CH362085A

CH362085A - Procédé de préparation d'un polypeptide

Info

Publication number: CH362085A
Authority: CH
Inventors: Velluz Leon; Amiard Gaston; Bartos Jaroslav; Goffinet Bernard; Heymes Rene
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1956-03-30
Filing date: 1957-03-28
Publication date: 1962-05-31

Description


  



  Procédé de préparation   d'un    polypeptide
 La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un dérivé   tétrapeptidique,    terme intermédiaire de la synthèse de l'ocytocine, hormone nonapeptidique dont la formule de constitution suivante :
EMI1.1     
 a été démontrée par Du Vigneaud et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.



   Le dérivé   tétrapeptidique    préparé par le procédé faisant l'objet de la présente invention est un ester de la   S-trityl-L-cystéinyl-L-propyl-L-leucyl-glycine    composé de formule L dont la préparation figure au
 schéma annexé et sera décrite plus loin. Comme on le voit, ce composé est très proche du tronçon   tétrapeptidique    terminal de l'ocytocine et s'apparente très étroitement à l'ester de la   S-benzyl-L-cystéinyl-   
L-propyl-L-leucyl-glycine de formule B [Ch. Ressler et V. Du Vigneaud (J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3107)] qui, après transformation en amide, a servi à Du Vigneaud et collaborateurs   (l.    c) à la synthèse de l'ocytocine.
EMI2.1     




   Pour arriver à ce   tétrapeptide    de formule B,
Ch. Ressler et V. Du Vigneaud ont employé une voie assez laborieuse. Utilisant comme agent de blocage de la fonction amine, au cours de leurs synthèses peptidiques, le chloroformiate de benzyle, composé coûteux, peu stable, lacrymogène et dont la préparation comporte la manipulation du phosgène et effectuant la condensation peptidique par la méthode aux anhydrides mixtes, ils ont d'abord préparé le dérivé   N-benzyl-oxycarbonylé    de la L-leucine, lequel condensé avec le glycinate d'éthyle, leur a fourni le N-benzyloxy-carbonyl-L-leucyl-glycinate   d'éthyle.    Une   hydrogénolyse    catalytique fournit le Lleucyl-glycinate   d'éthyle.    Après ces deux étapes,

   on condense le produit obtenu avec la N-benzyloxycarbonyl-L-proline par le procédé aux anhydrides mixtes avec utilisation du chlorure   d'isovaléryle,    ce qui fournit le   N-benzyloxy-carbonyl-L-prolyl-L-leu-    cyl-glycinate   d'éthyle.    Une nouvelle   hydrogénolyse    pour éliminer le groupement protecteur conduit au   L-prolyl-L-leucyl-glycinate      d'éthyle.    Ce composé est condensé avec le dichlorure de bis- (N-benzyloxycarbonyl)-L-cystinyle obtenu en une étape à partir de la benzyloxy-carbonyl-L-cystine, ce qui conduit au bis- (N-benzyloxy-carbonyl)-L-cystinyl-bis-   (Le    prolyl-L-leucyl-glycinate d'éthyle) après un total de 6 étapes.

   Pour passer de ce composé au peptide de formule B, il faut encore 4 étapes. On saponifie la fonction ester en acide correspondant, soumet ce produit à la réduction par le sodium dans   l'ammo-    niaque liquide pour transformer le pont cystinique en fonction cystéine, traite au chlorure de benzyle pour obtenir le dérivé S-benzylé du   tétrapeptide    qu'on estérifie à nouveau.

   Pour l'industrie, cette synthèse comporte l'inconvénient d'astreindre à une élimination répétée d'un agent de blocage par hydrogénolyse, d'obliger à bloquer à nouveau et à effectuer peu avant la fin de la synthèse une réduction au sodium dans l'ammoniaque liquide, opération difficile à réaliser sur une échelle industrielle et de soumettre un ester à la saponification préliminaire avant cette réduction, ce qui entraîne une nouvelle   estérifi-    cation finale.



   Vis-à-vis de ce procédé en 10 stades, le procède selon l'invention permet de parvenir au   tétrapeptide    ester de formule L en 6 stades, facilement réalisables n'utilisant qu'un blocage unique, le dérivé final présentant en outre l'avantage de se laisser scinder plus facilement que les composés   S-benzylés    pour lesquels la régénération de la fonction mercaptan libre nécessite une nouvelle intervention du sodium dans l'ammoniaque liquide.



