FR2661191A1

FR2661191A1 - Procede de production de l-lysine par fermantation et mutant pour la mise en óoeuvre du procede.

Info

Publication number: FR2661191A1
Application number: FR9104890A
Authority: FR
Inventors: Murakami Yutaka; Miwa Harufumi; Nakamori Shigeru
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-19
Publication date: 1991-10-25
Anticipated expiration: 2011-04-19
Also published as: US5250423A; JP2990735B2; JPH044887A; FR2661191B1

Abstract

Procédé de production de L-lysine par fermentation, qui comprend la culture dans un milieu d'un mutant producteur de L-lysine appartenant au genre Corynebacterium capable de croître même à 40degré C ou à une température supérieure et présentant une résistance à la S-(2-aminoéthyl)-L-cystéine pour produire et accumuler de la L-lysine dans le milieu de culture, et la récupération de la L-lysine à partir du milieu de culture,et mutant correspondant.

Description

La présente invention concerne un procédé de production de L-lysine par

fermentation qui comprend la culture dans un milieu de culture d'un mutant producteur de L-lysine appartenant au genre

Corynebacterium, capable de croître même à 40 C ou à des tempéra-

tures plus élevées et qui présente une résistance à la S-( 2-amino-

éthyl)-L-cystéine, pour produire et accumuler de la L-lysine dans le milieu de culture, et la récupération de la L-lysine à partir du milieu de culture, ainsi qu'un nouveau mutant producteur de L-lysine qui peut être utilisé de façon avantageuse pour un tel

procédé de production de L-lysine par fermentation.

La L-lysine, qui est importante comme additif pour

aliments pour le bétailest préparée principalement par fermenta-

tion. Dans la préparation industrielle de la L-lysine par fermentation, il existe certains facteurs techniques qui permettent une amélioration du point de vue économique Ces facteurs sont, par exemple, une amélioration du rendement par rapport au sucre, une

amélioration de la concentration de L-lysine accumulée, un raccour-

cissement des durées de culture, etc. En outre, il est important d'augmenter la température de culture En général, la culture est réalisée à une température optimale pour la production de L-lysine par fermentation Lorsque l'on utilise des bactéries productrices de L-lysine classiques, cette température est en général comprise entre 28 et 350 C Au début de la culture, il y a dégagement de chaleur de fermentation

de sorte que, lorsque le système est laissé au repos, la tempéra-

ture du milieu de culture augmente si bien que la formation de L-lysine décroît fortement Afin de maintenir la température du milieu de culture dans la gamme optimale, il est nécessaire de monter un échangeur de chaleur dans un réservoir de fermentation et de prévoir un circuit d'eau refroidie dans le réservoir Pour

obtenir de l'eau refroidie, il est nécessaire d'utiliser un conden-

seur Cependant, du fait que la chaleur de fermentation dégagée est très importante, l'énergie électrique consommée par le condenseur devient importante elle aussi Ainsi, si la température de culture pour la production de L-lysine par fermentation augmente, la charge de refroidissement diminue, si bien que la production de L-lysine

à l'échelle industrielle peut être améliorée du point de vue écono-

mique. On a proposé un procédé, décrit dans le brevet coréen

publié N 85-1231 (publié le 23 août 1985) pour augmenter la tempé-

rature de culture lors de la production de L-lysine par fermenta-

tion Ce procédé comprend l'utilisation d'un variant producteur de Llysine TR-3579 (KFCC 10065) appartenant au genre Corynebacterium,

présentant une résistance aux analogues de lysine et à la tempéra-

ture et exigeant de l'homosérine, de la leucine et de la valine en combinaison, et la culture du variant dans un milieu à température élevée ( 37 à 450 C) pour produire et accumuler de la L-lysine dans

le milieu de culture.

Le variant producteur de L-lysine utilisé dans ce procédé étant obtenu par amélioration de bactéries productrices de L-lysine classiques (cultivées entre 30 et 35 C) par un traitement mutagène pour produire de la L-lysine à haute température ( 37 à 45 C), le variant présente une auxotrophie complexe pour l'homosérine, la leucine et la valine comme évoqué ci-dessus, du fait du traitement mutagène en plusieurs étapes Ce procédé ne peut donc pas être mis

en oeuvre dans la pratique.

