Verfahren zur Herstellung cyclischer Dekapeptide
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung cyclischer Dekapeptide der Formel Cycio- (A-B-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl) , worin A für den zweiwertigen Rest einer L-a-Amino- salure der Formel
EMI1.1
oder für Glycyl steht, wobei X einon niederen Alkylrest bedeutet, z. B. für L-Valyl oder L-Leucyl, und B den zweiwertigen Rest einer natürlichen L-a- Aminosäure darstellt, die auch aromatische Reste oder eine weitere Aminogruppe aufweisen kann, z. B. L-Lysyl, L-Tyrosyl oder L-Leucyl, und weder A noch B Ornithylreste sind.
Die Dekapeptide besitzen gute antibiotische Eigenschaften gegenüber Bakterien, Pilzen und Viren und können daher als Antibiotika oder auch als Konservierungsmittel verwendet werden.
Es war überraschend, dass die genannten Dekapeptide eine starke antibiotische Wirkung, wie das Gramicidin, aufweisen, obwohl sie beispielsweise die seltene < > Aminosäure L-Ornithin, die als für die biologische Wirkung des Gramicidins wesentlich betrachtet wurde (vgl. J. I. Harries & T. S. Work, Nature, 161, 804 [1948] ; Biochemical Journal, 46, 196, 582 [1950]), nicht enthalten.
Ein besonderer Vorteil einiger der genannten Dekapeptide ist darin zu erblicken, dass sie z. B. mit Aminosäuren aufgebaut werden können, die leichter und billiger zugänglich sind als Aminosäurebausteine des Gramicidins, insbesondere Ornithin, wobei auch die Kupplung dieser Aminosäuren zum Dekapeptid einfacher ist.
Die Dekapeptide werden erfindungsgemäss erhalten, wenn man ein Salz eines HA-B-L-Leucyl-D phenylalanyl-L-prolin-esters, in welchem eine eventuell in B vorhandene weitere Aminogruppe geschützt ist und der in der Alkoholkomponente einen elektronenanziehenden Substituenten aufweist, mit basischen Mitteln behandelt und, falls man von einem Salz ausgegangen ist, das im Rest B eine geschützte Aminogruppe enthält, diese in die freie Aminogruppe überführt.
Eine in B vorhandene Aminogruppe wird zweckmässigerweise durch Einführung eines Restes, der ohne Ringöffnung abspaltbar ist, wie z. B. der Tosyl-, Trityl-, Carbobenzoxy-oder Trifluoracetyl-oder ein Arylazo-carbobenzoxyrest, wie z. B. der p-Methoxy phenyl-azo-carbobenzoxyrest, geschützt.
Die Alkoholkomponente der als Ausgangsmaterial verwendeten Ester kann irgendein organischer Rest sein, der einen oder mehrere elektronenanziehende Substituenten aufweist, insbesondere die Cyano-, Nitro-, Sulfo-oder Methansulfonylgruppe. Beispiele solcher Alkoholkomponenten sind z. B. der Rest des Cyanmethylalkohols, des p-Nitrophenols oder des p-Methansulfonylphenols.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten Salze der Peptidcarbonsäureester, die in der Alkoholkomponente einen elektronenanziehenden Substituenten aufweisen, lassen sich beispielsweise durch Umsatz des N-Triphenylmethyl-peptids mit einem Halogenwasserstoffester des entsprechenden Alkohols in Gegenwart einer tertiären organischen Base und anschliessende Abspaltung des Triphenylmethylrestes durch Behandlung mit verdünnter Säure, oder durch katalytische Hydrierung eines entsprechenden Esters des N-Carbobenzoxypeptids in Gegenwart einer Säure herstellen. Als zur erfindungsgemässen Umsetzung geeignete Salze sind insbesondere die der Halogen wasserstoffsäuren, wie der Salzsäure, oder von halogenierten Fettsäuren, wie der Trifluoressigsäure, zu nennen.
Als alkalische Mittel für die verfahrensgemässe Umsetzung werden z. B. anorganische Basen, wie Alkalihydroxyde oder-carbonate, oder organische Basen, vorzugsweise tertiäre Amine, verwendet.
Das Verfahren wird vorteilhaft in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Tetrahydrofuran oder deren Gemischen, gegebenenfalls auch in Anwesenheit von Wasser, durchgeführt. Die Ausbeute kann durch Zusatz von sauren Katalysatoren, beispielsweise Eisessig oder Schwefelsäure, zum Salz des Peptidesters weiter gesteigert werden.
Die gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbaren cyclischen Dekapeptide besitzen eine gute anti biotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdiinnungsreihen (Zehnerpotenzon) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 C bebrütet werden, so ergeben sich beispielsweise fur Cyclo- (Lvalyls L-lysyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-L- prolyl) 2 2HC1 folgende noch hemmende Konzentrationen :
Hemmende
Testorganismen Konzentration
Staphylococcus aureus 10-5
Streptococcus haemolyticus 10-5
Streptococcus viridans 10-5
Streptococcus faecalis 10-4
Corynebacterium diphtheriae 10-6
Escherichia Coli 10-4
Salmonella typhosa 10-4
Salmonella Schottmülleri 10-4
Shigella Sonnei 10-4
Pasteurella pestis 10-4
Vibrio cholerae el Tor 10-4
Bacillus megatherium 10-5
Endomyces albicans (Soor) 10-4
Candida vulgaris (Soor) 10-4
Die Dekapeptide oder deren Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.
Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Tale ; pflanzliche Ole, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenen- falls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz-oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den folgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. Folgende Abkürzungen werden verwendet :
Cbo = Carbobenzoxy
MZ = p-Methoxy-phenyl-azo-carbobenzoxy
T = Trityl tos = Tosyl
Beispiel 1
Cyclo- (L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-
L-prolyl) z
430 mg L-Leucyl-L-leucyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin-p-nitro-phenyl-ester-trifluoracetat werden in 8, 5 ml Dimethylformamid und 4 Tropfen Eisessig gelost und im Verlaufe von 41/o Stunden in 86 ml Pyridin bei 55 eingetropft.
Darauf wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in ein Gemisch von 150 ml Methanol und 65 ml Wasser an stark sauren und stark basischen Ionenaustauschern chromatographiert. Das Produkt (230 mg = 77 /o) wird an 7 g Aluminiumoxyd chromatographiert und mit Benzol und Chloroform gewaschen. Chloroform-Essigester eluiert 210 mg Ninhydrin-negative Substanz, welche noch durch multiplikative Verteilung im System Tetrachlor kohlenstoff-Methanol-Wasser (10 : 9 : 1) gereinigt wird.
Man erhält Cyclo- (L-leucyl-L-leucyl-L leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl), vom F. 132-134 , C64H98OloNlo
Das als Ausgangsmaterial verwendete Trifluoracetat des Pentapeptid-p-nitro-phenyl-esters kann wie folgt hergestellt werden : a) Cbo-leu-leu-NHNH2 (L-L).
2 g Cbo-L-leucyl-L-leucin-methylester (Cbo = Carbobenzoxy) werden mit 10 ml abs. Methanol und 0, 75 ml Hydrazinhydrat 21/.-, Stunden am Rückfluss erhitzt. Die klare Lösung wird im Vakuum verdampft und der feste Rückstand aus Athanol-Wasser umkristallisiert. Man erhält 1, 75 g (= 87 /o) Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucin-hydrazid vom F. 152 bis 152, 5 . b) Cbo-leu-leu-leu-phe-pro-OCHs (L-L-L-D-L).
395 mg Cbo-leu-leu-NHNH2 werden in 4 ml Eisessig und 12 ml 0, 5n Salzsäure gelöst und mit 85 mg Natriumnitrit bei 0 versetzt. Das gebildete Azid wird in Essigester aufgenommen und wie üblich mit 400 mg H-Leu-phepro-OCH3 (L-D-L) 2 Tage bei 0 umgesetzt. Die gallertige Fällung wird in viel Essigester gelöst, mit verdünnter Salzsäure und Na triumhydrogencarbonatlösung gewaschen.
Nach Verdampfen der getrockneten Essigesterphase wird der Rückstand aus Athanol-Wasser kristallisiert ; man erhält 400 mg (53 /o) Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl- L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin-methylester vom F. 180-181 , [a] 690 + 40 (c = 1, 25 in Athanol). c) HCl, H-Leu-leu-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-L-D-L).
9, 87 g Carbobenzoxy-pentapeptid-methylester (vgl. b) werden in 200 ml Methanol und 15 ml ln Salzsäure mit 1 g l Öliger Palladiumkohle und Wasserstoff unter Atmosphärendruck und bei Zimmertemperatur hydriert. Nach Aufnahme der berechneten 300 ml Wasserstoff wird abgenutscht und eingedampft. Das Produkt ist ein farbloser Schaum (5, 3 g = 62*/o) des Hydrochlorids des L-Leucyl-Lleucyl-L-leucyl-D-phenylalanin-L-prolin-methylesters. d) T-Leu-leu-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-D-L).
1 g Pentapeptid-methylester-hydrochlorid (vgl. c) wird in 10 ml abs. Chloroform und 0, 65 ml Triäthylamin gelöst. Nach Zugabe von 650 mg Triphenylchlormethan wird 18 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach dem Verdampfen des Lösungs- mittels wird mit Benzol am Aluminiumoxyd chromatographiert. Nach Durchwaschen des Triphenylchlormethans und Triphenylcarbinols wird der Tritylpentapeptid-methylester mit Chloroform und Essigester eluiert. Man erhält ihn in Form eines amorphen Schaums (740 g = 56 < Vo). e) T-Leu-leu-leu-phe-pro-OH (L-L-L-D-L).
740 mg Methylester gemäss d) werden in 30 ml Dioxan, 6 ml Methanol und 17, 2 ml 0, 5n Natronlauge bei 37 verseift. Die Säure Trityl-L-leucyl-L- leucyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin wird als amorpher Schaum in 96 /o Ausbeute erhalten. f) T-Leu-leu-leu-phe-pro-oc6H4No2 (L-L-L-D-L).
