CH444143A - Procédé de préparation du B-carotène - Google Patents
Procédé de préparation du B-carotèneInfo
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Description
Procédé de préparation du P-carotène La présente invention a pour objet un nouveau pro cédé de préparation du (3-carotène par fermentation.
Il est connu d'obtenir du (3-carotène par fermentation submergée de micro-organismes du genre Choanephora ou Blakeslea. Diverses publications ont décrit les condi tions favorisant la production de (3-carotène. Barnett et colt. [Science, 123, 141 (1956)] ont montré que la pro duction du (3-carotène était améliorée par la culture si multanée des formes opposées d'une même espèce.
Cette étude a ensuite été étendue à la culture de formes oppo sées d'espèces différentes [C. Hesseltine - Mycologia, 49, 449 (1957)]. Les milieux de cultures ont également été examinés et il a été montré que l'addition de graines entières ou hydrolysées, d'huiles végétales, d'agents ten- sioactifs, d'antioxydants et d'épaississants augmentait le rendement en (3-carotène. [R. Anderson et coll. - J.
Agr. Food Chem. 6, 543 (1958)] [A. Ciegler et coll. - App. Microb. 7, 94 et 98 (1959)].
Enfin Mackinney et coll. [J. Am. Chem. Soc., 74, 3456 (1952)] ont montré que l'addition de (3-ionone à la culture statique d'un Phycomyces augmentait forte ment la formation du (3-carotène, au détriment d'autres pigments caroténoïdes. Anderson et coll. ont noté le même effet en culture agitée avec des Blakeslea et Choa- nephora (loc. cit.).
On a maintenant trouvé un procédé de préparation du P-carotène par fermentation aérobie d'une culture des formes -f- et - de Blakeslea trispora. Ce procédé est caractérisé en ce que le milieu contient, comme pré curseur, au moins la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone ou un dérivé fonctionnel de cette cétone.
Par dérivés fonctionnels on entend par exemple les produits de condensation de la triméthyl-2,2,6 cyclo- hexanone avec l'ammoniac ou avec une amine tels que l'oxime, l'hydrazone, la semicarbazone, la thiosemicar- bazone ou les imines. Parmi ces dérivés on donne la préférence à la semicarbazone. La triméthyl-2,2,6 cyclohexanone (ou son dérivé)
peut être ajoutée au milieu de culture, en quantité allant de 0,1 à 10 g/litre, au départ ou en cours de fermen tation, en une ou plusieurs fois. De préférence, on em ploie une quantité comprise entre 1 et 3 g/litre et on effectue l'addition d'ordinaire après 1 à 3 jours de culture.
Quels que soient la quantité ajoutée et le mo ment d'addition de la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone ou de son dérivé, il convient de poursuivre la culture pen dant 6 à 10 jours après l'ensemencement pour obtenir la production maximale de (3-carotène. Le milieu de culture peut varier mais contient en règle générale une source de carbone et une source d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance, des antioxydants, des agents tensioactifs et des épaississants.
Comme source de carbone assimilable, on peut uti liser des hydrates de carbone (tels que le glucose, les dextrines, l'amidon), des huiles animales ou végétales (comme l'huile de lard, l'huile de soja, l'huile de graine de coton) ou leurs mélanges. Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées : elles peu vent être des composés chimiques définis ou des sub stances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique telles que caséine, lactalbumine, glu ten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachide, ex traits de levure, distiller s solubles , corn-steep .
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peu vent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux.
Parmi les facteurs de croissance, le plus fréquem ment employé est la vitamine Bl ou thiamine. Parmi les antioxydants on peut citer la N-N'-diphényl paraphé- nylène-diamine, la triméthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro-1,2 quinoléine, l'acide ascorbique ou l'acide sorbique. Les agents tensioactifs sont de préférence du genre non- ionique tels que des dérivés du sorbitol avec des acides gras, ou des produits à base de condensats d'oxyde d'éthylène.
Parmi les épaississants, les plus habituelle ment employés sont l'amidon, la carboxyméthylcellulose, la gélose.
