CH467277A

CH467277A - Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden

Info

Publication number: CH467277A
Application number: CH1319162A
Authority: CH
Inventors: Lester Smith Ernest; Mervyn Leonard; Malcolm Clark Victor
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1961-12-11
Filing date: 1962-11-12
Publication date: 1969-01-15
Also published as: US3213082A; GB963373A

Description

Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden
Vitamin B12 spielt in vielen biochemischen Pro essen, besonders bei der Synthese von Nucleinsäuren, eine wichtige Rolle. Wahrscheinlich ist dieses Vitamin in manchen dieser Prozesse in Gestalt eines Adenosyl Derivats wirksam, welches als Vitamin-B12-Coenzym bezeichnet werden kann, und man hat schon die Verwendung dieses Coenzyms für die Behandlung der bösartigen Blutarmut (anaemia perniciosa) vorgeschlagen.

Die genaue Funktion dieses Coenzyms im Metabolismus der Zellen bildet dlen Gegenstand emsiger Forschung und es besteht ein Bedarf für ein synthetisches Verfahren zu dessen Herstellung aus dem leichter erhältlichen Viatmin B12, sowohl in normaler als auch in radioaktiver Form. Es ist zweckmässig, wenn man mit Hilfe eines solchen synthetischen Verfahrens auch andere Analoge dieses in der Natur vorkommenden Stoffes herstellen kann. Es sind verschiedene Verfahren für die Synthese von Vitamin-B12-Coenzym und auch von einigen analogen Verbindungen, z.

B. der Coenzymform von #-Vitamin-B12 bekannt, aber diese Verfahren setzen langwierige Reinigungen voraus und es konnten bisher keine anderen Nucleoside als Adenosin zur Bildung von Derivaten des Vitamins B12 oder seiner Analogen gebracht werden und man konnte auch keine Vitamin-B12-Analoge mit modifizierten Seitenketten an den Pyrrolgruppen, welche eine antimetabolische Wirkung ausüben, in die Coenzymform bringen. Vitamin B1 hat die Formel
EMI2.1
und es hat sich herausgestellt, dass im Coenzym die -CN-Gruppe durch eine 5'-Desoxy-adenosyl-Gruppe der Formel
EMI2.2
ersetzt ist, welche mit dem 5'-Kohlenstoffatom des Ribosemoleküls am zentralen Kobaltatom hängt.

Es sind viele Analoge von Vitamin Bie bekannt, in denen das Molekül an einer oder mehreren Stellen modifiziert ist. Es können z. B. verschiedene, Amide tragende Seitenketten modifiziert sein, z. B. durch Entfernen der -NH2-Gruppen, wobei sich freie Säuren bilden, die man in andere Derivate umwandeln kann, z. B. in Ester oder andere Amide, z. B. Arylamide, usw.

[E. Lester Smith Vitamin B12 , (Methuen)]. Man kann den 5, 6-Dimethyl-benziminazolr, est des Moleküls durch andere heterocyclische Basen ersetzen, die zwei oder mehr Stickstoffatome im Ring haben, z. B. durch andere Renziminazole, wie Benziminazol, 5-Hydroxybenziminazol, Naphthiminazol, oder durch Purin-oder Pyrinimidinbasen, wie Adenin, Xanthin, Hypoxanthin, Guanin, 2-Methyladenin, 8-Aza-adenin, 2,6-Diaminopurin usw. (Lester Smith, 1. c.). Der Ribosetell des Moleküls kann an einem anderen Kohlenstoffatom an die Phosphorsäuregruppe gebunden sein, und die mit der Phosphorsäuregruppe verbundene Isopropylaminogruppe kann durch andere Alkylaminoketten ersetzt werden [Heinrich, Friedrich und Riedel (1961), Biochem. Zeit.

334, 284]. Man kann auch die CN-Gruppe durch eine andere Gruppe ersetzen, z. B. ein, e Hydroxyl-, Nitrit-, Thiocyanat-, Sulfitgruppe. Eine weitere Möglichkeit ist die völlige Abwesenheit des Nucleotid-Restes, z. B. im Faktor B oder Cobinamid (Armitage, Cannon, Johnson, Parker, Lester Smith, Stafford und Todd J. C. S. 1953, S. 3849).

Der Einfachheit halber werden das Vitamin B10 und seine Analoge mit abgeändertem Molekül allgemein als Cobalticorrinoide bezeichnet. Diese Beziechnung umfasst aber nicht nur Moleküle mit Ainiidgruppen, sondern auch Analoge von Vitamin B12 mit ersetzten oder entfernten Amidgruppen.

