CH383975A

CH383975A - Procédé de préparation de nouvelles céphalosphorines C

Info

Publication number: CH383975A
Application number: CH7089159A
Authority: CH
Inventors: Penley Abraham Edward; Frederick Newton Guy Geoffrey; William Hale Clifford
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1958-03-17
Filing date: 1959-03-17
Publication date: 1964-11-15
Also published as: NL110469C; SE307789B; OA02620A

Description


  Procédé de préparation de nouvelles     céphalosphorines    C    La présente invention se rapporte à un procédé  de préparation de nouvelles céphalosporines C.  



  Ce procédé consiste en une     modification    de la       céphalosporine    C et conduit à un groupe de substan  ces antibiotiques dont l'activité est différente de celle  de la     céphalosporine    C.  



       L'invention    est basée sur la découverte qu'une  substance active est apparue dans une solution obte  nue par lavage d'une résine     échangeuse    d'ions avec  de l'acétate de     pyridine,    durant la purification de la  céphalosporine C. On a trouvé que les fractions ini  tiales retirées de la     colonne    présentaient une activité  plus forte     contre        Staphylococcus        aureus    que contre  <I>Salmonella typbi.</I>  



  A la suite de recherches ultérieures, on a trouvé  que par traitement de la céphalosporine C avec une  base tertiaire     hétérocyclique    faible, on peut obtenir  des composés neutres présentant une activité anti  bactérienne     différente    de celle de la céphalosporine C  initiale, et qui peuvent servir à préparer d'autres     d6ri-          vés    de la céphalosporine C. On peut obtenir des       composés    semblables, mais acides, en utilisant des  bases tertiaires faibles contenant un     substituant    acide.

    D'autre     part,    on peut obtenir des composés sembla  bles, mais basiques, en     utilisant    des bases     tertiaires     faibles     contenant    un substituant basique en plus de  l'atome d'azote     tertiaire.    Les diverses     substances    anti  biotiques     diffèrent    l'une de l'autre et de la céphalo  sporine C par l'introduction dans la molécule des         différentes    bases ou de leurs dérivés de substitution  acides ou basiques.  



  Les substances résultant du procédé selon l'inven  tion (désignées ci-après   composés     céphalosporine          C4     ) sont sensiblement stables envers la     pénicilli-          nase,    relativement stables à l'égard de l'acide chlor  hydrique dilué froid et qui possèdent dans le cas du  composé neutre, une activité accrue tant envers     Staph.          aureus    qu'envers     Salm.   <I>typbi,</I> et une activité envers       Staph.        aureus    qui est plusieurs fois égale à l'activité  de la céphalosporine C.

   Ces substances présentent  une bande d'absorption dans le spectre d'absorption       ultraviolet    semblable à celle de la     céphalosporine    C,  mais présentant un     maximum,    dans le cas du dérivé       pyridinique,    voisin de 257     m#t,    et une extinction     Eioehm     à 257     ml,    de 220.  



  Le procédé permet aussi de préparer des compo  sés de la     céphalosporine    C avec des composés     hété-          rocycliques        sulfonamidosubstitués,    contenant un  atome d'azote tertiaire.  



  Le procédé selon l'invention est donc caractérisé  en ce que l'on traite de la     céphalosporine    C en solu  tion aqueuse avec une base tertiaire     faible    consistant  en un composé hétérocyclique contenant dans un  cycle un atome d'azote     tertiaire    faiblement basique.  



  La réaction qui se produit a pour effet de rempla  cer le groupe     acétoxy    de la     céphalosporine    C par la  base hétérocyclique, comme représenté par les formu  les     suivantes     
EMI0001.0052     
    
EMI0002.0001     
    La base tertiaire peut contenir un substituant  acide ou basique. Le traitement est effectué pendant  une durée prolongée, par exemple par incubation à  370 C pendant plusieurs heures, par exemple 48 heu  res, ou par chauffage à 500 C pendant 18 heures, la  solution étant tamponnée généralement à un pH ne  dépassant pas 7.  