700 mg Trityl-pentapeptidsäure gemϯ e) werden in 8 ml Pyridin gelöst und mit 1, 3 g Di- (p-nitro- phenyl)-sulfit versetzt. Nach 15 Stunden wird mit eiskalter Zitronenlösung versetzt, nach 11/2 Stunden bei 0 mit Essigester extrahiert, gewaschen und getrocknet. Der Nitrophenylester des Trityl-pentapeptids wird als Harz (685 g = 866/e3 erhalten. g) F3C-COOH, H-Leu-leu-leu-phe-pro-
OC6H4NO2 (L-L-L-D-L).
685 mg Trityl-pentapeptid-p-nitro-phenyl-ester gemϯ f) werden in 14 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei-5 bis-10 mit 14 ml Wasser langsam versetzt. Die Lösung wird lyophilisiert und der R ckstand mit ¯ther-PetrolÏther 1 : 1 verrieben. Man erhält 430 mg hellbraunes Pulver (= 72i/o) des Trifluoracetates des Pentapeptid-p-nitro-phenyl-esters.
Beispiel 2
Cyclo- (valyl-tyrosyl-leucyl-phenylalanyl-prolyl) 2 (L-L-L-D-L) 2
1, 1 g L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-D-phenylalanyl L-prolin-p-nitro-phenyl-ester-trifluoracetat werden in 22 ml Dimethylformamid und 1 ml Eisessig gelöst und langsam in 220 ml Pyridin bei 55 eingetropft.
Nach 41/2 Stunden ist die Zugabe beendet. Die Lösung wird nach weiteren 13/4 Stunden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in einem Gemisch von 250 ml Methanol und 100 ml Wasser warm gelöst und durch eine geheizte Säule von stark saurem Ionenaustauscher filtriert. Die Säule wird mit weiteren 500 ml des warmen Gemisches nachgewaschen.
Die Filtrate werden im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Essigester verrieben. 540 mg hellbraunes Pulver (69 /o). Das Produkt erweist sich als papierchromatographisch einheitlich (Pauly Reagens) und ist Ninhydrin-negativ. Die Verbindung wird im Gemisch Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform Methanol-Wasser 7 : 3 : 7 : 3 über 24 Stufen verteilt (Trennfaktor Substanz : Nitrophenol in diesem System = 19). Die reinen Fraktionen des Cyclo- (valyl tyrosyl-leucyl-phenylalanyl-prolyl) 2 (L-L-L-D-L) 2 werden aus ¯thanol-Wasser kristallisiert (runde Agglomerate). F. 191 , C68H90O12N10 . 3H2O.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Trifluoracetat des Pentapeptid-p-nitro-phenyl-esters kann wie folgt hergestellt werden : a) Cbo-val-tyr-leu-phe-pro-OCHg (L-L-L-D-L).
9, 49 g Cbo-L-valyl-L-tyrosin-hydrazid werden mit 90 ml Eisessig, 260 ml 0, 5n Salzsäure und 1, 88 g Natriumnitrit ins Azid übergeführt. Dieses wird mit 9 g L-Leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin-methylester in 200 ml Essigester bei 0 umgesetzt. Dabei scheidet sich der Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-D- phenylalanyl-L-prolin-methylester in kristallisierter Form aus : 12, 8 g (736/o) F. 214-215 , [a] D = -59 '4 (c = 1, 04 in Eisessig). b) H-Val-tyr-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-L-D-L).
11, 4 g Cbo-val-tyr-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-L- D-L) gemϯ a) werden in 120 ml Methanol und 16 ml In Salzsäure mit 1 g 10% iger Palladiumkohle bei Normaldruck hydriert. Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff wird vom Katalysator getrennt und verdampft. Der Rückstand wird in siedendem Ather gelöst. Beim Erkalten kristallisiert der Pentapeptid-methylester, 9, 36 g (= 94"/o), F. 209-210 . Die Verbindung ist nach Analyse nicht das Hydrochlorid, sondern der freie Pentapeptidester. c) T-Val-tyr-(T)-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-L-D-L).
10, 2 g H-Val-tyr-leu-phe-pro-OCH3 (L-L-L- D-L) gemäss b) und 6 ml Triäthylamin werden in 100 ml absolutem Chloroform gelöst und mit 11 g Triphenylchlormethan behandelt. Nach dem Ausschütteln in verdünnter Salzsäure und mit Wasser wird verdampft. Der Rückstand wird aus Benzol Petroläther mehrmals umgefällt. Ausbeute 93 /o T-L-Valyl-L-tyrosyl-(T)-L-Leucyl-D-phenylalanyl-L- prolin-methylester (T = Trityl = Triphenylmethyl), F. 129 , [a] =-47 4 (c = 1, 11 in Athanol). d) T-Val-tyr-(T)-leu-phe-pro-OH (L-L-L-D-L).
