Verfahren zur Herstellung von Toxoiden aus bakteriellen Toxinen
Für die Toxoidifizierung von bakteriellen Toxinen ist bis jetzt gewöhnlich Formalin verwendet worden.
Formalin weist jedoch selbst eine beträchtliche Toxizität auf und kann dem menschlichen Körper deshalb nicht immer zugemutet werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der neuen Entdeckung, dass, wenn man Glukuronolacton, Glukuronsäure oder ein Salz der letzteren auf ein bakterielles Toxin einwirken lässt, das Toxin ungiftig gemacht wird, wobei die Antigenität der Bakterien unbeeinflusst bleibt. Die gemäss der vorliegenden Erfindung verwendeten Substanzen, nämlich Glukuronolacton, Glukuronsäure und Salze der letzteren sind Substanzen, die im wesentlichen im lebenden Gewebe vorkommen und an sich nicht toxisch sind.
Das gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellte Toxoid kann deshalb als Medizin verwendet werden.
Gegenstand dieses Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung von Toxoiden aus bakteriellen Toxinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man bakterielles Toxin mit Glukuronolacton, Glukuronsäure oder mit einem Salz der letzteren vermischt und die Mischung stehen lässt. Glukuronolacton, Glukuronsäure oder ein Salz der letzteren kann als Feststoff oder in Form einer Lösung einem Kulturfiltrat zugegeben werden, das das bakterielle Toxin enthält. Wenn das pH der Mischung dann nicht einen Wert zwischen 4 und 10 einschliesslich aufweist, ist es empfehlenswert, sie auf einen solchen pH-Wert einzustellen. Diese Mischung kann bei niederer Temperatur oder bei Raumtemperatur während mehreren Tagen oder Wochen stehen gelassen oder auf eine Temperatur unterhalb 700 C erwärmt werden.
Danach wird die Mischung vorzugsweise während mehreren Tagen stehen gelassen, so dass das Glukuronolacton, die Glukuronsäure oder ein Salz der letzteren einwirken und das Toxin ungiftig machen können, wobei das Toxoid entsteht.
Es ist besonders vorteilhaft als Salz der Glukuronsäure Natriumglukuronat zu verwenden. Die Be- ziehung zwischen der Zeit und der Temperatur für das Stehenlassen der Mischung ist dermassen, dass je höher die Temperatur desto kürzer ist die Zeit und je niedriger die Temperatur desto länger ist die Zeit.
Beispiele des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung und die Resultate von Toxoidtesten an Tieren und in vitro sind im folgenden mit bezug auf die beiliegende Zeichnung beschrieben, wobei :
Fig. 1 ein Diagramm darstellt, welches den Einfluss von Glukuronsäure auf Hautteste von Diphtherie zeigt, und
Fig. 2 ein weiteres ähnliches Diagramm darstellt, welches den Einfluss von Glukuronsäure in Hauttesten von Diphtherie zeigt.
Beispiel 1 a) Ein Volumteil rohes Diphtherietoxin (PTD-1 of National Institute of Health, Japan) und ein Volumteil einer wässerigen Lösung von 250 mg Na triumglukuronat/cm3 werden miteinander vermischt.
Die Mischung wird bei 37 C stehen gelassen und dann als Stammlösung verwendet. Sie wird mehrfach mit S0rensen's Gelatineboraxpuffer verdünnt und zwar ungefähr jede Woche. 0,1 cm3 der Lösung wird einem männlichen Kaninchen, das ungefähr 3 kg wiegt, in die Rückenhaut injiziert. Es erleidet danach einen Kollaps und stirbt am dritten Tage nach der Injektion. Es wird ein eröteter Zustand festgestellt. Für Vergleichszwecke wird andererseits ein Volumteil rohes Diphtherietoxin (PTD-1) und ein Volumteil einer wässerigen Lösung von 200 mg Glukose gemäss japanischer Pharmakopoe/cm3 miteinander vermischt.