Dans ces milieux la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone et ses dérivés sont en règle générale compatibles avec les substances auxiliaires décrites dans le brevet fran çais No 1344264, c'est-à-dire - avec les amides de formule générale RCONR,Ro (dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone ou un radical aryle ou aralcoyle et R,R., identiques ou diffé- rents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle ayant au plus 4 atomes de carbone.
- ou les dialcoylsulfoxydes dont les radicaux al coyles contiennent au maximum 4 atomes de carbone. Le milieu de culture ainsi préparé est ensuite ense mencé par une culture des formes -I- et - de Blakeslea trispora (NRRL 2456 et 2457). Par NRRL on entend le Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., U.S.A.
Les exemples suivants montrent comment le procédé de l'invention peut être mis en pratique.
<I>Exemple 1</I> Des fioles d'Erlenmeyer de 300 cm3 sont remplies de 50 cm3 d'un milieu de culture dont la composition est la suivante - hydrolysat de graine de maïs . . . 75 g - huile de soja . . . . . . . . . 20 cms - huile de graine de coton . . . . . 20 cm3 - Tween 80 . . . . . . . . 1,2 cm3 - phosphate monopotassique . . . . 0,5 g - carboxyméthylcellulose . . . . . 20 g - chlorhydrate de thiamine. . . . . 0,01 g - eau distillée . . . .
complément à 1000 cm3 Le pH du milieu est ajusté à 6,2 avec de la soude concentrée. Les fioles sont stérilisées pendant 20 minutes à 1200 C. Après refroidissement on ajoute stérilement dans chaque fiole 0,5 cm3 d'une solution stérile de dihydro-1,2 triméthyl-2,2,4 éthoxy-6 quinoléine à 1% dans du pétrole.
Chaque fiole est ensuite ensemencée avec 5 cms d'une culture agitée contenant les deux formes -I- et - de la souche de Blakeslea trispora (NRRL 2456 et NRRL 2457), et âgée de 24 h.
Les fioles sont ensuite placées sur une table à agi tation rotative tournant à 220 t/mn dans une enceinte à 270 C. Après 2 jours d'incubation, les fioles sont partagées en deux lots équivalents.
A chaque fiole du premier lot sont ajoutés stérile- ment 0,5 cm2 de pétrole.
Chaque fiole du second lot reçoit 0,5 cm3 d'une solu tion à 10 % de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone dans du pétrole.
Les cultures sont poursuivies dans les mêmes condi tions de température et d'agitation, pendant 6 jours de plus. Au bout de ce temps, la production de P-carotène est maximale dans toutes les fioles.
Le dosage du P-carotène est effectué comme suit le mycélium est séparé par filtration, lavé par de l'eau, puis séché pendant une nuit sous vide à 35o C. Le mycé lium sec est ensuite extrait par de l'hexane. On sépare le p-carotène des autres caroténoïdes présents par une chromatographie de l'extrait sur alumine. Les fractions d'élution contenant le .-carotène sont réunies et dosées spectrophotométriquement par rapport à un échantillon pur de (3-carotène.
Les productions sont les suivantes
EMI0002.0073
Triméthyl-2,2,6 <SEP> cyclohexanone <SEP> (3-carotène
<tb> g/1 <SEP> de <SEP> milieu <SEP> initial <SEP> mg/1 <SEP> moût
<tb> 0 <SEP> <B><I>105</I></B>
<tb> 1 <SEP> 170 <I>Exemple 2</I> 500 cm3 d'eau contenant 75 g de distillers' solu bles sont portés à l'ébullition durant 15 minutes. Après refroidissement, on ajoute - Amidon de mais . . . . . . . 50 g - Huile de soja . . . . . . . . 30 cm3 - Huile de coton . . . . . . . . 30 #n3 - Tween <B>80 </B> . . . . . . . . 1,2 cm3 - Extrait de levure . . . . . . .
1 g - Phosphate monopotassique . . . 0,5 g - N,N' diphényl paraphénylène dia mine . . . . . . . . . . . 0,1 g - Chlorhydrate de thiamine . . . . 0,01 g On complète le volume à 1000 cm3 par de l'eau distillée.
Le mélange est ajusté à pH 6,0 avec de la soude, réparti en erlenmeyers de 300 cm3 à raison de 50 cm3 par fiole, puis stérilisé pendant 20 minutes à 1200 C. Après refroidissement, on ajoute stérilement dans cha que erlenmeyer 0,5 cmg de pétrole.