La demande de brevet japonais mise à la disposition du o public N 58170487 décrit un procédé de production de L-lysine par fermentation qui comprend la culture dans un milieu de culture d'un mutant appartenant au genre Corynebacterium, qui a une activité de pyruvate kinase réduite, capable de produire de la L-lysine et qui

présente également éventuellement une résistance à la S-( 2-amino-

éthyl)-L-cystéine, pour produire et accumuler de la L-lysine dans

le bouillon de culture, puis la récupération de la L-lysine.

Dans ce procédé, la température pour la fermentation est réglée entre 20 et 40 C comme cela ressort du seul exemple de mise en oeuvre (exemple 1) dans lequel on adopte une température de

C et, comme le présent inventeur a pu le confirmer en repro-

duisant ce procédé, la croissance des bactéries utilisées n'est pas notable à environ 40 O C, température qui constitue la limite supérieure de la gamme de températures pour la fermentation En outre, on ne note pas de formation et d'accumulation marquée de L-lysine. La présente invention a pour objet de fournir des bactéries capables de produire de la L-lysine par fermentation à haute température qui soient susceptibles d'être utilisée dans la

pratique ainsi qu'un procédé de production de L-lysine par fermen-

tation à haute température qui soit susceptible d'être utilisé

dans la pratique.

A la suite de recherches approfondies pour résoudre les

problèmes ci-dessus, on a constaté qu'en utilisant le mutant bacté-

rien modifié pour produire de la L-lysine en communiquant une

résistance à la S-( 2-aminoéthyl)-L-cystéine à des bactéries thermo-

philes appartenant au genre Corynebacterium capables de croître à C ou à des températures supérieures, il est possible d'atteindre les objets décrits ci-dessus La présente invention est basée sur

cette constatation.

Le mutant producteur de L-lysine appartenant au genre Corynebacterium, capable de croître à 40 O C ou à des températures

supérieures, présentant une résistance à la S-( 2-aminoéthyl)-L-

cystéine, qui peut être utilisé dans la présente invention, peut être obtenu en soumettant des bactéries appartenant au genre Corynebacterium et capables de croître à 40 C ou à des températures supérieures, par exemple des bactéries productrices d'acide

L-glutamique, en tant que souche parentale, à un traitement muta-

gène.

Comme souche parentale de ce type, on peut citer par

exemple les bactéries appartenant au genre Corynebacterium thermo-

aminogenes qui sont décrites dans la demande de brevet japonais o mise à la disposition du public N 63-240779 et qui proviennent de

sources naturelles.

Il n'est pas particulièrement difficile de recueillir le

mutant producteur de L-lysine après avoir soumis la souche paren-

tale à un traitement mutagène, et on peut appliquer un procédé connu classique pour recueillir un mutant résistant du point de vue chimique Par exemple, la souche parentale qui a été soumise à un traitement mutagène avec la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine

( 250 pg/ml, 30 C, 30 min), etc, est inocu Lée sur un milieu cons-

titué par des plaques d'agar ordinaires contenant 1 à 2 g/dl de S-( 2aminoéthyl)-L-cystéine dans lequel la souche parentale ne peut pas croître, et est cultivée à 40 C ou à une température supérieure, par exemple 43 C La colonie obtenue est recueillie

pour obtenir le mutant souhaité.

Des exemples de mutants producteurs de L-lysine ainsi recueillis sont les suivants:

Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12521, Coryne-

bacterium thermoaminogenes AJ 12522, Corynebacterium thermoamino-

genes AJ 12523 et Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12524.

Les propriétés bactériologiques de ces mutants sont

présentées dans le tableau 1 sous les rubriques 1 à 6.

