple 2.
On obtient finalement 7,8 g de néospiramycine II ayant les caractéristiques suivantes Composition : C'o/o = 60,9 H % = 8,65 O /o = 26,55 N'o/o = 3,70 Equivalent neutre:
380 Point de fusion (au bloc Maquenne) 116-1180 [a]20 (c = 1 0/0, méthanol) -561, Spectre ultraviolet (déterminé à partir d'une solu tion dans l'éthanol) longueur d'onde du maximum d'absorption 232 m#t <B>(El</B> /m = 362) La chromatographie sur papier effectuée dans les conditions utilisées pour l'exemple 1 indique la pré sence d'un seul produit caractérisé par un Rf = 0,10.
2 g de néospiramycine II base sont transformés en chlorhydrate selon la méthode décrite dans l'exem ple 2. On obtient ainsi 2,1g de chlorhydrate de néospiramycine II ayant les propriétés ci-dessous Cl % 8,5 [a]20 (c = 2 0/0, méthanol) -501,
Exemple 4 <I>Préparation de</I> néospiramycine <I>11l à partir</I> <I>de</I> spiramycine <I>III</I> 25 g de spiramycine III cristallisée sont transfor més en néo.spiramycine par traitement dans l'eau à pH 4 et extraction au benzène selon la méthode décrite dans l'exemple 2.
On obtient ainsi<B>:</B> néospiramycine III brute 18,3 g. La néospiramycine III brute est dissoute à l'ébul lition dans 550 cm3 d'éther de pétrole, la solution filtrée est refroidie lentement jusqu'à 00 et conservée 5 heures dans un bain de glace. La néospiramycine III est essorée, lavée par 50 cm3 d'éther de pétrole et séchée.
On obtient finalement 11,9 g de néospiramycine III ayant les caractéristiques suivantes Composition : C % = 61,9 H 0/0 = 8,9 O'o/o = 26 N % = 3,65 Equivalent neutre:
390 Point de fusion (au bloc Maquenne) 117-118 [a]20 (c= 1 0/0, méthanol) -521) Spectre ultraviolet (déterminé à partir d'une solu tion dans l'éthanol) longueur d'onde du maximum d'absorption : 232 m[i (Ei /@ = 366) La chromatographie sur papier effectuée dans les conditions utilisées pour l'exemple 1 indique la pré sence d'un seul produit caractérisé par un Rf = 0,18.
2 g de néospiramycine III base sont transformés en chlorhydrate selon la méthode décrite dans l'exem ple 2. On obtient ainsi 2,2 g de chlorhydrate de néo- spiramycine III ayant les propriétés ci-dessous CI % 8,4 [a]20 (c = 2,%, méthanol)
-470 Exemple 5 <I>Préparation</I> d'lsn <I>mélange de</I> néospiramy- cines <I>II et I11 et séparation des</I> néospira- tnycines <I>11 et 1I1 par distribution à</I> contre- courant 50 g de mélange cristallisé de spiramycines II et III sont dissous dans 0,5 litre d'eau, le pH étant réglé à 4 par addition d'acide sulfurique en solution normale-.
La solution est maintenue 8 jours à 37 puis diluée à 2,51 par de l'eau distillée et le pH est amené à 10 par addition d'une solution diluée de soude ; la solution est alors extraite successivement par 1 litre et deux fois 0,5 litre de dichloréthane. Les extraits obtenus sont réunis, concentrés sous pres sion réduite et le résidu est séché sous vide.
On obtient 37 g de mélange brut de néospiramy- cines II et III.
20 g sont fractionnés dans un appareil du même type que celui décrit dans l'exemple 1, mais compre nant 100 cellules d'une capacité unitaire de 200 ce. On utilise comme solvants les deux phases séparées du mélange suivant Benzène<B>-------------------------- -----------------------------------</B> .... 1 volume Solution tampon à pH 6,8 (PO4H,,K 22,7 g ; PO4HNa, , 12 H;O : 59,5 g ;
eau q. s. 1 litre) ..<B>------- ------</B> ....---- ... ...... 1 volume On charge 100<I>ce</I> de phase aqueuse dans cha cune des cellules de l'appareil de CRAIG placé dans une enceinte à 20 et dissout la néospiramycine dans la quantité nécessaire de phase benzénique pour obte nir 100 ce de solution.