L'ensemencement avec une culture mixte des formes -I- et - de Blakesla trispora et le développement des cultures ensemencées s'effectuent dans les conditions décrites dans l'exemple 1.
Après 48 heures de développement, les cultures sont réparties en 4 séries et chaque erlenmeyer reçoit stérile- ment les additions suivantes lére série: pétrole 0,5 cm3.
2éme série : 50 mg de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone en solution dans 0,5 cm3 de pétrole.
Sème série : 100 mg de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone en solution dans 0,5 cm3 de pétrole.
4ème série : 150 mg de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone en solution dans 0,5 cm3 de pétrole.
Les cultures sont encore poursuivies pendant 8 jours comme dans l'exemple 1.
Les productions en .P-carotène déterminées comme dans l'exemple 1 sont les suivantes
EMI0002.0117
Triméthyl-2,2,6 <SEP> cyclohexanone <SEP> P-carotène
<tb> g/1 <SEP> de <SEP> milieu <SEP> initial <SEP> mg/l <SEP> moût
<tb> 0 <SEP> 470
<tb> 1 <SEP> 690
<tb> 2 <SEP> 695
<tb> 3 <SEP> 740 <I>Exemple 3</I> 500 cm3 d'eau contenant 75 g de distillers' solu bles sont portés à l'ébullition durant 15 minutes.
Après refroidissement on ajoute - Amidon de maïs . . . . . . . . 50 g - Huile de soja . . . . . . . . . . 30 cm3 - Huile de coton . . . . . . . . . 30 cm3 - Tween 80 . . . . . . . . . . 5 cm3 - Extrait de levure . . . . . . . . 1 g - Phosphate monopotassique . . . . . 0,5 g - Diméthylformamide . . . . . . . 2 cm3 - Sulfate de manganèse monohydraté . . 0,1 g - Chlorhydrate de thiamine . . . . . 0,01 g On complète le volume à 1000 cm3 par de l'eau distillée.
Le mélange est ajusté à pH 6,0 avec de la soude et réparti en fioles d'Erlenmeyer de 300 cms à raison de 50 cm3 par fiole. Après stérilisation pendant 20 minutes à 120 C et refroidissement on ajoute stéri- lement dans chaque fiole 0,5 cm3 d'une solution de tri- méthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro-1,2 quinoléine à 1 % dans du pétrole.
L'ensemencement avec une culture mixte des for mes -f- et- de Blakeslea trispora et le développement des cultures ensemencées s'effectuent dans les condi tions indiquées dans l'exemple 1.
Après 48 heures de développement les cultures sont réparties en 3 séries et chaque Erlenmeyer reçoit stéri- lement les additions suivantes lgre série: 0,5 cm3 de pétrole.
2éme série : 50 mg de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone en solution dans 0,5 cm3 de pétrole. 3é-0 série : 60 mg de semicarbazone de la triméthyl- 2,2,6 cyclohexanone sous forme d'une suspension à 7,% dans l'eau additionnée de 1 1% de (t Tween<B>80 </B> et 0,5 cm3 de pétrole.
Les cultures sont poursuivies après ces additions pen dant 6 jours de plus dans les mêmes conditions de tem pérature et d'agitation. Au bout de ce temps la produc tion de P-carotène est maximale dans toutes les fioles.
Les productions en 0-carotène, déterminées comme dans l'exemple 1, sont les suivantes
EMI0003.0047
Production
<tb> Addition <SEP> à <SEP> 48 <SEP> h <SEP> de <SEP> fi-carotène
<tb> en <SEP> mg/litre <SEP> de <SEP> moût
<tb> Pétrole <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 820
<tb> Triméthyl-2,2,6 <SEP> cyclohexa none <SEP> -E- <SEP> pétrole <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 940
<tb> Semicarbazone <SEP> de <SEP> la <SEP> tri méthyl-2,2,6 <SEP> cyclohexa none <SEP> -f- <SEP> pétrole <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1110 <I>Exemple 4</I> Dans un fermenteur de 30 litres on charge - Distillers' solubles . . 1500 g - Eau . . . . . . .
