CH447150A - Procédé de production de B-carotène - Google Patents
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Description
Procédé de production de @-carotène La présente invention concerne un perfectionnement au procédé de- production de .p-carotène par fermentation.
Il est connu d'obtenir du (3-carotène par fermenta tion submergée de micro-organismes du genre Choane- phora ou Blakeslea. Diverses publications ont décrit les conditions favorisant la production de P-carotène. Bar- net et colt. [Science,<I>123,</I> 141 (l956)] ont montré que la production du (3-carotène était améliorée par la cul ture simultanée des formes opposées d'une même espèce.
Cette étude a ensuite été étendue à la culture de formes opposées d'espèces différentes [C. Hessel- tine - Mycologia, 49, 449 (l957)]. Les milieux de cul tures ont également été examinés et il a été montré que l'addition de graines entières ou hydrolysées, d'huiles végétales, d'agents tensio-,actifs, d'antioxydants. et d'épaississants augmentait le rendement en [3-carotène [R.Anderson et coll. - J. Agr. Food. Chem. 6, 543 (l958)] [A.
Ciegler et coll. - App. Microb. 7, 94 et 98 (1959)].
Enfin MacKinney et coll. [J. Am. Chem. Soc. 74, 3456 (1952)] avaient montré que l'addition de P-ionone à la culture statique d'un P'hycomyces augmentait forte ment la formation du 5-carotène, au détriment d'autres pigments caroténoïdes. Anderson et coll. ont noté le même effet .en culture agitée avec des Blakesla et Choanephora (lo.c. cit.)
. Ce promoteur peut être rem placé par d'autres produits tels que la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone (brevet français No 1325656 déposé le 22 février 1962) ou le triméthyl-2,6,6 acétyl-1 cyclo- hexène (brevet français No 1377523 déposé le 25 sep tembre 1963).
Il a été maintenant trouvé que la présence dans les milieux de culture a) d'une sonicotinoylhydrazine de formule générale
EMI0001.0053
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant de 1 à 8 atomes de carbone, aralcoyle contenant de 7 à 12 atomes de carbone, phé- ny1sulfonyle ou le radical -C(=NH)NH-C(=NH)NH,, b) ou d'une isonicotinoyl'hydrazone de formule géné rale
EMI0001.0059
dans laquelle R' représente un radical dialcoylamino ou un hétérocycle azoté ou oxygéné, mononucléaire à 5 ou 6 chaînons,
entraîne une augmentation notable du taux de (1-carotène.
Les isonicotinoylhydrazines et isonicotinoylhydra- zones peuvent être ajoutées au milieu de culture en quantités allant de 0,1 à 10 g/1, au départ ou en cours de fermentation, en une ou plusieurs fois. De préfé rence on emploie une quantité comprise entre 0,2 et 2 g/1 et on effectue l'addition en début de culture.
Quels que soient la quantité ajoutée et le moment d'ad dition de ce produit, il convient de poursuivre la cul ture pendant 6 à 15 jours après l'ensemencement pour obtenir la production maximale de (3-carotène. Le mi lieu de culture peut varier et peut contenir une source de carbone et une source d'azote assimilable, des élé ments, minéraux et éventuellement des facteurs de crois sance, des antioxydants, des agents tensioactifs, des épaississants et des promoteurs.
Comme source de carbone assimilable, on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, les dextrines, l'amidon ou des huiles animales ou végétales comme l'huile de lard ou l'huile de soja ou de graine de coton. Les sources convenables d'azote assimilable sont .extrêmement variées : elles peuvent être des subs tances chimiques ou des substances complexes conte nant principalement l'azote sous forme protidique telles que caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachide, extraits de levure, distillers' solubles, corn steep.
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peu vent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux.