Die Mischung wird stehen gelassen. Sie wird als Stammlösung verwendet und dieselbe Operation wird für einen Vergleich durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
In Fig. 1 ist A jene Kurve, die durch Aufzeichnen derjenigen Werte entsteht, wie sie beim Zusatz von wässeriger Natriumglukuronatlösung erhalten werden und B ist die entsprechende Kurve für wässerige Glukoselösung. b) 1 % und 10 % Natriumglukuronat werden rohem Diphtherietoxin (59-A of National Institute of Health, Japan) zugegeben. Jede Mischung wird bei 37O C stehen gelassen. Sie wird als Stammlösung verwendet. Sie wird mehrfach mit S0rensen's Gelatineboraxpuffer verdünnt und zwar ungefähr jede Woche.
0,1 cm3 der Lösung werden einem männlichen Kaninchen, das ungefähr 3 kg wiegt, in die Rückenhaut injiziert. Zu Vergleichszwecken wird rohes Diphtherietoxin (59-A) wie es ist und dasselbe mit einem Zusatz von 0,4 % Formalin als Stammlösungen verwendet und es werden damit dieselben Operationen durchgeführt. Die minimalen Grade des Rotwerdens nach den Ergebnissen werden in Fig. 2 gezeigt.
In Fig. 2 ist C die Kurve, die durch Aufzeichnen der Resultate beim Zusatz von 1 % Natriumglukuronat (Pulver) erhalten, D ist die Kurve, die durch Auftragen der Resultate des Zusatzes von 10 % Natriumglukuronat (Pulver) erhalten wird, E ist die Kurve, wie sie durch Aufzeichnen der Resultate aus dem Zusatz von 0,4 % Formalin und D ist die Kurve, wie sie durch Aufzeichnen der Resultate mit Diphtherie allein erhalten wird.
Wie aus den Fig. 1 und 2 hervorgeht, werden in der ersten Woche keine bemerkenswerten Unterschie- de von den Bezugsgrössen festgestellt ; in der zweiten und dritten Woche werden hiervon Differenzen festgestellt und in der vierten Woche wird das Toxin vollkommen ungiftig.
Beispiel 2
1 cm3 Keuchhustentoxin und 1 cm3 einer wässeri- gen Lösung von 250 mg Natriumglukuronat/cm werden miteinander vermischt. Die Mischung wird bei normaler Temperatur stehen gelassen und als Stammlösung verwendet. Gerade nach dem Mischen und am ersten, zweiten und dritten Tag wird sie wie in Tabelle 1 gezeigt mehrfach verdünnt mit SXrensen's Gelatineboraxpuffer. O, 1 cm3 der Lösung werden in die Rückenhaut eines männlichen Meerschweinchens mit einem Gewicht von 250 bis 400 g injiziert. 24 Stunden nach der Injektion werden hypodermatische Blutungen beobachtet.
Andererseits werden zu Vergleichszwecken 1 cm3 Keuchhustentoxin und 1 cm3 einer wässerigen Lösung von 200 mg Glukose gemäss japanischer Pharmakopoe/cm3 miteinander vermischt.
Die Mischung wird stehen gelassen und nachher als Stammlösung verwendet und dieselbe Operation vergleichsweise ausgeführt. Die Resultate sind aus Tabelle 1 ersichtlich.
Tabelle 1
Vielfache der Verdünnung mit SMrensen's Gelatineboraxpuffer
Anzahl der Haltungstage Tier Nr.
1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1#2560
1 + + - - -
0 Tage (gerade nach + + + ¯ ¯ -
Mischung)+ + ¯ - -
2 + + + ¯ -
3 + ¯ - - - ++ + + + ¯ 1 Tag 4 ++ + ¯ - - ++ + + + ¯
5 + + - - - ++ + + + ¯
2 Tage @ @ @
2 tape
6 + + ¯ - - ++ + + + + ¯
7 + + ¯ ¯ - ++ ++ ++ + + +
3 Tage
8 + + ¯ - - ++ ++ + + + +
In Tabelle 1 repräsentieren ++ hypodermati- sche Blutung von mehr als 10 mm, + repräsentiert eine hypodermatische Blutung von 5 bis 10 mm, repräsentieren hypodermatische Blutung von weniger als 5 mm und-repräsentiert keine hypodermatische Blutung. Für jedes Versuchstier zeigen die Zeichen in der oberen Linie die Resultate der Substanz gemäss vorliegender Erfindung und die Zeichen in der unteren Linie zeigen die Resultate der Bezugssubstanz.
