Verfahren zur Herstellung einer kombinierten Vaccine für Hunde
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines kombinierten Impfstoffes zur Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c. c.). Die Staupe und die H. c. c. sind zwei gefährliche und weitverbreitete Viruserkrankungen der Hunde. An Staupe erkranken ausserdem noch Füchse und Pelztiere der Marderfamilie (Mustelliden). Das H. c. c.-Virus ist ausser für Hunde auch für Büchse (Fuchsencephalitis) pathogen.
Man kann Hunde und andere empfängliche Tiere erfolgreich gegen die Staupe immunisieren. Die zur Zeit geübten Immunisierungsverfahren beruhen auf der Verabreichung eines Impfstoffes, der ein lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Virus enthält. Daneben wird auch noch die simultane Verabreichung eines pathogenen Virus in Verbindung mit Immunserum und die Verimpfung eines Impfstoffes mit inaktiviertem Virus angewendet. Durch die Verwendung obiger Impfstoffe wurde die Hundestaupe wirksam bekämpft.
Diese Impfungen gewähren jedoch keinen Schutz gegen die H. c. c.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c. c.) gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Vaccine zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und H. c. c. herstellen kann, indem man die zu einer Suspension aufgearbeiteten staupevirushaltigen Teile des embryonierten Hühnereies mit einem mittels Formaldehyd inaktivierten H. c. c.-Virus das aus Hundelebern undloder Hundemilzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur gewonnen wird und dessen virusschädigender Formaldehydanteil durch Zusatz einer 1,5- bis 2fachen stöchiometrischen Bisulfitlösung abgebunden wurde, mischt und gefriertrocknet.
Hierbei ist es vorteilhaft, wenn das H. c. c.-Antigen durch eine Aluminiumhydroxydlösung adsorbiert wird. Vorzugsweise geht man so vor, dass man ein Mischungsverhältnis von einem Staupe-Anteil, der aus etwa 500/0. eines modifizierten, staupevirushaltigen Chorioallantoismaterials, 400/0 Rinderbouillon vom pH 7,6 und 10 dz 500/ & iger Glukoselösung besteht, mit einem annähernd gleichgrossen H. c. c. Anteil, der aus etwa 75 /o eines inaktivierten, H. c. cvirushaltigen Extraktes und 25 0/ & einer 20/oigen Aluminiumhydroxydlösung besteht, einhält.
Die verfahrensgemäss erhaltene Staupe-H. c. c. Vaccine (SH-Vaccine) stellt eine Verbindung zwischen einem lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus und einem inaktivierten H. c. c.-Virus dar. Die Herstellung eines solchen Mischimpfstoffes bringt verschiedene Vorteile mit sich. Im Vergleich zur Herstellung von zwei getrennten Impfstoffzubereitungen wird verfahrensgemäss nach der Vermischung des Staupe- und H. c. c.-Vaccine-Anteiles der Material-, Arbeits- und Energieaufwand etwa auf die Hälfte gesenkt. Es ergibt sich insbesondere eine Einsparung an Abfüll- und Verpackungsmaterial und eine wesentliche Minderung der Kosten für die Lyophilisation. Ausserdem stellt die Verabreichung nur einer Vaccine anstelle von zweien eine Vereinfachung und Verbilligung des Impfverfahrens dar.
Der Staupe- und H. c. c.-Anteil der SH-Vaccine müssen erfindungsgemäss in eine besondere Form gebracht werden, damit keine nachteilige Beeinflussung der beiden Anteile entstehen kann. Namentlich das lebende Staupevirus ist sehr empfindlich und wird durch chemische, thermische und anders geartete Einflüsse leicht geschädigt und vernichtet. So würde beispielsweise das im H. c. c.-Vaccine-Anteil enthaltene Formaldehyd bei seiner Vermischung mit dem Staupe Anteil das modifizierte Staupevirus innerhalb einer Stunde vernichten. Es ist gelungen, die virusschädigenden Eigenschaften, die durch den Formaldehyd (CH2O) hervorgerufen werden, durch die Zugabe von Bisulfit (NaHSO3) zu beseitigen. Dabei verfährt man z. B. in der Art, dass man zunächst den freien und den gebundenen Formaldehyd quantitativ bestimmt.
Hierauf wird der freie Formaldehyd im H. c. c.-Virus Anteil durch Zugabe von 150 bis 200 via der stöchiometrischen Menge an Bisulfit, z. B. Natriumbisulfit, chemisch abgebunden nach der Gleichung
EMI2.1
Nun vereinigt man den H. c. c-Vaccine-Anteil mit dem Staupeimpfstoffanteil unter Eiskühlung, füllt ab und lyophilisiert das Impfstoffgemisch.
