CH381679A

CH381679A - Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen

Info

Publication number: CH381679A
Application number: CH6719458A
Authority: CH
Inventors: Pierre Rosselet Jean; Karel Sebek Oldrich; Basil Spero George
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1957-12-11
Filing date: 1958-12-11
Publication date: 1964-09-15

Description

Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen der Formel I
EMI0001.0003
und deren 9a-Fluoranalogen, das dadurch gekenn zeichnet ist, dass man ein 6-Methyl-16cc-oxy-hydro- cortison, dessen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat bzw. ein 6-Methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocorti.son, des sen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat mittels eines eine Doppelbindung in 1,

2-Stellung einführenden Organismus vergärt.

Die Ausgangsmaterialien des erfindungsgemässen Verfahrens können erhalten werden; indem man ein 6-Methyl-11 ss,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion-21- acylat, worin die Acylgruppe einer Carbonsäure, vorzugsweise einer Kohlenwasserstoff-Carbonsäure entstammt, mit Osmiumtetroxyd umsetzt und hydrolysiert, wobei das 6-Methyl-llss,16a,17a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acylat erhalten wird;

der Monoester kann zum 6-Methyl-16a-oxyhydro- cortison hydrolysiert und das freie Diol zum Diester 6-Methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacylat verestert werden, der dann der erfindungsgemässen Umsetzung unterworfen wird.

Zur Herstellung der fluorhaltigen Ausgangsmaterialien kann der obige Diester mit einem N-Halogenacylamid oder einem N-Halogenacylamid und anschliessend mit Schwefel dioxyd behandelt werden, wobei das entsprechende 6-Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9 (11)-pregnadien- 3,20- dion 16,21-diacylat .erhalten wird;

das derart her gestellte 6-Methyl-16a,17a-trioxy-4,9(11)-pregnadien- 3,20-dion-16a,21-diacylat wird mit einer unterhalo- genigen Säure, die z. B. durch Umsetzung eines N-Halogenacylamides oder eines N-Halogenacyl- imides, worin das Halogen Chlor oder Brom ist, zum 6-Methyl-9a-halogen-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat umgesetzt;

das derart erhaltene 6-Methyl-9a-halogen-11ss,16a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat wird ent weder mit einer schwachen Base, wie Natrium- oder Kaliumacetat, oder der kleinsten berechneten Menge einer starken Base dehydrohalogeniert, wobei 6-Methyl-9ss,11 ss-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion-16,21-diacylat erhalten wird;

diese Oxido- verbindung wird mit Fluorwas.serstoff zum entspre chenden 6-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat (6-Methyl-9a- fluor-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacylat) umgesetzt.

Das 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4- pregnen-3,20-dion-16,21-diacylat oder der durch Hydrolyse mit einer Base hergestellte freie Alkohol wird sodann der erfindungsgemässen Fermentein- wirkung durch die d'-Bindung einführende Organis men, z. B. Arten der Gattung Septomyxa, Coryne- bacterium, Fusarium oder dergleichen, unterworfen zur Herstellung des entsprechenden 4'-Analogen.

Die entsprechenden 11-Ketonanalogen dieser Verbindungen können durch Oxydation der 11- Oxy-16,21-diester-Verbindungen mit einem Oxy dationsmittel, wie Chromsäureanhydrid in Essig säure erhalten werden. Als Ausgangsverbindungen werden solche be vorzugt, die die Methylgruppe in 6a-Stellung ent halten.

Die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Ver bindungen 1-Dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortison, 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison und ihre Ester, insbesondere als 6a-Epimere, sind hochaktive Nebennierenrinden-Hormone mit einer grösseren glucocorticoiden Wirksamkeit als Hydro- cortison oder Cortison. Diese Verbindungen haben zusätzlich diuretische Wirksamkeit und Salzverlust hervorrufende Eigenschaften, die sie insbesondere für die Behandlung chronischer,

kongestiver Herz schäden und bei Leberzirrhose, nephrotischen und andrenogenitalen Syndromen und bei der Behand lung von Eklampsie oder Präeklampsie geeignet machen.

