Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen der Formel
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in der X einen ss-Oxymethylenrest oder Carbonyl- rest, Y Wasserstoff, Fluor, Chlor oder Brom, und R Wasserstoff, Fluor, Hydroxyl oder einen Acyl- oxyrest einer Carbonsäure darstellen.
Ausgangsstoffe für das erfindungsgemässe Ver fahren sind Verbindungen der Formel II:
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In dieser bedeutet X einen Carbonylrest (>C=O) oder einen ss-Oxymethylenrest (>CHOH), Y Wasser stoff, Fluor, Chlor oder Brom, R Wasserstoff, Fluor, Hydroxyl oder einen Acyloxyrest einer organischen Carbonsäure, vorzugsweise einer Kohlenwasserstoff- Carbonsäure mit 1 bis einschliesslich 12 C-Atomen.
Die neuen Verbindungen besitzen die wertvolle antirheumatisch-arthritische, entzündungshemmende und glukocorticoide Wirkung der Ausgangsverbin dungen, vereinigt mit günstigen mineralcorticoiden Eigenschaften. Die neuen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Entzündungen der Haut, der Augen und Ohren, Kontaktdenmatitis und andern allergischen Reaktionen.
Sie können bei oraler An wendung in üblichen Dosierungsformen, wie Pillen, Tabletten und Kapseln, bei parenteraler Anwendung in den üblichen flüssigen Formen verabreicht werden, wie sie bei natürlichen und synthetischen Cortical- steroidhormonen verwendet werden. Bei örtlicher Anwendung können sie in Form von Salben, Cremen, Lotionen und dergleichen angewendet werden, und zwar mit oder ohne andere wirksame Antibiotica, keimtötende Mittel und dergleichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekenn zeichnet, dass man Verbindungen der Formel 1I
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in 1,2-Stellung dehydriert. Die Dehydrierung kann entweder fermentativ oder chemisch erfolgen. Die fermentative Dehydrierung erfolgt durch An wendung von Mikroorganismen, wie Septomyxa, Corynebacterium, Fusarium und dergleichen unter bekannten Gärungsbedingungen (vgl.
USA-Patent schrift Nr.<B>2602769).</B> Bei der Dehydrierung mit Septomyxa ist es vorteilhaft, zusammen mit dem Sub strat und Gärungsmedium einen Steroidpromotor, wie Progesteron, 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-Ketobisnorcholensäure, 11 ss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und dergleichen zu verwenden. Im allgemeinen wer den bei der fermentativen Dehydrierung die freien Alkohole als Ausgangsstoff verwendet.
Doch kön nen auch die 21 Acylate, wie das 21-Acetat, 21-Pro- pionat, 21-Butyrat, 21-Isobutyrat oder 21-Hemi- succinat, verwendet werden. In diesen Fällen wird die 21-Estergruppe im allgemeinen während des Gärungsvorganges verseift. Der entstandene freie 21-Alkohol kann gegebenenfalls nach bekannten 21- Acylierungsverfahren reacyliert werden.
Die chemische Dehydrierung kann mit Selen dioxyd, ebenfalls nach bekannten Verfahren, durch geführt werden [Meystre und Mitarbeiter, Helv. Chem. Acta, Band 39, S. 734 (1956)]. Bei der chemischen Dehydrierung werden vorzugsweise die 21-Acylate als Ausgangsstoff verwendet, die das ent sprechende 2a-Methyl-6-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion-21-acylat ergeben.
Das so erhaltene 21-Acylat kann gegebenen falls nach bekannten Verfahren zu dem freien 21- Alkohol verseift werden.
Diese Acylierung der 21-Alkohole kann nach be kannten Veresterungsmethoden durchgeführt werden, z. B. durch Umsetzung mit einem Säurehalogenid, wie dem Säurechlorid oder Säurebromid, oder dem Anhydrid einer organischen Karbonsäure, oder durch Umsetzung mit der gewählten Säure in Gegenwart eines Veresterungskatalysators, z. B.
p-Toluolsulfonylchlorid, Trifluoracetanhydrid, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Schwefelsäure, oder mit einem Ester unter Esteraustausch-Reak- tionsbedingungen. Reaktionsbedingungen, die die labile 11-Hydroxylgruppe oder die 6-Halogengruppe angreifen können, sind hierbei zu vermeiden. Die so hergestellten 21-Acylate können nach be kannten Verfahren zu den entsprechenden 21-Hy- droxylverbindungen hydrolysiert werden.
Ein bevor zugtes Verfahren besteht darin, mindestens ein Mol- äquivalent eines Alkalimetallbikarbonates in einer im wesentlichen sauerstofffreien Lösung eines Gemisches aus einem niederen Alkanol und Wasser zu verwen den. Die Hydrolyse wird zwischen 10 und 30 durch geführt; das Gemisch ist vor atmosphärischem Sauer stoff zu schützen. Wenn die Hydrolyse beendet ist, wird das Reaktionsgemisch mit einer Säure, z. B.
Essigsäure, neutralisiert und das hydrolysierte Pro dukt aus dem Reaktionsgemisch durch Verdampfen und Kristallisieren, Extraktion mit Methylenchlorid oder dergleichen gewonnen.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen sind durch die Anwesenheit eines 6-Fluorsubstituen- ten gekennzeichnet. Das Fluor kann sich entweder in 6a- oder 6ss-Stellung befinden. Arbeitet man unter Einhaltung fast neutraler Bedingungen, so erhält man als Endprodukt das entsprechende 6ss-Epimere. Wer den als Ausgangsmaterial das 6/3-Epimere oder Ge mische, in denen es dominiert, verwendet, so kann jedes nachfolgende Reaktionsprodukt entweder als 6@-Epimeres oder als Gemisch von 6a- und 6/3- Epimeren isoliert werden.
Ein 6a-epimerisiertes Pro dukt kann durch Behandlung des 6ss-Epimeren oder von Gemischen aus 6a- und 6ss-Epimeren mit Halo genwasserstoff, wie Chlorwasserstoffgas, bei Tempe raturen nahe 0 in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid oder Äther, in Ge genwart eines Protonen liefernden Mittels, wie Alko holen oder organischen Säuren, erhalten werden. Das Gemisch sollte nahe bei 0 gehalten werden, jedoch können auch während der Zugabe der Säure etwas höhere oder niedrigere Temperaturen angewendet werden.
Das Reaktionsgemisch wird dann nacheinan der mit verdünntem Alkali und Wasser gewaschen, getrocknet und unter verringertem Druck verdampft. Die 6a-Fluorprodukte werden aus dem rohen Reak tionsprodukt durch Umkristallisation gewonnen und gereinigt.