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, kann gerade nach dem Mischvorgang kein erkennbarer Unterschied gegenüber der Bezugssubstanz festgestellt werden, aber besonders am dritten Tag ist ein bestimmt erkennbarer Unterschied aufgetreten. In der zweiten Woche ist das Toxin vollkommen untoxisch geworden.
Beispiel 3
1 cm3 Tetanustoxin ist einer fatalen Menge von 150 000 000 und eine wässerige Lösung von 250 mg Natriumglukuronat/cm3 werden miteinader vermischt und die Mischung bei 37O C gehalten. Dies wird als Stammlösung verwendet. Sie wird, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, mit SXrensen's Gelatineboraxpuffer verdünnt und zwar gerade nach der Mischung und am ersten, zweiten, dritten, fünften, siebenten, und 14.
Tage. 0,4 cm3 der Lösung wird in den Unterarm einer Maus injiziert, die ein Gewicht von ungefähr 16 g aufweist. Der Zustand der unter der Tetanustoxinwir kung stehenden Maus wird während einer Woche nach der Injektion beobachtet. Die Resultate sind in Tabelle 2 angegeben :
Tabelle 2
Vielfache der Verdünnung mit SMrensen's Gelatineboraxpuffer Anzahl Tier Nr. der Haltungs-Tage
Stamm 1 : 3 1 : 300 1 : 3X103 1 : 3X104 1 : 1X106 1 :
3X107
0 Tage (gerade nach 1 + + + + + + + Mischung) 2 + + + + +
3 + + + + + +
1 Tag 4 + + + +
2 Tage 5 + + + + + -
6 + + + + + -
7 + + + + - -
3 Tage
8 + + + + - - 9 + + +
5 Tage 10 + + + - - -
11 + + - - - -
7 Tage----------------------------------------------- 7 Tage 12 + + - - - - - 14 Tage 13 - - - - - - 14-------
In Tabelle 1 bedeutet + den Tod der Maus und -stellt des tJberleben der Maus dar.
Aus Tabelle 2 geht hervor, dass das Tetanustoxin vollkommen untoxisch gemacht wird.
Beispiel 4
In derselben Art wie in den vorangegangenen Beispielen werden Staphylokokken mit Toxinproduk tivität in einem Toxin produzierenden Kulturmedium kultiviert. Das kultivierte Produkt wird dann filtriert und dem Filtrat wird eine wässerige Lösung von 250 mg Natriumglukuronat/cm3 zugegeben.
Beim Testen der Hämolysefähigkeit gegen rote Blutkörperchen von Kaninchen und der Toxizität auf eine Maus ist herausgefunden worden, dass die Toxizität der gemischten Lösung nach einer 6tägigen Lagerung bei 370 C komplett verschwunden ist.
Wie in den obigen Beispielen 1 bis 4 gezeigt wird, ist es offensichtlich, dass jedes bakterielle Toxin vollkommen untoxisch gemacht werden kann.
Die Immunität des erhaltenen Toxoids durch Anwendung des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung auf Diphtherietoxin wird nun gezeigt.