Die neuen Verbindungen können in oral, paren- teral oder örtlich anzuwendenden Zusammenset zungen verabreicht werden. Die zur oralen An wendung bestimmten Tabletten können 5-10 mg aktive Verbindung je Tablette und zusätzlich inerte Stoffe, wie Laktose, Sukrose, Calziumstearat oder dergleichen, gewöhnlich etwa 100-200 mg inerte Bindestoffe, enthalten.

Bei Verwendung von 1- Dehydro-6a-methyl-16a-oxyhydrocortison in Tablet tenform werden Mengen zwischen 3-6 mg je Ta blette bevorzugt, bei 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor- 16a-oxyhydrocortison-Tabletten sind 1-5 mg der aktiven Substanz befriedigend. Bei örtlicher Behand lung können die aktiven Steroidbestandteile in Form von Salben, Bougies, Lotionen, Gelees, Lösungen oder Suspensionen oder als Aerosol, z. B. bei Nasen behandlungen, angewandt werden.

In diesen Zusammensetzungen werden die 6a- Epimeren bevorzugt, die 6/3-Methylepimeren kön nen jedoch in pharmazeutisch äquivalenten Men gen auch verwendet werden. Für parenterale Ver wendung eignen sich insbesondere wasserlösliche Ester von mehrbasischen Säuren und deren Salze, wie 21-Hemisuccinatnatriumsalz oder das Hemi- /3,/3-dimethylglutaratnatriumsalz der obigen Produkte.

Die Herstellung der Ausgangsstoffe der vor liegenden Erfindung sowie mögliche Umsetzungen mit den Verfahrensprodukten kann wie in den Präparaten 1-33 gezeigt erfolgen.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das 6-Methyl-16a-oxyhydrocortison oder 6-Methyl- 9cc-fluor-16a-oxyhydrocortison entweder als 21-Ester oder als 16,21-Diester oder als freier Alkohol der Fermenteinwirkung eines eine dl-Bindung erzeu genden Organismus, z.

B. einer Art der Gattung Septomyxa, Cornebacterium, Fusarium, Proamino- bacter, Microbacterium, Streptomyces (z. B. Laven- dulae), Pseudomonas (z.

B. Testosteroni), Ophiobolus, Calonectria, Alternaria, Dydimella, Cylindrocarpon, Listeria, Colletotrichum, Erysipelothrix, Ba:cillus (ins besondere B. sphaericus), Nocardia, Glieder der Familie Tuberculariaceae, Micromonospora und der gleichen, vorzugsweise der Art Septomyxa affinis, unterworfen.

Die Fermentation wird in üblicher Weise durchgeführt; vorzugsweise bei Temperatu ren zwischen 24 und 30, oder, je nach der Art des angewandten Organismus, bei etwas niedrigeren oder höheren Temperaturen, z. B. zwischen 15 und 35 , und das Substrat wird in einem Nährgemisch, das assimilierbaren Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen ent haltende Verbindungen enthält, suspendiert.

Nach dem man das Gemisch filtriert und die Feststoffe mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel gewaschen hat, das Filtrat und die Waschlösungen mit einem organischen Lösungsmit tel extrahiert und das Lösungsmittel verdampft hat, erhält man das 6 -Methyl -11[>,16a,17a,21 -tetra- oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion bzw. dessen 9a-Fluor- analogen, das durch Umkristallisation und;"oder Chromatographie gereinigt werden kann.

Die Behandlung beispielsweise des Monoesters 6-Methyl-11/3,16a,17a,21-tetraoxy- 4- pregnen- 3,20- dion-21-acylat oder des 6-Methyl-11/3,16a,17a,21- tetraoxy-3,20-dions mit einem Acylierungsmittel führt zu dem entsprechenden 16,21-Diester von 6-Methyl- 16a-oxyhydrocortison bzw. 1-Dehydro-6-methyl-16a- oxyhydrocortison.

