CH368900A - Verfahren zur Herstellung eines Vaccins für Hunde - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung eines Vaccins für Hunde
Die Staupe und die infektiöse Hepatitis sind zwei Viruserkrankungen, die bei Hunden sehr häufig auftreten. In vielen Fällen befallen beide Krankheiten gleichzeitig denselben Hund und dann ist das Sterblichkeitsverhältnis anscheinend viel grösser als bei jeder der beiden Erkrankungen für sich allein.



   In den letzten Jahren sind ei-modifizierte Stämme des Staupevirus zur Herstellung von Vaccinen, die den lebenden Virus enthalten, benutzt worden. Diese Vaccine schützen Hunde gegen Staupe und rufen nicht die üblichen Symptome der Staupe bei den damit behandelten Hunden hervor. Der modifizierte Hundestaupe-Virus immunisiert also Hunde in befriedigender Weise gegen die Staupe, aber die Hunde bleiben empfänglich gegen die infektiöse Hepatitis.



   Fieldsteel und Emery (Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine, 1954, Bd. 86, S. 819-823) haben kürzlich ein Verfahren zur Züchtung und Modifizierung des Virus der infektiösen Hundehepatitis in Gewebekulturen beschrieben. Der Virus der ansteckenden Lebererkrankung der Hunde wird in diesem Verfahren modifiziert, indem man ihn nacheinander 51mal oder öfters durch Kulturen von Hundenieren-, Hundemilz-, Hunde  uterus-oder    Hundetestikelgeweben schickt. Dabei wird der Virus so weit yerändert, dass ein empfänglicher Hund nach Impfung mit dem lebenden Virus nicht die üblichen Symptome der infektiösen Hepatitis entwickelt, sondern gegen eine spätere Einwirkung des virulenten Virus der infektiösen Hundehepatitis geschützt ist.



   Es ist nun gefunden worden, dass man unter geeigneten Bedingungen den lebenden, ei-modifizierten Virus der Hundestaupe zusammen mit Eimaterial auf die von der Gewebekultur abgetrennte Flüssigkeit, welche den lebenden, modifizierten Virus der infektiösen Hundehepatitis enthält, in Gegenwart eines geeigneten Stabilisierungsmittels einwirken lassen, dann das flüssige Material bei niedriger Temperatur rasch einfrieren und im gefrorenen Zustand trocknen lassen kann.



   Gegenstand des vorliegenden Patentes ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Vaccins für Hunde zur gleichzeitigen Immunisierung gegen infektiöse Hepatitis und Staupe, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Eigewebe mit Hundestaupeviren infiziert, die durch serienweise Passagen über Kükenembryos in bebrüteten Eiern modifiziert sind, eine wässrige Pufferlösung, die Saccharose, MonokaliumglutaminatLmonohydrat,   Monokaliumsulfat und    Dinatriumphosphat enthält und ein pH von 7,2 bis 7,4 aufweist, zusetzt, das Produkt auf eine aus einer Gewebekultur abgetrennten Flüssigkeit, die lebende, infektiöse Hundehepatitisviren enthält, welche durch serienweise Passagen über Kulturen von Hundenierengeweben oder von Hundenieren- und anschlie ssend von Schweinenierengeweben modifiziert sind,

   einwirken lässt und die erhaltene flüssige Masse einer Gefriertrocknung unterwirft.



   Man kann auf diese Weise ein trockenes, stabiles Präparat erhalten, welches beide Virusarten enthält. Das getrocknete Viruspräparat kann später mit destilliertem Wasser oder einem anderen geeigneten Mittel verdünnt und für die Immunisierung empfänglicher Hunde sowohl gegen die Staupe als auch gegen die infektiöse Heptatitis der Hunde benutzt werden.



   Es ist leicht einzusehen, dass sich aus der Vereinigung der beiden lebenden, modifizierten Virusarten in einem einzigen Produkt in solcher Weise, dass beide Komponenten im Hervorrufen der Immunität gegenüber der Erkrankung, gegen welche sie bestimmt sind, ebenso wirksam bleiben, wie wenn man sie gesondert verwenden würde, viele Vorteile ergeben. Die Suspendierung der beiden Stoffe vor  der Kältetrocknung In dem gleichen flüssigen Medium schaltet die Notwendigkeit der Verwendung von zwei Phiolen aus, wie es der Fall wäre, wenn die Vaccine getrennt hergestellt würden. Ferner werden erhebliche Ersparnisse dadurch erzielt, dass nur eine einzige Gefriertrocknung und bloss eine einmalige Verpackung und Handhabung erforderlich sind. Das neue Vaccin bringt manche Fortschritte in medizinischer Hinsicht mit sich.

   Beispielsweise ist bloss eine Injektion erforderlich, um einen empfänglichen Hund gegen beide Krankheiten zu schützen. Dies entbindet von der Notwendigkeit mehrfacher Injektionen, wie es bei Verwendung getrennter Vaccine der Fall sein würde.