A titre d'information, les bactéries Corynebacterium

thermoaminogenes AJ 12308 et AJ 12309 qui sont les souches paren-

tales ont été déposées au niveau international auprès de l'Institut de Recherches sur les Fermentations de l'Agence des Sciences et Technologies Industrielles du Japon (Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology of Japan) sous les numéros de dépôt FERM BP-1540 et FERM BP-1541,

respectivement De plus, les mutants Corynebacterium thermoamino-

genes AJ 12521, AJ 12522, AJ 12523 et AJ 12524 ont également été déposés au niveau international auprès du même organisme sous les numéros de dépôt FERM BP-3304, FERM BP-3305, FERM BP-3306 et

FERM BP-3307, respectivement.

T A B L E A U 1-1

Souche parentale

AJ 12308

FERM BP-1540

Mutant

AJ 12521 AJ 12522

FERM BP-3304 FERM BP-3305

Souche parentale

AJ 12309

FERM BP-1541

Mutant

AJ 12523 AJ 12524

FERM BP-3306 FERM BP-3307

Forme: ( 1) Forme et tail Le des cellu Les ( 2) Polymorphisme ( 3) Mobilité ( 4) Spore ( 5) Coloration Gram ( 6) Antiacide Bâtonnet de 0,7-1, 0 x 1,0-4,0 pm;

les bords des cellules sont arrondis.

On note une configuration en V due

à une division.

On ne note pas de polymorphisme mais parfois, selon la phase d'incubation, des cellules en bâtonnets allongés, des cellules en filaments et des

cellules prématurément ramifiées.

aucune aucun positive négatif idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem %l J idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem Do K) o M MD

T A B L E A U 1-2

Souche parentale

AJ 12308

Mutant

AJ 12521 AJ 12522

Souche parentale

AJ 12309

Propriétés physiologiques ( 1) Culture sur plaques de milieu gélosé ( 2) Culture sur milieu géLosé incliné ( 3) Cu Lture en milieu liquide ( 4) Culture sur milieu de gélatine piqué* ( 5) Lait de tournesol Croissance abondante ou modérée; les colonies sont circulaires, lisses, totalement convexes,

brillantes, opaques ou trans-

lucides, jaune mat butyreux.

Croissance abondante ou modérée; colonies filiformes, brillantes,

jaune mat.

Croissance modérée; les colonies deviennent troubles, presque uniformément, mais certaines

cellules précipitent.

Croissance modérée; pas de gélatine liquéfiée Légèrement alcalin; on ne note idem idem idem idem idem idem idem i dem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem os idem idem idem

ni liquéfaction, ni solidifica-

tion.

* Un milieu de culture solidifié par addition de gélatine est piqué avec un fil de platine sur lequel se trouvent des cellules de micro-

organisme, puis cultivé et on observe la croissance de la souche et la liquéfaction du milieu.

Do K) o M MD Mutant

AJ 12523

AJ 12524

TABLEAU A U

Souche parentale

AJ 12308

Mutant

AJ 12521 AJ 12522

Souche parentale

AJ 12309

Propriétés physio Logiques: ( 1) Réduction de nitrates ( 2) Denitration ( 3) Test au rouge de méthyle ( 4) Test de Voges-Proskauer ( 5) Formation d'indole ( 6) Formation de sulfure d'hydrogène ( 7) Hydrolyse de l'amidon ( 8) Utilisation du citrate ( 9) Utilisation de l'azote inorganique positive négative négatif ou Légèrement positif positif négative positive négative Ne croit pas dans le milieu de Koser, mais croit dans le milieu de Christensen; rend le milieu alcalin. N'utilise pas les nitrates, mais

utilise les sels d'ammonium.

Mutant

AJ 12523

AJ 12524

idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem négatif négatif idem idem idem idem idem -'J idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem D 1-3

T A B L E A U 1-4

( 10) Formation de pigment ( 11) ( 12) ( 13) ( 14) Test à l'urée Oxydase Catalase Domaine de croissance ( 15) Comportement vis-à-vis de l'oxygène

( 16) Test d'oxydation-

fermentation (glucose) Souche parentale

AJ 12308

pas de formation extracellulaire de pigment négatif ou légèrement positif négative positive croit bien à p H 7-8,5; croît bien à 35-45 C croit légèrement à 46-50 C aérobie ou facultativement anaérobie croît par fermentation pour former de l'acide Mutant