Mit einer Stammlösung, hergestellt in derselben Art wie in Beispiel lb werden Ausflockungsteste durchgeführt. Die Resultate werden in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Haltungstage oder Wochen 3 Tage 1 Woche 2 Wochen 3 Wochen 4 Wochen 5 Wochen 6 Wochen
Lf Lf Lf Lf Lf Lf Lf
Kf Kf Kf Kf Kf Kf Kf Diphterietoxin 5650 50 50 44 40 36
13' 13' 11' 12' 12' 14' 14' Diphterietoxin + 1 % 56 30 44 50 40 36 32
Natriumglukuronat 13' 20' 20' 15' 14' 17' 16' (Pulver) Diphterietoxin + 10 % 56 50 44 50 40 36 32
Natriumglukuronat 13' 18' 20' 68' 100' ? 900' (Pulver) Dipherietoxin + 0,4 % 56 50 50 50 44 44 44
Formalin 53' 70 56' 66' 105' 100' 100'
Die Stammlösung, die in derselben Art wie in Beispiel la erhalten worden ist, wird untoxisch gemacht durch Stehenlassen derselben während 4 Wochen bei 370 C. Die Resultate von Schick-Testen und Antitoxin-Einheiten, hergestellt durch Gebrauch desselben, werden in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Schick-Test und Antitoxin-Einheiten (PTD-I)
Schick-Test (Mehrfaches der Verdünnung des Stammes) Nr. Injektionsdosis (Lf) Antitoxin-Einheiten 1α 5α 10α 30α
1 l165X8----L
300
2 16 - - - - 1/100
3 16 10X11----L <
1000 4 * 27 18X18 1OX10--1 <
1000
5 27 - - - - 1/30
6 27 - - - - 1/30
7 27 - - - - 1/30 30
7 27--.-.-JL
30
8 27--.-J
30
9 27--J..
10 * Nr. 4 war unteremährt (Einheiten des Masses der Injektionsdosis und Schick-Test).
Die Stammlösung, hergestellt in der gleichen Art wie bei Beispiel 1 (b) wird durch 6-stündiges Stehenlassen bei 37 C untoxisch gemacht. Die Antitoxin-Einheiten der Lösung, welche den Lf-Wert 8 und 40 haben, sind dann untersucht worden. Die mit Formalin untoxisch gemachte Lösung und die Werte von Lf 8 und 40 werden als Kontrolle verwendet. Die Resultate werden in Tabellen 5- (a) und 5- (b) gezeigt.
Aus den folgenden Versuchen ist ersichtlich, dass es sich bei dem beanspruchten Verfahren um eine chemische Umsetzung handelt :
Versuch 1
125 mg Natriumglukuronat wurden zu 1 cc. Diphtherietoxin zugesetzt. Die Menge der freien Glukuronsäure im Gemisch wurde quantitativ bestimmt (1). im Moment des Vermischens und (2) nachdem das Gemisch während 3 Tagen bei Zimmertemperatur stehen gelassen worden war.
Bestimmung (1) ergab 120mg/cm3
Bestimmung (2) ergab 97 mg/cm3
Diese Resultate zeigen, dass das Natriumglukuronat mit dem Diphtherietoxin reagierte, da nach drei Tagen eindeutig weniger freie Glukuronsäure im Gemisch vorhanden war.
Versuch 2
Einfluss der Dialyse auf mit Natriumglukuronat behandeltes Toxin und auf nichtbehandeltes Toxin.
10 cc. Diphtherietoxin, welches mit Natriumglukuronat nicht toxisch gemacht worden war, wurden der Dialyse in SMrensen's Pufferlösung mit einer Cel lophane -Membran unterworfen. Als Kontrolle wurden 10 cc. nichtbehandeltes Toxin (75 Lf) der Dialyse auf genau dieselbe Art unterworfen. vor Dialyse nach Dialyse Mit Natrium-Volumen 10 cc. 14 cc. flucuronat Lf/cc. 70 45 behandeltes Kf 300 Min. 300 Min.
Toxin DRM/cc. 0 0
Volumen 10 cc. 11 cc.
Nichtbehandeltes Lf/cc. 75 60
Toxin Kf 40 Min. 40 Min.
DRM/cc. 10-8 10-7
Versuch 3
60 cc. mit Natriumglukuronat behandelte Toxinlösung (400 Lf/cc., DRMo/cc.) wurden mit Ammo- niumsulfat (pH 7,0-7,2) ausgesalzt. Selbst in diesem Fall wurde die Toxizität nicht wieder erzielt.
Aussalzen von mit Natriumglukuronat behandeltem Toxin und quantitative Bestimmung der Glukuronsäure
EMI5.1
<tb> 60 <SEP> cc. <SEP> mit <SEP> GNa <SEP> behandeltes <SEP> Toxin <SEP> (400 <SEP> Lf/cc.) <SEP> DRM <SEP> o/cc.