   Das erfindungsgemässe Verfahren kann wie folgt ausgeführt werden:
Der lebende, wie oben angegeben (z. B. analog der Methode von Fieldsteel und Emery) modifierte Virus der infektiösen Hundehepatitis wird in Kolben mit Gewebekulturen eingetragen und bei einer geeigneten Temperatur etwa vier Tage lang bebrütet.



  Nachher wird die Flüssigkeit der Gewebekulturen, welche die modifizierten Hundehepatibisviren enthält, gewonnen. Zu etwa der gleichen Zeit, zu der die modifizierten Viren der infektiösen Hepatitis auf den Gewebekulturen ausgesät werden, impft man angebrütete, befruchtete Eier mit dem lebenden, wie oben angegeben, modifizierten Hundestaupe-Virus.



  Nach einer angemessenen Inkubationszeit von etwa fünf Tagen werden die infizierten Membranen der Eier gewonnen und mit der genannten Pufferlösung zu einer gleichförmigen Suspension verarbeitet, so dass je 2 ml davon ungefähr 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Man fügt nun zu je 2 ml dieser Suspension 2 ml der abgetrennten Gewebekulturflüssigkeit, welche den modifizierten Virus der infektiösen Hepatitis enthält. Die entstandene Lösung wird dann in geeignet abgemessenen Mengen in sterile Phiolen abgefüllt. Die flüssige Masse in den Phiolen lässt man rasch einfrieren und trocknet sie im gefrorenen Zustand im Vakuum ein. Dabei wird ein trockenes Vaccin erhalten, das beide lebenden Viren in stabiler Form enthält.



   Beispiel
A. Herstellung der den lebenden, modifizierten    Hundestaupeviru. y enthaltenden Komponente   
Hühnereier, die sieben bis acht Tage lang bebrütet worden waren, werden für die Kultivierung des Hundestaupe-Virus benutzt. Die Eier werden durchleuchtet und nur lebende Embryonen werden beimpft. In die Schale des bebrüteten Eis wird oberhalb des Luftsackes ein kleines Loch gebohrt und 0,1   ml    einer Suspension von chorio-allantischer Membranen, die mit durch serienweise Passagen über Kükenembryos in bebrüteten Eiern modifizierten Hundestaupe-Viren infiziert sind, werden auf der Membran aufgetragen. Das Loch im Ei wird dann verschlossen und das Ei bei   37"C    fünf bis sieben Tage lang bebrütet. Nachher werden die infizierten Membranen unter sterilen Bedingungen gewonnen.

   Diese Membranen werden anschliessend mit einer sterilen Pufferlösung, der unten angegebenen Zusammensetzung, zu einer gleichförmigen, homogenen Suspension verarbeitet, so dass je 2 ml etwa 1 g des infizierten Gewebes enthalten. Die verwendete Pufferlösung hat folgende Zusammensetzung: 75 g Saccharose, 0,99 g Monokaliumphosphat, 2,38 g Dinatriumphosphat, 0,96 g Monokaliumglutaminat-monohydrat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml. pH-Endwert   =    7,2 bis 7,4.



   B. Herstellung der den modifizierten, infektiösen
Hundehepatitis-Virus enthaltenden Komponente
Eine mit Trypsin versetzte Kultur von Hundenierengeweben in einem Nährmedium, das aus 8 Teilen Earlescher Lösung (Earles ausgeglichene Salzlösung enthält 6,8 g Natriumchlorid, 0,40 g Kaliumchlorid, 0,20 g Calciumchlorid, 0,20 g Magnesiumsulfat, 0,125 g Mononatriumphosphat, 1,00 g Glukose und 2,20 g Natriumbicarbonat, aufgefüllt mit Wasser zu 1000 ml), 1 Teil 50/oligem Lactalbumin Hydrolysat und 1 Teil inaktiviertem Pferdeserum oder einer Suspension, die Reste einer Hundeniere enthält, zusammengesetzt ist, wird mit 0,2 ml einer mit Trypsin versehenen aus einer Hundenierengewebekultur abgetrennten Flüssigkeit, die einen modifizierten infektiösen Hundehepatitis-Virus enthält, der aufeinanderfolgend mindestens 51mal, vorzugsweise 100 und mehr Male,

   durch Kulturen von Hundenierengeweben hindurchgeschickt worden war, beimpft. Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,6 bis 7,8 eingestellt und die Inkubation der Kultur bei   35"C    ausgeführt. Nach viertägiger Inkubation wird die Gewebekulturflüssigkeit, die eine hohe Konzentration an lebendem, geschwächtem infektiösem Hundehepatitis-Virus enthält, unter sterilen Bedingungen gewonnen. Ähnliche Herstellungsmethoden können unter Verwendung einer Schweinenierengewebekultur anstelle der Hundenierengewebekultur ausgeführt werden. Ebenso kann man für die Herstellung der Nierengewebekulturen andere Nährmedien benutzen, als das oben erwähnte Medium.