  Parmi les bases tertiaires faibles et leurs dérivés  de substitution qui se sont montrés particulièrement  utiles pour la préparation des composés céphalospo  rine C on peut mentionner la     pyridine,    la     nicotina-          mide,    l'acide     nicotique,    la     collidine,    la quinoléine, les       pyrimidines,    les     thiazoles    et leurs dérivés     sulfonami-          dés    tels que la     sulfadiazine        (2-sulfanilamidopyrimi-          dine),

      le     sulfathiazole        .(2-sulfanilarnidothiazole)    et la       sulfapyridine        (2-sulfanilamidopyridine).       Les     sulfonamides    mentionnées donnent naissance  à des composés céphalosporine     C_@    qui, contrairement  à la céphalosporine C, se montrent beaucoup plus  actifs contre le     Staphylococcus        aureus    que contre le  <I>Salmonella typbi.</I>  



  Le tableau ci-dessous illustre la préparation de  composés     céphalosporine        C_@    à partir de céphalospo  rine C, par incubation de 48 h à 370 C dans la solu  tion spécifiée. Les croix indiquent les dimensions  relatives des zones d'inhibition lorsque la solution  incubée a été soumise à l'électrophorèse sur papier,  suivie de séchage du papier, qui a été ensuite placé  sur la surface d'une plaque     d'agar    nutritif ensemencé  par du     Staph.        aureus.    Deux zones séparées d'inhibi  tion ont été notées, en raison de la séparation     électro-          phorétique    des deux antibiotiques.

    
EMI0002.0029     
  
    <I>Solution <SEP> dans <SEP> :</I> <SEP> Céphalosporine <SEP> C, <SEP> Céphalosporine <SEP> C
<tb>  formée <SEP> résiduelle
<tb>  Eau <SEP> 0 <SEP> X
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> XXXXX <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> 0,3 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> XXXX <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> 0,1 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> XX <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> 0,01 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> X <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> XXXXXX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> 0,25 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> XXXX <SEP> XX
<tb>  Sulfate <SEP> de <SEP> pyridine <SEP> 0,3 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> XXX <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> collidine <SEP> 0,

  3 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> X <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> collidine <SEP> 0,3 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 7 <SEP> XX <SEP> XX
<tb>  Acétate <SEP> de <SEP> quinoléine <SEP> 0,3 <SEP> M <SEP> pH <SEP> 4,5 <SEP> XX <SEP> XX       Lorsque     l'électrophorèse    a été suivie de chroma  tographie sur papier dans du     butanol-acide        acétique-          eau,    le dérivé     pyridinique    a pu être distingué des déri  vés de la     collidine    et de la quinoléine grâce au fait  que ces trois composés ont des valeurs     Rf    qui     diffè-          rent    légèrement.

   Le dérivé d'acide nicotinique est éga  lement séparable de la céphalosporine C par électro  phorèse sur papier suivie de     chromatographie    sur  papier.  



  Des expériences comparatives avec d'autres bases,  telles que l'acétate de sodium et d'ammonium ou le       méthylbromure    de     pyridinium    n'ont pas permis d'ob  tenir de composé céphalosporine     C-,.     



  Les composés céphalosporine     C_L    sont sensibles  aux     alcalis    et leur     activité        antibactérienne    est détruite  lorsqu'ils sont maintenus en milieu alcalin.    Les exemples ci-après illustrent l'invention    Exemple 1    On a dissous 100 mg du sel de sodium     cristallin     de céphalosporine C dans 5 ml d'eau. On a ajouté  une résine     échangeuse    de cations, connue sous la  marque de fabrique       Dowex      50 X 8 (forme hydro  gène, 200-400 mailles) jusqu'à ce que le pH de la  solution soit tombé à 2,6. (La quantité nécessaire de  résine humide a été d'environ 28 mg.) En procédant  ainsi, l'ion sodium a été adsorbé sur la résine.