La distribution est ensuite effectuée selon la technique habituelle : on introduit la solution benzénique de néospiramycine dans la première cellule, agite, laisse décanter et transfère la phase benzénique dans la deuxième cellule, puis intro duit 100 ce de phase benzénique fraîche dans la première cellule ; on agite, décante et transfère la phase benzénique de la deuxième cellule dans la troi sième, celle de la première dans la deuxième et l'on continue l'opération en introduisant 100 ce de phase benzénique dans la première cellule après chaque décantation.
Lorsque 99 transferts en série ont été effectués, la séparation est terminée ; le contenu de chaque cellule est recueilli et la néospiramycine rassemblée dans la phase benzénique par alcalinisation de la phase aqueuse à pH 10 au moyen de solution de soude diluée. Après décantation, une deuxième extraction est faite par 40 cm-3 de benzène, les extraits benzéniques sont réunis et leur volume ajusté à 150<B>ce.</B>
On détermine l'extrait sec de chaque solution benzénique à partir de 5 cm' de solution et trace la courbe représentant la concentration en fonction du rang des cellules. Les maxima de concentration observés correspondent aux coefficients de partage suivant des deux néospiramycines
EMI0006.0036
Cellules <SEP> I <SEP> Coefficient <SEP> de <SEP> partage
<tb> présentant <SEP> un <SEP> maximum <SEP> <I>Conc. <SEP> dans <SEP> la <SEP> phase <SEP> benzénique</I>
<tb> de <SEP> concentration <SEP> <I>Conc. <SEP> dans <SEP> la <SEP> phase <SEP> aqueuse</I>
<tb> <U>i</U>
<tb> Néospiramycine <SEP> II <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> <B>...... <SEP> .. <SEP> ....</B> <SEP> .... <SEP> . <SEP> ..... <SEP> I <SEP> 12 <SEP> K <SEP> II <SEP> <B>=0,136</B>
<tb> Néospiramycine <SEP> III <SEP> <B>------</B> <SEP> ..
<SEP> <B>----</B> <SEP> .. <SEP> ..... <SEP> .. <SEP> 39 <SEP> K <SEP> III <SEP> = <SEP> 0,638 La comparaison de la courbe expérimentale de répartition avec la courbe calculée d'après les coeffi cients de partage trouvés montre que les deux cons tituants se trouvent à l'état pur dans les solutions correspondant aux cellules suivantes Néospiramycine II - Cellules 7 - 16 Néospiramycine III - Cellules 29 - 44 Les solutions benzéniques correspondant à ces deux groupes de cellules sont rassemblées, le solvant est chassé par distillation sous pression réduite et le résidu de distillation séché sous vide.
La base provenant des cellules 7 à 16 est cristal lisée une fois dans l'éther comme indiqué dans l'exemple 3 et la base provenant des cellules 29 à 44 traitée comme dans l'exemple 4. Les caractéristiques des bases obtenues sont données dans le tableau ci-dessous
EMI0006.0042
Néospiramycine <SEP> II <SEP> Néospiramycine <SEP> III
<tb> Poids <SEP> <B>-------</B> <SEP> ...... <SEP> 4,1 <SEP> g <SEP> 4,8 <SEP> g
<tb> P. <SEP> F. <SEP> (au <SEP> bloc <SEP> Maquenne) <SEP> . <SEP> ... <SEP> . <SEP> 117-118o <SEP> 117-118o
<tb> [a]D <SEP> (c= <SEP> 1@/0, <SEP> méthanol) <SEP> <B>-------- <SEP> ------</B> <SEP> -550 <SEP> I <SEP> -51o
<tb> 360 <SEP> 363
<tb> Spectre <SEP> ultraviolet
<tb> Ei @m <SEP> à <SEP> 232 <SEP> m@, <SEP> <B>.- <SEP> ---------</B> <SEP> .. <SEP> ........