   Selon le présent procédé, on fait réagir la S, N  ditrityl-L-cystéine    en présence d'un carbodiimide
N,   N'-disubstitué    avec un ester de L-proline, isole l'ester du dipeptide formé, le saponifie en S, N  ditrityl-L-cystéinyl-L-proline    que l'on condense en présence d'un carbodiimide N, N'-disubstitué avec un ester de L-leucine, isole l'ester du tripeptide formé, le saponifie en S,   N-ditrityl-L-cystéinyl-L-propyl-L-    leucine que l'on condense en présence d'un carbodiimide   N,      N-disubstitué    avec un ester de glycine, isole l'ester du   tétrapeptide    formé et soumet cet ester, d'une part, à une   détritylation    sélective sur l'azote et, d'autre part,

   à une saponification pour obtenir le   tétrapeptide    libre correspondant.



   La préparation de la S,   N-ditrityl-cystéine    a déjà été décrite par la titulaire dans le brevet suisse
N    357729,    sa préparation ne figurant donc dans l'exemple qu'à titre de rappel.



   Le mode opératoire décrit dans l'exemple qui suit peut évidemment être employé au départ des aminoacides racémiques ou des énantiomorphes. On peut notamment faire varier les températures, changer de solvant, employer d'autres esters d'aminoacides que ceux mentionnés ou les préparer par d'autres voies que celles indiquées, les saponifier par toute autre méthode connue ou employer comme agent de condensation un autre carbodiimide disubstitué que le dicyclohexylcarbodiimide ou utiliser toute autre méthode de condensation peptidique connue.



  Les points de fusion sont des points de fusion instantanée déterminés sur bloc de Maquenne. Les formules des composés figurent sur le schéma annexé. 



   Exemple
 Stade   1 : Préparation du SJN-ditrityl-L-cystéinyl-L-   
   prolinate de méthyle de formule    E
 a) Condensation de la S, N-ditrityl-L-cystéine de
 formule C avec le prolinate de méthyle de for
 mule D (R =   CHg,)   
 27, 5 g de S,   N-ditrityl-cystéinate    de   diéthylamine    cristallise sont dissous dans 150 ce de chloroforme.



  On lave cette solution avec 41   cm : 3 d'acide    chlorhy
 drique normal, puis à l'eau, sèche sur sulfate de soude et évapore à sec. D'autre part, on dissout
 6, 66 g de chlorhydrate de prolinate de méthyle dans 25   cil de    chlorure de méthylène ; on    glace à      ¯ 10 {} C    et ajoute, sans dépasser   0t) C,    4,   8 cm3    de   diéthylamine,    puis 200   cm3      d'éther.    Le chlorhydrate de   diéthylamine,    insoluble dans l'éther précipite. On le filtre et évapore la solution du prolinate de méthyle à sec sous vide.



   La S,   N-ditritylcystéine    de formule C préparée comme on vient de l'indiquer est dissoute dans 50 ce de chlorure de méthylène. On refroidit à   00    C et ajoute le prolinate de méthyle de formule D également dissous dans 50   cm3    de chlorure de méthylène et refroidi à   0ç) C.    Dans ce mélange réactionnel, on introduit 9 g de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne une nuit à   20     C. Le lendemain, on ajoute
 1   cm3    d'acide acétique pour transformer l'excès de dicyclohexylcarbodiimide en   dicyclohexylurée.    Après une demi-heure on filtre la   dicyclohexylurée    qu'on lave au chlorure de méthylène.

   Le filtrat, réuni au chlorure de méthylène de lavage, est lavé à l'acide chlorhydrique dilué, à l'eau, séché et évaporé à sec.



  L'ester du dispeptide de formule E brut   (R = CH)    ainsi obtenu peut servir directement à la deuxième étape de la synthèse, c'est-à-dire être saponifié en dipeptide de formule F.



   Pour la préparation de la   S,      N-ditrityl-L-cystéine    de formule C, qui est donnée ici à titre de rappel, on procède comme suit : dans une solution, refroidie à   00 de    25 g de chlorhydrate de L-cystéine   [a] 20 = + 5, 50 (c= 1  /o,    acide chlorhydrique N) dans 480   cm3    d'eau, on introduit, sous courant d'azote et agitation mécanique, 480 cm3 d'éther et 80   cm    de   diéthylamine    et refroidit   à-5fM C.    Sans interrompre l'agitation, on introduit 120 g de chlorure de   trityle    et poursuit l'agitation pendant trois heures. Le mélange réactionnel devient une masse pâteuse assez difficile à agiter.