<tb>
<SEP> ) <SEP> 70 <SEP> o/o <SEP> gesättigt <SEP> mit <SEP> (NH4) <SEP> 2SO4
<tb> <SEP> I- <SEP> I
<tb> tJberstehende <SEP> Niederschlag
<tb> Flüssigkeit <SEP> golöst <SEP> in <SEP> SXrensen's <SEP> Puffer <SEP> (pH <SEP> 7,2) <SEP> zu <SEP> 15 <SEP> cc.
<tb>
<SEP> I <SEP> 70 <SEP> /o <SEP> gesattigt <SEP> mit <SEP> (NH4) <SEP> zoo4
<tb> <SEP> F-I
<tb> <SEP> Überstehende <SEP> Niederschlag
<tb> <SEP> Flüssigkeit <SEP> gelöst <SEP> in <SEP> S0rensen's-PuSer <SEP> (pH <SEP> 7,2) <SEP> zu <SEP> 15 <SEP> cc.
<tb>
<SEP> ) <SEP> 70"/o <SEP> gesättigt <SEP> mit <SEP> (NH4) <SEP> 2SO4
<tb> <SEP> Überstehende <SEP> Niederschlag
<tb> <SEP> Flüssigkeit <SEP> gelöst <SEP> in <SEP> S°rensen's-Puffer <SEP> (pH <SEP> 7,2) <SEP> zu <SEP> 15 <SEP> cc.
<tb>
<SEP> ) <SEP> 70"/o <SEP> gesättigt <SEP> mit <SEP> (NH4) <SEP> 2S04
<tb> <SEP> Überstehende <SEP> Niederschlag
<tb> <SEP> Flüssigkeit <SEP> gelöst <SEP> in <SEP> SZrensen's-Puffer <SEP> (pH <SEP> 7,2)
<tb> <SEP> DRM <SEP> o/cc. <SEP> zu <SEP> 30 <SEP> cc... <SEP> (A)
<tb> (600 Lf/cc.
(A) (GNa 36, 21/cc.
(GNa 0, 51/Lf.
Aus den obigen Versuchen 1, 2 und 3 ist klar ersichtlich, dass das Toxin nicht nur durch blosses Vermischen mit Natriumglukuronat nicht toxisch gemacht wird, sondern dass eine chemische Umsetzung der beiden Komponenten stattfindet. Wahrscheinlich wird durch die chemische Umsetzung zwischen dem freien Aminorest des Toxinproteins und dem Aldehydrest der Glukuronsäure N-glukuronid gebildet.
Tabelle 5- (a)
Antitoxin-Einheiten .. Glukuronsäuregruppe Formalingruppe dosis Nr. Antitoxin-Einheiten Nr. Antitoxin-Einheiten
1 1/300 1 1/30
2 1 1
300 30
8
3 1/100 3 1/300
100 300
Lf 4 1/300 4 1/300
5 1 1
100 300
6 1 6 1
1000 1000 300 1 1 300 100 30
8 8 1
300 100
40 9 1 1 9 1
30 10 10 10-L-.i10-L-v Lf 100 30 100 30 nInl
30 30
12 1 12 1 1
100 100 30
Tabelle S- (b)
Antitoxin-Einheiten Injektions- Glukuronsäuregruppe Formalingruppe dosis Nr. Antitoxin-Einheiten Nr. Antitoxin-Einheiten I 1 1 <
1000 1000
2 1 < J
1000 1000 8
3 1 3 1
1000 300 1000
4 1 4 1
1000 1000
Lf
5 1 1 5 1
100 300 1000
6 1 6 1 1 1000 100 300
7 1/30 - 1/100 7 1/30
8 1 8 1 1
30 30 100
40 9 1
100 300 300
Lf--
10 J--J-10
100 300 30 'nI.uI
100 10
Die Immunität aus Diphtherietoxin als Beispiel wird oben gezeigt.
Die gleiche Immunität von anderen Toxinen wie Keuchhustentoxin, Tetanustoxin und Staphylokokkustoxin kann gemäss der vorliegenden Erfindung ebenfalls erzielt werden.