Die Epimerisierung kann auch mit Alkali durch geführt werden. Basen, z. B. Lösungen aus Natrium hydroxyd oder Kaliumhydroxyd, können zur Behand lung des 6ss-Epimeren in Lösung in einem organi schen Lösungsmittel, wie Methanol, verwendet wer den und ergeben das 6a-Epimere.
Verbindungen der Formel 1 mit R = Wasser stoff können z. B. nach folgendem Schema herge stellt werden:
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in dem R' einen organischen Rest, insbesondere einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis einschliesslich 10 C-Atomen, wie Methyl, Äthyl, Phenyl, Tolyl oder Naphthyl, darstellt, wobei Methyl bevorzugt ist.
Danach wird ein in der 11-Stellung Sauerstoff enthaltendes 2a-Methyl-6-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion III mit einem organischen Sulfonylhalogenid behandelt und bildet den entsprechenden 21-Ester IV.
Das 21-Alkyl- oder Arylsulfonat IV wird sodann mit einem Jodierungsmittel zum entsprechenden 21-Jod- steroid V umgesetzt, das mit einem reduzierenden Mittel zum 2a-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion 1I dehalogeniert wird.
Das so erhaltene 2a-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion wird sodann erfindungsgemäss zu dem entsprechenden 2-Methyl-6-fluor-1 Iss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion I dehydriert.
Die erfindungsgemässe Dehydrierung des in der 11-Stellung Sauerstoff enthaltenden 2a-Methyl-6 fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,20-dions, z. B. des 2a-Methyl 6-fluor-1 lss,17a-oxy-4-pregnen- 3,20-dions und 2a-Methyl-6 fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trions, zu den entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B.
2-Methyl-6-fluor-1 lss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion und 2-Methyl-6-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion erfolgt fermentativ durch Mikroorganismen, wie Septomyxa, Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria,
Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria, Nocardia und Pilze der Familie Tuberculariaceae unter bekannten Gärbedingungen, vgl. USA-Patent- schrift Nr. 2 602 769.
Bei Verwendung von Septomyxa zur Dehydrie- rung ist es vorteilhaft, im Substrat und Gärmedium einen Steroidpromotor, wie Progesteron, 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-Ketobisnorcholensäure, 11ss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und dergleichen zu verwenden.
Die chemische Dehydrierung kann z. B. mit Selen dioxyd nach bekannten Verfahren (z. B. Mystre und Mitarbeiter, Helv. Chim. Acta, Band 39, S. 734 [1956]) durchgeführt werden.
6a-Fluor- und 6ss-Fluorsteroidverbindungen der Formel I mit R = Fluor können nach folgendem Reaktionsschema hergestellt werden:
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in dem R' die bereits angegebene Bedeutung hat. Zur Herstellung dieser Verbindungen wird z. B.
ein 21-Alkyl- oder Arylsulfonat VI mit einem Fluo- rierungsmittel behandelt und bildet das entsprechende 2a-Methyl-6,21-difluor-11ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion.
Das 2a-Methyl-6,21-difluorprodukt kann gegebenen falls zum entsprechenden 2a-Methyl-6,21-difluor-17a-4-pregnen- 3,11,20-trion oxydiert werden. Auch das 2a-Methyl76-fluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion VII kann zum 21-Fluorsteroid fluoriert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6,21-difluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6,21-diuor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20 trion wird dann erfindungsgemäss durch fermentative oder chemische Dehydrierung zum entsprechenden 2-Methyl 6,21-difluor-11ss,17a-dioxy-1,4- pregnadien-3,20-dion oder 2-Methyl-6,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien 3,11,
20-trion in 1-Stellung dehydriert, wobei analog wie bei den 21-Desoxyverbindungen vorgegangen wird. 6a-Fluor- und 6ss Fluorsteroidverbindungen der Formel I mit' Y = Halogen können nach folgendem Reaktionsschema hergestellt werden:
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in dem Y' Halogen ist und R' die bereits angegebene Bedeutung hat.
Nach vorstehendem Verfahren wird z. B. 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion VIII mit einem organischen Sulfonylhalogenid behandelt, wobei der entsprechende 21-Ester IX erhalten wird.
Darauf wird das so hergestellte 21-Alkyl oder Aryl- sulfonat mit einem Jodierungsmittel zum entspre chenden 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a-dioxy- 21-jod-4-pregnen-3,20-dion X und dieses schliesslich mit einem reduzierenden Mittel zum 2a-Methyl-6 fluor-9a-halogen-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,
20-dion II umgesetzt. Das Produkt 1I kann gegebenenfalls zum entsprechenden 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6-fluor-9a-halogen 17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion wird dann erfindungsgemäss durch fermentative oder chemische Dehydrierung in der 1-Stellung dehydriert, wobei das entsprechende 2-Methyl-6-fluor-9a-halogen-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,
20-dion I oder das entsprechende 2-Methyl 6-fluor-9 halogen-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-dion erhalten wird.
Die Dehydrierung erfolgt fermentativ oder che misch in der bereits beschriebenen Weise.
6a-Fluor- und 6ss-Fluorsteroidverbindungen der Formel I, in der R = Fluor und Y = Halogen ist, können nach folgendem Schema hergestellt werden:
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in dem R' die bereits angegebenen Bedeutungen hat und Y Halogen ist.
Das Verfahren besteht darin, dass das 2a-Methyl 6 fluor-9a-halogen-llss,17a-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-alkyl- oder -arylsulfonat XI mit einem Fluorierungsmittel behandelt wird, wo durch das entsprechende 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-l lss,17a- dioxy 4-pregnen-3,20-dion II erhalten wird.
Das 6,21-Difluorprodukt kann gege benenfalls zum entsprechenden 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden. Auch das 2a-Methyl-6-fluor-8a-halogen-1 lss,17a-dioxy- 21 jod 4-pregnen-3,20-dion kann zum 21-Fluorsteroid 1I fluoriert werden.
Das so hergestellte 2a-Methyl-6,2l-difluor-9a-halogen-1 lss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion wird durch fermentative oder chemische Dehydrie- rung in der 1-Stellung dehydriert, und man erhält das entsprechende 2-Methyl-6,21-difluor-9a-halogen-11ss,17a- dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion oder das entsprechende 2-Methyl-6,
21-difluor-9a-halogen-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. Auch hier schliesst sich sodann die erfindungs gemässe Dehydrierung in der bereits beschriebenen Weise an.
<I>Präparat 1:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-l lss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion.
278 mg (0,637 Millimol) 2a-Methyl-6a-fluor 11ss,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion- 21-acetat wurden in 30 cm3 Methylalkohol gelöst. Diese Lö sung wurde von Luft befreit, indem man 5 Minuten lang Stickstoff hindurchleitete. Eine Lösung aus 150 mg Kaliumbikarbonat in 3 cm3 Wasser wurde ebenfalls mit Stickstoff luftfrei gemacht und der Steroidlösung hinzugefügt. Dieses Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt und 5 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre gehalten.