Parmi les facteurs de croissance les plus fréquem ment employés est la vitamine Bl ou thiamine. Parmi les antioxydants on peut citer la N,N'-.diphényl para- phénylènediamine, la triméthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro- 1,1 quinoléine, l'acide ascorbique ou l'acide sorbique.,Les agents tensioactifs sont de préférence du genre non ionique tels que des dérivés du sorbitol avec des acides gras, ou des produits à base de condensats d'oxyde d'éthylène.
Parmi les épaississants les plus habituelle ment employés sont l'amidon, la carboxyméthylcellu- lose,la gélose.
Comme promoteur on peut utiliser la (3-ionone, la triméthyl-2,2,6 cyclohexanone ou le triméthyl-2,6,6 acétyl-1 cyclohexène.
Le milieu de culture ainsi préparé est ensuite-:ense- mencé par une culture des formes -f- et - de Blakes- lea trispora (NRRL 2456 et 2457).
L'augmentation du taux de production de [3-caro- tène en présence d'isonicotinoylhydrazine ou de l'un de ses dérivés de formule I ou II est plus ou moins impor tante suivant les conditions opératoires: elle se retrouve cependant, que l'on ajoute ou non des antioxydants ou des promoteurs aux milieux de culture.
Les exemples suivants montrent comment l'inven tion peut être mise en pratique <I>Exemple l:</I> On prépare un milieu de culture A comme suit 500 cm," d'eau contenant 75 g de distillera' solubles sont portés à l'ébullition durant 15 mn. Après refroi dissement on ajoute Amidon<B>........ ..</B> 70 g Huile de soja<B>------- ..... .....
. .......</B> 40 cm3 Huile de coton<B>--------- -</B> 40 cm3 Extrait de levure ........... ......... ... 1 g Phosphate monopotassique . . .. 0,5 g Sulfate de manganèse monohydraté .. ... 0,1 g Chlorhydrate de thiamine . .. 0,01 g On complète le volume à 1000 cm3 avec de l'eau distillée.
Le mélange est ajouté à pH 6,3 avec quelques gouttes de soude 10 N, réparti en fioles d'Erlenmeyer de 300 cm-' à raison de 50 cm-3 par fiole, puis stérilisé pendant 20 mn à 120 . Après stérilisation et refroidis- sement, on ajoute stérilement dans chaque fiole 1 cm3 d'une solution stérile de triméthyl-2,2,4 éthoxy-6 di- hydro-1,2 quinoléine à 2,5 % dans du pétrole.
On prépare également des milieux B et C avec les mêmes éléments et de la même façon que le milieu A mais en ajoutant dans chaque fiole, après stérilisa tion du milieu, en plus de l'antioxydant en solution dans le pétrole, les quantités ci-dessous indiquées d'une solution stérile d'isonicotinoylhydrazine à 5 % dans de l'eau Milieu B : 0,1 cm3 Milieu C :
1 cm3 Chaque fiole des milieux A, B et C est ensuite ense mencée avec 5 cm3 d'une culture agitée contenant les deux formes -I-- et - de la souche de Blakeslea trispo- ra (NRRL 2456 et NRRL 2457) et âgée de 48 heures. Les fioles sont ensuite placées sur une table à agitation rotative tournant à 220 t/mn dans une étuve à 260 C.
Après 10 jours de culture dans ces conditions d'agita tion et de température, la production de (3-caroténe est maximale dans toutes les fioles.
Le dosage du [3-carotène est effectué comme suit le mycélium est séparé par filtration, lavé par de l'eau puis séché une nuit à 350 C sous vide. Le mycélium sec est ensuite extrait par de l'hexane. On sépare le (0- carotène des autres caroténoïdes présents par une chro matographie de l'extrait sur alumine.
Les fractions d'élution contenant le (3-carotène sont réunies et dosées spectrophotométriquement par rapport à un échantillon pur de (3-carotène.