Präparat 1 Eine 1,65 g Semicarbazidhydrochlorid in 10 cm Wasser enthaltende Lösung wurde zu einer Lösung von 1 g 6a-Methyl-hydrocortisonacetat [Spero et a1., J. Am. Chem. Soc. 78, S.6213 (1956)] in 1,2 cm33 Pyridin und 40 cm3 Methanol gegeben. Dieses Gemisch wurde 18 Stunden am Rückflusskühler erhitzt, darauf auf 20 cm3 eingeengt und in 500 cm3 eiskaltes Wasser gegossen.

Dann wurde das Reak tionsgemisch 6 Stunden bei 0 gehalten und an schliessend filtriert. Der Niederschlag wurde mit Eiswasser gewaschen und getrocknet. Die farb losen Kristalle,1,216 g 3,20-Disemicarbazon von 6a-Methyl-hydrocortison-21-acetat, hatten einen Schmelzpunkt von mehr als 300 ; [a]1,: A-173' (Dioxan).

Präparat 2 1 g des nach Präparat 1 hergestellten 6a-Methyl- hydrocortison-acetat-3,20-bisemicarbazons wurde in 20 cm-- Eisessig und 1 cm33 Essigsäureanhydrid gelöst. Dieses Gemisch wurde eine Stunde in einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluss erhitzt. Darauf wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum auf etwa 12 cm- eingeengt, mit 6 cm-- Brenztraubensäure behandelt und anschliessend 40 Stunden bei Raum temperatur gehalten. Dann wird das Gemisch 2 Stunden auf 60 C erhitzt, abgekühlt und mit 600 cm33 Wasser verdünnt.

Darauf wird das wäss- rige Gemisch dreimal mit je 400 cm33 Chloroform extrahiert, die Chloroformextrakte werden zweimal mit je 100 cm- 5 olodger Natriumkarbonatlösung und dreimal mit je 100 cm33 Wasser gewaschen. Die derart gewaschenen und vereinigten Chloroform- extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockne eingedampft.

Der rohe, 6a-Methyl-llss,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20- dion-21-acetat enthaltende Rückstand wurde an 70 g Aluminiumoxyd unter Verwendung von Benzol, Benzol : Äther, Äther, Äther : Methylenchlorid, Me- thylenchlorid und Methanol chromatographiert, wobei jeweils Fraktionen von 60 cms abgenommen wurden.

Die mit Äther erhaltenen Mittelfraktionen wur den vereinigt, kristallisiert und aus Benzol-Hexan kohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergaben insgesamt 122 mg 6a-Methylllss,21-dioxy-4,16- pregnadien-3,20-dion mit einem Schmelzpunkt von etwa 115 C und einem zweiten Schmelzpunkt von 152-1540 C; [a]D : + 177 C (Chloroform).

Präparat 3 Ein Reaktionsgemisch aus 90 mg 6a-Methyl-11ss, 21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion-21-acetat, 6.5 mg Osmiumtetroxyd in 2,5 cm3 Benzol und 0,12 cm3 Pyridin liess man 95 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Darauf wurde dem Gemisch unter Rühren eine Lösung von 0,7 g wasserfreiem Natrium sulfit und 0,7g Kaliumbikarbonat in 65 etn3 Was ser zugegeben und das Rühren wurde weitere 16 Stunden fortgesetzt. Dann wurde das Gemisch mit 10 cm- Chloroform verdünnt und filtriert.

Der Rückstand auf dem Filter wurde mit insgesamt 100 cm3 heissem Chloroform gewaschen. Die Chloro- formwaschlösungen und das Filtrat wurden verei nigt, mit einer Salzlösung gesättigt und die Chloro- formschicht abgetrennt. Die Chloroformschicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat ge trocknet und zur Trockne eingedampft.