600 mg T-Val-tyr- (T)-leu-phe-pro-OCH3 (L-L- L-D-L) gemϯ c) werden in 24 ml Dioxan und 5 ml Methanol gelöst und mit 13, 4 ml 0, 5n Natronlauge versetzt. Nach 3/4 Stunden bei 37 ist die Verseifung beendet. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und auf eiskalte, überschüssige Zitronensäurelösung gegossen. Die Säure wird mit Essigester extrahiert, in Benzol durch eine Säule von Floridin XXS filtriert und aus Benzol-Petroläther umgelöst. F. 159 . Ausbeute 95 /o Trityl-L-valyl-trityl-L-tyrosyl-L-leucyl D-phenylalanyl-L-prolin. e) T-Val-tyr-(T)-leu-phe-pro-OC6H4NO2 (L-L-L-D-L).
1, 56 g Ditrityl-pentapeptidsäure gemϯ d) und 2, 2 g Di- (p-nitro-phenyl)-sulfit werden in 15 ml Pyridin gelöst und 5 Stunden stehengelassen. Dann wird bei 0¯ bersch ssige ZitronensÏurel¯sung zugegeben und mit Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird beim Verreiben mit Ather-Petroläther (1 : 1) fest : 1, 30 g (= 73%) Di trityl-pentapeptid-p-nitro-phenyl-ester. f) F3C-COOH, H-Val-tyr-leu-phe-pro-OC6H4NO2 (L-L-L-D-L).
1, 47 g Ditrityl-pentapeptid-p-nitro-phenyl-ester gemäss e) werden in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei-5 bis-10 langsam unter Rühren mit 30 ml Wasser versetzt, dann lyophilisiert. Der ltückstand wird mit Ather-Petroläther 1 : 1 und 1 : 2 sowie mit Ather verrieben. Festes Pulver, 1, 0 g (= 97 /o3 Trifluoracetat des L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-D-phenyl- alanyl-L-prolin-p-nitro-phenyl-esters.
Beispiel 3 Cyclo- (glycyl-lysyl-leucyl-phenylalanyl- prolyl) 2 . 2 HBr (L-L-D-L)2
1, 02 g Glycyl-(MZ)-L-lysyl-L-leucyl-D-phenyl alanyl-L-prolin-p-nitro-phenyl-ester-trifluoracetat [MZ = (p-Methoxyphenyl-azo-carbobenzoxy)] werden in 20 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 8 Tropfen Eisessig gelöst und die Lösung in 6 Stunden unter Rühren in 200 ml Pyridin bei 55 eingetropft.
Es wird noch 2 Stunden bei 55 gerührt, dann das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der R ckstand wird in 150 ml Methanol und 40 ml Wasser gelöst und dann durch Ionenaustauschersäulen ¸Merck I und III (Markenprodukte) filtriert. Die
Säulen werden mit Methanol-Wasser 2 : I quantitativ ausgewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird aus Athanol-Wasser umkristallisiert. Man erhält 500 mg 64 /o eines mikrokristallinen Produktes, Cyclo [gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro]2 (L-L-D-L)2. Nach zweimaligem Umkristallisieren schmilzt die Substanz bei 241-243 .
1, 13 gCyclo-[gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro] 2 (L-L-D-L) werden mit 4, 2 ml 4n Bromwasserstoff in Eisessig versetzt und 1 Stunde auf 40¯ erwÏrmt. Nach etwa 20 Minuten beginnt das p-Methoxy-phenyl-azobenzylbromid auszukristallisieren. Der Eisessig wird im Vakuum verdampft und der Rückstand zwischen Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform 1 : 1 und Wasser verteilt. Die wässrige Phase wird noch einige Male mit Tetrachlorkohlenstoff-Chloroform 1 : 1 ausgeschüttelt, dann im Vakuum zur Trockne verdampft.
Der Rückstand wird mit wenigen Tropfen wässrigem Bromwasserstoff gelöst, mit abs. Aceton versetzt, wobei das Cyclo- (glycyl-lysyl-leucyl-phenylalanyl- propyl) -2HBr (L-L-D-L) in weissen Nädelchen auskristallisiert. Ausbeute : 775 mg = 89 /o der Theorie. F. 199-200¯.
Überführung ins Hydrochlorid : Das Hydrobromid wird in Methanol-Wasser 2 : 1 gelöst, durch entsprechend mit Natronlauge vorbehandelten und neutral gewaschenen stark basischen Ionenaustauscher (¸Merck III¯) filtriert und das Filtrat mit 2n Salzsäure angesäuert. Nach dem Verdampfen des Lö sungsmittels kann der Rückstand aus 2n Salzsäure und Aceton kristallisiert werden. Weisse Stäbchen, F. 199-201" ; [α]D25,5 = -147 ¯ 1,5¯ (c - 1, 01 in In Salzsäure).
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden : a) N- (p-Methoxy-phenyl-azo-carbobenzoxy)-L- lysin (MZ-Lysin).
