CH655949A5 - Verfahren zur herstellung von einem threonin(b30)-ester des humaninsulins, einem salz desselben oder einem metallkomplex desselben, sowie diesen ester und eine verwendung desselben. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von einem threonin(b30)-ester des humaninsulins, einem salz desselben oder einem metallkomplex desselben, sowie diesen ester und eine verwendung desselben. Download PDFInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einem ThreoninB30-Ester des Humaninsulins der allgemeinen Formel III
(Thr( R5)-0 R4) B3(1-h-I n (III)
worin R4 eine Carboxyl-Schutzgruppe, R5 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe und h-In die Des(ThrB30)-Hu-maninsulin-Einheit bedeuten, oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben.
Bei der Behandlung von Diabetes Mellitus werden Insulinverbindungen, hergestellt aus Schweine- oder Rinderinsulin allgemein verwendet.
Schweine-, Rinder- und menschliche Insuline zeigen geringfügige Unterschiede in ihrer Aminosäurezusammensetzung, wobei der Unterschied zwischen menschlichem und Schweineinsulin sich auf eine einzige Aminosäure beschränkt insofern, dass die B30-Aminosäure des menschlichen Insulins Threonin ist, während die von Schweineinsulin Alanin ist. Es kann daher immerhin eingewendet werden, dass die ideale Insulinpräparation für die Behandlung von Menschen ein Insulin mit exakt der gleichen chemischen Struktur wie der von menschlichem Insulin ist.
Für die Herstellung von menschlichem, natürlichem Insulin steht die notwendige Menge menschlicher Pancreas-Drü-sen nicht zur Verfügung.
Synthetisches menschliches Insulin ist sehr teuer in kleinem Massstab hergestellt worden, siehe Helv. Chim. Acta, 57, S. 2617, und 60, S. 27. Halbsynthetisches menschliches Insulin ist aus Schweineinsulin über zeitaufwendige Reaktionswege, wie in Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 357, 759 und Nature 280,412 beschrieben, hergestellt worden.
Die US-PS 32 76 961 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von halbsynthetischem menschlichem Insulin. Nichtsdestoweniger ist die Ausbeute an menschlichem Insulin schlecht, da das Verfahren in Wasser durchgeführt wird, und unter Bedingungen, in denen Trypsin eine Spaltung der ArgB22-GlyB23-Bindung bewirkt, siehe Journal of Biological Chemistry, 236, S. 743.
Ein bekanntes halbsynthetisches Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin weist folgende drei Schritte auf: Zuerst wird Schweineinsulin in Schweine-des-(AlaB30)-Insulin mittels Behandlung mit Carboxypeptidase A, siehe Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 359, S. 799, umgewandelt. Im zweiten Schritt wird Schweine-des-(AlaB30)-Insulin einer Trypsin-katalysierte Kopplung mit Thr-OBu' unterworfen, wodurch der ThrB30-tert-Butylester menschlichen Insulins gebildet wird. Schliesslich wird dieser Ester mitTrifluoressigsäure behandelt, um menschliches Insulin zu liefern, siehe Nature 280, S. 412. Der erste Schritt liefert eine teilweise Abspaltung von AsnA21, wodurch des-(AlaB30,-AsnA21)-Insulin geliefert wird. Dieser Abkömmling führt nach den beiden anschliessenden Reaktionen zu einer Verunreinigung von des-(AsnA2l)-Insulin in dem hergestellten halbsynthetischen menschlichen Insulin, die nicht leicht mit dem bekannten Präparationsverfahren entfernt werden kann. Des-(AsnA2l)-Insulin besitzt niedrige biologische Aktivität (etwa 5%), siehe American Journal of Medicine 40, S. 750.
Die Aufgabe der Erfindung besteht also darin, ein Verfahren zuliefern, mit welchem in industriellem Massstab menschliches Insulin hergestellt werden kann, wobei nichtmenschliches Insulin in menschliches Insulin umgewandelt werden soll. Weiterhin soll ein Verfahren geliefert werden, welches Schweineinsulin und in diesem enthaltene bestimmte Verunreinigungen in menschliches Insulin über einen Threo-ninB30-Ester des menschlichen Insulins umwandelt.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von ThreoninB30-Estern des menschlichen Insulins gelöst, das gekennzeichnet ist durch die Kombination der im Anspruch 1 angegebenen Merkmale. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens sowie ein Ergebnis des Verfahrens und eine Verwendung dieses Ergebnisses gehen aus den abhängigen Ansprüchen hervor.
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Das Verfahren nach der Erfindung besitzt also folgende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik:
a) Die enzymatische Hydrolyse zur Abspaltung von AlaB3°, beispielsweise mit Carboxypeptidase A, wird ausgelassen.
b) Die Isolation einer Zwischenverbindung, wie beispielsweise Schweine-des-(AlaB30)-Insulins, ist unnötig.
c) Verunreinigungen mit des(AsnA2l)-Insulin-Derivaten werden vermieden.
d) Proinsulin und andere insulinähnliche Verunreinigungen, die im Rohinsulin anwesend sind, werden durch das erfindungsgemässe Verfahren über den ThreoninB30-Ester des menschlichen Insulins in menschliches Insulin umgewandelt, wodurch die Ausbeute erhöht wird.
e) Antigenartige insulinähnliche Verbindungen, siehe GB-PS 12 85 023, werden in menschliches Insulin umgewandelt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele erläutert sind.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die an die Carbonylgruppe von LysB29 gebundene Aminosäure oder Peptidkette in der Insulinverbindung mit einem Threonin-Ester ausgetauscht werden kann. Dieser Austausch wird hierin als Transpeptidierung bezeichnet.