Les résultats suivants ont été obtenus Milieu A (sans adjuvant): 980 mg/1 de [3-carotène Milieu B (avec 0,1 g/f d'isonicotinoylhydrazine): <B>1630</B> mg/1 de P-carotène Milieu C (avec 1 g/1 d'isonicotinoylhydrazine): 1950 mg/1 de (3-carotène <I>Exemple 2</I> On prépare et ensemence les milieux de culture A et C comme il a été dit à l'exemple 1.
Après ens,e- mencement et incubation pendant 48 heures dans les conditions décrites à l'exemple 1, on ajoute stérile ment dans chaque fiole de culture une solution de 50 mg de (3-i,onone dans 0,5 cm3 de pétrole. Les cultures sont alors poursuivies puis analysées dans les conditions dé crites à l'exemple 1.
Les résultats suivants ont été obtenus Milieu A (sans adjuvant): 1050 mg/1 de 0-carotène Milieu C (avec 1 g/1 d'isonicatinoylhydrazine) : 2050 mg/1 de (3-carotène <I>Exemple 3:</I> On prépare le milieu A comme il a été dit à l'exem ple 1.
On prépare également des milieux D et F avec les mêmes éléments et de la même façon que le milieu A mais en ajoutant dans chaque fiole, après stérilisation du milieu, en plus de l'antioxydant en solution dans le pétrole, les quantités. ci-dessous indiquées d'une so lution stérile d'isonicotinoyl-1 isopropyl-2 hydrazine à 5 % dans de l'eau.
Milieu D : 0,1 cm3 Milieu F : 1 cm3 Chaque fiole des milieux A, D et F est ensuite ense mencée avec 5 cm3 d'une culture agitée contenant les deux formes -f- et - de la souche de Blakeslea tris- pora (NRRL 2456 et NRRL 2457) et âgée de 48 heures. Les fioles sont ensuite placées sur une table à agitation rotative tournant à 220 t/mn dans une étuve à 260 C.
Après 12 jours de culture dans ces conditions d'agitation et de température, la production de (3-caro- tène est maximale dans toutle les fioles.
Le dosage du 0-carotène est effectué comme il a été dit à l'exemple 1.
Les résultats suivants ont été obtenus Milieu A (sans adjuvant): 1065 mg/1 de P-carotène Milieu D (avec 0,1 g/1 d'isonicotinoyl-1 isopropyl-2 hydrazine) : 1565 mg/1 de (3-carotène Milieu F (avec 1 g/1 d'isonicotinoyl-1 isopropyl-2 hydrazine) :
2440 mg/1 de (3-carotène <I>Exemple 4:</I> On prépare et ensemence les milieux de culture A et F comme il a été dit à l'exemple 3. Après ensemen cement et incubation pendant 48 heures dans les condi tions décrites aux exemples 1 et 3, on ajoute stérile- ment dans chaque fiole de culture du milieu A une solution de 50 mg de .ü-ionone dans 0,5 cm3 de pétrole, et dans chaque fiole du milieu F :
soit 50 mg de (3- ionone en solution dans 0,5 cm3 de pétrole soit 50 mg de triméthyl-2,6,6 acétyl-1 cyclohexène (TMACH) en solution dans 0,5 cm3 de pétrole. Les cultures sont en core poursuivies pendant 10 jours puis analysées dans les conditions décrites à l'exemple 1.
Les résultats suivants ont été obtenus
EMI0003.0015
Milieux <SEP> Production <SEP> de <SEP> (1-carotène <SEP> en: <SEP> mg/ <SEP> 1
<tb> Avec <SEP> Avec
<tb> Référence <SEP> Additions <SEP> ionone <SEP> 1 <SEP> g/1 <SEP> TMACH <SEP> 1 <SEP> g/1
<tb> A <SEP> - <SEP> 1905 <SEP> F <SEP> isomcotinoyl@l <SEP> 3560 <SEP> 3770
<tb> isopropyl-2
<tb> hydrazine <SEP> 1 <SEP> g/1 <I>Exemple 5:
</I> On prépare d'autres milieux de la même manière que le milieu F de l'exemple 3 mais en remplaçant l'addition d'isonicotinoyl@l isopropyl-2 hydrazine par une addition d'autres dérivés N substitués de l'isonico- tinoyl hydrazine en solution dans l'eau aux doses indi quées ci-dessous.