AJ 12521 AJ 12522

idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem Souche parentale

AJ 12309

idem idem idem idem idem idem idem Mutant

AJ 12524

idem

AJ 12523

idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem O O idem idem (D

T A B L E A U 1-5

Souche parentale Mutant Souche parentale Mutant

AJ 12308 AJ 12521 AJ 12522 AJ 12309 AJ 12523 AJ 12524

( 17) Formation d'acide à partir d'un sucre: 1 L-arabinose négative idem idem idem idem idem 2 D-xylose négative idem idem idem idem idem 3 Dglucose positive idem idem idem idem idem 4 D-mannose positive idem idem idem idem idem D-fructose positive idem idem idem idem idem 0. 6 Dgalactose négative idem idem idem idem idem 7 ma Ltose positive idem idem idem idem idem 8 saccharose positive idem idem idem idem idem 9 lactose négative idem idem idem idem idem tréhalose négative idem idem idem idem idem 11 D-sorbitol négative idem idem idem idem idem 12 D-mannitol négative idem idem idem idem idem 13 inositol négative idem idem idemf idem idem 14 glycérine négative idem idem idem idem idem amidon négative idem idem idem idem idem D

T A B L E A U 1-6

Souche parentale

AJ 12308

Mutant

AJ 12521 AJ 12522

Souche parentale

AJ 12309

AJ 12523

Mutant

AJ 12524

Autres caractéristiques: ( 1) Résistance à la température ( 2) Résistance au chlorure de sodium ( 3) Auxotrophie pour La substance nutritive ( 4) Composition des nucléotides de l'ADN (méthode Tm)* ( 5) Acide aminé dibasique contenu dans la paroi cellulaire ( 6) Source par méthode capillaire dans le lait écrémé: vivante à 60 C, 10 min morte à 650 C, 10 min

croît dans un milieu conte-

nant 5 % de solution salée exige de la biotine pour croître

,2 % G+C

acide mésodiaminopimélique fruits idem idem idem idem idem idem idem idem idem par méthode capillaire dans le lait écrémé: vivante à 60 C, 10 min morte à 65 C, 10 min idem idem idem idem idem

59,5 % G+C

idem Légumes * Méthode pour déterminer la teneur de L'ADN en G+C (guanine plus cytosine), dans laquelle on mesure la température de fusion de la double

chaîne d'ADN.

I) Mg idem idem idem idem idem idem idem idem idem idem o idem idem Les milieux utilisés pour produire et accumuler la L-lysine au moyen du mutant producteur de L-lysine, c'est-à-dire les milieux utilisés dans la présente invention, peuvent être des milieux connus de manière classique pour produire la L-lysine On peut utiliser des milieux classiques contenant des sources de

carbone, des sources d'azote, des sels inorganiques et, si néces-

saire, d'autres éléments nutritifs à l'état de traces qui sont nécessaires pour le micro-organisme On peut utiliser des sources de carbone quelconques dans la mesure o le mutant peut les utiliser Les sources de carbone sont par exemple le glucose, le saccharose, le maltose, les hydrolysats d'amidon contenant ces sucres, des sucres tels que les mélasses, etc; les alcools tels que l'éthanol, le propanol, etc; des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide propionique, etc De plus, on peut utiliser également des paraffines normales seules ou en combinaison avec d'autres sources de carbone, en fonction de la souche Comme sources d'azote, on peut utiliser des sources d'azote inorganique ou organique, par exemple des sels d'ammonium tels que l'acétate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, le phosphate d'ammonium, etc; des nitrates, l'urée, l'ammoniac et en outre des extraits de viande, etc Comme sels inorganiques, on peut utiliser KH 2 P 04,

Mg 504, Fe 504, Mn SO 4 et analogues qui sont utilisés habituellement.

Comme substances nutritives organiques à l'état de traces, on peut utiliser des vitamines, des acides gras ou des acides nucléiques, la peptone, l'acide casaminique, des extraits de levure ou des

hydrolysats de protéines les contenant.