5 g L-Lysin-monohydrochlorid werden in 150 ml Wasser gelöst und 2 Stunden mit 7, 5 g basischem Kupfercarbonat gekocht. Es wird heiss abgenutscht, das Filtrat mit 200 ml Aceton versetzt, 1, 65 g Ma gnesiumoxyd zugegeben und unter Rühren in 1 Stunde 10 g Kohlensäure- (p-methoxy-phenyl-azo- benzylester) chlorid [(M)-chlorid], gelöst in 50 ml Aceton, zugetropft. Nachdem noch 2 Stunden gerührt wird, nutscht man den Kupferkomplex ab, wäscht ihn mit Wasser, Athanol und Ather. Hierauf wird der Kupferkomplex in 75 ml 2n Salzsäure auf geschlämmt und 10 Minuten auf 60 erwärmt.
Die Farbe der Fällung schlägt dabei von grünlichgelb auf goldgelb um. Das MZ-lysin wird genutscht, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50 getrocknet. Ausbeute : 9, 1 g = 80 lo der Theorie, F. 242 bis 243 nach Zersetzung. Das Produkt ist äusserst schwer löslich, es wird deshalb roh weiterverarbeitet. b) N-MZ-L-Lysin-Nα-carboxyanhydrid.
In eine Suspension von 11, 2 g rohem MZ-Lysin gemäss a) in 300 ml Tetrahydrofuran wird während
1 Stunde bei 40¯ Phosgen eingeleitet. Etwas ungelöstes Material wird abgenutscht und das Lösungsmittel im Vakuum vollständig verdampft. Der R ckstand (9, 84 g = 83% der Theorie) besteht aus dem schwerlöslichen Nα-Carboxyanhydrid des N'-MZ-L- Lysins. Dieses wird roh weiterverarbeitet. c) N-MZ-L-Lysin-methylester-hydrochlorid.
9, 84 g rohes Nα-Carboxyanhydrid gemϯ b) wer den mit 17 ml abs. Methanol und 30 ml 1, 5n Salz säure in Methanol 5 Minuten gekocht. Dabei geht das Carboxyanhydrid vollständig in Lösung. Das Losungsmittel wird im Vakuum verdampft, der Rück- stand in abs. Methanol gelöst und mit abs. Ather versetzt. Beim Kratzen beginnt das Ester-hydrochlorid zu kristallisieren. Zur Analyse wird nochmals auf gleiche Weise umkristallisiert. Ausbeute : 7, 1 g = 68 I/o der Theorie des N-MZ-L-Lysin-methylester- hydrochlorids, F. 241 nach Zersetzung. d) Trityl-gly-(MZ)-lys-OCH3 (L).
7, 0 g MZ-Lysin-methylester-hydrochlorid werden mit 11 ml Tetrahydrofuran, 4, 7 ml Triäthylamin, 5, 35 g Trityl-glycin-cyanmethylester und 1 ml Eisessig versetzt und 3 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Darauf wird 1 ml Wasser zugegeben und noch 1 Stunde gerührt. Die Mischung wird in 300 ml Essigester aufgenommen und mit Wasser, Natriumhydrogencarbonat-und Zitronensäurelösung gewaschen. Nach dem Trocknen des Lösungsmittels wird im Vakuum zur Trockne verdampft. Das erhaltene rote Harz wird in Essigester gelöst und durch eine Aluminiumoxyd-Säule filtriert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels hinterbleiben 9, 2 g Harz = 84e/o der Theorie des Trityl-glycyl- (MZ)-L-lysin- methylesters.
Es gelingt nicht, dieses Produkt zu kristallisieren. e) Trityl-gly-(MZ)-lys-NHNH2 (L).
9, 2 g Trityl-gly-(MZ)-lys-OCHs gemäss d) werden in 47 ml Methanol warm gelöst, mit 1, 85 ml Hydrazinhydrat versetzt und 2 Stunden am Rückfluss gekocht. Dann wird im Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand in hei¯em Tetrachlorkohlenstoff gelöst und das Hydrazid kristallisieren gelassen.
Ausbeute : 5, 3 g = 580/o Trityl-glycyl-(MZ)-L-lysin- hydrazid. Es wird aus Benzol-Tetrachlorkohlenstoff umkristallisiert (gelbe feine Nädelchen), F. 154-155 . f) Trityl-gly- (MZ)-lys-leu-phe-pro-OCHg (L-L-D-L).
1, 12 g Trit-gly-(MZ)-lys-NHNH2 gemäss e) werden bei-10 in einem Gemisch von 11 ml Eisessig und 7, 7 ml In Salzsäure gelöst. Dazu gibt man 10 ml Eiswasser, dann eine Lösung von 130 mg Natriumnitrit in Wasser. Das Azid fällt fest aus.