Ces nouveaux milieux sont ensemencés en même temps qu'un milieu de référence A, décrit ci-dessus, et un milieu F et les cultures sont développées dans les conditions décrites à l'exemple 1.
Après 12 jours de culture, le (3-carotène est dosé comme il est dit à l'exemple 1. Les résultats sont con signés dans le tableau ci-dessous. Par convention on a affecté le coefficient 100 à la production de [3-carotène du milieu A témoin. Les coefficients affectés aux mi lieux contenant des dérivés de l'isonicotinoyl hydrazine suivant l'invention donnent donc l'augmentation de la production de (3-carotène par rapport au milieu témoin.
EMI0003.0035
Quantité <SEP> ajoutée <SEP> Production <SEP> de
<tb> Dérivé <SEP> de <SEP> l'isonicotinoylhydrazine <SEP> utilisé <SEP> en <SEP> g/1 <SEP> p-carotène
<tb> Néant <SEP> (milieu <SEP> A) <SEP> <B>.......... <SEP> ..... <SEP> ...........................................</B> <SEP> - <SEP> <B>100</B>
<tb> Isomcotinoyl-1 <SEP> isopropyl-2 <SEP> hydrazine
<tb> [formule <SEP> (I), <SEP> R <SEP> = <SEP> -CH(CH3)2] <SEP> (milieu <SEP> F) <SEP> ..... <SEP> 1 <SEP> 229
<tb> Isonicotinoylamino-1 <SEP> bigua-nide <SEP> [formule <SEP> (I),
<tb> R <SEP> = <SEP> -C(=NH)NH-C(=NH)NH2] <SEP> .................. <SEP> 1 <SEP> 262
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> diméthylamino-méthylidène-2
<tb> hydrazone <SEP> [formule <SEP> (II), <SEP> R' <SEP> = <SEP> -N(CH3)2] <SEP> ...... <SEP> 1 <SEP> 124 <I>Exemple 6:
</I> Comme à l'exemple 5, on prépare des milieux de culture de la même manière que le milieu F de l'exem- ple 3 mais en remplçant l'isonicotinoyl-1 isopropyl-2 hydrazine par d'autres dérivés de l'isonicotinoyl hydra- zine de formule I ou 11, en solution dans l'eau aux doses indiquées ci-dessous.
Les nouveaux milieux sont ensemencés en même temps qu'un milieu de référence A décrit à l'exemple 1 et qu'un milieu F décrit à l'exemple 3, et les cultures sont développées dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Après deux jours d'incubation, les fioles de chaque in flieu reçoivent l'addition d'une solution de 50 mg de p-ionone dans 0,5 cm3 de pétrole.
Les cultures sont ensuite poursuivies pendant encore 10 jours. Le (3-ca- rotène est alors dosé comme il est dit à l'exemple 1. Les résultats sont consignés dans le tableau ci-dessous en adoptant la même convention qu'à l'exemple 5 soit af fecter le coefficient 100 à la production de P-carotène du milieu témoin A ;les coefficients des autres milieux correspondant alors à l'augmentation de production de (3-carotène par rapport à ce milieu témoin.