Die Cobalticorrinoide sind im allgemeinen rot oder orange gefärbt, wenn man sie aber z. B. mit einem Borhydrid reduziert, erhält man eine braungefärbte reduzierte Form, in welches das Kobaltatom wahrscheinlich zweiwertig ist. Diese Reduktion ist reversibel und die reduzierten braunen Stoffe werden an der Luft leicht wieder oxydiert, und man erhält Verbindungen mit unveränderter Molekülstruktur, in denen aber das an das Kobaltatom gebundene Anion im allgemeinen durch OH ersetzt ist, wenn die Oxydation in Gegenwart von Wasser erfolgt. Solche Verbindungen seien reduzierte Cobalticorrinoide genannt.

Die Reduktion kann aber weiter geführt werden, wobei man graugrün gefärbte Produkte erhält [Beavan und Johnson Nature (1955) 176, 1264]. Solche Verbindungen werden als vollständig reduzierte Cobalticorrinoide bezeichnet. Diese vollständig reduzierten Cobalticorrinoide sind ebenso wie die braungefärbten redu zierten Cobalticorrinoide leicht oxydierbar Ein Gegenwart von Wasser, z. B. durch die Einwirkung von Luft, und liefern dabei die entsprechenden Hydroxocobalticorrinoide.

Wie gezeigt wird, ist der Nucleosid-Rest im Vitamin Bu-Coenzym mit dem zentralen Kobaltatom durch eine Kohlenstoff-Kobaltbindung verbunden. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, solche Cobalticorrinoide herzustellen, in denen eine organische Gruppe mit dem zentralen Kobaltatom durch eine Kohlenstoff-Kobaltbindung verbunden ist, ähnlich wie beim Vitamin Bly-Coenzym, und das Verfahren ist auch anwendbar zur Herstellung dieses Coenzyms selbst aus Vitamin Bie. Das Verfahren ist aber auch zur Herstellung von analogen Verbindungen mit einer Schwefel Kobaltbindung, z. B. von Sulfonylderivaten, anwendbar.

Es hat sich gezeigt, dass man neue Cobalticorrinoide herstellen kann durch Umsetzung von vollständig reduzierten Cobalticorrinoiden mit alkylierenden Mitteln, wobei man eine gegebenenfalls substituierte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe beim Kobaltatom einführen kann. Solche Mittel umfassen insbesondere Verbindungen der Formel RX, in welcher X ein anionenbildender Stubstituent ist, z. B. ein Halogenatom, ein Sulfat-, Phosphat-, Sulfonat- oder Oxalatrest, und R einen gegebenenfalls substituierten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest, bedeutet. Insbesondere wurde gefunden, dass man Vitamin B-Coenzym und dessen Analoge herstellen kann, wenn man ein vollständig reduziertes Cobalticorrinoid mit einem reaktiven Derivat eines Nucleosides umsetzt. Das Derivat kann ein Halogenid- oder Sulfonyl- (z. B. Tosyl-, Mesyl-) Derivat sein.

X kann ausserdem eine Sulfonatgruppe sein wie z. B. ein Adenosin-p-toluolsulfonat.

Damit das Ausgangsmaterial nicht oxydiert wird, soll die Umsetzung unter nichtoxydierenden Bedingungen durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden mit einer an das Cobaltatom gebundenen Gruppe R, die ein gegebenenfalls substituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest, z. B. ein Alkylrest, ist das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Cobalticorrinoid reduziert, bis das Cobaltatom in einwertiger Form vorliegt und dann unter nichtoxydierenden Bedingungen die Gruppe R durch Umsetzung mit einem den Rest R abgebenden Mittel einführt.

Der Substituent X im Mittel RX kann z. B. ein Chlor-, Brom- oder Jodatom sein, oder der Rest einer starken anorganischen Säure, wie Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Er kann auch eine Alkyl-, Aryl- oder Aralkylsulfonylgruppe sein, z. B. eine Methylsuffonyl- oder Tosylgruppe. Die Gruppe R kann gesättigt oder ungesättigt sein, z. B. eine Alkylgruppe von 1-5 Kohlenstoffatomen, wie die Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Butylgruppe oder eine mit einem Arylrest (z.