Es werden noch 10 ml Eiswasser zugegeben, 5 Minuten in der Eis-Natriumchlorid-Mischung stehengelassen, darauf das Azid abgenutscht und mit Eiswasser neutral gewaschen. Das feuchte Azid wird bei -10 in Essigester gelöst und die Essigesterlösung nach dem Waschen mit eiskalter gesättigter Kochsalzlösung kurz getrocknet. Dann wird die Essigesterlösung des Azids in eine eiskalte Essigesterlösung von H-Leu-phe-pro-OCH3 (hergestellt aus 660 mg HCl-H-Leu-phe-pro-OCH3) filtriert. Nach zweitägi- dem Stehen bei-5 wird noch über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann die Essigesterlösung mit Zitronensäure-und Natriumhydrogencarbonat-lösung ausgezogen, neutral gewaschen, getrocknet und der Essigester im Vakuum vollständig verdampft.
Der Rückstand wird in Athanol-Wasser 9 : 1 (V : V) gelöst, durch eine Aluminiumoxyd-Säule filtriert und mit dem Gemisch ausgewaschen. Das.
Filtrat wird verdampft und getrocknet. Ausbeute : 1, 4 g = 840/o, der Theorie des Trityl-glycyl- (MZ)-Llysyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin-methylesters ; gelboranger, fester Schaum. Kann nicht kristallisiert werden. Zur vollständigen Reinigung wird eine Probe einer Craig-Verteilung über 42 Stufen in Tetrachlorkohlenstoff-Methanol-Wasser 10 : 9 : 1 unterworfen.
Die Fraktionen 4-12 sind rein und werden zur Analyse gegeben. Auch dieses Material kristallisiert nicht. g) Trityl-gly- (MZ)-lys-leu-phe-pro-OH (L-L-D-L).
1, 16 g Trit-gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro-OCH3 ge mäss f) werden in einem Gemisch von 35 ml Dioxan und 6 ml Methanol gelöst, mit 4, 2 ml 0, 5n Natronlauge versetzt und 11/4 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wird im Vakuum stark eingeengt, der Rückstand mit eiskaltem Wasser versetzt, wobei das Natriumsalz ausfällt. Beim Ansäuern mit Zitronensäurelösung entsteht eine feine Fällung. Diese wird in Essigester gelöst, die Essigesterlösung neutral gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne verdampft. Ausbeute : 1, 13 g =99' /o Trityl-glycyl- (MZ)-L-lysyl-L-leucyl-D- phenylalanyl-L-prolin. h) Trityl-gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro-OC6H4NO2 (p) (L-L-D-L).
1, 13 g Trit-gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro-OH gemäss g) werden in 11 ml Pyridin gelöst, mit 1, 7 g Di- (nitro- phenyl)-sulfit versetzt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Pyridin wird im Vakuum zum Teil verdampft, dann wird Eiswasser zugegeben und mit Zitronensäure angesäuert. Zur Zersetzung des überschüssigen Sulfits lässt man 1 Stunde bei 0 stehen, dann wird mit Essigester extrahiert und dieser neutral gewaschen. Die Lösung wird nach dem Trocknen verdampft und der Rückstand mit Ather Petroläther 1 : 2 und 1 : 1 verrieben, bis alles Nitrophenol entfernt ist.
Es hinterbleiben 1, 19 g = 94 /o gelboranges Pulver, das den Trityl-glycyl- (MZ)-L- lysyl-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolin-p-nitro-phenyl- ester darstellt. i) CF3COOH-H-Gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro- OC6H4NO2 (p) (L-L-D-L)
1, 19 g Trit-gly-(MZ)-lys-leu-phe-pro-OC6H4NO2 (L-L-D-L) gemäss h) werden in 24 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei-5 bis-10 langsam unter Rühren mit 24 ml Wasser versetzt. Nach 15 Minuten bei 0 wird lyophilisiert und der Rückstand, das Trifluoracetat des Trityl-pentapeptid-p-nitrophenyl-esters, gut mit ¯ther-PetrolÏther 1 : 1 verrieben. Ausbeute : 1, 02 g = 96 /o gelbes Pulver.
Beispiel 4 Cyclo- (val-lys-leu-phe-pro) 2 (L-L-L-D-L) 2
420 mg CF3COOH-H-Val-tos-lys-leu-phe-pro- OCsHNO2 (L-L-L-D-L), gelöst in 8 ml Dimethyl formamid unter Zusatz von 10 Tropfen Lösung, werden unter Rühren bei 55 in 5 Stunden in 84 ml Pyridin eingetropft. Es wird noch 2 Stunden weitergerührt, dann die Lösungsmittel im Vakuum vollständig verdampft und der Rückstand in 150 ml Methanol-Isopropanol-Wasser 1 : 1 : 1 gelöst. Diese Lösung wird durch einen stark sauren und einen stark basischen Ionenaustauscher ( Merck I und III¯) filtriert und mit 200 ml des obigen Gemisches ausgewaschen. Der Rückstand, nach dem Verdampfen des Lösungsmittels, gibt nach Umkristallisieren aus Methanol-Wasser 70 mg Rohprodukt.