EMI0003.0069
Quantité <SEP> ajoutée <SEP> Production <SEP> de
<tb> Dérivé <SEP> de <SEP> l'isonicotinoylhydrazine <SEP> utilisé <SEP> en <SEP> g/1 <SEP> p-carotène
<tb> Néant <SEP> (milieu <SEP> A) <SEP> ..... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ........... <SEP> .... <SEP> <B>-----------------------</B> <SEP> . <SEP> ..... <SEP> - <SEP> 100
<tb> Isonicatinoyl-1 <SEP> isopropyl-2 <SEP> hydrazine
<tb> [formule <SEP> (I), <SEP> R <SEP> = <SEP> -CH(CH3)2] <SEP> (milieu <SEP> F) <SEP> . <SEP> ....... <SEP> ..... <SEP> 1 <SEP> 187
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> heptyl-2 <SEP> hydrazine
<tb> [formule <SEP> (I), <SEP> R <SEP> = <SEP> -(CH2)3CH3] <SEP> ................... <SEP> ..... <SEP> .. <SEP> .......
<SEP> 0,5 <SEP> 177
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> benzyl-2 <SEP> hydrazine
<tb> [formule <SEP> (I), <SEP> R <SEP> = <SEP> _CHesPh] <SEP> <B>........................</B> <SEP> 0,5 <SEP> 169
<tb> Isomcotinoyl-1 <SEP> benzènesulfonyl-2 <SEP> hydrazine
<tb> [formule <SEP> (1), <SEP> R <SEP> = <SEP> -S02CCH5] <SEP> ................ <SEP> <B>........ <SEP> -----</B> <SEP> 1 <SEP> 164
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> biguanide
<tb> [formule <SEP> (I), <SEP> R-C(=NH)NH-C(=NH)NH2] <SEP> <B>- <SEP> ----------</B> <SEP> 1 <SEP> 175
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> cUméthylaminométhylidène-2 <SEP> hydrazone
<tb> [formule <SEP> (II) <SEP> R' <SEP> = <SEP> -N(CH3)2] <SEP> .. <SEP> <B>.......................................</B> <SEP> 0,75 <SEP> 134
EMI0004.0001
Quantité <SEP> ajoutée <SEP> Production.
<SEP> de
<tb> Dérivé <SEP> de <SEP> l'isonicotinoylhydnazue <SEP> utilisé <SEP> en <SEP> g/1 <SEP> p-carotène
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> (pyridylL4 <SEP> méthylidène)-2 <SEP> hydrazone
<tb> [formule <SEP> (II), <SEP> R' <SEP> 2 <SEP> 150
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> furfurylidène-2 <SEP> hydrazone
<tb> [formule <SEP> (II), <SEP> R' <SEP> = <SEP> -#\
<tb> ] <SEP> ....... <SEP> .. <SEP> ... <SEP> 0,2 <SEP> 142
<tb> O
<tb> Isonicotinoyl-1 <SEP> (méthyl-2 <SEP> hydroxy-3 <SEP> hydroxyméthyl-5
<tb> pyridyl-4 <SEP> méthylidène)-2 <SEP> hydrazone
<tb> CH,OH
<tb> [formule <SEP> (II), <SEP> R' <SEP> _ <SEP> - <SEP> <B>N"</B>N <SEP> ] <SEP> 2 <SEP> <B>127</B>
<tb> HO <SEP> CHs <I>Exemple 7:
</I> Dans un fermenteur de 8001 contenant 2001 d'eau portés à 90 C on ajoute Distillers' solubles 22,4 kg Le mélange est agité tout en, maintenant la tempé rature à 90 C pendant 10 mn.
Après refroidissement à 30 C on ajoute Amidon . . . .... . .. . ..19,2 kg Huile de soja .. 9,6 1 Huile de coton . 9,6 1 Sulfate de manganèse monohydraté 0,064 kg Trimêthyl-2,2,4 éthoxy-6 dihydro- 1,2 quinoléine en solution à 50/0 dans l'éthanol (poids: vol.) .0,2241 Solution de chlorhydrate de thi amine dans l'eau à 1 g/1 . 0,1601 Le volume est ajusté à 285 1 avec de l'eau ; le pH du mélange est amené à 6,35 avec l,11 de lessive de soude 10 N.
Le milieu est stérilisé par chauffage pen dant 55 mn à 122 C avec un barbotage de vapeur. Après refroidissement le pH est de 5,85 et le volume de 3101.