B. der Benzylrest), einer heterocyclischen Gruppe, wie der Pyridin-, Pyrimidin-, Piperidin-, Purin-, Adenin- oder Uridinrest, substituierte aliphatische Gruppe oder eine cyclische Äther- oder Hemiacetalgruppe, wie in den Sacchariden oder Nucleosgiden. R kann auch mit einer Hydroxyl-, Äther-, Thioäther- oder Carboxylgruppe substituiert sein.

R kann auch, wie schon erwähnt, ein Nucleosidrest sein. Die Bezeichnung Nucleosid bezieht sich auf N-Glycoside oder Desoxyglycoside von heterocyciischen Basen und umfasst sowohl die in der Natur vorkommenden Nucleoside, wie Adenosin, Cytidin, Inosin, Guanosin, Uridin und deren Desoxy-Derivate, als auch synthetische Glycoside, die aus natürlichen oder synthetischen Hexosen oder Pentosen, wie Glucose, Fructose, Mannose, Sorbose, Ribose und deren Desoxy-Derivaten, und natürlichen oder synthetischen heterocyclischen Basen gebildet werden. Die Bezeichnung Nucleosidrest bezieht sich auf eine Nucleosidgruppe, die mit dem Kobaltatom durch eine Kohlenstoff-Kobaltbindung verbunden ist, und deren am verbindenden Kohlenstoffatom befindliche OH-Gruppe entfernt ist.

Die Bezeichnungen 5'-Desoxy-oder 6'-Desoxy-nucleoside sind genauer, aber der Gebrauch der kürzeren Bezeichnung list bequemer.

In den Zuckeranteilen können schützende Gruppen vorhanden sein, z. B. Acetyl-, Isopropyliden- oder Ben zylidengruppen. Die heterocyclischen Basen umfassen z. B. die Basen Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Benziminazol, Azapurin, Azapyrimidin. Besonders wichtig sind die Pyrimidine und Purine, z. B. die in der Natur vorkommenden Basen Xanthin, Cytosin, Hypoxanthin, Guanin, Adenin und Uracil, oder die synthetischen Basen 8-Aza-adenin, 6-Aza-uracil und 5-Bromuracil. Manche Nucleoside sind im Handel erhältlich oder sie können synthetisch hergestellt werden nach Methoden von Duschinsky, Bleven und Heidelberger, 1957, J. A. C. S.

79, 4559; M. J. Hall, 1960, Ph. D. Dissertation Universität von Manchester; Lee Benitz, Anderson, Goodman & Harper, 1961, J. A. C. S. 83, 1906; Blackburn und Johnson, 1960, J. C. S., 4347.

Die bevorzugten reaktiven Derivate der Nucleoside sind die Toluolsulfonate und Methansulfonate. Wenn man den reaktiven Substituenten an ein besimmtes Kohlenstoffatom des Zuckeranteils binden will, kann man das reaktive Derivat aus einem Nucleosid herstellen, in welchem alle OH-Gruppen des Zuckerrests geschützt sind, mit Ausnahme desjenigen Kohlenstoffatoms, das an das Kobaltatom gebunden werden soll. Man kann die schützenden Gruppen vor der Umsetzung mit dem vollständig reduzierten Cobalticorrinoid entfernen, aber man kann sie auch unverändert belassen. Gewünschtenfalls können die schützenden Gruppen aus dem Verfahrensprodukt entfernt werden, z. B. mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure, oder einer starken organischen Säure, wie Ameisensäure, oder man kann Acetoxygruppen mit schwachen Basen entfernen. Als solche sind z.

B. wirksam alkoholisches Ammoniak oder Amine, wie Morpholin, oder verdünnte Alkalimetallalkoxyde, Hydroxyde oder Carbonate. Die schützenden Gruppen können auch in vielen Fällen reduziert werden.

Man wählt die schützende Gruppe je nach ihrer Entfernbarkeit aus. Als Acylgruppen kann man z. B.

Acetyl oder Propionylgruppen verwenden. Will man mehrere benachbarte OH- Gruppen schützen, so bildet man zweckmässig lein Acetyl- oder Ketalderivat, z. B. ein Benzyliden- oder noch besser ein Isopropyliden Derivat. Besitzt der Zuckerteil des NucleoSides eine primäre Alkoholgruppe, wie z. B. in Ribose'und Glucose, ist es zweckmässig, die primäre alkoholische Hydroxylgruppe durch einen reaktiveren Substituenten zu ersetzen. Wenn man z. B. das Vitamin-Bl°Coenzym selbst herstellen will oder eine analoge Verbindung, die sich davon nur im Vitamin B11?-Teil des Moleküls unterscheidet, benötigt man Adenosin als Nucleosid, und das bevorzugte Mittel ist 5'-(Toluolsulfonyl)-adenosin.