Der hierin verwandte Terminus «Insulinverbindungen» umschliesst Insuline und Insulin-ähnliche Verbindungen, welche die menschliche des(ThrB30-Insulineinheit enthalten, wobei die B30-Aminosäure des Insulins Alanin (in Insulin von beispielsweise Schwein, Hund und Finn- und Spermwal) oder Serin ist, wie beim Kaninchen. Der Terminus «insulinähnliche Verbindungen», wie er hierin gebraucht wird, schliesst Proinsulin, das sich von irgendeiner oben genannter Spezies und Primaten ableitet, gemeinsam mit Intermediärprodukten von der Umwandlung von Proinsulin in Insulin, ein. Als Beispiel derartiger Intermediärprodukte können gespaltenes Proinsulin, Desdipeptid-Proinsuline, Desnona-peptid-Proinsulin und Diarginin-Insuline genannt werden, siehe auch R. Chance «In Proceedings of the Seventh Con-gress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 bis 305, Herausgeber: R.R. Rodrigues & J.V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.
Das erfindungsgemässe Verfahren weist die Transpeptidierung einer Insulinverbindung oder eines Salzes oder eines Komplexes derselben mit einem L-Threonin-Ester oder einem Salz desselben in einer Mischung von Wasser, einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, und Trypsin, auf, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung weniger als etwa 50 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb etwa 50 °C liegt.
Obwohl Trypsin wegen seiner proteolytischen Eigenschaften am bekanntesten ist, haben Fachleute erkannt, dass Trypsin dazu befähigt ist, das Koppeln von des-(AlaB30)-Insulin und einem Threonin tert-Butyl-Ester zu katalysieren, vide Nature 280, S. 412. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird das Trypsin zur Katalyse der Transpeptidierungsreak-tion eingesetzt.
Die Transpeptidierung kann durch Auflösen von 1. der Insulinverbindung, 2. einem L-Threonin-Ester und 3. Trypsin in einer Mischung von Wasser und mindestens einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wunschweise in Gegenwart einer Säure, durchgeführt werden.
Bevorzugte wassermischbare organische Lösungsmittel sind polare Lösungsmittel. Als spezifische Beispiele derartiger Lösungsmittel können Methanol, Ethanol, 2-Propanol, 1,2-Ethandiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, N,N-Dime-thylformamid, Formamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid und Acetoni-tril genannt werden.
In Abhängigkeit davon, welches wassermischbare organische Lösungsmittel verwendet wird, von der ausgewählten Reaktionstemperatur und davon, ob eine Säure in der Reaktionsmischung anwesend ist, sollte der Wassergehalt in der Reaktionsmischung weniger als etwa 50 Vol.-° ii, bevorzugt weniger als etwa 40 Vol.-%, und mehr als etwa 10 Vol.-% betragen.
Ein Vorteil der Verminderung der Wassermenge in der Reaktionsmischung besteht darin, dass aufgrund dessen die Bildung von Nebenprodukten vermindert wird. Durch Erhöhen der Säuremenge in der Reaktionsmischung ist es auf ähnliche Art und Weise möglich, die Nebenproduktbildung herabzusetzen. Die Erhöhung der Ausbeute ist positiv mit einem hohen Prozentsatz organischen Lösungsmittel korreliert.
Die Trypsinart ist nicht wesentlich für die Ausführung der Erfindung. Trypsin ist ein gut charakterisiertes, kommerziell in hoher Reinheit erhältliches Enzym, nämlich von Schweinen und Rindern. Weiterhin kann Trypsin mikrobiellen Ursprungs verwandt werden. Die Trypsinform, beispielsweise kristallines Trypsin (lösliche Form), immobilisiertes Trypsin oder sogar Trypsinderivate (so lange die Trypsinaktivität erhalten bleibt) ist nicht kritisch für die Durchführung der Erfindung. Der Terminus «Trypsin», wie er hierin verwandt wird, soll Trypsine aus allen Quellen und alle Formen von Trypsin umschliessen, welche transpeptidierende Aktivität besitzen, eingeschlossen Proteasen mit trypsinähnlicher Spezifität, beispielsweise Achromobacter lyticus Protease, siehe Agric. Biol. Chem. 42, S. 1443.
Als Beispiele aktiver Trypsinderivate können acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, mit Glutaraldehyd behandeltes Trypsin und immobilisierte Trypsin-Derivate genannt werden.
Wenn ein immobilisiertes Trypsin eingesetzt wird, wird es im Medium suspendiert.
Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Butyrsäure oder Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-hydroxymethylaminomethan) N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin können dazugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zustande zu bringen. Organische Säuren werden bevorzugt eingesetzt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne derartige Zusätze durchgeführt werden. Die Menge zugesetzter Säure ist üblicherweise geringer als 10 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-Ester. Bevorzugt beträgt die Säuremenge zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-Ester. Ionen, welche Trypsin stabilisieren, wie Calciumionen, können zugegeben werden.
Das Verfahren kann in einem Temperaturbereich von + 50 °C bis zum Erstarrungspunkt der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden üblicherweise bei etwa 37 °C durchgeführt, um eine genügende Reaktionsgeschwindigkeit zu gewährleisten. Nichtsdestoweniger ist es vorteilhaft, um Inaktivierung des Trypsins zu vermeiden, das Verfahren nach der Erfindung bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. In praxi werden Reaktionstemperaturen oberhalb etwa 0 0 C bevorzugt.
Die Reaktionszeit beträgt üblicherweise zwischen einigen Stunden und mehreren Tagen, abhängig von der Reaktionstemperatur, von der Menge zugegebenen Trypsins und von anderen Reaktionsbedingungen.
Das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung ist üblicherweise oberhalb von etwa 1:200, bevorzugt oberhalb etwa 1:50, und unterhalb etwa 1:1.
Die für die Durchführung der Erfindung vorgesehenen L-Threonin-Ester können durch die allgemeine Formel
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Thr(R5)-OR4 II
beschrieben werden, wobei R4 eine Carboxylschutzgruppe und R5 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist.
Die ThreoninB30-Ester des menschlichen Insulins, die bei der Transpeptidierung entstehen, können durch die allgemeine Formel
(Thr(R5)-OR4)B30-h-In, III
wobei h-In die menschliche des-ThrB30)-Insulineinheit repräsentiert und R4 und R5 die gleichen Reste wie weiter oben definiert sind, beschrieben werden.