Der etwa 100 mg wiegende Rückstand wurde zweimal aus Aceton-Äther umkristallisiert und ergab 39 mg 6a- Methyl-11 ss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion mit einem Schmelzpunkt von 215-217 ; [a]D : -I-680 (Dioxan).

Präparat 3a Ein Reaktionsgemisch aus 200 mg 6a-Methyl- I lss,21-dioxy-4,16-pregnadien - 3,20-dion-21-acetat, 145 mg Osmiumtetroxyd in 6 cm3 Benzol und 0,30 cm3 Pyridin liess man 76 Stunden bei Raumtemperatur ste hen. Darauf wurde dem Gemisch unter Rühren eine Lösung von 1,5 g wasserfreiem Natriumsulfit und 1,5g Kaliumbikarbonat ün 140 em3 Wasser zugege ben und das Rühren eine weitere Stunde fortgesetzt.

Das Gemisch wurde mit 25 cm3 Chloroform verdünnt und filtriert und der Rückstand auf dem Filter mit insgesamt 200 cm3 heissem Chloroform gewaschen. Die Chloroformwaschlösungen und das Filtratwurden ver einigt, mit Salzlösungen gesättigt und die Chloroform- schichten abgetrennt. Dann wurde die Chloroform schicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand wurde zweimal aus Aceton-Äther umkristallisiert und ergab 6a-Methyl - I1ss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20- dion-21-acetat.

Präparat 4 0,5 g 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4- pregnen-3,20-dion-21-acetat wurden in 20 cm3 einer Lösung von 0,3g Natriumhydroxyd in 18 cm3 Metha nol und 2 cm3 Wasser gelöst und 6 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre stehengelassen.

Darauf wurde die Lösung mit 100 cm3 Wasser verdünnt und auf 0-50 gekühlt. -Das wässrige Gemisch wurde dann fil triert und der Niederschlag zweimal aus Aceton- Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Es wurde reines 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen- 3,20-dion erhalten.

Präparat 5 Ein Gemisch aus 0,2 g 6a-Methyl-llss,16a,17a, 21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,1 cm?, Essigsäure anhydrid und 1 cm3 Pyridin liess man vier Stunden stehen. Darauf wurde das Gemisch in 15 cm3 Wasser gegossen, das wässrige Gemisch wurde auf 0-50 ab gekühlt und filtriert. Der so gesammelte Niederschlag wunde wiederholt mit Wasser gewaschen und schliess lich aus Methanol umkristallisiert. Man erhielt 6a Methyll 1 0-16a,17a,21 -itetraoxy-4-Apregnen-3,20-dion- 16,21-diacetat.

Präparat 6 Ein Gemisch aus 0,2 g6a-Methyl-11ss,16a,1-7a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, 1 cm3 Ben- zoylchlorid und 2 cm3 Pyridin wurde über Nacht (18 Stunden) bei Raumtemperatur stehengelassen.

Das Gemisch wurde in 30 em3 Wasser gegossen und die wässrige Lösung zweimal mit je 20 cm3 Methylen- chlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wur den vereinigt, wiederholt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der so erhaltene Rückstand dreimal aus.

Äthanol um- kristallisiert. Er ergab ba-Methyl-llss,16a,17a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion16-benzoat,-21- acetat. Beispiel 1 6a- Methyl-11 ss,16a,17a,21 - tetraoxy -1,4 - preg- nadien-3,20-dion.

Je 100 cm?, eines Mediums aus 11/o, Glukose, 21/o Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungs- wasser in sechs je 250 cm3 fassenden Erlenmeyer- kolben wurden auf .einen pH-Wert von 5,9 einge stellt.

Dieses Medium wurde 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein- bis zweitägigen Wachstum von Septomyxa affi- nis ATCC 6737 geimpft. Die Erlenmeyer-Kolben wurden drei Tage lang bei Raumtemperatur (etwa 240) geschüttelt.