An 32 Hunden wurde die verfahrensgemäss erhaltene SH-Vaccine auf ihre immunisierende Eigenschaften sowohl gegen Staupe als auch gegen H. c. c. geprüft. Von den mit je einer Dosis von 2 ml des kombinierten Impfstoffes subkanten vaccinierten Hunden widerstanden alle einer künstlichen Infektion mit aktivem Staupe- und H. c. c-Virus. Dagegen erkrankten alle der insgesamt 7 nicht geimpften Staupe Kontrollhunde an dem für die Virusstaupe typischen Fieberverlauf. Ein Teil dieser Staupe-Kontrollhunde wurde auf der Höhe des sogenannten zweiten Fieberanstieges getötet. Dieser Fieberanstieg ist durch die Besiedelung und Vermehrung des Virus in den Organen gekennzeichnet. Bei der Untersuchung der Organe in der Komplementbindungsreaktion (KBR) wurde ein für die Staupe positives Ergebnis erhalten.
9 nicht vaccinierte H. c. c.-Kontrollhunde erkrankten mehr oder weniger heftig an H. c. c. 4 davon verendeten nach einigen Tagen. In der KBR konnte ein Befall der Organe mit dem H. c. c.-Virus nachgewiesen werden.
Neben der Prüfung im Tierexperiment wird die erfindungsgemäss hergestellte SH-Vaccine auf ihren Staupevirusgehalt am vorbebrüteten Hühnerei geprüft.
Ausserdem wurden 12 weitere Versuchshunde mit je 2 ml der oben beschriebenen SH-Vaccine subkutan geimpft. Unmittelbar vor der Impfung und 3 Wochen danach wurden Blutproben entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am vorbebrüteten Hühnerei geprüft. Alle 12 Hunde hatten vor der Impfung keinen, 3 Wochen danach dagegen einen beträchtlichen Blutserumspiegel an staupevirusneutralisierenden Antikörpern, die ein Vielfaches einer infektiösen Virusdosis zu neutralisieren imstande sind.
Beispiel a) Herstellung des Staupeanteils der SH-Vaccine
Bei der Herstellung des lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Staupevirus enthaltenden Staupeanteils wird wie folgt verfahren.
8 Tage vorbebrütete Hühnereier werden durchleuchtet, und die Lage des Embryos wird markiert.
An der bezeichneten Stelle wird die Eischale angebohrt so dass eine Öffnung entsteht, durch welche die Chorioallantoishaut mit 0,2 ml einer 40!cigen Suspension infiziert wird. Diese Suspension enthält modifiziertes. vom Ei gewonnenes Staupevirus in Aqua dest., dem 10 O/c einer 1l1, molaren Phosphatpuffer-Lösung vom pH 7,6 zugegeben wurde. Die Impföffnung wird mit paraffingetränktem japanischem Seidenpapier verschlossen. Die so behandelten Eier werden 5 Tage bei 37O nachbebrütet und anschlie ssend geöffnet. Die mit Staupevirus bewachsenen Eihäute werden geerntet, gesammelt, im Homogenisator unter Eiskühlung fein zerkleinert und mit einer Stabilisatorlösung wie folgt zu einer Suspension aufgearbeitet.
Es wird beispielsweise zu 500 ml des zerkleinerten Chorioallantoismaterials eine Stabilisatorlösung zugegeben, die sich aus 400 ml Rinderbouillon vom pH 7.6 und 100 ml einer 50'Ycigen Glukoselösung zusammensetzt. Der Staupeanteil der SH Vaccine besteht demnach aus 50oil virushaltigem Chorioallantoismaterial, 40 0/0 Rinderbouillon vom pH 7,6 und 10 O/r, einer 500/obigen Glukoselösung. b) Herstellung des H. c. c.-Anteils der SH-Vaccine
Bei der Herstellung des H. c. c.-Anteils der SH Vaccine wird wie folgt vorgegangen:
350 g der H. c. c.-virushaltigen Leber und Milz eines Hundes werden unter Eiskühlung im Homogenisator fein zerkleinert, und das Material wird unter Zugabe von 700 ml Aqua dest. zu einer Suspension aufgearbeitet. Die Suspension wird in einer Flasche gesammelt, mit 0,5 0/o, das sind 5,25 ml 35 /tiige Formaldehydlösung, versetzt und eine Stunde im Schüttelapparat kräftig geschüttelt. Die Suspension wird in der Folge dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und eine Woche bei Kühlschranktemperatur (etwa 4 ) aufbewahrt.
Die so behandelte Suspension wird anschliessend 30 Minuten bei 3000 U;min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
Zu 750 ml des gewonnenen Extraktes werden 250 ml einer 20/0eigen Aluminiumhydroxydlösung zugesetzt. Man erhält somit 1000 ml des inaktivierten H. c. c.-virushaltigen Vaccine-Anteils, der sich aus 75 O/o H. c. c.-virushaltigem Extrakt und 25 O/n einer 2 0/o igen Aluminiumhydroxydlösung zusammensetzt.