11 litres Le mélange est agité et chauffé à 950 C pendant 10 minutes. Après refroidissement on ajuste à pH 6,4 avec 70 cm3 de soude 10N et on complète le milieu avec les matières premières suivantes - Amidon . . . . . . . . . . . 750 g - Huile de soja . . . . . . . . . . 450 cm3 - Huile de coton . . . . . . . . . 450 crn3 - < c Tween 80 . . . . . . . . . . 75 cm3 - Extrait de levure . . . . . . . . 15 g - Phosphate monopotassique . . . . .
7,5 g - Sulfate de manganèse monohydraté . . 1,5 g - Triméthyl - 2, 2, 4 éthoxy - 6 dihydro -1, 2 quinoléine . . . . . . . . . . . 1,5 cm3 - Solution de chlorhydrate de thiamine à 0,3 g/litre . . . . . . . . . . . 250 cm3 Le volume est ajusté à 15 litres avec de l'eau, le pH du mélange est à 6,40. Le milieu est stérilisé pendant 50 minutes à 1220 C avec injection de vapeur. Après refroidissement le pH est à 5,85 et le volume est de 14,2 litres.
On ajoute alors stérilement 30 cm3 de diméthylfor- mamide et<B>150</B> cm8 de pétrole. Le fermenteur est en suite ensemencé avec deux cultures inoculum en fer menteurs âgées de 48 heures de la souche Blakeslea trispora à raison de 750 cm3 de culture de la forme -I- (NRRL 2456) et de 750 cm3 de culture de la forme - (NRRL 2457).
La culture est développée à 26-27 C avec agitation par turbine à 400 t/mn et aération avec un débit de 1,2 m3/h.
Après 48 heures de développement on ajoute stérile- ment 15 cm3 de triméthyl-2,2,6 cyclohexanone en solu tion dans 150 cm3 de pétrole. Après cette addition la culture est poursuivie dans les mêmes conditions d'aéra tion, d'agitation et de température pendant 5 jours de plus.
La production en p-carotène, dosé comme indiqué dans l'exemple 1, atteint alors 580 mg/1.
Dans un autre fermenteur de 30 litres on prépare de la même façon le milieu décrit ci-dessus. Après sté rilisation et refroidissement on ajoute également 30 cm3 de diméthylformamide et 150 cm3 de pétrole.
Le milieu est ensuite ensemencé dans les conditions décrites ci- dessus avec les mêmes cultures inoculums. Après 48 heures de développement on ajoute stérilement 150 cm3 de pétrole et 21 g de semicarbazone de la triméthyl-2, 2,
6 cyclohexanone sous forme d'une suspension à 7 0/0 dans l'eau additionnée de 1% de Tween 80 . Après ces additions la culture est poursuivie dans les mêmes conditions d'aération, d'agitation et de température pen dant 5 jours de plus.
La production en (3-carotène est alors de 765 mg/1.
Claims (1)
- REVENDICATION Procédé de préparation du >carotène par fermenta tion aérobie d'une culture des formes -I- et - de Blakes- lea trispora, caractérisé en ce que le milieu contient, comme précurseur, au moins la triméthyl-2,2,6 cyclo- hexanone ou un dérivé fonctionel de cette cétone. SOUS-REVENDICATIONS 1.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est ajouté entre le second et le qua trième jour de culture, à une dose comprise entre 1 et 3 g/litre. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est l'oxime de ladite cétone. 3. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est l'hydrazone de ladite cétone. 4.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est la semicarbazone de ladite cétone. 5. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est la thiosemicarbazone de ladite cétone. 6. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le précurseur est une imine de ladite cétone.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR888857A FR1325656A (fr) | 1962-02-22 | 1962-02-22 | Nouveau procédé de production de beta-carotène |
| FR913913 | 1962-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH444143A true CH444143A (fr) | 1967-09-30 |
Family
ID=26194503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH230063A CH444143A (fr) | 1962-02-22 | 1963-02-22 | Procédé de préparation du B-carotène |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CH (1) | CH444143A (fr) |
-
1963
- 1963-02-22 CH CH230063A patent/CH444143A/fr unknown
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