   On ajoute alors 150 à 200 ce de chloroforme, décante la phase aqueuse qui ne renferme que du chlorhydrate de   diéthylamine    et le chlorhydrate de cystéine qui n'a pas réagi. La couche organique est lavée à nouveau avec 300 ce d'eau, séchée sur sulfate de soude et concentrée. On ajoute alors   100cm3    d'alcool contenant 1 ce de   diéthylamine    et distille le solvant jusqu'à ce qu'il ait entraîné tout le chloroforme. Le sel de   diéthylamine    de la   N,      S-ditrityl-L-cystéine    cristallise.

   On complète la cristallisation par addition progressive de 100 cm3   d'éther.    On obtient ainsi 55 g de sel se présentant
 sous forme d'aiguilles   [a]      2D0= +71  + 1 (c=2  /o,   
 chloroforme) solubles en chloroforme, très peu solu
 bles en alcool, insolubles dans l'eau et l'éther. Les
 réactions à la ninhydrine sont négatives. A partir des
 eaux mères de cristallisation on obtient un deuxième
 jet de produit portant le rendement global à   70 g   
 environ. En reprenant ce sel par l'eau acidulée, on le
 décompose avec mise en liberté de la   N,    S-ditrityl-L
 cystéine de formule C qui peut être facilement
 extraite par l'éther dans lequel elle est assez soluble.



  L'évaporation de l'éther fournit le produit brut à l'état amorphe.



   Le chlorhydrate de L-prolinate de méthyle de formule D (R = CH3) est préparé selon J. Schumann et R. A. Boissonnas (Helv. Chim. Acta, 1952,   35,    2240), par action d'un courant d'acide chlorhydrique sec sur une suspension de L-proline dans le méthanol. On introduit 6 g de L-proline dans 120   cm    de méthanol saturé à   20     C d'acide chlorhydrique sec ; on abandonne 24 heures à température ambiante, évapore à sec sous vide.

   On obtient finalement 8 g de chlorhydrate de L-prolinate de méthyle sous forme d'une huile jaune pâle, prête à l'emploi pour la condensation, soit un rendement de   94  /0.    b) Condensation de la S, N-ditritylcystéine avec le
 chlorhydrate de prolinate de benzyle de formule
 D   (R=CGH5-CH2-)   
 On fait réagir pendant une nuit 6, 8 g de sel de
S,   N-ditritylcystéine    et 2, 5 g de chlorhydrate de prolinate de benzyle dissous dans 50 cm3 de chlorure de   méthylène-en présence    de 2, 2 g de dicyclohexylcarbodiimide. Après un traitement identique à celui décrit sous a) on isole du dipeptide de formule E   (R=-CH.,-CH)    sous forme d'huile.



   Pour la préparation du chlorhydrate de L-prolinate de benzyle D   (R=CgHs-CHo-)    on procède comme suit :
 15 g de L-proline sont mis en suspension fine dans 150   cm3    d'alcool benzylique pur. On refroidit vers +10  C et sature à cette température d'acide chlorhydrique gazeux sec. Après avoir abandonné quelque temps, on chauffe sous vide à   90"C pour    éliminer l'eau formée et l'acide chlorhydrique. On laisse refroidir et ajoute un grand excès   d'éther.    Le chlorhydrate de prolinate de benzyle cristallise en petits prismes incolores. On glace, filtre, lave à l'éther et sèche sous vide. On recueille 31 g de produit blanc, [   =-42" 1 (c==2"/o    alcool absolu) identique au composé décrit par R. E. Neumann et
E. L. Smith (J. Biol.

   Chem., 1951, 193, 97).