Verwendbare L-Threonin-Ester der Formel II sind solche, in denen R4 eine Carboxyl-Schutzgruppe ist, die vom Threo-ninB30-Ester des menschlichen Insulins (Formel III) unter Bedingungen, welche keine wesentliche irreversible Umwandlung im Insulinmolekül hervorrufen, abgespalten werden kann. Als Beispiele derartiger Carboxyl-Schutzgruppen können niedere Alkylgruppen, beispielsweise Methyl, Ethyl und tert-Butyl, substituiertes Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl genannt werden, sowie Gruppen der allgemeinen Formel -CH2CH2SO2R6, wobei R6 einen niederen Alkylrest wie Methyl, Ethyl, Propyl und n-Butyl bedeutet. Geeignete Hydroxyl-Schutzgruppen R5 sind solche, die von dem ThreoninB30-Ester des menschlichen Insulins (Formel III) unter Bedingungen abgespalten werden können, die keine wesentlichen irreversiblen Umwandlungen im Insulinmolekül hervorrufen. Als Beispiel einer derartigen Gruppe R5 kann tert-Butyl genannt werden.
Niedrige Alkylgruppen enthalten weniger als 7 Kohlenstoffatome, bevorzugt weniger als 5 Kohlenstoffatome.
Weitere Schutzgruppen, die üblicherweise eingesetzt werden, sind von Wünsch in: Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl), Band XV/1, Herausgeber Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, beschrieben worden.
Einige L-Threonin-Ester (Formel II) sind bekannte Verbindungen und die restlichen L-Threonin-Ester (Formel II) können analog der Herstellung bekannter Verbindungen präpariert werden.
Die L-Threonin-Ester der Formel II können freie Basen oder Salze geeigneter organischer oder anorganischer Säuren derselben sein, bevorzugt Acetate, Propionate, Butyrate und Salze von Hologenwasserstoffen wie Hydrochloride.
Es ist wünschenswert, die Reaktanden, nämlich die Insulinverbindung und den L-Threonin-Ester (Formel II), in hohen Konzentrationen einzusetzen. Bevorzugt wird ein Molverhältnis oberhalb etwa 5:1 zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung eingesetzt.
Es ist wünschenswert, dass die Konzentration an L-Threonin-Ester (Formel II) in der Reaktionsmischung oberhalb von 0,1 Molar liegt.
Menschliches Insulin kann aus ThreoninB30-Estern von menschlichem Insulin (Formel III) durch Abspaltung der Schutzgruppe R4 und irgendeiner Schutzgruppe R5 durch bekannte Verfahren oder per se bekannte Methoden erhalten werden. Im Falle, dass R4 Methyl, Ethyl oder eine Gruppe -CH2CH2S02R6 ist, wobei R6 wie oben beschrieben definiert ist, kann die Schutzgruppe unter leicht basischen Bedingungen im wässrigen Medium abgespalten werden, bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, beispielsweise bei etwa 9,5. Als Base können Ammoniak, Triethylamin oder Alkalime-tallhydroxide verwandt werden, wie Natriumhydroxid. Falls R4 tert-Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann die besagte Gruppe durch Acidolyse entfernt werden, bevorzugt mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann wasserfrei sein oder etwas Wasser enthalten oder mit einem organischen
Lösungsmittel wie Dichlormethan verdünnt sein. Falls R5 tert-Butyl ist, kann die Gruppe durch Acidolyse, wie oben beschrieben, abgespalten werden.
Bevorzugte ThreoninB30-Ester menschlichen Insulins der 5 Formel III sind Verbindungen, in denen R5 Wasserstoff ist; diese werden aus den L-Threonin-Estern der Formel II hergestellt, in denen R5 Wasserstoff ist.
Die Transpeptidierung der Insulinverbindungen in Threo-ninB30-Ester des menschlichen Insulins wird detaillierter auf 10 Basis folgender Formel, die den Insulinverbindungen gegeben wird, beschrieben :
R1— (1—t-AI 21 )
15 ( 1—l-Bl—29) -R2,
wobei 1
- ( 1 —tA-T—21 )
20 (1——29)-
menschliche des(ThreoninB30)-Insulineinheit ist, wobei GlyAI mit dem als R1 bezeichneten Substituenten verbunden ist und 25 LysB29 mit dem Substituenten, der als R2 bezeichnet ist, verbunden ist, wobei R2 eine Aminosäure oder eine Peptidkette bedeutet, die nicht mehr als 36 Aminosäuren enthält und R1 Wasserstoff oder eine Gruppe der allgemeinen Formel R3-X-repräsentiert, wobei X Arginin oder Lysin bedeutet und R3 30 eine Peptidkette, welche nicht mehr als 35 Aminosäuren enthält, repräsentiert, oder R2 gemeinsam mit R3 eine Peptidkette repräsentieren, welche nicht mehr als 35 Aminosäuren enthält, unter der Voraussetzung, dass die Anzahl der in R1 plus R2 gegenwärtigen Aminosäuren weniger als 37 beträgt. 35 Die Transpeptidierung nach dieser Erfindung wandelt dementsprechend jegliche der oben genannten Insulinverbindungen in ThreoninB30-Ester menschlichen Insulins (Formel III) um, welche sodann zur Bildung von menschlichem Insulin entblockiert werden.
40 Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die in rohem Insulin vorhandenen insulinähnlichen Verbindungen, die in einigen handelsüblichen Insulinpräparationen gegenwärtig sind und durch die Formel 1 gedeckt werden, durch die erfindungsgemässe Transpeptidierung in Threo-45 ninB30-Ester menschlichen Insulins umgewandelt werden, welche sodann zur Bildung von menschlichem Insulin entblockiert werden können. Beispiele insulinähnlicher Verbindungen der Formel I ergeben sich aus dem folgenden: Schweinediarginin-Insulin (R1 ist Wasserstoff und R2 ist so -Ala-Arg-Arg), Schweineproinsulin (R3 zusammen mit R2 ist -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, wobei das terminale Alanyl mit LysB29 verbunden ist), Hundeproinsulin (R3 zusammen mit R2 ist 55 -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-AIa-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gin-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Alanyl mit LysB29 verbunden ist), gespaltenes Schweineproinsulin (R3 ist -Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, und R2 ist -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-60 Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), Desdipeptid-Proinsulin vom Schwein (R1 ist Wasserstoff und R2 ist -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), 65 menschliches Proinsulin (R3 zusammen mit R2 ist -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threo-
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nyl mit LysB29 verbunden ist) und Affenproinsulin (R3 zusammen mit R2 ist -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-GIn-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-AIa-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threonyl mit Lys829 verbunden ist).