   La  solution surnageante contenait la céphalosporine C  sous forme d'acide libre. Après avoir éliminé la résine,  on a ajouté 0,38 ml de     pyridine    à la solution, de sorte  que cette     dernière    était approximativement molaire  par rapport à la     pyridine    et son pH est monté à envi-           ron    6,5. On a alors maintenu la solution à     37,1    C     dans     un tube à     bouchon    rodé pendant 48 h. On a soutiré  des échantillons de     100        ug    de temps à autre et on les  a soumis à une électrophorèse sur papier au pH 7.

    On a placé le papier sur des plaques ensemencées  avec du     Staph.        aureus    pour déterminer les propor  tions de composé céphalosporine     C,'    neutre formé et  de céphalosporine C acide résiduelle. Les diamètres  des zones d'inhibition ont été les suivants  
EMI0003.0010     
  
    Durée <SEP> (heures) <SEP> Céphalosporine <SEP> C., <SEP> Céphalosporine <SEP> C
<tb>  0 <SEP> 0 <SEP> 29
<tb>  3 <SEP> 24 <SEP> 28
<tb>  24 <SEP> 35 <SEP> 28
<tb>  48 <SEP> 36 <SEP> 18       Après 48 heures, la solution a été séchée à l'état  congelé, on a agité le résidu deux fois avec 5 ml  d'acétone et on a séché à nouveau.

   On a ensuite dis  sous le produit     solide    (78 mg) dans 1 ml d'eau et on  l'a déposé au sommet d'une colonne de résine     échan-          geuse    d'anions     Dow-1    X 10 acétate (10 cm X 1 cm de       diam).    On a     élué    la colonne avec de l'eau et on a  recueilli des fractions de 1 ml. La     céphalosporine          C.@-pyridine    a été     éluée    dans les fractions 2, 3 et 4,  laissant la céphalosporine C résiduelle et les autres  substances acides adsorbées sur la colonne.

   On a  séché sous congélation la solution de composé cépha  losporine     CA-pyridine,    on a remué le résidu avec de  l'acétone et on a séché. Le produit (24 mg) a montré  une activité de 90 unités/mg contre     Staph.        aureus.     Il s'est comporté comme une substance neutre lors  qu'on l'a soumis à une électrophorèse sur papier au  pH 7 et a donné une valeur     Rf    de 0,06 par chroma  tographie sur papier dans du     butanol-acide        acétique-          eau.     



  Exemple 2  On a     chauffé    de la céphalosporine C sous forme  d'acide     libre    avec une solution deux fois moléculaire  de     pyridine    pendant 18 heures. La céphalosporine       C.1-pyridine    obtenue a été isolée de la manière décrite  à l'exemple 1.  



  Les exemples ci-après illustrent la purification de  la céphalosporine<B>CA</B> (dérivé     pyridinique)       <I>Par chromatographie sur échangeur d'ions</I>  La     céphalosporine    CA (dérivé     pyridinique)    peut  être séparée de la céphalosporine C en faisant des  cendre un mélange des deux     substances    dans une  résine     échangeuse        d'anions    (telle que la résine     Amber-          lite        IR4B)

      sous forme     d'acétate.    Le composé céphalo  sporine C A sort rapidement de la colonne alors que  la     céphalosporine    C est adsorbée.  



  On peut compléter la purification du composé  céphalosporine CA par chromatographie sur une  résine     échangeuse    de cations telle que     Dowex    50.  Par exemple on a     chromatographié    48 mg de com  posé céphalosporine CA brut (4,8     untiés/mg    contre       Staph.        aureus)        dans    un tampon d'acétate d'ammonium  0,2 M, pH 4,5, sur une colonne de     Dowex    50 X 4    (45 cm X 0,9 cm de     diam)    en équilibre avec le tam  pon. On a     élué    la colonne avec de l'acétate d'ammo  nium 0,2 M et on a recueilli des fractions de 2 ml  toutes les 20 minutes.