Aus der Mutterlauge kann nach Chromatographie an Aluminiumoxyd, Elution mit Chloroform und Umkristallisieren aus Methanol-Wasser noch 15 mg Substanz gewonnen werden. Ausbeute roh : 27"/o'. Dieses Produkt wird über 30 Stufen zwischen Tetrachlorkohlen- stoff-Methanol-Wasser 10 : 9 : 1 verteilt. Verteilungszahl 0, 65. Die reinen Fraktionen wiegen 70 mg = 2311/9 der Theorie. F. 263 nach Zersetzung, [a] =-225 ;-227 4 (c = 0, 622 in Eisessig). Aus Methanol-Wasser umkristallisiert, bildet das Cyclodekapeptid weisse Prismen vom F. 266-269 (Zers.).
100 g Cyclo- (val-tos-lys-leu-phe-pro) 2 werden in 100 ml flüssigen, über Natrium destillierten Ammoniak gegeben und mit Natrium bis zur bleibenden Blaufärbung versetzt. Verbrauch etwa 120 mg. Das Gemisch wird zur Zerstörung des Natriums und Überführung in das Hydrochlorid mit 600 mg Ammoniumchlorid versetzt, der Ammoniak verdampfen gelassen und der Rückstand bei 30-40 extrahiert.
Der Rückstand wird mit wenig In Salzsäure verrieben, die feste Fällung abgenutscht und mit In Salzsäure gewaschen. Die Ausbeute beträgt nach dem Trocknen im Hochvakuum bei 70 38 mg.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Trifluoracetat des Pentapeptid-p-nitro-phenyl-esters kann wie folgt hergestellt werden : a) NE-p-Toluolsulfonyl-L-lysin-methylester- hydrochlorid.
23 g N-Toluolsulfonyl-L-lysin [R. Roeske, F. H. C. Stewart, R. J. Stedman und V. du Vigneaud, J. Amer. Chem. Soc. 78, 5884 (1956)] werden in 550 ml abs. Methanol gelöst und diese Lösung unter Rühren und Kühlen mit Eis-Kochsalz mit Salz säuregas gesättigt. Nach einstündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird der Methanol im Vakuum verdampft. Der ganze Prozess wird nochmals wiederholt. Der erhaltene rohe Ester wird aus abs. Athanol + Ather umkristallisiert und schmilzt dann bei 135 .
Ausbeute : 26 g = 97% der Theorie. b) Cbo-L-valyl-N-tosyl-L-lysin-methylester.
Zu einem Gemisch von 1 g Cbo-valin, 1, 4 g N-Tosyl-lysin-methylester-hydrochlorid, 2, 2 ml Tri äthylamin und 20 ml Tetrahydrofuran wird unter Rühren bei-5 in etwa 1 Stunde 0, 74 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml Tetrahydrofuran zugetropft. Anschliessend wird noch 2 Stunden unter Eiskühlung gerührt, dann das überschüssige Phosphoroxychlorid mit wenig Wasser zerstört und das Tetrahydrofuran im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in Essigester und Wasser gelöst und die Essigesterlösung noch mit 2n Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Essigesterlösung über Natriumsulfat wird zur Trockne verdampft und der Rückstand aus Aceton-Ather umkristallisiert.
Die Ausbeute beträgt 1, 81 g = 83"/o.
F. 130 . [a] D18 = -8¯ ¯ 4¯ (c - 0, 958 in Eisessig).
Dasselbe Produkt wird aus Cbo-valin-p-nitro-phenylester und N-Tosyl-lysin-methylester-hydrochlorid erhalten. Die Ausbeute beträgt in diesem Fall 67 /o der Theorie. c) Cbo-L-valyl-N-tosyl-L-lysin-hydrazid.
10 g Cbo-L-valyl-N-tosyl-L-lysin-methylester werden mit 100 ml abs. Athanol und 2, 6 ml Hydrazinhydrat 40 Stunden unter Rückfluss gekocht. Der Methylester geht dabei in Lösung, und nach kurzer Zeit beginnt das Hydrazid auszufallen. Dieses wird genutscht und mit Ather gewaschen. Man erhält 7 g = 70 /0 der Theorie. F. 209 . Aus der Mutterlauge erhält man nach Versetzen mit Wasser noch
19% unverÏnderter Methylester zurück. d) Cbo-val-tos-lys-leu-phe-pro-OMe (L-L-L-D-L).
Aus 1, 56 g HCI-H-Leu-phe-pro-OMe wird mit Hilfe von Natriummethylat das freie Peptid hergestellt und dieses in Essigester gelöst.
2 g Cbo-val-tos-lys-NHNH. werden in einem Gemisch von 24 ml Eisessig, 36 ml ln Salzsäure und 36 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird auf-10 abgekühlt und auf einmal mit einer konzentrierten Lösung von 300 mg Natriumnitrit versetzt. Das ausgefallene Acid wird sofort genutscht, 3mal mit Eiswasser gewaschen, dann in Essigester bei-10 gelöst, über Natriumsulfat getrocknet und in die obige Essigesterlösung des Tripeptids hineinfiltriert. Das Gemisch wird 7 Tage bei 0 stehengelassen. Nach
1-2 Tagen beginnt das Pentapeptid in weissen Nädel- chen zu kristallisieren. Diese werden genutscht und mit Äther gewaschen.