On effectue l'incubation de préférence dans des condi-

tions aérobies En réalisant une culture secouée ou une culture aérobie tournante (méthode de culture aérobie caractérisée en ce que l'on fait tourner la solution de culture dans un ballon muni d'une plaque formant chicane en mélangeant cette solution de culture) pendant 2 à 4 jours, tout en réglant le p H du milieu entre et 9, de préférence entre 7 et 8,5, à la température de crois- sance des bactéries utilisées, à savoir à une température d'environ 25 à environ 50 C, de préférence d'environ 35 à environ 45 C, pour maintenir une forte productivité de L-lysine, il est possible de produire et d'accumuler la L-lysine dans le milieu de culture en

une quantité notable.

On applique différents procédés classiques pour recueillir la L-lysine à partir du milieu de culture Par exemple, il est possible de recueillir la L-lysine par un procédé classique

faisant intervenir des résines échangeuses d'ions, par cristallisa-

tion, etc, en combinant ces techniques de manière appropriée.

Comme indiqué ci-dessus, la température qui règne lors de la production de L-lysine par fermentation selon la présente invention est la température de croissance des bactéries utilisées,

c'est-à-dire une température d'environ 25 à environ 50 C, de préfé-

rence de 35 à 45 C, à laquelle la productivité de la L-lysine augmente Les exemples 2 et 3 ci-dessous démontrent qu'il est possible d'obtenir la formation et l'accumulation de L-lysine en quantité notable en réglant la température de fermentation à 43 C à

l'échelle du laboratoire.

On a calculé par des essais, sur la base des résultats expérimentaux, la charge de refroidissement nécessaire pour éliminer la chaleur dégagée lors d'une fermentation à l'échelle commerciale Dans le cas o l'on a réalisé une production de L-lysine par fermentation au moyen d'un réservoir de fermentation d'un volume de 200 kl par exemple, la charge de refroidissement nécessaire pour maintenir la température optimale de fermentation, par exemple 300 C, pour les bactéries productrices de Llysine était de 125,5 x 106 k J ( 30 x 106 kcal) par passe, tandis que, selon la présente invention, la charge de refroidissement nécessaire pour maintenir la température de fermentation au plus égale à 43 O C était de 12,55 x 10 k J ( 3 x 10 kcal) par passe, lorsque l'on a utilisé

le mutant producteur de L-lysine selon la présente invention.

Ainsi, selon la présente invention, la charge de refroidissement

peut être réduite de 90 %.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention

apparaîtront mieux dans la description détaillée qui suit et se

réfère aux exemples non limitatifs suivants.

Exemple 1 (Récolte du mutant) La souche Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12308 ayant été traitée par la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ( 250 pg/ml, C, 30 min) de manière classique, on a effectué une incubation à

43 C dans un milieu obtenu en ajoutant 1,5 g/dl de S-( 2-amino-

éthyl)-L-cystéine au milieu minimum présenté ci-dessous On a

récolté les colonies cultivées à 43 O C dans ce milieu.

Composition du milieu minimum Glucose 2,0 g/dl Urée 0,25 g/dl Sulfate d'ammonium 1,0 g/dl KH 2 PO 4 0,1 g/dl Mg SO 4 7 H 20 0,04 g/dl Fe SO 4 7 H 20 1,0 mg/dl L-alanine 50 mg/dl Nicotinamide 0,5 mg/dl Mn SO 4 4 H 20 1, 0 mg/dl Biotine 5,0 pg/dl Chlorhydrate de thiamine 10 pg/dl Na CL 5 mg/dl p H 7,2 Parmi les mutants ainsi obtenus, on a récolté AJ 12521 et AJ 12522 en tant que mutants ayant une excellente productivité de

L-lysine.

On a récolté de même AJ 12523 et AJ 12524 en utilisant

comme souche parentale Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12309.