<SEP> ... <SEP> un <SEP> seul <SEP> un <SEP> seul
<tb> Chromatographie <SEP> sur <SEP> papier <SEP> .. <SEP> ... <SEP> produit <SEP> produit
<tb> Rf <SEP> .<B>............... <SEP> ..........</B> <SEP> .<B>...... <SEP> .......</B> <SEP> ..<B>......... <SEP> .... <SEP> 0,10</B> <SEP> 0,18 Exemple 6:
<I>Séparation des</I> néospiramycines <I>11 et 11I</I> <I>par chromatographie sur alumine</I> 10g de mélange de néospiramycines II et III brut préparé comme il est indiqué dans l'exemple 5 sont dissous dans 125 cm3 d'un mélange benzène- cyclohexane (25 : 75 en volumes) et la solution chro- matographiée sur colonne contenant 200 g d'alumine sur une hauteur de 75 cm.
Le chromatogramme est développé d'abord par un solvant de même compo sition que ci-dessus puis par un mélange benzène- cyclohexane (75:25 en volumes) ensuite par un mélange benzène-éther<B>(50:</B> 50 en volumes) et enfin éther-acétone (50 : 50 en volumes).
La marche de la chromatographie est résumée par le tableau ci-dessous
EMI0007.0011
No <SEP> Extrait <SEP> <U>Composition <SEP> (x)</U>
<tb> des <SEP> fractions <SEP> Composition <SEP> du <SEP> solvant <SEP> Volume <SEP> total <SEP> sec <SEP> Nép- <SEP> Néo <U>spiramycine <SEP> <B>II</B> <SEP> spiramycine <SEP> <B>III</B></U>
<tb> Benzène-cyclohexane
<tb> 1 <SEP> (25 <SEP> : <SEP> 75 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> <B>------ <SEP> ......... <SEP> ......</B> <SEP> 300 <SEP> crus <SEP> 0,1 <SEP> g <SEP> - <SEP> Benzène-cyclohexane
<tb> 2 <SEP> (75 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> ... <SEP> ... <SEP> ....... <SEP> .... <SEP> 150 <SEP> cm3 <SEP> 0,2 <SEP> g <SEP> - <SEP> Benzène-cyclohexane
<tb> 3 <SEP> (75 <SEP> :
<SEP> 25 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> . <SEP> <B>-------</B> <SEP> ... <SEP> .... <SEP> 250 <SEP> cm3 <SEP> 1,9 <SEP> g <SEP> 0 <SEP> <B>100%</B>
<tb> Benzène-cyclohexane
<tb> 4 <SEP> <B>(75:</B> <SEP> 25 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> .. <SEP> .. <SEP> ........ <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 300 <SEP> cm3 <SEP> 0.,8 <SEP> g <SEP> <B>10%</B> <SEP> 90 <SEP> 0/0
<tb> Benzène-éther
<tb> 5 <SEP> <B><I>(50:</I></B> <SEP> 50 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> <B>--------- <SEP> ..............</B> <SEP> 250 <SEP> cm3 <SEP> 0,6 <SEP> g <SEP> 351)/o <SEP> 65%
<tb> Benzène-éther
<tb> 6 <SEP> <B><I>(50-:</I></B> <SEP> 50 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> ...... <SEP> .. <SEP> ..... <SEP> .. <SEP> 500 <SEP> cm3 <SEP> 1,7 <SEP> g <SEP> 701)/o <SEP> <B>30%</B>
<tb> Ether-acétone
<tb> 7 <SEP> <B><I>(50:
</I></B> <SEP> 50 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> .... <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> ... <SEP> . <SEP> 250 <SEP> cm3 <SEP> 0,5 <SEP> g <SEP> <B>90%</B> <SEP> Traces.
<tb> Ether-acétone
<tb> 8 <SEP> <B><I>(50:</I></B> <SEP> 50 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> ... <SEP> <B>-------- <SEP> ----------</B> <SEP> 500 <SEP> cm3 <SEP> 1,8 <SEP> g <SEP> <B>100%</B> <SEP> 0
<tb> Ether-acétone
<tb> 9 <SEP> <B><I>(50:</I></B> <SEP> 50 <SEP> en <SEP> volumes) <SEP> <B>--------- <SEP> -------------</B> <SEP> 500 <SEP> cm3 <SEP> 0,4 <SEP> g <SEP> 100 <SEP> 0/0 <SEP> 0 (x) Déterminée par chromatographie sur papier effectuée selon la méthode indiquée dans l'exemple 1.