   Le     composé        céphalosporine    CA  a été trouvé dans les fractions 46-54, qui ont été  réunies et séchées sous congélation. Le produit a  montré une activité d'un peu plus de 30 unités/mg  contre     Staph.        aureus    et de 3 unités/mg     contre        Salm.     <I>typbi.</I>    <I>Par répartition à contre-courant</I>    La céphalosporine CA (dérivé     pyridinique)    peut  être purifiée     par    répartition à     contre-courant    dans le  système solvant     phénol-tétrachlorure    de carbone-acide  acétique aqueux,

   décrit par Newton et Abraham     (Bio-          chem.    J., 1956, 62, 651) pour la     purification    de la  céphalosporine C. Par exemple, on a tout d'abord  soumis un mélange brut de     céphalosporine    C et de  composé céphalosporine     CA        pyridine    à 100 transferts  dans ce système, en     utilisant    le   procédé fondamen  tal   et avec une phase supérieure égale à 1,5 fois le  volume de la phase inférieure.

   Ceci a été suivi d'en  core 150     transferts    avec un seul retrait de la couche  supérieure, et finalement de 100     transferts    avec un  seul retrait par les deux extrémités de la machine.  (Pour les détails de cette méthode, voir     Craig     &   Post, (Anal.     Chem.    1949, 21, 500.) Les couches  supérieures résultantes (série retirée en premier lieu)  ont contenu la céphalosporine C et les couches infé  rieures (série retirée en second lieu) ont contenu le  composé céphalosporine CA dans les fractions 33-81.  Le     maximum    est apparu au tube 48.

   Les fractions  40-72 ont été réunies, on a ajouté un volume d'eau  et on a     secoué    le mélange une fois avec 4 volumes  de tétrachlorure de carbone et 3 fois avec 3 volumes  de benzène. On a amené la phase aqueuse au pH 3,1       par    addition de 0,1 ml de     pyridine,    on a concentré à  un faible volume par séchage sous congélation et on  a précipité le composé     céphalosporine    CA par addi  tion d'un grand volume d'acétone.

   Le produit a mon  tré une activité de 50     unités/mg    contre     Staph.        aureus     et de 4,6     unités/mg        contre        Salm.   <I>typbi.</I>     (La    céphalo  sporine C montre une activité de     8-10unités/mg    con  tre ces deux organismes.)  Les propriétés de la     céphalosporine    CA (dérivé       pyridinique)    peuvent être résumées     comme    suit  L'activité de la céphalosporine CA (dérivé     pyridi-          nique)

      contre     Staph.        aureus    est égale à 8-10 fois son  activité contre     Salm.   <I>typbi.</I> Son activité contre     Staph.          aureus    est égale à au     moins    dix fois celle de la cépha  losporine C.  



  La céphalosporine CA (dérivé     pyridinique)    se  comporte     comme    une substance neutre lorsqu'elle est  soumise à une électrophorèse sur papier au pH 7.  Sur des chromatogrammes sur papier     dans    du buta  nol-acide     acétique-eau    (4:1:4 en volume) elle  donne une valeur     Rf    d'environ 0,06.  



  Les     préparations    de ce composé céphalosporine  C     j    les plus pures obtenues jusqu'ici contiennent C,  H, O, N et S et le rapport de N à S     est    de 4 : 1.      Elles présentent une bande d'absorption semblable à  celle de la céphalosporine C mais avec un maximum  voisin de 257 mu. L'absorption disparaît rapidement  lorsque le composé céphalosporine C A est maintenu  dans un     alcali    dilué et l'activité antibactérienne dis  paraît en même temps.