On a fait croître au préalable les quatre mutants ainsi obtenus sur un milieu gélosé contenant du glucose à 43 C On a inoculé des parties aliquotes d'une boucle de platine sur 20 ml de

milieu stérile introduit dans un flacon secoué de 500 ml et présen-

tant la composition suivante: Composition du milieu Mélasse raffinée 10 g/dl Sulfate d'ammonium 5 g/dl

KH 2 PO 4

Mg SO 47 H 20 Biotine Carbonate de calcium (stérilisé et ajouté séparément) p H 7,0 On a cultivé ces mutants à 430 C pendant

s'est accumulée comme le montre le tableau 2.

0,1 g/dl mg/dl pg/dl g/dl 72 h La lysine

TABLEAU 2

Souche

AJ 12521

AJ 12522

AJ 12523

AJ 12524

ment on a Concentration de la L-lysine accumulée (g/dl) 3,2 2,9 2,8 3,0

Exemple 2

Dans un flacon secoué de 500 ml, on a introduit séparé-

ml d'un milieu aqueux ayant la composition suivante puis stérilisé à la vapeur à 110 C pendant 10 min. Composition du milieu Glucose Sulfate d'ammonium

KH 2 PO 4

Mg SO 4 7 H 20 Fe SO 7 H 20 Mn SO 4 H 20 Biotine Chlorhydrate de thiamine Concentré d'hydrolysat de protéines de soja par l'acide chlorhydrique (azote total: 7 %) Carbonate de calcium (stérilisé et ajouté séparément) p H 7,0 g/dl 4,5 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1,0 mg/dl 1,0 mg/dl ,0 pg/dl pg/dl 1,5 ml/dl g/dl On a inocu Lé sur le milieu ainsi préparé, introduit dans

un ballon, une boucle de platine de Corynebacterium thermoamino-

genes AJ 12521 qui avait été cultivée au préalable sur un milieu de culture de géLose inclinée contenant de l'extrait de viande et du glucose, puis on a réalisé une culture secouée à 43 C pendant 72 h. On a déterminé colorimétriquement par la réaction à la ninhydrine la quantité de L-lysine produite dans le milieu après 72 h de culture Les résultats indiquent une production de L-lysine

de 3,0 g/dl.

En outre, on a recueilli les solutions correspondant à ballons cultivées de la même manière et dont l'incubation était comp Lète, et on a retiré par centrifugation les cellules et le sel de calcium On a fait passer environ 1 l du surnageant ainsi obtenu sur une résine échangeuse d'ions fortement acide ("AMBERLITE" IR-120 (type OH)) pour adsorber la L-lysine sur celle-ci On a élué la L-lysine adsorbée avec de l'ammoniaque à 3 % et on a concentré l'éluat sous pression réduite Après avoir ajouté de l'acide chlorhydrique au concentre, on a refroidi le méLange et la L- lysine a précipité sous forme de chlorhydrate de L-lysine dihydraté pour

donner 26,5 g de cristaux.

Exemple 3

On a préLevé sur la culture inclinée une boucle de platine de Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12523 et une boucle de platine de la souche parentale AJ 12309 que l'on a inoculées sur 50 ml de milieu de culture d'ensemencement aqueux décrit ci-dessous On a effectué une culture aérobie tournante à 43 C

pendant 18 h pour préparer un milieu de culture d'ensemencement.

Composition du milieu de culture d'ensemencement: Glucose 1,5 g/dl Sulfate d'ammonium 0,3 g/dl Urée 0,1 g/dl KH 2 PO 4 0,1 g/d L Mg SO 4 7 H 20 0,04 g/d L Fe SO 4 7 H 20 1,0 mg/dl Mn SO 4 4 H 20 Biotine Chlorhydrate de thiamine Concentré d'hydrolysat de protéines de soja par l'acide chlorhydrique (azote total: 7 %) p H 7,5 D'autre part, on a introduit dans un de 1 I stérilisé de manière classique des pa 300 ml d'un milieu aqueux pour fermentation pr

tion donnée ci-dessous.

Sur celles-ci, on a inoculé à chaque de culture d'ensemencement et on a amorcé u

tournante à 43 C.