Bei all diesen durch die Formel I abgedeckten Verunreinigungen wird der mit R3-X- bezeichnete R1-Substituent mit Wasserstoff ausgetauscht.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst das Reagierenlassen von rohem Schweineinsulin, welches insulinähnliche Verbindungen enthält oder eines Salzes oder eines Komplexes desselben mit einen L-Threonin-Ester (Formel II) oder einem Salz desselben unter oben genannten Bedingungen, wonach die Schutzgruppe R4 und irgendeine Schutzgruppe R5 abgespalten werden. Durch dieses Verfahren wird das Schweineinsulin zusammen mit insulinähnlichen Verbindungen in demselben in menschliches Insulin umgewandelt.
Als Beispiel eines Metallkomplexes oder eines Salzes einer Insulinverbindung (Formel I) kann ein Zinkkomplex oder ein Zinksalz genannt werden.
Wenn die Reaktionsbedingungen entsprechend der obigen Erklärungen ausgewählt werden und die in den darauffolgenden Beispielen erzielten Resultate in Betracht gezogen werden, ist es möglich, eine Ausbeute von mehr als 60% ThreoninB30-Ester menschlichen Insulins zu erzielen, und sogar eine solche, die höher als 80% ist, und unter besonders bevorzugten Bedingungen eine von mehr als 90%.
Ein bevorzuges Verfahren zur Herstellung menschlichen Insulins ist das folgende:
1. Das Ausgangsmaterial für die Transpeptidierung ist rohes Schweineinsulin, beispielsweise kristallines Insulin, das durch Verwendung eines Citratpuffers, siehe US-PS 26 26 228 hergestellt wurde.
2. Falls nach der Transpeptidierung noch etwas Trypsin-Aktivität übrigbleibt, wird diese bevorzugt unter Bedingungen, unter denen Trypsin nicht aktiv ist, beispielsweise in saurem Medium mit einem pH-Wert unterhalb von 3, entfernt. Trypsin kann durch Trennverfahren nach dem Molekulargewicht, beispielsweise durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 oder Bio-gel P-30 in 1 M Essigsäure, siehe Nature 280, S. 412, entfernt werden.
3. Andere Verunreinigungen, wie beispielsweise nicht reagiertes Schweineinsulin, können durch Anionen- oder Katio-nen-Austauschchromatographie, siehe Beispiele 1 und 2, entfernt werden.
4. Anschliessend wird der ThreoninB30-Ester des menschlichen Insulins entblockiert und das menschliche Insulin in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Kristallisation, isoliert.
Durch dieses Verfahren kann Insulin einer akzeptablen pharmazeutischen Reinheit erhalten und, falls gewünscht, weiterer Reinigung unterworfen werden.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auch auf neuartige ThreoninB30-Ester menschlichen Insulins, in welchem die Estereinheit unterschiedlich von tert-Butyl und Methyl ist.
Die hier verwandten Abkürzungen entsprechen den von der IUPAC-IUB Commission in Biochemical Nomenclature, 1974, empfohlenen Regeln, siehe Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland, 1975.
Analytische Untersuchungen:
Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schweineproinsulin in menschliche Insulinester kann durch DISC PAGE Elektrophorese in 7,5% Polyacrylamidgel in einem Puffer, bestehend aus 0,375 M Tris, 0,06 M HCl und 8 M Harnstoff demonstriert werden. Der pH-Wert des Puffers beträgt 8,7.
Ester der Formel III wandern mit 75% der Geschwindigkeit von Schweineinsulin. Schweineproinsulin wandert mit 55% der Geschwindigkeit von Schweineinsulin und wird durch den erfindungsgemässen Prozess in das gleiche Produkt umgewandelt. Identifizierung der Umwandlungsprodukte als Verbindungen der Formel III erfolgt aufgrund folgender Kriterien:
a) Die elektrophoretische Migration der menschlichen Insulinester der Formel III, bezogen auf Schweineinsulin, entspricht dem Verlust einer negativen Ladung.
b) Die Aminosäurezusammensetzung der angefärbten Proteinbänder im Gel, die die Verbindungen der Formel III repräsentieren, ist identisch mit derjenigen menschlichen Insulins, nämlich 3 Mol Threonin und 1 Mol Alanin pro Mol Insulin, und die Zusammensetzung des Schweineinsulins beträgt 2 Mol Threonin und 2 Mol Alanin pro Mol Insulin. Die Technik der Aminosäureanalyse von Proteinbändern in Polyacrylamidgelen ist in Eur. J. Biochem. 25, 147 beschrieben.
c) Der Beweis, dass das eingebaute Threonin als C-termi-nale Aminosäure in der B-Kette gebunden wird, wird durch oxidative Sulfitolyse der Schwefelbrücken des Insulins in 6 M Guanidiniumhydrochlorid, gefolgt durch Abtrennen der A-und B-Ketten durch Ionen-Austauschchromatographie an SP Sephadex geführt. Die Verdauung des B-Ketten-S-Sulfonats mit Carboxypeptidase A setzt lediglich die C-terminale Aminosäure frei. Diese Technik ist von Markussen in Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12-14 July, 1978 (Herausgeber: Baba, Kaneko & Yaniahara) Int. Congress Series No. 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford beschrieben. Die Analyse wird durchgeführt, nachdem die Estergruppe von den Verbindungen der Formel III abgespalten worden ist.
Diese drei Analysen zeigen eindeutig, dass Umwandlung in menschliches Insulin stattgefunden hat.
Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schweineproinsulin in menschliche Insulinester kann quantitativ durch HPCL (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie) in Umkehrphase verfolgt werden. Eine 4 x 300 mm u Bondapak Cig-Säule (Waters Ass.) wurde eingesetzt und die Elution mit einem 0,2 M Ammoniumsulphat (mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt) und 26 bis 50 Vol.-% Acetonitril aufweisenden Puffer durchgeführt. Die optimale Acetonitril-konzentration hängt davon ab, welchen Ester der Formel III man vom Schweineinsulin abzutrennen wünscht. Im Falle dass R4 Methyl und R5 Wasserstoff ist, wird die Auftrennung in 26 Vol.-% Acetonitril erreicht. Schweineinsulin und (Thr-Ome)B30-h-In (Me ist Methyl) sind nach 4,5 bzw. 5,9 Säulenvolumen eluiert, als gut aufgetrennte, symmetrischer Peaks. Vor dem Auftragen auf der HPLC-Säule wurden die Proteine in der Reaktionsmischung durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Das Ausgefällte wurde durch Zentrifuga-tion isoliert, vakuumgetrocknet und in 0,02 M Schwefelsäure gelöst.
Das Verfahren zur Herstellung menschlicher Insulinester und menschlichen Insulins wird durch folgende Beispiele genauer erläutert, welche keineswegs als Begrenzung angesehen werden sollen. Die Beispiele zeigen einige bevorzugte Ausführungsbeispiele des erfindungsgemässen Verfahrens.
Beispiel 1
200 mg rohes Schweineinsulin, einmal kristallisiert, wurden in 1,8 ml 3,33 M Essigsäure gelöst. 2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe (Me ist Methyl) in N,N-Dimethylacetamid und 20 mg Trypsin, gelöst in 0,2 ml Wasser, wurden zugegeben. Nach 18stündigem Stehenlassen bei 37 °C wurden die Proteine zur Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt und das Ausgefällte durch Zentrifugieren isoliert. Der Überstand wurde ver-
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worfen. Analyse des Ausgefällten durch HPLC unter Verwendung von 26% Acetonitril (siehe «Analytische Untersuchungen») zeigt eine 60%ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In. Das Ausgefällte wurde in 8 ml frisch entionisierter 8molarer Harnstofflösung gelöst, der pH-Wert auf 8,0 mit 1 molarer Ammoniaklösung eingestellt, und die Lösung auf eine 2,5 x 25 cm Säule, gepackt mit QAE A-25 Sephadex, mit einem 0,1 molaren Ammoniumchloridpuffer äquilibriert, welcher 60 Vol.-% Ethanol enthielt und dessen pH-Wert mit Ammoniak of 8,0 eingestellt worden war, aufgetragen. Die Elution wurde mit dem gleichen Puffer durchgeführt, und Fraktionen von 15 ml gesammelt. (Thr-OMe) B30-h-In wurde in den Fraktionen 26 bis 46 gefunden, nicht reagiertes Schweineinsulin in der Fraktionen 90 bis 120. Die Fraktionen Nr. 26 bis 46 wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum verdampft und (Thr-OMe) B30-h-In in einem Citrat-puffer, wie durch Schlichtkrüll et al., Handbuch der inneren Medizin 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York, 1975 beschrieben, kristallisiert. Die Ausbeute betrug 95 mg Kristalle mit der gleichen rhombischen Gestalt wie auf die gleiche Art und Weise kristallisiertes Schweineinsulin. Die Aminosäurezusammensetzung wurde als identisch mit derjenigen von menschlichem Insulin befunden. Weitere analytische Untersuchungen, die in dem oberen Abschnitt «Analytische Untersuchungen» beschrieben sind, zeigten, dass das entstandene Produkt (Thr-OMe)B30-h-In war.
Beispiel 2
100 mg Schweineinsulin, welche den Reinheitsanforderungen der GB-PS 12 85 023 genügten, wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und anschliessend 1 ml einer 2molaren Lösung Threonin-Methylester in N,N-Dimethyl-formamid und 12 mg mit TPCK (Tosylphenylalanin-Chloro-methylketon) behandeltes Trypsin, gelöst in 0,1 ml Wasser, zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37 °C wurden die Reaktion durch Zugabe von 4 ml 1 molarer Phosphorsäure beendet. Das erhaltene (Thr-OMe)B30-h-In wurde von dem nicht reagierten Schweineinsulin durch Ionen-Austauschchromatographie auf einer 2,5 x 25 cm Säule mit SP-Sephadex mittels eines Elutionsmittels, welches 0,09 M Natriumchlorid und 0,02 M Natriumdihydrogenphosphat (pH-Wert des Puffers : 5,5) in 60% Ethanol aufwies, abgetrennt. Fraktionen enthaltend (Thr-OMe)B30-h-In wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum entfernt und das Produkt wie in Beispiel 1 kristallisiert. Die Ausbeute betrug 50 mg (Thr-OMe)B3ü-h-In.
Beispiel 3
100 mg Schweineproinsulin wurde in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst, in (Thr-OMe)B30-h-In umgewandelt und wie für Schweineinsulin in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Die Umwandlung von Proinsulin in (Thr-OMe)B30-h-In wurde mittels HPLC-Analyse des Acetonniederschlags zu 73% bestimmt. Die Ausbeute an kristallinem (Thr-OMe) B30-h-In betrug 54 mg.
Beispiel 4
100 mg Schweineinsulin werden in 0,9 ml 2,77molarer Essigsäure in Wasser gelöst und analog dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigt eine Umwandlung von 70% in (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 5
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml 2 M Thr-OMe-Lösung in N-
methylpyrrolidon zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt und die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In war 20%.
s Beispiel 6
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 m 2,77 M Essigsäure in Wasser gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in HMPA (Hexamethylphosphortriamid) zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebe-lo nen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 80%.
Beispiel 7
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer i5 Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-Ome-Lösung in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B3U-h-In betrug 80%.
20 Beispiel 8
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-Ome-Lösung in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Anschliessend wurde Trypsin mit 200 U Aktivität (gemessen gegen das Substrat 25 BAEE), immobilisiert an 1 g Glasperlen, zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37 °C wurde das an das Glas gebundene Trypsin durch Filtration abgetrennt.
Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch 30 DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In von 40%.