Durch Zu gabe von zwei Tropfen Eisessig wurde das Reak tionsgemisch schwach sauer gemacht und dann mit 30 cm3 Wasser verdünnt. Durch Destillation bei ver mindertem Druck wurde das Methanol entfernt. Das Produkt wurde aus dem wässrigen Gemisch dreimal mit je 10 cm3 Methylenchlorid extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft.
Er ergab 100 mg (0,254 Millimol) 2a-Methyl-6a-fluor-I lss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion, einen weissen kristallinen Stoff, der bei 200-206' schmilzt.
<I>Beispiel 1</I> 2-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm- eines aus 10/9 Glukose, 2% Maisquellwasser (601/o Feststoffe) und Leitungswasser bestehenden Nähr mediums werden auf einen pH-Wert von 4,9 einge stellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem ein, bis zwei Tage alten vegetativen Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raum temperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 Liter des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquell wasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasser bad von 28 gestellt, der Inhalt kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luftlmin/10 1 Gär- medium). Nach 20stündiger Inkubationszeit, nachdem sich ein<I>gutes</I> Wachstum entwickelt hat, fügt man 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion und 1/2 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al zu.
Die Inkubation wird bei der gleichen Temperatur (28 ) und die Belüftung 72 Stunden (bis zu einem endgültigen pH-Wert von 8,3) durchgeführt. Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gär- medium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert. Darauf werden die Acetonextrakte und die des Nährmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem, synthetischem Magne- siumsilikat (Florisil) und Umkristallisation aus Hexan- kohlenwasserstoffen gereinigt.
Man erhält kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Anstelle von Septomyxa können auch andere Arten, wie Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium,
Leptosphaeria, C.icurbitaria, Nocardia oder Enzyme von Pilzen der Familie Tuberculariaceae zur Einführung einer dl-Bindung in das 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion verwendet werden.
Diese Verbindung wird wie folgt zum 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-acetat umgesetzt: 50 mg 2-Methyl-6a-fluor-llss,l7a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 1 cm3 Pyridin und 1 cm3 Essigsäure anhydrid gelöst.
Diese Lösung wird 21 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt und darauf in Eiswasser gegossen, wodurch man kristallines 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-acetat erhält, das durch Umkristallisation aus Hexan- kohlenwasserstoff gereinigt werden kann.
2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat: 0,5 g Succinsäureanhydrid und 0,1 g 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion werden in 5 cm3 Pyridin gelöst. Diese Lösung wird 20 Stunden abgestellt, mit Wasser verdünnt, das Ge misch gekühlt und filtriert.
Das auf einem Filtrier papier gesammelte Ausfällprodukt wird zweimal aus Methanol umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat. 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz:
Zu einer Lösung von 100 mg 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat in 2 cm3 Aceton wird langsam unter Rühren so lange Natriumhydroxydlösung (0,1 normal) zugefügt, bis der pH-Wert auf etwa 7,4 gestiegen ist. Während die Natriumhydroxydlösung zugefügt wird, werden zugleich 5 cm3 Wasser zugegeben.
Die Lösung wird dann bei 25 unter Vakuum zur Entfernung des Acetons konzentriert. Die erhaltene wässrige Lösung aus 2-Methyl-6a-fluor-l lss,l7a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz wird filtriert und durch Gefrieren getrocknet, wo durch man reines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy 1,4-pregnadien-3,20-dion-21-hemisuccinat- natriumsalz erhält.
<I>Beispiel 2</I> 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Fünf 250-cm?>-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm?, eines aus 1 a/Q Glukose, 2 % Maisquellwasser (60 % Feststoffe) und Leitungswasser bestehenden Nähr mediums werden auf einen pH-Wert von 4,9 einge stellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten mit einem Druck von 1,05 kg/cm9 sterilisiert und mit einem ein bis zwei Tage alten Wachstum von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyer- kolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden diese 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Ge misch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, ver wendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt; der Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/Minute/10 1 Gärmedium). Die Inkubation wird bei der gleichen Temperatur (28 ) und die Belüftung 72 Stunden (bis zu einem endgültigen pH-Wert von 8,3) durchge führt.
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird darauf dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, dann werden die Acetonextrakte und die des Gär- mediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat gärocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem synthetischem Magnesiumsilikat und Umkristallisation aus Hexankohlenwasserstoffen ge reinigt und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
Die Verbindung wird wie folgt zum 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion-21-acetat umgesetzt: 50 mg 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion werden in 1 cm3 Pyridin und 1 cm3 Essigsäure anhydrid gelöst.
Diese Lösung wird 21 Stunden bei Raumtemperatur abgestellt und darauf in Eiswasser gegossen, wodurch man kristallines 2-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion-21-acetat erhält, das durch Umkristall'isieren aus Hexankohlen- wasserstoffen gereinigt werden kann.
<I>Beispiel 3</I> 2-Methyl-6ss-fluor-11 ss, l 7a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Eine stöchiometrische äquivalente Menge 2a-Methyl-6ss-fluor-11 /3,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion wird anstelle von 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion im Verfahren von Beispiel 1 verwendet und ergibt kristallines 2-Methyl-6ss fluor-llss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,
20-dion. <I>Beispiel 4</I> 2-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Eine stöchiometrisch äquivalente Menge 2a-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion wird anstelle von 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 4-pregnen-3,11,20-trion im Verfahren des Beispiels 2 verwendet und ergibt kristallines 2-Methyl-6ss-fluor-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 5</I> Isomerisierung von 2 - Methyl - 6ss-fluor-11 ss,17a,21- trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion zu 2-Methyl-6a-fluor- 11/3,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion Eine Lösung von 0,150 g 2-Methyl-6ss-fluor-11 P,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion in 12 cm3 Chloroform und 0,1 cm3 absolutem Alkohol wird in einem Eis-Kochsalz-Gemisch auf -10 abgekühlt;
ein Strom wasserfreien Chlorwasser stoffes wird etwa 2,5 Stunden lang langsam durch die Lösung geleitet, während die Temperatur zwi schen etwa -5 und -15 gehalten wird. Darauf wird die Lösung mit verdünntem Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Die Umkristallisation des Rückstandes aus Hexankohlenwasserstoffen ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Präparat 2:</I> 2a-Methyl 6a-fluor-17a,21-dioxy- 4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-21-acetat. Zu einer Lösung von 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-1 1ss,17a,21-trioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-acetat in 10 cm3 Pyridin werden 0,4 g N-Bromacetamid ge geben.