Man erhält 1, 81 g = 55 /" der Theorie vom F. 208-208, 5 . [n] D =-47 ; -48 4 (c = 1, 056 in Eisessig).
Die Essigester-Mutterlauge wird mit 2n Salzsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und nach dem Trocknen vollständig verdampft.
Der Rückstand ergibt nach dem Umkristallisieren aus Athanol-Wasser noch 500 mg Pentapeptid = 150/o der Theorie. Der Schmelzpunkt beträgt trotz nochmaligem Umkristallisieren nur 142-143". Es zeigt sich, dass verschiedene Modifikationen vorlie gen, denn das tief schmelzende Produkt schmilzt nach Impfen mit Hochschmelzendem auch bei 206 .
Die Analyse stimmt auch vom tiefschmelzenden Pro dukt. [a] 2D =-48 ;-49 4 (c = 1, 146 in Eis essig). e) HCI-H-Val-tos-lys-leu-phe-pro-OMe (L-L-L-D-L).
3, 6 g Cbo-val-tos-lys-leu-phe-pro-OMe werden in 40 ml Eisessig und 8 ml ln Salzsäure gel¯st und in Gegenwart von 300 mg 10 neiger Palladiumkohle hydriert. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abgenutscht, das Filtrat vollständig zur Trockne verdampft und der Rückstand noch dreimal mit abs.
Athanol verdampft. Die Ausbeute beträgt 3, 15 g = 98% der Theorie. Zur Analyse wird aus abs.
Athanol-Ather ausgefällt. F. 140 . f) T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OMe (L-L-L-D-L).
2, 93 g HCI-H-Yal-tos-lys-leu-phe-pro-OMe werden in 11 ml abs. Chloroform und 1, 47 ml Triäthylamin gelost, bei 0 mit 1, 47 g Triphenylchlormethan versetzt und 6 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Chloroform wird dann im Vakuum vollständig verdampft und der Rückstand nochmals mit ¯ther-PetrolÏther I : 2 und 1 : 1 und zuletzt mit Wasser verrieben. Der Rückstand wiegt nach dem Trocknen 3, 83 g = 10401'e, der Theorie. Das Produkt wird aus Essigester-Ather-Petroläther umgefällt.
F. 111-. [a] D24 =-27 ;-28" 4" (c = 0, 9795 in Methanol). g) T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OH (L-L-L-D-L).
3, 83 g T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OMe werden in 65 ml Methanol gelöst, mit 7, 7 ml ln Natronlauge versetzt und 2 Stunden auf 36 erwärmt. Das Methanol wird im Vakuum eingedampft, bis sich eine Trübung bildet. Diese alkalische Lösung wird bei 0 mit überschüssiger Zitronensäurelösung versetze, die ausgefallene Säure abgenutscht und gewaschen. Die Ausbeute beträgt 3, 5 g = 93% der Theorie. Zur Analyse wird das Produkt aus Benzol-Ather-Petrol äther umgefällt. F. 138 . [a] D22 = -34; -36¯ ¯ 3¯ (c = 1, 4 in Methanol). h) T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OC6H4NO2p (L-L-L-D-L).
1, 16 g T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OH in 3 ml Pyri- din werden mit 1, 9 g Di- (p-nitro-phenyl)-sulfit versetzt und etwa 1 Tag bei Zimmertemperatur stehen- gelassen. Das Gemisch wird dann mit überschüssiger Zitronensäurelösung versetzt und 1 Stunde bei 0 stehengelassen. Die Fällung wird in Essigester gelöst, diese Lösung mit Zitronensäurelösung gewaschen und das Lösungsmittel nach dem Trocknen verdampft.
Der Rückstand wird gut mit Ather-Petroläther 1 : 2, 1 : 1 und 2 : 1 verrieben, wobei er fest wird. Die Ausbeute beträgt 1, 21 g = 93"/o der Theorie. Die spektroskopische Gehaltsbestimmung ergibt eine Reinheit von 96, 5 I/o (gemessen in einer Lösung von ¯thanol-@n Natronlauge 1 : 1). i) CF. jCOOH-H-VaI-tos-lys-leu-phe-pro-
OC6H4NO2p (L-L-L-D-L).
2, 33 g T-val-tos-lys-leu-phe-pro-OCOHNO2, gelöst in 46 ml Tritluoressigsäure, werden bei-5 bis -10 langsam mit 46 ml Wasser versetzt. Dabei fällt Triphenylcarbinol aus. Das Gemisch wird noch 15 Minuten bei 0 stehengelassen, dann in Aceton Trockeneis gefroren und am Hochvakuum getrocknet.
Der Rückstand wird mit Äther-Petroläther 1 : 2, 1 : 1 und Ather verrieben, wobei er sofort fest wird.
Ausbeute : 2, 03 g = 98 f/o.