   C. Herstellung des kombinierten Vaccins
Zu je 2 ml der Komponente mit dem Hundestaupe-Virus werden 0,2 ml der Komponente mit dem Hundehepatitis-Virus hinzugefügt, und die Massen werden gründlich miteinander   gemischt.    Je 2 ml der Mischung werden dann unter sterilen Bedingungen in Glasphiolen abgefüllt. Die Mischungen in den Phiolen werden anschliessend rasch bei einer Temperatur von   etwa -50 C    einfrieren gelassen und im gefrorenen Zustand im Vakuum unter Aufrechterhaltung einer tiefen Temperatur getrocknet. Für die Verwendung zur Immunisierung von Hunden wird das getrocknete Vaccin mit destilliertem Wasser oder einer Normal-Kochsalzlösung wieder zu 2 ml rekonstituiert.  



   Das   Im    vorstehenden Beispiel verwendete Verhältnis der Viruskomponenten stellt ein bevorzugtes Mengenverhältnis dar. Man kann aber auch andere Verhältnisse benutzen und erhält immer noch ein wirksames Vaccin. Immerhin ist es natürlich notwendig, dass jede Viruskomponente in solcher Menge vorhanden ist, dass sie infizierend wirkt und jeder Virus muss lebend bleiben. Die Lebensfähigkeit der kombinierten Viren scheint etwas von dem verwendeten Puffer abhängig zu sein. Es ist vorteilhaft, wenn der Puffer in der angegebenen Menge verwendet wird. Man kann aber auch grössere Mengen mit befriedigendem Erfolg anwenden.



   Die Wirksamkeit des kombinierten Vaccins als Immunisierungsmittel für Hunde ergibt sich aus den nachstehenden Versuchen.



   48 Hunde wurden subkutan mit je 2 ml des kombinierten Vaccins, das wie oben beschrieben hergestellt war und den modifizierten infektiösen Hundehepatitis-Virus und den modifizierten Hundestaupe Virus enthielt, geimpft. Von diesen Hunden wurden zur Zeit der Impfung Serumproben gezogen und diese Massnahme wurde drei oder mehr Wochen später wiederholt. Mit diesen Serumproben wurden   Neutralis ationsprüfungen    vorgenommen, wobei man als Test den infektiösen Hundehepatitisvirus in der Gewebekultur und den Hundestaupe-Virus in bebrüteten Eiern benutzte. In Ergänzung der Prüfung der Serumproben auf die Bildung von Antikörpern wurden 31 der Hunde mit einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von Hundestaupe und einem virulenten, krankheitserregenden Stamm von infektiöser Hepatitis infiziert.

   In allen Fällen waren die Serumproben der Hunde, die zur Zeit der Impfung gezogen wurden, frei von Antikörpern. Nach der Impfung entwickelten alle Hunde einen beträchtlichen Anstieg der Abwehrbereitschaft gegen den Hundestaupe-Virus und den Virus der infektiösen Hepatitis. Alle 31 Hunde, die mit den krankheitserregenden Viren behandelt worden waren, widerstanden erfolgreich diesem Angriff.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines Vaccins für Hunde zur gleichzeitigen Immunisierung gegen infektiöse Hepatitis und Staupe, dadurch gekennzeichnet, dass man Eigewebe mit Hundestaape-Viren infiziert, die durch serienweise Passagen über Kükenembryos in bebrüteten Eiern modifiziert sind, eine wässrige Pufferlösung, die Saccharose, Monokaliumglutaminatmonohydrat, Monokaliumsulfat und Dinatnumphos- phat enthält und ein pH von 7,2 bis 7,4 aufweist, zuletzt das Produkt auf eine aus einer Gewebekultur abgtrerinten Flüssigkeit, die lebende, infektiöse Hundehepatitis-Viren enthält, welche durch serienweise Passagen über Kulturen von Hundenierengeweben oder von Hundenieren- und anschliessend von Schweinenierengeweben modifiziert sind,

   einwirken lässt und die erhaltene flüssige Masse einer Gefriertrocknung unterwirft.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man ein bebrütetes Eigewebe mit den Hundestaupe-Viren infiziert.

   2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man eine aus einer Hundegewebe Kultur abgetrennte, die Hundehepatitis-Viren enthaltende Flüssigkeit benutzt.

   3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Geflügel-Eigewebe mit den Hundestaupe-Viren infiziert.

   4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene flüssige Masse sofort gefroren und eingetrocknet wird.

   5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man 10 Teile des bebrüteten, mit den Hundestaupe-Viren infizierten Eigewebes auf 1 Teil der aus einer Hundegewebekultur abgetrennten, die Hundehepatitis-Viren enthaltenden Flüssigkeit benutzt.

   6. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf 1 Teil des bebrüteten mit den Hundestaupe-Viren infizierten Eigewebes 2 Teile der Pufferlösung und 0,1 Teile der aus einer Gewebekultur abgetrennten Flüssigkeit verwendet, wobei die Pufferlösung eine wässrige Lösung von 75 g Saccharose, 0,99 g Monokaliumphosphat, 2,38 g Dinatriumphosphat, 0,96 g Monokaliumglutaminat-monohydrat pro Liter ist.