  Stade 2 : Préparation de la S, N-ditrityl-L-cystéinyl
 L-proline de formule F
 a) L'ester méthylique du dipeptide de formule E brut huileux obtenu comme on vient de l'indiquer dans le stade 1 a) est traité au reflux par 100 cm3 d'alcool, 30 cm3 de potasse   méthanolique    et 30 cm3 d'eau. Après refroidissement, on verse dans un mélange d'eau et de glace et ajoute de l'acide chlor hydrique normal jusqu'à pH 1 (environ 90 cm3 d'acide chlorhydrique N). Le précipité formé est extrait au chloroforme. La solution chloroformique est lavée à l'eau jusqu'à neutralité, séchée et évaporée à sec. On reprend le résidu par 150 cm3 d'éther anhydre et porte au reflux en ajoutant 5 cm3 de   diéthylamine.    On laisse refroidir et ajoute 2   crd,    d'eau.

   Le sel de   diéthylamine    du dipeptide de formule F cristallise en aiguilles. On ajoute 150   cm3    d'éther de pétrole léger et abandonne une nuit à la température ambiante. On obtient ainsi 22 g de sel de   diéthylamine    de formule F cristallisant avec   1/2    molécule d'eau et suffisamment pur pour la condensation avec le leucinate de méthyle. Rendement : 70%, F.   = vers 150¯ C (dÚc.), [&alpha;]20D = + 92¯ ¯    2 (c =   2  /0, éthanol    absolu).



  Analyse: C50H53O3N3S. 1/2 H2O= 785, 02
Calculé   : C76, 49 /o H6, 93 /o N5*35 /o S4, 09 /o   
Trouvé   : 76,    4 6, 9 5, 2 4, 2
 Ce produit n'est pas décrit dans la littérature.
 b) L'ester benzylique du dipeptide de formule E dont la préparation a été décrite dans le stade 1 b) est saponifié au reflux avec 6   cm3    de potasse   métha-    nolique à   20  /0    et 6 cm3 d'eau. On ajoute 50 g d'eau glacée, acidifie à l'acide chlorhydrique à pH 2, 3 et effectue une extraction au chloroforme. L'extrait chloroformique est lavé à l'acide chlorhydrique   N/10,    à   l'eau,    séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec.

   Le résidu est repris par 50 ce d'éther et 2 ce de   diéthylamine.    On refroidit et ajoute 1   cm3    d'eau. On recueille 5, 8 g de sel de   diéthylamine    de la S,   N-ditrityl-L-cystéinyl-L-proline    renfermant   Va molécule    d'eau, identique à tous points de vue au produit décrit à la fin de a). Rendement   74  /0.   



  Stade 3 : Préparation du   S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-   
   prolyl-L-leucinate d'éthyle (H) (R    =   C2Hs)   
 Les matières premières utilisées pour cette préparation sont la   SN-ditrityl-Lcystéinyl-L-proline    de formule F, préparée selon le stade 2 et le chlorhydrate du L-leucinate d'éthyle (G) (R =   CgHg)    de préparation classique sur lequel on opère directement.



   15, 7 g de sel de diéthylamine de la S,   N-ditrityl-      L-cystéinyl-L-proline    précédemment décrit sont dissous dans   100 cm3    de chlorure de méthylène. On sèche la solution sur sulfate de magnésium et ajoute 4, 1 g de chlorhydrate de L-leucinate d'éthyle, puis 4, 5 g de dicyclohexylcarbodiimide. On abandonne quatre heures à une température de 25 à   300 C,    ajoute 1 ce d'acide acétique et filtre la dicyclo  hexylurée    au bout d'une demi-heure. Le précipité de   dicyclohexylurée    est lavé au chlorure de méthylène, les liqueurs de lavage sont jointes au filtrat et le mélange est lavé à l'acide chlorhydrique, à l'eau, séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec.

   Le résidu fournit l'ester du tripeptide de formule H à l'état suffisamment pur pour la saponification ultérieure.



  Stade 4: PrÚparation de la S,N-ditrityl-L-cystÚinyl   L-prolyl-L-lecscine de forrnule I   
 La totalité de l'ester du tripeptide de formule H obtenu selon le stade 3 est saponifiée à l'ébullition par 50 cm3 d'alcool Ó 95% et 40   cm : 3    de soude normale. On refroidit, verse dans l'eau glacée et extrait le précipité formé au chloroforme. L'extrait chloroformique est lavé à l'acide chlorhydrique N/5 et à l'eau, séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec. On reprend le résidu par 20 cm3 d'éther auxquels on ajoute 200   cm3    d'éther de pétrole léger.