Nach Ablauf dieser Zeit wurden die ganzen 600 cm3 als Impfstoff für 10 Liter des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 10: cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und 1% Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 280 gestellt, der Inhalt gerührt (300 U. p. M.) und belüftet (0,5 1 Luft/10 1 Gärmedium).

Nach 17 stündiger Inkubation, als sich ein gutes Wachs tum entwickelt hatte und der Säuregrad auf einen pH-Wert von 6,7 angestiegen war, fügte man 2 g 6a-Methyl-,1 1ss,16a,17a,21-tetraoxy-4,pregnen - 3,20 - dion-21-acetat und 1 g 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, in115 cm3 Dimethylformamid gelöst, zu. Die Inku- batnon wurde bei gleicher Temperatur und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt.

Das Mycel wurde abfiltriert, das Steroidmaterial mit Methylenchlorid extrahiert, die Methylenchlorid-Extrakte zur Trockne einge dampft und der erhaltene Rückstand über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat ( Florisil ) chro- matographiert. Die Säule enthielt 200 g synthetisches Magnesiumsilikat und wurde fünfmal mit je 400-cm3- Fraktionen, die jeweils aus Methylenchlorid,

Hexan- kohlenwasserstoff-Aceton-Gemischen im Verhältnis 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3, 1 : 1 und Methanol bestanden, ent wickelt. Die mit Hexankohlenwasserstoff-Aceton (7: 3) eluierte Fraktion wurde zweimal aus Aceton umkristallisiert und ergab 1-Dehydro-6a-methyl-16a- oxyhydrocortison (6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetra- oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion).

In der im Beispiel 1 gezeigten Weise werden durch Fermentation mit Mikroorganismen der Gat tungen Corynebacterium, Didymella, Calonectria@, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Pro- aminobacter, Ophiobolus, Septomyxa, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium, Streptomy- ces (z.

B. Lavendulae), Pseudermonas (z. B. Testo- steroni), Bacillus (insbesondere B. sphaericus), No- cardia, Micromonospora und Gliedern der Familie Tuberculariaceae 6-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 4-pregnen-3,20-dion und alle davon abgeleiteten Mono- oder Diester zum 6a-Methyl-llss,l6a,17a,21- tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion umgewandelt.

Das Produkt von Beispiel 1 kann wie folgt in das 1-Dehydro-6-methyl-16a-oxyhydrocortison-16, 21-diacetat umgewandelt und zur 11-Ketoverbindung oxydiert werden: Eine Mischung aus 200 mg 6a-Methyl-llss,16a, 17a,21-tetra;oxy-1,4-pregnadien-3,20-dion, 1 em3 Es sigsäureanhydrid und 2 cm3 Pyridin liess man fünf Stunden bei Raumtemperatur stehen und goss sie dann in 25 cm-' Wasser.

Die wässrige Lösung wurde auf etwa 5 C abgekühlt und abfiltriert und der Nieder schlag, der zweimal aus Methanol umkristallisiert wurde, ergab 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dUon-16,21-diacetat (1-Dehydro- 6a-methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat).

Ein Gemisch aus. 0,5 g 6a-Methyl-llss,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat, 0,20 g Natriumbichromat, 10 em3 Eisessig und 1 cm3 Wasser wurde gerührt und darauf acht Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.

Anschliessend wurde das Gemisch in 50 ein- Eiswasser gegossen, durch Zu gabe von verdünntem Natriumhydroxyd neutralisiert, der so erhaltene Niederschlag auf einem Filter ge sammelt und dreimal aus Äthylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert. Es ergab 6a- Methyl -16u,17a,21 - trioxy-1,4-pregnadien-3,11,20- trion-16,21-diacetat.

Analog lässt sich 6a-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4@pregnadien-3,20-dion-16,21- diacetat zum 6a-Methyl-9a-fluor-16a,17a,21-trioxy-1,4-preg- nadien-3.11.20-trion-16,21-diacetat oxydieren.