Composition du milieu de fermentation principale Glucose Sulfate d'ammonium Urée

KH 2 PO 4

Mg SO 4 7 H 20 Fe SO 7 H 20 Mn SO 4 4 H 20 Biotine Chlorhydrate de thiamine Nicotinamide Concentré d'hydrolysat de protéines de soja par l'acide chlorhydrique (azote total: 7 %) p H 7,2 1,0 ,0 mg/dl pg/dl pg/dl 2,0 ml/dl fermenteur en verre rties aliquotes de

incipale de composi-

fois 15 ml du milieu une culture aérobie 2,0 g/dl 0,5 g/dl 0,2 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1,0 mg/dl 1,0 mg/dl ,0 pg/l pg/l 1,0 mg/l 3,0 ml/dl Pour maintenir le p H du milieu de culture entre 7,2 et 8,0, on lui a ajouté un mélange d'acide acétique et d'acétate d'ammonium (le rapport molaire acide acétique:acétate d'ammonium du mélange était de 1:0,25 et la concentration en acide acétique du mélange était de 60 %) On a effectué une incubation à 43 C pendant h.

Les résultats sont présentés dans le tableau 3.

TABLEAU 3

Quantité de L-lysine Souche utilisée accumulée (g/dl)

AJ 12523 3,2

AJ 12309 0,03

(parentale)

A partir de 300 ml de la solution obtenue après achève-

ment de la fermentation de AJ 12323, on a obtenu 1,0 g de chlorhydrate de L-lysine dihydraté sous forme de cristaux d'une

manière analogue à l'exemple 2.

Exemple 4

Dans un flacon secoué de 500 ml, on a introduit 20 ml du même milieu que celui utilisé dans l'exemple 2, puis on a stérilisé à 110 C pendant 10 min à la vapeur On a inoculé sur le milieu une boucle de platine de Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12524 qui avait été cultivée auparavant sur un milieu de gélose inclinée contenant de l'extrait de viande et du glucose, puis on a effectué une culture secouée à 43 C pendant 50 h. Après avoir introduit 0,2 ml de milieu de culture dans un fermenteur en verre, on a ajouté 5 ml de sérum physiologique refroidi Après avoir agité, on a centrifugé le mélange à

4 500 tr/min pendant 10 min et on a rejeté le surnageant.

On a ajouté un méLange de 1,5 ml de tampon phosphate 0,2 M (p H 7,5) et de 1,5 ml de la solution de réaction décrite ci-dessous et on a agité le mélange On a mis en suspension les cellules puis on a effectué une réaction secouée ( 120 tr/min) à 43 C pendant 2 h. Solution de réaction: Glucose

(NH 4)25 04

Mg 504 7 H 20 Biotine Chlorhydrate de thiamine p H 7,5 1 g/dl 0,4 g/dl 0, 04 g/dl 500 pg/dl pg/dl On a ensuite centrifugé ( 4 500 tr/min, 10 min) et on a analysé par chromatographie liquide la concentration de L-lysine dans le surnageant Les résultats montrent qu'il s'est accumulé

0,2 g/dl de L-lysine.

On obtient donc, selon la présente invention, un procédé de production de L-lysine à l'échelle industrielle selon lequel la charge de refroidissement nécessaire pour éliminer la chaleur

dégagée lors de la fermentation est réduite, ce procédé ne nécessi-

tant aucun acide aminé et répondant aux conditions pratiques.

Claims

REVENDICATIONS

1 Procédé de production de L-lysine par fermentation, caractérisé en ce qu'il comprend la culture dans un milieu d'un mutant producteur de Llysine appartenant au genre Corynebacterium capable de croître même à 40 O C ou à une température supérieure et présentant une résistance à la S- ( 2-aminoéthyl)-L-cystéine pour produire et accumuler de la L-lysine dans le milieu de culture, et

la récupération de la L-lysine à partir du milieu de culture.

2 Mutant producteur de L-lysine appartenant au genre Corynebacterium, caractérisé en ce qu'il est capable de croître

même à 40 C ou à une température supérieure et présente une résis-

tance à la S-( 2-aminoéthyl)-L-cystéine, choisi parmi les souches suivantes: Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12521, FERM BP-3304 Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12522, FERM BP-3305 Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12523, FERM BP-3306

Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12524, FERM BP-3307.