  Le tripeptide de formule 1 se sépare sous forme d'un produit pulvérulent, soluble dans tous les solvants usuels sauf l'éther de pétrole, suffisamment pur pour la transformation en   tétrapeptide.    Rendement quantitatif, F. =   120  C (déc.), [a] = + 80"    2 (c =   2 0/o,    chloroforme).



  Analyse : C52H53O4N3S = 816.03
Calculé : C 76,53% H 6,55% O 7,84% N 5,15%    S 3. 93  /o   
Trouvé   : C    76,   4'"/o    H 6, 5% O 7,8% N 5,   1  /o   
 S   3,    9    /0   
 Ce produit n'est pas décrit dans la littérature.



  Stade 5 : a) PrÚparation du S,N-ditrityl-L-cystÚinyl
   L-prolyl-L-leucyl-glycinaíe    de méthyle de for
 mule K   (R= CH,)   
 8,   25 g de S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-prolyl-L-leu-    cine de formule   I,    obtenus selon le stade 4, sont introduits dans une solution refroidie à   0  C    de 1, 5 g de chlorhydrate de glycinate de méthyle de formule
J dans 50 cm3 de chlorure de méthylène et 1, 3 cm3 de   diéthylamine.    On ajoute à la solution 2, 3 g de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne trois heures à   25-30     C. On refroidit à la température ambiante, ajoute 0, 5   cm    d'acide acétique et filtre après une demi-heure.

   Le filtrat est lavé à l'acide chlorhydrique et à l'eau, séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec sous vide. On reprend par 50   cm : 3 d'éther.   



  L'ester méthylique du   tétrapeptide    de formule K cristallise en feuillets incolores (6 g). Rendement   68"/o. Recristallisé    en alcool, il se présente sous forme de grands prismes incolores, F. environ   130  C    (déc.)   [a]      20 = + 1120 2 (c = 2 0/o,    chloroforme) solubles en chloroforme, éthanol chaud, peu solubles en acétone, insolubles dans l'éther et   l'eau.   



  Analyse : C55H58O5N4S=887, 11
Calculé   : C 74, 46 /o H 6, 59 /o N 6, 32 /o S 3, 6 /o   
Trouvé   : 74, 3  /0    6, 7   zozo    6,   3  /0    3,   7  /o   
 Ce produit n'est pas décrit dans la littérature. b)   Préparation de la S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-   
   prolyl-L-leucyl-glycine    de formule K (R = H)
 2 g d'ester méthylique du   tétrapeptide    de formule
K sont saponifiés au reflux par 20 cm3 de méthanol et 10 cm3 de soude N/2 ; on refroidit, ajoute de l'eau glacée, acidifie à   plll    à 2 par addition d'acide chlorhydrique N et extrait au chloroforme.

   L'extrait   chlo-    
 roformique est lavé à l'eau jusqu'à neutralité, séché
 sur sulfate de magnésium et évaporé à sec. Par
 reprise au benzène, le produit de formule K cristal
 lise en fines aiguilles incolores : 1, 65 g (rendement
   80  /0).    F.   135-1400    C puis 190o C, [a]   20 115o   
   2 (c 2 0/o,    chloroforme). Le produit qui renferme   Va    mol. de benzène de solvatation est soluble dans l'acétone, l'alcool et le chloroforme, très peu soluble dans le benzène, insoluble dans l'eau et l'éther.



  Analyse: C54H56O5N4S 1/2 C6H6 = 912, 13
Calculé   : C 75, 05 /o H 6, 52 /o 0    8,   77 0/o N 6, 14 0/o       S 3, 51 /o   
Trouvé   : C 75, 10/o    H 6,   40/0 09, 0"/o N5, 9"/o       S 3, 6"/o   
 Ce produit est nouveau.



  Stade 6 : Détritylation sélective à l'azote du S, N   ditrityl-L-cystéinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinate de   
 méthyle de formule K (R =   CH3)    par l'acétone
 chlorhydrique et prÚparation du S-trityl-L
   cystéinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinate    de méthyle    de formule LR = CH3)   
 4, 4 g d'ester méthylique de formule K sont mis en suspension dans 20 cm3 d'acétone, on ajoute 5   cmS    d'acide chlorhydrique 5 N et abandonne vingt minutes à   35O    C. On ajoute 60 cm3 d'eau, extrait au chloroforme. Les extraits chloroformiques réunis sont lavés à l'acide chlorhydrique, séchés sur sulfate de magnésium et évaporés à sec sous vide.