Nach dem obigen Veresterungsverfahren erhält man unter Verwendung anderer Säureanhydride oder Säurehalogenide in Pyridinlösung die entsprechenden Ester des 6a - Me.thyl - 1 lss,16a,17a,21- tetraoxy-1,4- pregnadien-3,20-dions, z.

B. das Dipropionat, Dibu- tyrat, Divalerat, Dihexanoat, Dilaurat, Bis-tert.- butylacetat, Di-(ss-cyclopentylproprionat), Dibenzoat, Bis-phenylacetat, Bis-phenylproprionat, Bis-(hemisuc- cinat), Diacrylat, Bis-crotonat, Dipropiolat,

Di-(2- butinoat), Bis-cinnamat und dergleichen.

Die 6/3-Epimeren werden unter Anwendung von 6ss-Methyl 1 lss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 - pregnadien - 3,20-dion als Ausgangsmaterial in der gleichen Weise wie die 6a-Epimeren hergestellt.

Präparat 7 Ein Gemisch aus 1 g 6a-Methyl-11/)',16a,21- tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat, 650 mg N-Bromacetamid und 6 cm3 Pyridin wurde im Dun keln 30 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, und ein Schwefeldioxyd- Strom wurde so lange auf die Oberfläche des gerühr ten Gemisches geleitet, bis man einen negativen Kaliumjodid-Stärke-Test erhielt. Das. Gemisch wurde dann mit 50 cm3 Wasser versetzt und 30 Minuten auf einer Temperatur von etwa 5 gehalten.

Der ausgefällte weisse Feststoff wurde filtriert, mit Was ser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Nach der Umkristallisation aus Aceton erhielt man 6(.z- Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9 (11) -pregnadien - 3,20- dion-16,21-diacetat.

Präparat 8 Eine Lösung von 0,5 g 6(i-Methyl-16a,17a,21- trioxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat in 20 cm3 Methylenchlorid wurde mit einer Lösung von 1 cm-' 71 0/aiger Perchlorsäure in 10 ein- Wasser und 200 mg N-Bromacetamid in 50 cm3 tert. Butyl- alkohol versetzt. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann mit einer Lö sung von 0,3g Natriumsulfit in 12 cm?, Wasser ver mischt.

Das Gemisch wurde so lange bei vermin dertem Druck destilliert, bis die restliche Lösung wolkig wurde. Dann fällte man das Produkt durch Zugabe von 100 ein- eines Eis-Wasser-Gemisches aus. Der weisse kristalline Niederschlag wurde fil triert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus einem Gemisch von Aceton und Hexankohlenwas- serstoffen umkristallisiert. Es ergab 6a-Methyl-9a- brom-1 li)',16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion- 16,21-diacetat.

Präparat 9 Ein Gemisch aus 0,45 g 6a-Methyl-9a-brom- l lss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21- diacetat, 0,45 g wasserfreiem Kaliumacetat und 20 cm3 Aceton wurde bei Rückflusstemperatur fünf Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde darauf abge kühlt, in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde ge trocknet und über eine Säule von 25 g synthetischem Magnesiumsilikat gegossen.

Die Säule wurde mit Hexankohlenwasserstoffen enwickelt, die zunehmende Anteile Aceton enthielten. Das Eluat aus Hexan- kohlenwasserstoff + 10-0/ü Aceton enthielt das 6a- Methyl - 9ss,11(3-oxido - 16a,17a,21-trioxy-4-pregnen 3,20-dion-16,21-d'iacetat.

Präparat 10 Eine Lösung von 1 g 6a-Methyl-9ss,11/3-oxido- 16r-i,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-dti.acetat wurde in 50 cm3 Methylenchlorid gelöst und mit 5 cm- 48ühiger Fluorwasserstoffsäure und 0,5 cm3 71 ü/aiger Perchlorsäure versetzt. Das Gemisch wurde sechs Stunden kräftig gerührt und darauf in einen Überschuss kalter, wässriger, 5ü/oiger Natriumbikar- bonatlösung gegossen.