Das Gemisch wird etwa 20 Minuten in eine Stickstoffatmosphäre gebracht, worauf es auf 5 ab gekühlt wird. Unter Rühren wird wasserfreies Schwefeldioxyd über die Oberfläche geleitet, bis die Lösung mit angesäuertem Jod-Stärke-Papier keine Farbveränderungen mehr gibt. Während der Schwe- feldioxyd-Zugabe lässt man die Temperatur des Re aktionsgemisches nicht über 20\1 ansteigen. Das Ge misch wird dann etwa 5 Minuten abgestellt und dann in 100 cm3 Eiswasser gegossen, wobei ein roher Feststoff ausfällt.
Die Umkristallisation aus Aceton gibt kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a, 21-dioxy-4, 9 (11)- pregnadien-3,20-dion-21-acetat. <I>Präparat 3:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregn:
en-3,20-dion-21-acetat. Zu einer Lösung von 420 mg 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4,9(11)- pregnadien-3,20-dion-21-acetat in 6,5 cm3 Methylenchlorid werden 12,5 cm3 tert. Butylalkohol, eine Lösung von 1,0 cm3 72 % ige Perchlorsäure in 7,
5 cm3 Wasser und eine Lösung von 182 mg N-Bromacetamid in 3,2 cm3 tert. Butyl- alkohol gegeben. Nachdem etwa 15 Minuten gerührt worden ist, wurde eine Lösung von 182 mg Natrium sulfit in 10 cm3 Wasser zugefügt und das Gemisch unter vermindertem Druck bei etwa 60 eingedampft, bis eine Auskristallisierung stattfand. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurden 30 cm-' Wasser unter Rühren zugefügt.
Das kristalline Produkt wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wo durch im wesentlichen reines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-11 ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat erhalten wurde. Das Produkt wurde in dem nach folgenden Beispiel ohne weitere Reinigung verwendet.
<I>Präparat 4:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9ss, l lss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat. Ein Gemisch von 2,816 g 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, 2,816g Kaliumacetat und 90 cm3 Aceton wird unter Rühren bei Rückflusstemperatur etwa 18 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird dann auf etwa die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingedampft und in einem Eisbad gekühlt.
Die Zugabe von 250 cm3 Wasser ergibt kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9ss,11 ss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat, das durch Umkristallisation aus Aceton weitergerei nigt wird.
<I>Präparat 5:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat. Zu 3,41 g in einem Bad aus fester Kohlensäure gekühltem flüssigem Fluorwasserstoff wird portions- weise eine Suspension von 1,875 g 2a-Methyl-6a fluor-9ss,llss-oxido-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat in 5,97 g (über Natriumhydroxyd destilliertem)
Tetra- hydrofuran und 20 em33 Methylenchlorid, die gleich falls in einem Bad aus fester Kohlensäure gekühlt wurde, gegeben. Das Steroid wird vollständig gelöst. Nachdem das Reaktionsgemisch etwa 17 Stunden bei 0-5 abgestellt worden war, wurde es langsam unter Rühren in ein Gemisch von 300 cm3 Eiswasser, 50 em3 Methylenchlorid und 20g Natriumbikarbonat gegossen.
Das Gemisch wird einige Minuten gerührt, die Methylenchloridschicht abgetrennt und die Wasserphase zweimal mit je 50 em3 Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridlösungen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel eingedampft, wodurch ein Öl erhalten wird. Das Öl wird in einem Gemisch aus 10 cm3 Essigsäureanhydrid in 10 cm3 Pyridin gelöst und etwa 20 Stunden abgestellt.
Das Acetylierungsgemisch wird dann in Eiswasser gegossen und mit Methylen- chlorid extrahiert. Der Extrakt wird mit verdünnter Säure, verdünnter Base und Wasser gewaschen, ge trocknet und über einer Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat chromatographiert. Die Eluierung der Säule mit Aceton in Hexankohlenwasserstoffen gibt ein kristallines Produkt, das mehrere Male aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert wird und kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,
21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat ergibt.
Die Verwendung von wässrigem Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff anstelle des Fluorwasserstoffes ergibt das entsprechende 9a-Chlor- bzw. 9a-Brom- produkt.
<I>Präparat 6:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Stickstoff wird etwa 15 Minuten lang durch eine Lösung von 0,33 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat in 33 cm3 Methanol geleitet. Hierzu wird eine Lö sung von 0,33g Kaliumbikarbonat in 4 cm3 Wasser, die ebenfalls mit Stickstoff behandelt worden ist, ge fügt.
Nachdem die Base etwa 8 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre gerührt worden war, wurde sie durch Zugabe von 2,5 cm3 5 I/o-iger Salzsäure neutra lisiert. Das Gemisch wird dann unter vermindertem Druck bei etwa 50 auf etwa 5 cm3 eingeengt. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, ge waschen, getrocknet, und zur Trockne eingedampft.
Die Umkristallisation aus Aceton-Hexankohlen- wasserstoffen ergab kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,21-trioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Bei Verwendung des entsprechenden 9a-Chlor- oder 9a-Brom-2a-methyl 6a fluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetates in der genannten Hydrolyse erhält man 2a-Methyl-6a-flnor-9a-chlor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion und die entsprechende 9a-Bromverbindung.
Das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion oder dessen 9a-Chlor- oder 9a- Bromanaloge können an der 21-ständigen Hydroxyl- gruppe mit einer organischen Karbonsäure, vorzugs weise einer beliebigen Kohlenwasserstoffkarbonsäure mit 1 - einschliesslich 12 C-Atomen oder dem davon abgeleiteten Anhydrid oder Acylhalogenid, rück verestert werden.
Wenn das Acyherungsmittel fest ist, so kann ein inertes Lösungsmittel, wie Toluol, Xylol oder Dioxan, zugefügt werden, um die Lösung zu bewirken und ein flüssiges Veresterungsmedium zu schaffen.
Wenn das Veresterungsmittel eine freie Säure ist, so wird die Umsetzung in Gegenwart eines Vereste- rungskatalysators, z. B.
p-Toluolsulfonylchlorid, Trifluoressigsäureanhydrid, p-Toluolsulfonsäure, Trifluoressigsäure, Schwefelsäure oder dergleichen, durchgeführt. <I>Präparat 7:
</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. Zu einer Lösung von 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 1 cm3 Pyridin und 35 cm3 tert. Butylalkohol wer den 250 mg N-Bromacetamid gefügt.
Nachdem das Reaktionsgemisch etwa 16 Stunden bei Raum temperatur abgestellt worden war, wurde es mit 25 cm3 250 mg Natriumsulfit enthaltendem Wasser verdünnt und auf etwa 20 cm3 eingeengt, worauf die Ausfällung stattfand.