   Le résidu huileux, repris par l'éther, se prend en masse et fournit 3, 2 g de chlorhydrate du   tétrapeptide    S-tritylé de formule L   (R = CH3)    (rendement :   94  /o).   



  F. environ   150¯C, [&alpha;]20D = -17¯¯ l (c=2%,    chloroforme), soluble en chloroforme, benzène, acétone, eau insoluble dans l'éther et les acides dilués aqueux.



  Analyse :   CHgOgNSCI = 681,    28
Calculé   : C    63,   46"/o H6, 66"/o N8, 22"/o S4, 7"/o   
 O 11,74% Cl 5,   21  /o   
Trouvé : C 63,4% H 6,8% N 8,3% S 4,8%    011, 7"/o C15, l"/o   
 Ce composé est nouveau.

   b) Détritylation sélective   à l'azote de la SN-ditrityl-      
 L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycine de formule   
 K(R = H) par l'acétone chlorhydrique et pré
 paration   de la S-trityl-L-cystéinyl-L-prolyl-L-   
 leucyl-glycine de formule L (R = H)
 En opérant comme il a été indiqué dans   l'exem-    ple 6 et en faisant précéder l'extraction chloroformique du peptide   détritylé    à l'azote par une neutralisation à l'acétate de soude, on obtient au départ de 1,   5g    du produit de formule K   (R = H), après    traitement à l'éther, 1 g de peptide   détritylé,    soit un rendement de 95%.

   Apr¯s recristallisation en éthanol-éther, le produit se présente en aiguilles   [a]    D
 -28  2 (c =   2"/o, éthanol    absolu), renferment   Va    molécule d'eau de cristallisation. Il est soluble
 dans les acides et alcalis dilués aqueux, dans l'alcool chaud, peu soluble en chloroforme, insoluble dans l'eau et l'éther.

Claims

Analyse : C35H4205N4S t/2 H2O = 639, 8 Calculé : C 65, 70 0/o H 6, 77% O 13,75% N 8, 76 0/o S 5, 01 /o Trouvé : C 65,9% H 6,8% O 14,0% N 8,8% S 5, 010/0 REVENDICATION Procédé de préparation de la S-trityl-L-cystéinyl L-prolyl-L-leucyl-glycine, caractérisé en ce qu'on fait réagir la S, N-ditrityl-L-cystéine en présence d'un carbodiimide N, N'-disubstitué avec un ester de L-pro- line, isole l'ester du dipeptide formé, le saponifie en S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-proline que l'on condense en présence d'un carbodiimide N, N'-disubstitué avec un ester de L-leucine, isole l'ester du tripeptide formé,

le saponifie en S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-prolyl-L- leucine que l'on condense, en présence d'un carbodiimide N, N'-disubstituÚ, avec un ester de glycine, isole l'ester du tétrapeptide formé et soumet cet ester, d'une part, à une détritylation sélective sur l'azote et, d'autre part, à une saponification pour obtenir le tétrapeptide libre correspondant.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le carbodiimide N, N'-disubstitué employé est le N, N'-dicyclohexyl-carbodiimide.

2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'ester de proline employé est l'ester méthylique.

3. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'ester de proline employé est l'ester benzylique.

4. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'ester de leucine employé est l'ester éthylique.

5. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'ester de glycine employé est l'ester méthylique.

6. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que l'agent de saponification des esters des di-, tri-et tétrapeptides formés est la soude alcoolique.

7. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on isole la S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-pro- line sous forme de sel de diéthylamine.

8. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on détrityle l'ester de la S, N-ditrityl-L cystéinyl-L-propyl-L-leucyl-glycine sélectivement sur l'azote par action de l'acétone chlorhydrique ou de l'acide acétique aqueux chaud.

9. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que, après isolation de l'ester tétrapeptide on le détrityle sélectivement sur l'azote par l'action de l'acétone aqueuse chlorhydrique ou de l'acide acétique aqueux chaud, puis le soumet à une saponification pour obtenir le tétrapeptide libre correspondant.

10. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que, après isolation de l'ester tétrapeptide on le saponifie, après quoi on détrityle sélectivement sur l'azote la S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-prolyl-L-leucyl- glycine par l'acétone aqueuse chlorhydrique ou l'acide acétique aqueux chaud.