Beispiel 9
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer 35 Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Anschliessend wurde Trypsin entsprechend einer Aktivität von 300 U (die Aktivität wurde gegen das Substrat BAEE gemessen) immobilisiert an 200 mg CNBr-aktivierten «Sephadex G-150», zugegeben. 40 Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37 °C wurde das an Sephadex gebundene Trypsin durch Filtration abgetrennt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in 45 (Thr-OMe)B30-h-In von 70%.
Beispiel 10
Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Voraussetzung, dass der eingesetzte Ester eine 5o 2 M Lösung von Thr-OBu' (Bu1 ist tert-Butyl) in N,N-Di-ethylacetamid war. Die Umwandlung in (Thr-OBu^^-h-In betrug 80%.
Beispiel 11
55 Das in Beispiel 8 beschriebene Beispiel wurde wiederholt, wobei der eingesetzte Ester eine 2 M Lösung von Thr-OBu1 in N,N-Dimethylacetamid war. Die Umwandlung in (Thr-OBu1) B30-h-In betrug 30%.
60 Beispiel 12
Das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei der eingesetzte Ester eine 2 M Lösung von Thr-OBu1 in N,N-Dimethylacetamid war. Die Umwandlung in (Thr-OBut)B30-h-In betrug 70%.
65
Beispiel 13
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml 2 M Thr-OMe in N,N-Dimethyl-
655 949
acetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-ln betrug 80%.
Beispiel 14
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit immobilisierten Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 40%.
Beispiel 15
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33moIarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren mit immobilisiertem Trypsin behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 70%.
Beispiel 16
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33moIarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in N,N-Dimethylacetamid, zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OBu')B30-h-In betrug 80%.
Beispiel 17
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit an Glasperlen immobilisiertem Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OBu')B30-h-In betrug 80%.
Beispiel 18
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33molarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit Trypsin, immobilisiert an CNBr-aktiviertem Sephadex G-150, behandelt, analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Prozess. Die Umwandlung in (Thr-OBu')B30-h-In betrug 70%.
Beispiel 19
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,5 ml 6molarer Essigsäure gelöst und mit 1 ml 1 M Lösung von Thr-OTmb (Tmb ist 2,4,6-Trimethylbenzyl) in N,N-Dimethylacetamid versetzt. Weiterhin wurden 0,5 ml N,N-Dimethylacetamid und 5 mg TPCK-behandeltes Trypsin in 0,1 ml Wasser zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 32 °C 44 Stunden stehen gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in (Thr-OTmb)B30-h-In von 50%.
Beispiel 20
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3moIarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Dioxan zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt; die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 10%.
Beispiel 21
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3moiarer Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Acetonitril zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Art und Weise durchgeführt und die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 10%.
Beispiel 22
250 mg kristalline (Thr-OMe)B30-h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0, gelöst. Der pH-Wert wurde konstant für 24 Stunden bei 25 °C auf 10 gehalten. Das gebildete menschliche Insulin wurde durch Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natriumacetattrihydrat und 2,5 mg Zinkacetatdihydrat, gefolgt durch Zugabe von 1 N Salzsäure zum Erhalt eines pH-Wertes von 5,52 kristallisiert. Nach 24stündigem Stehenlassen bei 4 °C wurden die rhom-boedrischen Kristalle durch Zentrifugieren isoliert, mit 3 ml Wasser gewaschen, nochmals durch Zentrifugation isoliert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 220 mg menschlichen Insulin.
Beispiel 23
100 mg (Thr-OTmb)B30 wurden in 1 ml eiskalter Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung 2 Stunden bei 0°C stehen gelassen. Das gebildete menschliche Insulin wurde durch Zugabe von 10 ml Tetrahydrofuran und 0,97 ml 1,03 molarer Salzsäure in Tetrahydrofuran ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert, mit 10 ml Tetrahydrofuran gewaschen, durch Zentrifugation abgetrennt und vakuumgetrocknet. Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mittels 1 N Natriumhydroxidlösung auf 2,5 eingestellt. Das menschliche Insulin wurde durch Zugabe von 1,5 g Natriumchlorid ausgefällt und durch Zentrifugation isoliert. Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und das menschliche Insulin durch Zugabe von 0,8 g Natriumchlorid, 3,7 mg Zinkacetatdihydrat und 0,14 g Natriumacetattrihydrat, gefolgt durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung zum Erhalt eines pH-Wertes von 5,52 ausgefällt. Nach Stehenlassen bei 4 °C für 24.Stunden wurde der Niederschlag durch Zentrifugation isoliert, mit 0,9 ml Wasser gewaschen, nochmals durch Zentrifugation isoliert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 90 mg menschliches Insulin.
Beispiel 24
100 mg Schweineinsulin wurden in 0,5 ml lOmolarer Essigsäure gelöst und 1,3 ml einer 1,54 M Lösung von Thr-OME in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde auf 12 °C abgekühlt. 10 mg Trypsin, gelöst in 0,2 ml 0,05 M Calciumacetatlösung, wurden zugegeben. Nach Stehenlassen von 48 Stunden bei 12 °C wurden die Proteine durch Zugabe von 20 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 97%, wie durch HPLC festgestellt wurde.
Beispiel 25
20 mg Schweineinsulin wurden in einer Mischung von 0,08 ml lOmolarer Essigsäure und 0,14 ml Wasser gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethyl-acetamid wurde zugegeben und die Mischung auf-10°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung, wurde zugegeben. Nach 72 Stunden Stehenlassen bei -10°C wurden die Proteine durch Zugabe von 5 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 64%, wie durch HPLC nachgewiesen wurde.
Beispiel 26
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml Wasser gegeben. Zugabe von 0,6 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid veranlassten das Insulin, sich zu lösen. Die Mischung wurde auf 7 °C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetats wurden zugegeben. Nach 24 Stunden wurden die Proteine durch Zugabe von 5 ml Aceton
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ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-ln betrug 62%, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte.
Beispiel 27
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,135 ml einer 4,45 M Propionsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid wurde zugegeben. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung, wurden zugegeben und die Mischung bei 37 °C 24 Stunden gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen 2-Propanol ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In betrug, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte, 75%.