      Exemple 3  <I>Céphalosporine</I>     CA-sulfapyridine     <B>a</B>  On a dissous de la     sulfapyridine    dans de la     N,N'-          diméthylformamide    (60 mg/ml) et on a ajouté un  volume égal d'une solution de sel de sodium de cé  phalosporine C dans l'eau (40 mg/ml). On a chauffé  le mélange (pH 6,2 avec une     électrode    de verre) à  370 C pendant 4 jours. On a prélevé des échantillons  de 10     R.1)    à     intervalles    de 24 h et on les a soumis à       l'ionophorèse    dans un tampon d'acétate de     collodine.     (pH 7,0) sur papier pendant 3-4 h à 17 volts/cm.

   La  présence de la céphalosporine     CA-sulfapyridine    a été  décelée en     faisant    un     bioautographe    (comme décrit       ci-après)    de     l'ionogramme.    La céphalosporine     CA-          sulfapyridine,    portant une charge négative au pH 7,  a pu être aisément distinguée des deux réactifs du fait  que la     sulfonamide    non transformée était neutre au  pH 7 et que la céphalosporine C a     migré    vers l'anode       approximativement    21/2 fois plus     vite    que le produit  modifié.  



  Les     bioautographes    sont obtenus en plaçant la       feuille    de papier, après chromatographie ou     ionopho-          rèse,    sur de la gelée     d'agar    ensemencée avec un orga  nisme d'épreuve     approprié.    Après que le papier a  été en     contact    avec la gelée pendant environ une  demi-heure, on l'enlève et on fait incuber la gelée       ensemencée    à     37()    pendant la nuit.

   Le matin suivant  les zones de la gelée dans lesquelles de l'antibiotique  a     diffusé    à partir du papier apparaissent comme des  zones     claires        d'inhibition    de la     croissance    de l'orga  nisme d'épreuve, contrastant avec le fond opaque où  l'organisme s'est développé.

      Exemple 4  <I>Céphalosporine</I>     C,4-sulfadiazine       On a produit une céphalosporine C     modifiée    par  la     sulfadiazine    en procédant comme     décrit    à l'exem  ple 3, sauf que la     sulfapyridine    a été remplacée par  de la     sulfadiazine    et que le mélange a été chauffé à       37o    C pendant 48 h.

      Exemple 5  <I>Céphalosporine</I>     CI-sulfathiazole       On a produit une céphalosporine C modifiée par  le     sulfathiazole    en procédant comme     décrit    à l'exem  ple 3, sauf que la     sulfapyridine    a été remplacée par  du     sulfathiazole.     



  On a séparé les     composés    céphalosporine     Ca-sul-          fapyridine    et     -sulfadiazine    des deux réactifs par     chro-          mathographie    sur papier en employant un solvant     u-          butanol-acide    acétique-eau (4:1:4). On a obtenu avec  ce solvant les valeurs     Rf    suivantes :     céphalosporine    C,       Rf    0,2 et     sulfapyridine,        Rf    0,8.

   La     céphalosporine            CA-sulfapyridine    et la céphalosporine     CA-sulfadiazine     avaient chacune un     Rf    de 0,24. Les composés modi  fiés à la     sulfonamide    sont séparables de la céphalo  sporine C et de la     sulfonamide    non     transformée    par       ionophorèse    suivie de chromatographie sur papier.  



  En utilisant les méthodes décrites dans les exem  ples 2, 3 et 4, on a constaté que la quantité de cépha  losporine     CA-sulfonamide    est montée constamment  durant les premières 48 h, de nouvelles augmenta  tions ont été observées jusqu'à 96 h, après quoi on  n'a relevé que de faibles changements. On peut mon  trer que les céphalosporines C A contiennent le groupe  aniline substituée, qui est une partie essentielle de  toutes les     sulfonamides,    en arrosant les ionogrammes  ou chromatogrammes sur papier tout d'abord avec  une solution diluée d'acide nitrique puis avec une  solution à 1 %     d'a-naphtylamine    dans de l'acide acé  tique à 75 %.