Das so erhaltene Ausfällprodukt wird auf einem Filter gesammelt und dreimal aus Athylacetat und Hexankohlenwasserstoffen umkristal lisiert und ergibt 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. Die Verwendung der entsprechenden 9a-Chlor- und 9a-Bromverbindung als Ausgangsmaterial in der obigen Oxydation ergab 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion und die entsprechende 9a Bromverbindung.
<I>Präparat 8:</I> 2a Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat. 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-acetat und 0,15g Chromtrioxyd werden in 10 cms Eisessig und 1/2 cm' Wasser gelöst. Dieses Gemisch wird ge rührt und etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur ge halten.
Darauf wird es in 50 cm3 Eiswasser gegossen und das erhaltene Ausfällprodukt auf einem Filter gesammelt und dreimal aus Äthylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert, wodurch man 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat erhält.
Bei Verwendung des entsprechenden 9a-Chlor- und 9a-Bromsteroides als Ausgangsmaterial in der obigen Umsetzung erhält man 2a-Methyl-öa-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-acetat und die entsprechende 9a-Bromverbindung. <I>Präparat 9:
</I> 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. Zu einer Lösung von 100 mg (0,254 Millimol) rohem 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 3 cms vorher auf 0 abgekühltem Pyridin wurden 0,2 cm3 Methansulfonylchlorid gegeben und darauf bei einer Temperatur zwischen 0 und -5 2 Stunden gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert.
Dieser Extrakt wurde zur Entfernung des Pyridins mit eiskalter verdünnter Salzsäure gewaschen. Der Methylenchloridextrakt wurde dann mit kalter, ver dünnter, wässriger Natriumkarbonatlösung gewa schen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net. Der getrocknete Extrakt wurde anschliessend durch Destillation bei vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Das erhaltene halbkristalline, lederfarbene Produkt war 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. <I>Präparat 10:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-21-jod-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Das rohe 2a Methyl-6a-fluor-llss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat wurde in 5 cm3 Aceton aufgenommen.
Eine Lösung von 150 mg Natriumjodid in 3 cm3 Aceton wurde zugefügt und das Gemisch 15 Minuten unter Rühren am Rückflusskühler behandelt. Darauf wurde die Wärmezufuhr gedrosselt und das Gemisch durch Destillation unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Das erhaltene 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion wurde in der nachfolgend beschriebenen Umsetzung verwendet.
Die Umkristallisierung aus Methylen- chlorid ergab sehr reines kristallines 2a-Methyl-6a fluor-11ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion. <I>Präparat<B>1</B></I><B>1:
</B> 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Das 2a-Methyl-6a-fluor-llss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion wurde in 3 cm3 Eisessig aufgenommen und bei Raumtemperatur (etwa 25 ) 45 Minuten lang ge rührt. 200 mg Zinkpulver wurden hinzugegeben und das Gemisch weitere 15 Minuten gerührt. Darauf wurde das Gemisch mit Methylenchlorid verdünnt und auf einem Filter aus gesintertem Glas zur Ent fernung des überschüssigen Zinks filtriert. Das Fil trat wurde mit Wasser bzw. verdünntem Natrium bikarbonat gewaschen und über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet.
Der getrocknete Extrakt wurde zur Trockne eingedampft und ergab 105 mg eines teilweise kristallinen Feststoffes. Dieses rohe Produkt wurde nochmals in 30 cm3 Methylenchlorid gelöst und über 10 g synthetisches Magnesiumsilikat (Florisil)
chromatographiert. Das Produkt wurde mit 12 25-cm3-Fraktionen aus 1011/9 Aceton in Hexan- kohlenwasserstoffen eluiert. Die Fraktionen 5 bis einschliesslich 7 ergaben 36 mg 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion, die aus Äthylacetat und Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert wurden und 34 mg 2a-Methyl-6 a-fluor-11 ss,
17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion ergaben.
Schmelzpunkt 265-267 , Drehung [ab + 45 (in Dioxan).
<I>Präparat 12:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17cc-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a-fluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und 1/2 cm-' Wasser wurde ein Gemisch hergestellt. Dieses Gemisch wird gerührt und 8 Stunden auf Raum temperatur gehalten.
Anschliessend wird das Ge misch in 50 em3 Eiswasser gegossen, durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd neutralisiert. Das erhaltene Ausfällprodukt wird auf einem Filter ge sammelt und aus Äthylacetat-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert, worauf man kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion erhält.
<I>Präparat 13:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion-21-methansulfonat.
Nach dem Verfahren von Präparat 9 wird durch Umsetzung von 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion in 7 cm3 Pyridin mit 0,3 cm3 Methansulfonylchlorid in Pyridinlösung kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-17a,21-dioxy-4-pregnen- 3,11,20-trion-21-methansulfonat hergestellt. <I>Präparat 14:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Rohes 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-21-jod- 4-pregnen-3,11,20-trion wird mit 15 cm3 Eisessig aufgeschlämmt und 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Darauf wird 1 g Zinkstaub zugefügt und weitere 15 Minuten ge rührt. Der überschüssige Zinkstaub wird durch Fil trieren entfernt, das Filtrat mit Methylenehlorid ver dünnt und mit Wasser in kalter Natriumbikarbonat- lösung gewaschen, bis die gesamte Essigsäure neutra lisiert ist.
Nachdem die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden ist, wird sie über synthetischem Magnesiumsilikat chromatographiert. Die Umkristallisation aus Aceton -Hexankohlen- wasserstoffen ergibt im wesentlichen reines 2cc-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 6</I> 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm?, Nährmedium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (601/ü# Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben wurden 3 Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cms eines Anti- schaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadeka- nol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt kräftig ge rührt (300 Ufmin) und belüftet (0,11 Luft/min/101 Gärmedium). Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6a-fluor-1 Iss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion und i/;, g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al hinzugefügt.
Die Inku- bation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Be lüftung 24 Stunden fortgeführt (endgültiger pH- Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gär- mediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rück stand wird durch Chromatographie über einer Säule aus wasserfreiem synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen um- kristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion. <I>Beispiel 7</I> 2-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,
20-trion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit 100 em3 Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/em2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 ems eines Antischaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet.
Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium). Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelösteµ 2a-Methyl 6a-fluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt und die Inkubation bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgeführt (end gültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhal tene Rückstand wird durch Chromatographie über einer Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt und aus Aceton-Hexankohlen- wasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl 6a-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 8</I> 6-Epimere Durch Verwendung der 6ss-Epimeren als Aus gangsmaterial in den vorhergehenden Beispielen er hält man bei Beibehaltung fast neutraler Reaktions- begingungen die entsprechenden 2 Methyl-6ss-fluor- produkte einschliesslich 2-Methyl-6ss fluor-11ss,17a-dioxy-1,4-pregnadien- 3,20-dion und 2-Methyl-6ss-fluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
Die so erhaltenen 6ss-Epimeren ergeben bei Be handlung in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, mit einer wasserfreien Mineralsäure, wie Salzsäure, in Gegenwart von Alkohol bei Tempera turen von 0 oder etwa darunterliegenden Tempera turen der gesamten Zeit der Säurezugabe beibehalten werden.