On ajoute alors stérilement une solution de 0,192 kg d'isonicotinoylhydrazine dans 31 d'eau puis 6,41 de pétrole filtré stérilement. Le fermenteur est ensuite ensemencé avec 321 d'une culture inoculum .en fermen- teurs des deux formes -f- et - de la souche de Blakes- lea trispora (NRRL 2456 et 2457) âgée de 48 heures, La culture est développée à 26,
1 C en agitant avec une turbine tournant à 210 t/mn et en aérant avec un débit de 25 em3 d'air stérile par heure.
Après 48 heures de développement, on ajoute stéri- lement une solution stérile de 0,320 kg de P-ionone dans 1,6 1 de pétrole et on commence une addition con tinue d'une solution aqueuse stérile de glucose mono hydraté à 580 g/1.
Le dispositif qui permet d'ajouter la solution glucosée a un débit de 230 cm2 par heure. La culture est poursuivie dans les mêmes conditions d'aé ration et de température pendant 5 jours de plus après l'addition de (3-jonone. A l'arrêt de la culture 261 de solution soit 15 kg de glucose monohydraté ont été introduits dans le fermenteur.
Le P-carotène produit dans la fermentation est dosé comme il est dit à l'exemple 1. Dans cette opération on a obtenu : 2560 mg/1 de (3-carotène.
Sur une partie aliquote du moût de fermentation de cette opération on a procédé à la cristallisation du (3- carotène produit en opérant de la manière suivante,: 7,41 de moût renfermant 19 g de (3-carotène sont filtrés et le mycélium lavé à l'eau est récupéré puis séché une nuit sous vide à 451, C.
Le mycélium sec est extrait par 4500 em3 de chlorure de méthylène et l'ex trait obtenu est concentré jusqu'à un volume de 300 cm'. 300 cms de butanol normal sont ensuite ajoutés au concentrat pour faire cristalliser le [3-carotène. Les cris taux essorés, lavés et séchés pèsent 15,7 g et contien nent 95 % de (3-carotène.
Claims (1)
- REVENDICATION Procédé de préparation de (3-carotène par fermen tation aérobie des formes -1- et - de Blakeslea tris- pora, caractérisé en ce que le milieu de culture contient au moins un activateur choisi parmi - les isonicotinoylhydrazines de formule générale EMI0004.0063 dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant de 1 à 8 atomes de carbone, aralcoyle contenant de 7 à 12 atomes de carbone, phé- nyl'sulfo@nyle ou le radical -C(=NH)NH-C(=NH)NHz, et - les isonicotinoylhydrazones de formule générale EMI0004.0070 dans laquelle R' représente un radical dialcoylamino ou un hétérocycle azoté ou oxygéné, mononucléaire, à 5 ou 6 chainons.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR985362A FR1412506A (fr) | 1964-08-17 | 1964-08-17 | Procédé de production de beta-carotène |
| FR23958A FR88293E (fr) | 1964-08-17 | 1965-07-08 | Procédé de production de beta-carotène |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH447150A true CH447150A (fr) | 1967-11-30 |
Family
ID=26164641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH1149065A CH447150A (fr) | 1964-08-17 | 1965-08-16 | Procédé de production de B-carotène |
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| CH (1) | CH447150A (fr) |
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-
1965
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- 1965-08-09 NL NL6510341A patent/NL147475B/xx unknown
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- 1965-08-16 DK DK419365A patent/DK111353B/da unknown
- 1965-08-17 SE SE1074265A patent/SE300961B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR88293E (fr) | 1967-01-06 |
| SE300961B (fr) | 1968-05-20 |
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| DE1249798B (de) | 1967-09-14 |
| FR1412506A (fr) | 1965-10-01 |
| NL6510341A (fr) | 1966-02-18 |
| DK111353B (da) | 1968-08-05 |
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