Beispiel 28
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml Wasser disper-giert. 0,4 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dime-thylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch 0,04 ml 10 N Salzsäure, welches das Insulin veranlasste, sich zu lösen. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat wurde zugegeben und die Mischung bei 37 °C 4 Stunden gehalten. Analyse durch HPLC zeigt eine 46%ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 29
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,175 ml 0,57 M Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat. 10 mg einer Rohpräparation von Achromobacter lyticus Protease wurde zugegeben und die Mischung 22 Stunden bei 37 °C gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In betrug 12%, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte.
Beispiel 30
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 0,5molarer Essigsäure gelöst. Zugabe von 0,2 ml einer 0,1 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid löste das Insulin. Die Mischung wurde auf 12 °C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12 °C Stehenlassen zeigte die HPLC-Analyse eine 42%ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 31
2 mg Kanincheninsulin wurden in 0,135 ml 4,45molarer Essigsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid wurde zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1,25 mg Trypsin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung. Die Mischung wurde bei 37 °C 4 Stunden gehalten. HPLC-Analyse zeigte eine 88%ige Umwandlung des Kanincheninsulins in (Thr-OMe)B30-h-In. Kanincheninsulin wird vor dem Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Elutionsvolumina des Kaninchensinsulins zu (Thr-OMe)B30-h-In 0,72% beträgt.
Beispiel 32
2 mg Schweinediarginininsulins (ArgB31-ArgB32-Insulin) wurden in 0,135 ml 4,45molarer Essigsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Diethylacetamid wurde zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1,25 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung. Die Mischung wurde 4 Stunden bei 37 °C gehalten. Analyse durch HPLC zeigte eine 91 %ige Umwandlung des Diarginin-insulins in (Thr-OMe)B3ü-h-In. Diarginininsulin wird vor
Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Elutionsvolumina von Diarginininsulin zu (Thr-OMe)B30-h-In 0,50% beträgt.
Beispiel 33
2 mg von Schweine-Zwischenprodukten (nämlich eine Mischung von Desdipeptid (Lys62-Arg63)-Proinsulin und Des-dipeptid (Arg3l-Arg32-Proinsulin) wurde analog der in Beispiel 32 beschriebenen Reaktion reagieren gelassen. Analyse durch HPLC zeigte eine 88%ige Ausbeute an (Thr-OMe) B3°-h-In.
Beispiel 34
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 2molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf -18 °C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung wurden zugegeben und die Mischung 120 Stunden bei -18 °C gehalten. HPLC-Analyse zeigte, dass die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In 83% betrug.
Beispiel 35
Das in Beispiel 34 beschriebene Verfahren wurde unter der Massnahme wiederholt, dass die Reaktion bei 50 °C in 4 Stunden durchgeführt wurde. HPLC-Analyse zeigte, dass die Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In 23% betrug.
Beispiel 36
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 3molarer Essigsäure gelöst. 0,3 ml einer 0,33 M Lösung von Thr-0(CH2)2-S02-CH3, CH3COOH (Threonin-2-(methylsulfonyl) ethylester, Hydroacetat) in N,N-Dimethylacetamid wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 12 °C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12 °C einen 77%ige Umwandlung in (Thr-O(CH2)2-SO2-CH3)B30-h-In. Das Produkt eluiert ungefähr an der gleichen Stelle wie (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 37
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml lOmolarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OEt (Et ist Ethyl) in N,N-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf 12 °C abgekühlt. 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat wurden zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12 °C eine 75%ige Umwandlung in (Thr-OEt)B30-h-In. Das Produkt eluierte in einer Position kurz nach der von (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 38
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 6molarer Essigsäure gelöst. 0,3 ml einer 0,67 M Lösung von Th^Bu^-OBu' (Bu1 ist tertiäres Butyl in N,N-Dimethylacetamid wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 12 °C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12 °C betrug die Umwandlung in (Thr(But)-OBu')B30-h-In 77%. Das Produkt wurde aus der HPLC Säule durch Anwendung eines Acetonitril-Gradienten von 27 bis auf 40% eluiert.
Beispiel 39
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 1,5 M Lösung vor Thr-OMe, in Tetrahydrofuran, wurden zugegeben und die Mischung auf 12 °C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05mola-rem Calciumacetats wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12 °C zeigt die Analyse durch HPLC eine Umwandlung von 75% in (Thr-OMe)B30-h-In.
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Beispiel 40
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4molarer Essigsäure gelöst. 0,8 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in 1,2-Ethan-diol wurden zugegeben und die Mischung auf 12 °C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung wurden zugegeben. Nach 4 Stunden Stehenlassen bei 12 °C zeigte die HPLC-Analyse eine Umwandlung von 48% in (Thr-OMe)B30-h-In.
Beispiel 41
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in Ethanol wurden zugegeben und die Mischung auf 12 °C abgekühlt.
2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung, wurden zugegeben und die Reaktion 4 Stunden lang bei 12 °C durchgeführt. Analyse durch HPLC zeigte eine 46%ige Umwandlung in (Thr-OMe)B30-h-In.
5
Beispiel 42
20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4molarer Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Aceton wurden zugegeben und die Mischung auf 12 °C abge-io kühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetatlösung wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12 °C zeigte die HPLC-Analyse eine Umwandlung von 48% in (Thr-OMe)B30-h-In.