Mehrmaliges Waschen mit verdünntem Alkali und nachfolgendes Eindampfen unter ver- mindertem Druck ergibt hohe Ausbeuten an 6a-Epi- meren.
<I>Präparat 15:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Ein Gemisch von 20 mg 2a-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-methansulfonat und 10 mg Kaliumfluorid in 2 cm3 Dimethylsulfoxyd wird etwa 17 Stunden auf einem Dampfbad erhitzt, dann mit 50 cm3 Methylenchlorid verdünnt und drei mal mit je 10 cm3 Wasser gewaschen.
Nachdem man die Methylenchloridlösung über Natriumsulfat ge trocknet hatte, leitete man sie über eine Säule aus 10 g synthetischem Magnesiumsilikat. Die Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen plus Aceton ergibt zuerst rohe Kristalle von 2a-Methyl 6a-fluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion. Diese Verbindung hat eine grosse harntreibende Wir kung, und zwar verursacht sie Salz- und Wasser verluste, wodurch sie bei der Behandlung von Leber schrumpfung,
von nephrotischem Syndrom und Eklampsia und Präeklampsia besonders wertvoll ist.
Weitere Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen und Aceton ergibt das 2a-Methyl-6a,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, das bei der Umkristallisierung aus Äthylacetat- Hexankohlenwasserstoffen im wesentlichen reines, kristallines 2a-Methyl-6a,21-difluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion ergibt.
<I>Präparat 16:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy 4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,21-difluor-llss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und 1/2 cm3 Wasser wird eine Lösung hergestellt. Dieses Gemisch wird gerührt und etwa 8 Stunden bei Raum temperatur gehalten.
Darauf wird das Gemisch in 50 cm3 Eiswasser gegossen, durch Zugabe von ver dünntem Natriumhydroxyd neutralisiert und das derart erhaltene Ausfällprodukt auf einem Filter ge sammelt und dreimal aus Athylacetat und Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert, wobei 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion erhalten wird.
<I>Präparat 17:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-11ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Zu einer Lösung von 0,57 g 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion in 55 cm3 Acetonitril werden, im Dunkeln bei 50-60 0,4 cm3 einer 50%igen wässrigen Silberfluoridlösung zugefügt. Die Lösung wird in drei gleichen Teilen in halbstündigen Abständen zugegeben.
Nachdem diese Temperatur insgesamt etwa 11/2 Stunden beibehalten wurde, wird sie für weitere etwa 21/2 Stunden auf 40-50 herabgesetzt. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei 50 entfernt und der schwarze Rückstand dreimal mit je 50 cm3 Aceton versetzt.
Das in der Acetonlösung enthaltene Produkt wird durch Chromatographie über einer Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt und aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert, wobei man kristallines 2a-Methyl-6a,21-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion erhält.
Durch Substitution von 2a-Methyl-6a-fluor-17a-oxy-21-jod-4-pregnen- 3,11,20-trion als Ausgangsstoff in der vorstehenden Umsetzung er hält man 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion. Das 2a-Methyl-6a,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion kann zum 6a,21-Difluor-17a-oxy-4-pregnen-3,11,20-trion oxydiert werden.
<I>Beispiel 9</I> 2-Methyl-6a,21-difluor-1 lss,l7a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Fünf 250 cm3 fassende, je 100 cm- Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthaltende Erlenmeyerkolben werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Nährmedium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impf stoff für 10 1 des gleichen Glukose-Maisquellwasser- Mediums verwendet,
das zusätzlich 5 cm3 eines Anti- schaummittels (Gemisch aus Specköl und Oktadeka- nol) enthält. Der Gärbehälter wird in das Wasserbad von 28 gestellt, der Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luftimin,/10 1 Gär- medium). Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 0,
5 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 48 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton filtriert. Das Gärmedium wird drei mal mit je 1 1 Methylenchlor extrahiert. Darauf wer den die Acetonextrakte und die des Gärmediums ver einigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthe tischem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a-fluor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 10</I> 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion Fünf 250 cm3 fassende, je 100 cm-' Medium aus 1% Glukose,
2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthaltende Erlenmeyerkolben werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nährmedium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden diese 500 cm'. als Impfstoff für 10 1 des gleichen Glukose Maisquellwasser-Mediums verwendet, das zusätzlich noch 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält. Der Gär- behälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein. Inhalt wird kräftig gerührt (300 U.Jmin) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm s Dimethylformamid ge löstes 2a-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Tempe ratur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfil triert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert.
Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylen- chlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 11</I> 6ss Epimere Durch Verwendung der 6ss-Epimeren als Aus gangsstoffe in den vorhergehenden Beispielen erhält man bei Beibehaltung fast neutraler Reaktionsbedin gungen die entsprechenden 2a-Methyl-6ss,21-difluor- produkte, einschliesslich 2-Methyl-6ss,21-difluor-11 ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion und 2-Methyl-6a,21-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion. Die derart erhaltenen 6ss-Epimeren ergeben durch Behandlung in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform,
mit einer wasserfreien Mineralsäure, wie Salzsäure, in Gegenwart von Alkohol bei Tempe raturen von 0 oder etwas darunterliegenden Tempe raturen die 6a-Epimeren. Die niederen Temperaturen sollten während der gesamten Zeit der Säurezugabe beibehalten werden. Mehrmaliges Waschen mit ver dünntem Alkali und nachfolgendes Eindampfen unter vermindertem Druck ergibt hohe Ausbeuten an 6a- Epimeren.
Präparat <I>18:</I> 2a-Methyl 6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat. Zu einer Lösung von 500 mg 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in 6 cm3 vorher auf 0-5 abgekühltem Pyridin wer den 0,55 cm3 Methansulfonylchlorid gefügt.
Das Re aktionsgemisch wird bei etwa 6 bis zur Beendigung der Umsetzung gerührt und dann in kalte 5%ige Salzsäurelösung geschüttet. Das erhaltene feste Mexylat, 2a-Methyl 6a,9a-difluor-11ss,17a,21 trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat, wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
<I>Präparat 19:</I> 2a-Methyl-6a,9a-ditluor-l lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion und 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Zu einer Lösung von 370 mg rohem 2a-Methyl,-6a,9a-difluor-l lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat in 10 cm-3 Aceton wird eine Lösung von 370 mg Na- triumjodid in 4 cm3 Aceton gefügt.