La fraction 3 et les deux fractions 8 et 9 réunies sont séchées et les bases traitées comme indiqué dans l'exemple 5 ce qui conduit aux produits ayant les caractéristiques suivantes
EMI0007.0013
I <SEP> Néospiramycine <SEP> III <SEP> Néospiramycine <SEP> III
<tb> Poids <SEP> ...... <SEP> ...... <SEP> ..... <SEP> <B>....... <SEP> ....................</B> <SEP> ._.. <SEP> 1,3 <SEP> g <SEP> 1,5 <SEP> g
<tb> P. <SEP> F. <SEP> (au <SEP> bloc <SEP> Maquenne) <SEP> ............ <SEP> 116-118 <SEP> 115-117
<tb> [a]20 <SEP> (c <SEP> = <SEP> 10/0, <SEP> méthanol) <SEP> ............... <SEP> -54o <SEP> -51o
<tb> 361 <SEP> 364
<tb> Spectre <SEP> ultraviolet
<tb> <B>E11%</B> <SEP> a <SEP> 232 <SEP> m[, <SEP> ....................... <SEP> . <SEP> ....
<SEP> un <SEP> seul <SEP> un <SEP> seul
<tb> Chromatographie <SEP> sur <SEP> papier <SEP> ......... <SEP> constituant <SEP> constituant
<tb> Rf <SEP> ........................................................... <SEP> <B>0,10</B> <SEP> 0,18 Exemple 7 <I>Séparation des</I> néospiramycines <I>1, 11 et 111</I> <I>par distribution à contre-courant</I> 10 g de mélange de néospiramycines I, II et III préparé à partir de spiramycine comme il est indiqué dans l'exemple 1 sont fractionnés et purifiés par dis tribution à contre-courant, selon une technique voi sine de celle qui est décrite dans l'exemple 5.
Les solvants utilisés sont les deux phases sépa rées du mélange suivant Dichloréthane <B>...... ......................... .......... ....</B> 1 volume Solution tampon à pH 6,64 (P04H2K ' 16,3 g ; P04HNa2, 12 H20: 28,6 g ;
eau q. s. 1 litre)<B>........</B> .<B>........</B> -....................... 1 volume Après distribution à contre-courant dans l'appa reil de CRAIG à 100 cellules de 200 cm3 de capacité unitaire, on isole les bases contenues dans les groupes de cellules suivantes Cellules 28 à 37 - Néospiramycine I Cellules 46 à 56 - Néospiramycine II Cellules 65 à 74 - Néospiramycine III La purification des bases brutes comme il a été indiqué respectivement dans les exemples 2,
3 et conduit aux produits ayant les caractéristiques suivantes
EMI0008.0004
Néospiramycine <SEP> I <SEP> I <SEP> Néospiramycine <SEP> III <SEP> Néospiramycine <SEP> ni
<tb> Poids <SEP> ....._.__..__...._............_.. <SEP> .......... <SEP> .... <SEP> 1,7 <SEP> g <SEP> 1,2 <SEP> g <SEP> 1,4 <SEP> g
<tb> [a]D <SEP> (c= <SEP> 111/o, <SEP> méthanol) <SEP> <B>--------</B> <SEP> .... <SEP> -56o <SEP> -55 <SEP> -50@,
<tb> Chromatographie <SEP> sur <SEP> papier <SEP> .... <SEP> _. <SEP> un <SEP> seul <SEP> un <SEP> seul <SEP> un <SEP> seul
<tb> constituant <SEP> constituant <SEP> constituant
<tb> Rf <SEP> ...............<B>-------- <SEP> ---------------</B> <SEP> ... <SEP> .... <SEP> ..... <SEP> 0,02 <SEP> 0,10 <SEP> <B>0,18</B>