Vom H. c. c.-Vaccine-Anteil wird eine Probe zur Bestimmung des freien und des gebundenen Formaldehydgehaltes entnommen.
Der freie Formaldehyd wird durch Zugabe der 1,fachen stöchiometrischen Menge an Bisulfit abgebunden. Beträgt beispielsweise der freie Formaldehydgehalt 100 mg 0/o, so werden zu 1 Liter H. c. c.-Vaccine-Anteil 26.9 ml einer 200/eigen Bisulfitlösung zugesetzt. c) Herstellung des H. c. c.-Anteils der SH-Vaccine durch ein von der Gewebekultur gewonnenes
H. c. c.-Virus
Von einer frischen Hundeniere wird unter möglichst sterilen Verhältnissen die Nierenrinde gewonnen. Diese wird in einer Petrischale gesammelt und zu 4 bis 5 mm grossen Stückchen zerkleinert. Diese Gewebestückchen werden mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) nach Dulbecco, R. und Vogt, M.
(J. of Exp. Med. 99, 167, 1954) gewaschen. Im An sdsluss daran erfolgt die Trypsinierung der Nierenrindenstückchen mit einer 0,25 O/o igen Trypsinlösung im Wasserbad bei 37". Durch die Trypsinierung werden aus den Organstückchen einzelne Zellen abgespalten. Die Aufschwemmung dieser losgelösten Zellen wird gesammelt und die Trypsinierung durch Unterkühlung im Eiswasserbad unterbrochen. Durch Zentrifugieren zunächst bei 1000 und nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpufferlösung (pH 7,5) bei 600 Um'min werden die Trypsinlösung und die in der Aufschwemmung enthaltenen Blutkörperchen entfernt. 1 ml gewaschene Nierenzellen werden jetzt z. B. in einer Mischung von 95 ml Kulturmedium 199 nach Morgan, J. F., Morton, A. J. und Parker, R. C.
(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. V. 73, 1, 1950) und 5 ml Kälberserum aufgeschwemmt. Zu 100 ml dieser Zellsuspension wird ein Antibiotika-Gemisch, bestehend aus 20 000 I. E. Penicillin, 20 000 y Streptomycin und 20 000 y Neomycin, zugesetzt und mit einer 2,8 6/obigen Natriumbikarbonat-Lösung, die einen Zusatz von 0,002 /o Phenolrot enthält, ein pH-Wert von 6,8 eingestellt. Mit dieser Zellsuspension werden sterile Kulturgefässe, z. B. Fernbachkolben, Erlenmeyerkölbchen oder Rollrandröhrchen, mit etwa 8 /o ihres Fassungsvermögens beschickt. Etwa 4 bis 6 Tage nach dem Ansatz müssen die zu dem Epithelrasen auswachsenden Nierenzellen durch Ersatz der Nährlösung gefüttert werden und gegebenenfalls in den nachfolgenden Tagen der pH-Wert mit einer Natriumbikarbonat Lösung nachgestellt werden.
Sobald der Zellrasen voll ausgebildet ist, wird er mit einer Suspension, die ein aus Hundeleber herausgezüchtetes und durch einige Passagen an die Gewebekultur adaptiertes H. c. c.-Virus enthält, beimpft. Das H. c. c.-Virus wird nach etwa 6-7 Tagen, nachdem sich ein vollständiger cytopathogener Effekt ausgebildet hat und eine Loslösung der abgestorbenen Epithelzellen erfolgt ist, durch Abgiessen der Zellsuspension geerntet.
Der H. c. c.-Virusgehalt bzw. die Antigenität der Suspension wird durch Beimpfen von Kulturröhrchen in verschiedenen Verdünnungen (Virustitration) oder durch Untersuchung in der Komplementbindungsreaktion (KBR) geprüft. Die von der Gewebekultur gewonnene H. c. c.-virushaltige Zellsuspension wird mit 0,1 bis 0,2 /o 35 6/o Formaldehydlösung versetzt und zur Inaktivierung 1 Woche lang bei Kühlschranktemperatur (etwa 4 ) aufbewahrt. Danach werden zu 750 ml der Suspension 250 ml einer 20/obigen Aluminiumhydroxydlösung zugesetzt.
Der freie Formaldehyd wird bestimmt und vor der Vermischung mit dem Staupe-Anteil durch die Zugabe der 1 ,fachen stöchiometrischen Menge Bisulfit abgebunden. d) Mischung des Staupe- und H. c. c.-Anteils der
SH-Vaccine
1000 ml des Staupe-Anteils werden mit 1000 ml des mit Bisulfit behandelten H. c. c.-Anteils unter Eiskühlung gemischt und zu je 2 ml in Fläschchen abgefüllt. Die so erhaltene Staupe-H. c. c.-Vaccine Mischung wird im Stehen bei einer Temperatur von 400 eingefroren und in der Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. Dadurch wird der Impfstoff in eine haltbare und lagerfähige Form übergeführt.