Das Gemisch wird etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, etwa 15 Minuten am Rückfluss behandelt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion enthaltende Rückstand wird in 5 cm3 Essigsäure ge löst und etwa 45 Minuten gerührt. Eine Lösung von 600 mg Natriumthiosulfat in 7,2 cm3 Wasser wird zur Essigsäurelösung hinzugefügt, anschliessend wer den 70 cms Eis und Wasser zugegeben.
Der erhal tene feste Stoff wird durch Filtrieren isoliert, wird über synthetisches Magnesiumsilikat chromatogra- phiert und aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Ein weiteres Produkt wird erhalten,
indem man die Wasserphase der vorstehenden Ausfällstufe mit Me- thylenchlorid extrahiert und dann wie vorstehend chromatographiert und umkristallisiert. Das 2a-Methyl-6a,9a-difluor-llss,l7a-dioxy- 24-jod-4-pregnen-3,20-dion kann auch durch Umkristallisation aus Methylen- chlorid gereinigt werden.
<I>Präparat 20:</I> 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-11ss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 em3 Eisessigsäure und 1/2 cm-' Wasser wird eine Lösung hergestellt. Das Gemisch wird gerührt und bis zur Beendigung der Umsetzung bei Raumtemperatur gehalten. Anschlie ssend wird das überschüssige Oxydationsmittel durch Zugabe von Methanol zerstört, und das Gemisch wird in Eiswasser gegossen.
Das so ausgefällte 2a Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion wird auf einem Filter gesammelt, mit Wasser gewa schen und getrocknet.
<I>Präparat 21:</I> Za-Methyl-6a fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 2a-Methyl-6a fluor-9a-brom-llss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Durch Umsetzung von 2a-Methyl 6a-fluor-9a-chlor-1 Iss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion in Pyridinlösung mit Methansulfonylchlorid,
Um- setzung des so hergestellten 21-Methansulfonats mit Natriumjodid in Aceton und Reduzieren des 21- Jodids mit wässrigem Natriumthiosulfat erhält man in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben das 2a Methyl-6a-fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion.
<I>Präparat 22:</I> 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion und 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
In der gleichen Weise erhält man durch Um- setzung von 2a-Methyl-6a fluor-9a-chlor-llss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion mit Chromtfoxyd in Essigsäure und Wasser das 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion. In ähnlicher Weise ergibt 2a Methyl-6a fluor-9a-brom-llss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsstoff das 6a Fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,
20-trion. Bei Verwendung von Za-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion als Ausgangsstoff und Umsetzung dieser Verbindung mit Methansulfonylchlorid zum 21-Methansulfonat, Umsetzung des 21 Methansulfonats mit Natriumjodid in Aceton zum 21-Jodid und Umsetzung des 21- Jodids mit Natriumthiosulfat erhält man auch das 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
In ähnlicher Weise führt die Verwendung von 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion als Ausgangsmaterial zum 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Beispiel 12</I> 2-Methyl-6a,9ri-difluor-l 1ss, l7a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm-' Nährmedium aus l 0/a Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!em2 sterilisiert und darauf mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 101 des gleichen Nährmediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbe- hälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt kräftig gerührt (300U./min) und belüftet (0,11 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach einer 20stündigen lnkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl-6a,9a-difluor-l lss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 1/2 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 cm3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt, die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 48 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,4).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit einem Liter Methylenchlorid extrahiert, darauf wer den die Acetonextrakte und die des Nährmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus syntheti schem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 13</I> 2-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,
2Qtrion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus 1% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dieses Medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impf stoff für 101 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser, das zusätzlich 5 cm3 eines Anti- schaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Okta- dekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 cm3 Dimethylformamid gelöstes 2a-Methyl 6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Tempe ratur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert.
Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, worauf die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, getrocknet, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft werden.
Der erhaltene Rückstand wird durch Chromatogra- phie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexan- kohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kri stallines 2-Methyl-6a,9a-difluor-17cc-oxy-1,4-pregnadien- 3,11,20-trion.
In gleicher Weise erhält man durch Verwendung von 2a-Methyl-6a fluor-9a-chlor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion oder 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion anstelle von 2a-Methyl-6a,9a-difluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion das 2-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-1 lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion bzw. das 2-Methyl-6a-fluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. <I>Präparat 23:
</I> 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,l7a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. Ein Gemisch von 200 mg 2a-Methyl-6a-fluor-11 ss,17a-dioxy-4-pregnen- 3,20-dion-21-methansulfonat und 100 mg Kaliumfluorid in 2 cm3 Dimethyl- sulfoxyd wird bis zur Beendigung der Umsetzung auf einem Dampfbad erhitzt.
Darauf wird das Re aktionsgemisch mit 50 cm3 Methylchlorid verdünnt und dreimal mit je 10 cm3 Wasser gewaschen. Nach dem man die Methylenehloridlösung über Natrium sulfat getrocknet hatte, leitete man sie über eine Säule aus 10 g synthetischem Magnesiumsilikat. Die Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen + Aceton ergibt zuerst rohes kristallines 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion.
Diese Verbindung besitzt eine starke harntreibende Wirkung, das heisst sie verursacht Salz- und Wasser verluste, wodurch sie für die Behandlung von Leber schrumpfung, von nephrotischem Syndrom und Eklampsie und Präeklampsie besonders wertvoll ist.
Weitere Eluierung mit Hexankohlenwasserstoffen + Aceton ergibt das 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion, das bei der Umkristallisierung aus Äthylacetat- Hexankohlenwasserstoffen im wesentlichen reines, kristallines 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion ergibt.
<I>Präparat 24:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-l lss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Bei Verwendung von 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-1 lss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat als Ausgangsmaterial im vorstehenden Verfahren er hält man kristallines 2 a-Methyl-6a,21-difluor-9 a-chlor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-l lss-oxy-17a,21- epoxy-4-pregnen-3,
20-dion. Die letztgenannte Verbindung besitzt ähnliche pharmakologische Eigenschaften wie das 2a-Methyl-6a,9a-lifluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dion. Präparat <I>24:</I> 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-l lss,17a-dioxy- 4-pregnen 3,20-dion.
Verwendet man 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom-11ss,17a,21-trioxy- 4-pregnen-3,20-dion-21-methansulfonat als Ausgangsmaterial im vorstehenden Verfahren, so erhält man kristallines 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-brom llss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion und kristallines 2a-Methyl-6a-fluor-9a-brom 11ss-oxy-17a,21- epoxy-4 pregnen-3,20-dion.