Die Methylenchlorid'schicht wurde abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, zur Trockne eingedampft und der so erhaltene Rückstand aus Aceton und Hexankohlen- wasserstoffen umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl- 9a-fluor - 11ss,16a,17a-21-tetra.oxy-4-pregnen - 3,20- dion-16,21-diacetat.

Präparat 11 Aus 0,5g 6 a-Methyl-9a-fluor-11/3,16a,17a,21-tetra oxy-4-pregnen-3,20-dion-16,2i-diacetat, 100 mg Ka- liumhydroxyd in 10 em3 1 cm?, Wasser enthaltendem Methanol wurde eine Lösung hergestellt. Dieses Ge misch wurde sechs Stunden in einer Stickstoffatmo sphäre stehengelassen, in 50 CM3 Eiswasser gegos sen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neu tralisiert. Anschliessend wurde das wässrige Gemisch auf etwa 5 abgekühlt, zwei Stunden bei dieser Tem peratur stehengelassen und filtriert.

Der so erhal tene Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und zweimal aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen um kristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a, 17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-ddon.

Präparat 12 0,2 g 6a-Methyl-9a-fluor-11/3,16a,17a,21-tetra- oxy-4-pregnen-3,20-dion werden mit 1 cm3 Propion- säureanhydrid in 2 CM3 Pyridin vermischt. Man liess das Gemisch etwa 18 Stunden stehen und goss es dann in 50 cm3 Wasser. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und nach dreimali gem Waschen aus Aceton-HexankohlenwasSerStoffen umkristallisiert.

Es ergab 6a-Methyl-9a-fluor-11ss, 16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen -3,20- dion-16,21- dipropionat.

Beispiel 2 6a-Methyl-9a fluor-11,ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4- pregnadien-3,20-dion (1-Dehydro-6a-methyl-9a-fluor- 16a-oxyhydrocortison).

Je 100 CM3 eines Mediums aus10/9 Glukose, 20/6 Maisquellwasser (60 0/ü Feststoffe) und Leitungs wasser in drei je 250 cms fassenden Erlenmeyer-Kol- ben wurden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein bis zwei Tage alten Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyer-Kolben wurden drei Tage lang bei Raumtemperatur (etwa 26 bis 28 Grad) geschüttelt.

Nach Ablauf dieser Zeit wurden die 300 cm3 als Impfstoff für 5 1 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischäumers. (Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthielt, verwendet. Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 28 Grad gestellt, der Inhalt wurde gerührt (300 U. p. M.) und belüftet (0,3 1 Luft/51 Gärmedium). Nach 20 stündiger Inkubationszeit, als sich ein gutes.

Wachs tum entwickelt hatte, wurden 1 g 6a-Methyl-9a-fluor- llss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dilon und r/2 g 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Di- methylformamid gelöst, zugegeben und die Inku bation bei gleicher Temperatur (28 Grad) und Be lüftung 72 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wurde abfiltriert und dreimal mit je 200 CM3 Methylenehlorid extrahiert.

Darauf wur den die Extrakte vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet, eingeengt und der erhaltene Rückstand dreimal aus, Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umknistallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor- 11ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 -pregnadien-3,20 - dion (1-Dehydro-6a-methyl-9 a-fluor-16 a-oxyhydrocortisan).

In analoger Weise, unter Verwendung anderer Arten der Gattung Septomyxa bei bekannten Gä- rungsbedingungen, vorzugsweise in Gegenwart eines Promotors, wie 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, Proge steron, llss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on, 3- Ketobisnor-4-cholensäure oder dergleichen, erhält man aus 6-Methyl-9a-fluor-l 1ss, 16a,17a,21-tetraoxy- 4-pTegnen-3,20-dion das 6-Methyl-9a-fluor-11ss,

16a, 17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion. Anstelle von Septomyxa können andere Mikroorganismen wie Corynebacterium, Didymella, Bacillus, Calonectria" Alternaria, Col'letotrichum, Cylindrocarpon, Pro- aminobacter, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysü- pelothrix, Mycobacterium,

Leptosphaeria, Cucurbi- taria, Streptomyces, Nocardia, Pseudomonas, Micro- monospora und Pilze der Familie Tuberculariaceae verwendet werden, um eine dl-Bindung in das 6- Methyl-9a-fluor-1 lss,16a,17a,21-tetraioxy-4- pregnen- 3,20-dion einzuführen.