G
Claims (32)
- (1—Bl—29)-Rworin(I)R1-(l—TAT—21)(l—ißi—29)-die Des(ThrB30)-Humaninsulin-Einheit bedeutet, wobei GlyAI mit dem als R1 bezeichneten Substituenten und LysB29 mit dem als R2 bezeichneten Substituenten verbunden ist, R2 eine Aminosäure oder eine nicht mehr als 36 Aminosäuren enthaltende Peptidkette und R1 Wasserstoff oder eine Gruppe der allgemeinen Formel R3-X-, worin X für Arginin oder Lysin und R3 für eine nicht mehr als 35 Aminosäuren enthaltende Peptidkette steht, bedeuten, oder R2 und R3 zusammen eine nicht mehr als 35 Aminosäuren enthaltende Peptidkette bedeuten, mit der Massgabe, dass die Anzahl der in R1 plus R2 vorhandenen Aminosäuren weniger als 37 beträgt, oder eines Salzes oder eines Metallkomplexes derselben, mit einem L-Threonin-Ester der Formel IIThr(R5)-OR4(II)worin R4 und R5 wie oben definiert sind, oder mit einem Salz desselben, in einer Mischung von Wasser, mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und einer trypsinähnlicher Protease, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung weniger als 50 Vol.-% beträgt und die Reaktionstemperatur unterhalb 50 °C liegt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Transpeptidierung in Gegenwart einer Säure durchgeführt wird.2PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von einem Threonin830-Ester des Humaninsulins der allgemeinen Formel II(Thr(R5)-OR4)B30-h-In(III)worin R4 eine Carboxyl-Schutzgruppe, R5 Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe und h-In die Des(ThrB30)-Hu-maninsulin-Einheit bedeuten, oder von einem Salz oder einem Metallkomplex desselben, gekennzeichnet durch Transpeptidierung einer Insulinverbindung der Formel IR1-(l—rAT—21)
- 3655 949Butyl ist, bedeutet.3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die trypsinähnliche Protease Trypsin ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die trypsinähnliche Protease Achromobacter lyticus Protease ist.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des L-Threonin-Esters in der Reaktionsmischung mehr als 0,1 Molar beträgt und die Reaktionstemperatur oberhalb des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung liegt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung bis zu 10 Äquivalenten von einer Säure pro Äquivalent von L-Threonin-Ester enthält.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Insulinverbindung eine aus der von Schweine-, Hunde-, Finnwal-, Spermwal- und Kanincheninsulin, Schweine-Diarginininsulin, gespaltenem Schweine-Proinsulin, Schweine-Desdipeptidoproinsulin, Schweine-, Hunde-, Affen- und Menschen-Proinsulin und deren Mischungen gebildeten Gruppe ausgewählte Verbindung ist.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Insulinverbindung vom Schwein stammendes rohes Insulin eingesetzt wird.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch 5 gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur zwischen 0und 37 °C und vorzugsweise zwischen 0 °C und der Raumtemperatur liegt, der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 40 Vol.-% liegt und das Mol-Verhältnis zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung mehr io als 5:1 beträgt.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein polares Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, 2-Propanol, 1,2-Äthandiol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Formamid,i5 N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-pyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid oder Acetonitril ist.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,dadurch gekennzeichnet, dass die Säure eine organische Säure und vorzugsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propion-
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwi-
- 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,dadurch gekennzeichnet, dass die Transpeptidierung in3o Gegenwart von Calciumionen und/oder in einem Puffersystem durchgeführt wird.
- 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,dadurch gekennzeichnet, dass der L-Threonin-Ester als Ace-tat, Propionat, Butyrat oder als Halogenwasserstoff-Verbin-35 dung wie Hydrochlorid zugegeben wird.
- 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Wasserstoff und R2 -Ala, -Ser, -Ala-Arg-Arg oder -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-GIn-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-40 Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln bedeuten, oder dass R3 Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- und R2 -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Val-GIu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu bedeuten, oder dass R2 und R3 zusammen -Ala-Arg-Arg-Glu-AIa-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-45 Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-, wobei das terminale Ala-nyl mit LysB29 verbunden ist, -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Alanyl50 mit LysB29 verbunden ist, -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-GIy-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threonyl mit LysB29 verbunden ist, oder -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-GIu-Asp-Pro-GIn-Val-Gly-55 Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, wobei das terminale Threonyl mit LysB29 verbunden ist, bedeuten.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Wasserstoff und R2 Alanin bedeuten.bo
- 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,dadurch gekennzeichnet, dass R4 niederes Alkyl, substituiertes Benzyl, substituiertes Diphenylmethyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -CH2-CH2-SO6, worin R6 niederes Alkyl ist, bedeutet.65
- 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass R4 Methyl, Äthyl, tert-Butyl, p-Methoxybenzyl, 2,4,6-Tri-methylbenzyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel -CH2-CH2-SO2-R6, worin R6 Methyl, Äthyl, Propyl oder n-
- 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Insulinverbindung Schweineinsulin ist, der L-Threonin-Ester Thr-O-Methyl oder Thr-O-tert-Butyl ist, das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid oder N,N-Dimethylacetamid ist, die Reaktionstemperatur etwa 37 °C beträgt, der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 41 und 43 Vol.-% liegt, das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung etwa 1:8 beträgt, das Mol-Verhältnis zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung etwa 1:120 beträgt und zwischen 1,2 und 1,5 Äquivalente von Essigsäure pro Äquivalent von L-Threonin-Ester zugegeben werden.
- 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 21 und 43 Vol.-% liegt.20 säure oder Buttersäure ist, und die Menge Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent von L-Threonin-Ester beträgt.
- 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt in der Reaktionsmischung etwa 38 Vol.-% beträgt.
- 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung etwa 4,5 beträgt.
- 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung etwa 5,1 beträgt.
- 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung etwa 5,2 beträgt.
- 25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung etwa 5,4 beträgt.25 sehen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung zwischen 1:200 und 1:1 und vorzugsweise zwischen 1:50 und 1:1 liegt.
- 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert in der Reaktionsmischung 4,5 bis 5,4 beträgt.
- 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen dem ThreoninB30-Ester und der Insulinverbindung der Formel I in der Reaktionsmischung zwischen 60:1 und 180:1 liegt.
- 28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen dem Threoninß30-Ester und der Insuiinverbindung der Formel I in der Reaktionsmischung etwa 60:1 beträgt.
- 29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen dem ThreoninB30-Ester und der Insulinverbindung der Formel I in der Reaktionsmischung etwa 120:1 beträgt.
- 30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26,dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis zwischen dem ThreoninB30-Ester und der Insulinverbindung der Formel I in der Reaktionsmischung etwa 180:1 beträgt.
- 31. ThreoninB30-Ester des Humaninsulins der allgemeinen Formel III, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.
- 32. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellten ThreoninB3()-Esters des Humaninsulins der allgemeinen Formel III zur Herstellung von Humaninsulin durch Abspaltung der Schutzgruppen.
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