Die letztgenannte Verbindung besitzt pharma kologische Eigenschaften, die denen des 2a-Methyl-6a,9a-difluor-1 lss-oxy-17a,21-epoxy- 4-pregnen-3,20-dions ähnlich sind. <I>Präparat 25:</I> 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 4 pregnen-3,20-dion.
Zu einer Lösung von 0,57 g 2a-Methyl 6a,9a-difluor-11ss,17a-dioxy-21-jod- 4-pregnen-3,20-dion in 55 cm3 Acetonitril werden bei einer Temperatur von 50-60 im Dunkeln 0,4 em3 50o/oiger wässriger Silberfluoridlösung gefügt. Die Lösung wird in drei gleichen Teilen in halbstündigem Abstand zugegeben. Diese Temperatur wird insgesamt etwa 11/2 Stunden beibehalten, dann wird sie weitere etwa 21/2 Stunden auf 40-50 herabgesetzt.
Anschliessend wird das Lö- sungsmittel bei 50 herabgesetzt. Anschliessend wird das Lösungsmittel bei 50 unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird dreimal mit je 50 cm3 Aceton versetzt.
Das in der Acetonlösung enthaltene Produkt wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristalli siert und ergibt kristallines 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-11 ss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion. <I>Präparat 26:</I> 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
Aus 0,5 g 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-llss,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion, 0,15 g Chromtrioxyd, 10 cm3 Eisessigsäure und I/2 em3 Wasser wird eine Lösung hergestellt. Dieses Gemisch wird bis zur Beendigung der Umsetzung gerührt und bei Raumtemperatur gehalten. Darauf wird das überschüssige Oxydationsmittel durch Zu gabe von Methanol zerstört und das Gemisch in Eis wasser gegossen.
Das. erhaltene Fällprodukt wird auf einem Filter gesammelt, aus Äthylacetat umkristalli siert und ergibt kristallines 2a Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion.
<I>Präparat 27:</I> 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion, 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion und 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. In der in Präparat 23 gezeigten Weise erhält man durch Umsetzung von 2a Methyl 6a,9a-difluor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-methansulfonat, 2a-Methyl-6a-fluor-9a-chlor-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,
20-trion-2l-methansulfonat und 2a-Methyl-6a fluor-9a-brom-17a,21-dioxy- 4-pregnen-3,11,20-trion-21-methansulfonat mit Kaliumfluorid in Dimethylsulfoxyd das 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion, 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion bzw.
das 2a Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion. <I>Beispiel 14</I> 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-l Iss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. Fünf 250-em3 Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus <B>1</B> % Glukose, 2 % Maisquellwasser (60% Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!cm2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit werden 500 cm3 als Impfstoff für 10 1 des gleichen Glukose-Mais- quellwasser-Mediums, das zusätzlich 5 cm3 eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält, verwendet. Der Gärbehälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 Luft/min/10 1 Gärmedium).
Nach 20stündiger Inku bation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, werden 1 g 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-11t3,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion und 0,5 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 16 em3 Dimethylformamid gelöst, zugefügt. Die Inkubation wird bei gleicher Temperatur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (endgültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 cm3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der erhaltene Rückstand wird zur Reinigung über einer Säule aus synthetischem wasser freiem Magnesiumsilikat chromatographiert, aus Aceton - Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion. In ähnlicher Weise erhält man bei Verwendung von 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-11/3,17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-11/3,
17a- dioxy-4-pregnen-3,20-dion anstelle von 2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-1 lss,17a-dioxy- 4-pregnen-3,20-dion das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion bzw.
das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-1 lss,17a-dioxy- 1,4.-pregnadien-3,20-dion. <I>Beispiel 15</I> 2-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion Fünf 250-cm3-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 cm3 Medium aus 111/o Glukose, 2% Maisquellwasser (60%. Feststoffe)
und Leitungswasser werden auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt. Dieses Nähr medium wird 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg!em2 sterilisiert und mit einer ein bis zwei Tage alten vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyerkolben werden darauf drei Tage bei Raumtemperatur (etwa 26-28 ) geschüttelt.
Nach Ablauf dieser Zeit wer den 500 cm3 Impfstoff für 101 des gleichen Glukose Maisquellwasser-Nährmediums verwendet, das zu- sätzlich 5 cms eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol) enthält. Der Gär- behälter wird in ein Wasserbad von 28 gestellt, sein Inhalt wird kräftig gerührt (300 U./min) und belüftet (0,1 1 1 Medium).
Nach 20stündiger Inkubation, wenn sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g in 16 em3 Dimethylformamid gelöstes.
2a-Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy-4-pregnen- 3,11,20-trion zugefügt, die Inkubation wird bei gleicher Tempera tur (28 ) und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt (end gültiger pH-Wert 8,3).
Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 em3 Aceton extrahiert. Das Gärmedium wird dreimal mit je 1 1 Methylenchlorid extrahiert, darauf werden die Acetonextrakte und die des Gärmediums vereinigt, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der er haltene Rückstand wird durch Chromatographie über eine Säule aus synthetischem wasserfreiem Magne- siumsilikat gereinigt, aus Aceton-Hexankohlenwasser- stoffen umkristallisiert und ergibt kristallines 2 Methyl-6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion. In der gleichen Weise erhält man bei Verwen dung von 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion oder 2a-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,
20-trion anstelle von 2a-Methyl 6a,9a,21-trifluor-17a-oxy- 4-pregnen-3,11,20-trion das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion bzw. das 2-Methyl-6a,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion.
<I>Beispiel 16</I> 6ss-Epimere Bei Verwendung der 6ss-Epimeren als Ausgangs stoffe in den vorhergehenden Beispielen erhält man unter Einhaltung fast neutraler Reaktionsbedingun gen die entsprechenden 2-Methyl-6ss-fluorprodukte, wie 2-Methyl-6ss,9a,21-trifluor-l lss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion, 2-Methyl 6ss,21-difluor-9a-chlor-11ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion, 2-Methyl-6ss,21-difluor-9a-brom-11ss,17a-dioxy- 1,4-pregnadien-3,20-dion,
2-Methyl-6ss,9a,21-trifluor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion, 2-Methyl-6ss,21-difluor-9a-chlor-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion und 2-Methyl 6ss,21-difluor-9a-brom-17a-oxy- 1,4-pregnadien-3,11,20-trion, die aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden kön nen.
Die so erhaltenen 6ss Epimeren können durch Behandlung mit Säure oder Base in einem organi schen Lösungsmittel in die 6a-Epimeren übergeführt werden.
Die 2a-Methyl-6ss fluor-9a-halogen-l lss-oxy- 17a,21-epoxy-4-pregnen-3,20-dione besitzen im allgemeinen die gleichen Wirksamkeiten wie die entsprechenden 6a Fluorverbindungen.