   Lorsqu'on les traite ainsi, les dérivés  de     l'aniline    donnent des colorants azoïques rouge  brillant. Les composés céphalosporine     CA-sulfonami-          des    et les     sulfonamides    non transformées ont donné  des réactions     diazo    fortement positives après traite  ment avec de l'acide     nitreux,    alors que la céphalo  sporine C a donné un résultat négatif.

   Dans le cas  des céphalosporines     C_,,-sulfonamides,    une des taches  rouges sur les chromatogrammes, due au colorant  azoïque, a coïncidé exactement avec une des zones  du papier qui a donné une zone antibactérienne     bio-          autogramme.     



  Lorsqu'on a fait des     bioautographies        d'ionogram-          mes    ou de chromatogrammes sur papier en utilisant  plus d'un organisme d'épreuve, on a constaté que les  nouveaux composés céphalosporine     C,@-sulfonamide     étaient beaucoup plus actifs contre     Staph.        aureus    que  contre     Staph.        typhi.,    cependant, contrairement aux       sulfonamides    elles-mêmes, les nouveaux composés ont  montré une nette activité contre<I>Salin.</I>     typhi.     



  Les composés céphalosporine     C,,    , de même que  la céphalosporine C, sont beaucoup plus stables que  la pénicilline vis-à-vis d'une préparation fortement pu  rifiée de     pénicillinase    provenant de     Bacillus        cereus.     Ainsi, une préparation purifiée de céphalosporine CA  (dérivé     pyridinique)    n'a pas perdu d'activité dans une  mesure appréciable (essai après 2 h à 370 C)

   en pré  sence d'une concentration de l'enzyme provoquant  une inactivation sensiblement complète d'un poids  semblable de     benzylpénicilline.    La     benzylpénicilline    a  été aussi complètement inactivée dans ces conditions  lorsque la concentration de l'enzyme a été réduite  dix fois.  



  Le composé céphalosporine CA préparé à partir  d'acide     nicotique    présente une activité antibiotique  semblable envers     Staph.        aureus    et     Salm.        typhi.     



  Des épreuves<I>in vivo</I> ont été effectuées sur des  souris pour établir l'activité     chimiothérapeutique    et  le caractère non toxique des composés céphalospo  rine     CA.     



  Dans ces épreuves, on a     infecté    un     certain    nom  bre de souris avec des doses de streptocoque et on a  utilisé     certaines    des souris infectées comme témoins.      Toutes les souris témoins sont     mortes    dans les 24 h  d'infection, ce qui démontre le caractère létal de     l'in-          fection    produite.  



  Les autres souris infectées ont reçu chacune une  injection sous-cutanée de 0,13 mg de céphalosporine       CA-pyridine    et ces injections ont été répétées à inter  valles de 3 h, de façon que chaque souris reçoive un  total de 9 injections. La série d'injections a protégé  complètement toutes les souris soumises à l'épreuve,  ce qui démontre la protection complète assurée con  tre une infection légale par des streptocoques.  



  Trois souris, pesant chacune 20 g ont survécu à  une     injection        intraveineuse    de 40 mg du composé  céphalosporine     CA-pyridine,    ce qui démontre que la  toxicité aiguë du composé céphalosporine<B>ÇA</B> est très  faible pour la souris.

Claims

REVENDICATION Procédé de préparation de nouvelles céphalospo rines C, caractérisé en ce que l'on traite de la cépha- i losporine C en solution aqueuse avec une base faible consistant en un composé hétérocyclique con tenant dans un cycle un atome d'azote tertiaire fai blement basique. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on effectue ledit traitement à chaud. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on effectue ledit traitement en chauffant à 37o C pendant 2 à 6 jours. 3.

Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on chauffe la céphalosporine C à 500 C avec une solution de ladite base d'une molarité d'au moins 1. 4. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que ledit composé hétérocyclique contient un substituant acide ou un substituant basique addition nel.