Wird bei der obigen Fermentation 6ss-Methyl-9a- fluor-1 lss,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen- 3,20 - dion als Ausgangssteroid verwendet, so führt dies zu der Herstellung von 6ss-Methyl-9a-fluor-11ss,16a,17a,21- tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion.

Das Produkt von Beispiel 2 lässt sich wie folgt verestern:. a) Ein Gemisch aus 0,2 g 6a Methyl-9a-fluor- 11ss,16a,17a,21-tetraoxy-1,4 -pxegnadieri#-3,20-dion, 1 em3 Essigsäureanhydrid und 1 CM3 Pyridin wurde sechs Stunden stehengelassen, dann in 20 cm3 Was ser geschüttet;

das wässrige Gemisch wurde auf etwa 5 gekühlt und filtriert. Der gesammelte Niederschlag wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und schliess lich aus Methanol umkristallisiert. Er ergab 6a- Methyl-9a-fluor- l lss,16a,17a,21, ,-;tetraoxy-n1,4-;preg- nadien - 3,20 - dion - 16,21- diacetat- (1-Dehydro-6a- methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat).

b) Ein Gemisch aus 0,2 g 6a-Methyl-9-fluor- llss,16a,17a,21 tetraoxy-1,4 -pregnadien-3,204dion, 1 cms Benzoylchlorid und 2 cmj Pyridin liess man bei Raumtemperatur (etwa 25 Grad) über Nacht stehen. Es wurde dann in 20 cm- Wasser gegossen und die wässrige Lösung wurde zweimal mit 10 cm3 Methylenchlorid extrahiert.

Die Methylenchloridan- teile wurden vereinigt, wiederholt mit Wasser gewa schen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingedampft und der so erhaltene Rückstand wurde dreimal aus Athanol umkristallisiert. Er ergab 6a- Methyl-9a-fluori-1 lss,16a,17a,21@-'tetraoxy-@ 1,4-preg- nadien-3,20-dion-16,21-dibenzoat.

Aus obigem 6a-Methyl-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat (siehe Bei spiel 1) kann z. B. mit N-Bromacetamid 6a-Methyl- 16a,17a,21-trioxy-1,4,9(11) -pregnatrien-3,20-dion- 16,21-diacetat erhalten werden, das unter Einwir kung von Perchlorsäure und N-Bromacetamid 6a Methyl-9a-brom-11ss,16a,17a,21-tetraoxy.-1,4-preg- nadien-3,20-don-16,21-diacetat ergibt.

Letzteres lie fert beim Kochen mit wasserfreiem Kadiumacetat und Aceton 6a-Methyl-9ss,llss-oxido-16a,17a,21- trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat, das mit 480/aiger Fluorwasserstoffsäure und Perchlor- säure 6a-Methyl-9a-fluor-llss,16a,17a,21-tetraoxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat ergibt.

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindun- gen der Formel 1
EMI0006.0055
und deren 9a-Fluoranalogen, dadurch gekennzeich net, dass man ein 6-Methyl-1 da-oxy-hydrocortison, dessen 21-Acylat oder 16,21-Diacylat bzw.

ein 6- Methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortison, dessen 21- Acylat oder 16,21-Diacylat mittels eines eine Dop pelbindung in 1,2-Stellung einführenden Organismus vergärt.

Claims

UNTERANSPRCCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass der die Doppelbindung einführende Organismus der Gattung Septomyxa entstammt. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man die so erhaltenen Verbindun gen anschliessend in 16- und 21-Stellung acyliert.