Die Reaktion zwischen der Verbindung RX und dem vollständig reduzierten Cobalticorrinoid wird vorzugs- weise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt, zweckmässig in einem polaren Lösungsmittel. Brauchbar sind Wasser, Alkanole, wie Methanol und Äthanol, und substituierte Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid.

Die nichtoxydierenden Bedingungen können erzielt werden, wenn man die Umsetzung in einer inerten Atmosphäre, z. B. unter Stickstoff, durchführt. Besonders zweckmässig ist es, das Cobalticorrinoid z. B. mit einem Metallhydrid, wie Alkaliborhydrid, zu reduzieren und eventuell ohne Zerstörung oder Entfernung des überschüssigen Reduziermittels und ohne Isolierung des vollständig reduzierten Cobalticorrinoids, den anderen Reaktionsteilnehmer unmittelbar der Lösung zuzusetzen.

Man kann überschüssiges Borhydrid nach beendigter Reduktion des Cobalticorrinoids vor oder nach Zusetzen des anderen Reaktionsteilnehmers zersetzen, z. B. mit einer organischen Säure, wie Essigsäure. Andere brauchbare Reduktionsmittel sind Verbindungen mit niedrigwertigen Metallionen, z. B. Chrom-II-acetat, Zink- und Essigsäure oder Wasserstoffgas in Gegenwart eines Katalysators, wie Platinoxyd.

Als Cobalticorrinoids verwendet man zweckmässig ein Hydroxo-cobalticorrinoid. Obwohl man Cyanooder Sulfitocobalticorrinoide usw. auch verwenden kann, ist es im allgemeinen empfehlenswert, das freiwerdende HCN oder SO; vor der kondensierenden Einführung zu entfernen, weil diese ähnlich wirken wie das kondensie rende Mittel und bilden das ursprüngliche Cobalticorrinoid wieder zurück. So säuert man z. B., wenn man von Cyano-Cobalamin ausgeht, die bei der Reduktion gebildete Lösung an und erwärmt sie unter vermindertem Druck, um das gebildete HCN zu entfernen.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Derivate von Vit amin-B12 sind von besonderem Wert bei der experimentellen Untersuchung des Vitamin-B 12-Metaoolismus und bei der darauf gegründeten Therapie. Eine Anzahl dieser Derivate ist besonders als Antimetabolite des Coen zyms wertvoll, indem sie Prozesse e hemmen, in welchen das Vitamin eine wesentliche Rolle spielt. Von grosser Brauchbarkeit sind insbesondere die Coenzym-Analoge, welche aus solchen Vitamin-Bl2-Analogen gebildet werden, welche an sich antimetabolisch wirken.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Cobalticorrinoide sind neue Verbindungen, mit Ausnahme des Vitamin Bts-coenzyms und der Co-5'-desoxy-adenosyl-Derivate von anderen Cobalticorrinoiden, die an den Pyrrolringen die gleichen Seitenketten tragen wie das Vitamin Bt2 selbst.

Besonders stark antagonistisch zu Vitamin-Bls-Co- enzym sind diejenigen Derivate, in denen der Adenosinteil des Coenzyms durch eine Äthylgruppe, eine Uridm-, Inosingruppe oder eine Isopropyliden-Adenosingruppe ersetzt ist. Das Methylderivat ist auch darum wertvoll, weil es in entsprechenden biologlschen Systemen bei der Übertragung von Methylresten in Homocysteine und bei d, er Bildung von Methionin als Coenzym wirkt.

Beispiel 1
Herstellung von Isopropyliden-Coenzym Isopropyliden-Adenosin wird in den p-Toluolsulfonyl-(Tosyl)-ester durch Umsetzung mit Tosylchlorid in Pyridinlösung nach dem von Clark et al. in J. Chem.

Soc. 1951, 5. 2952 beschriebenen Verfahren übergeführt. Da es zum Cyclisieren neigt, wird es sofort nach seiner Herstellung verwendet. Ein Reaktionsgefäss mit Trenntrichtern wird so ausgebildet, dass das ganze System entleert und zwei oder dreimal mit reinem Stickstoff gefüllt werden kann, um allen Sauerstoff zu entfernen. Die Reaktionsteilnehmer können dann gewünschtenfalls in das geschlossene System eingebracht werden. Das Gefäss enthält 700 mg Hydroxocobalamin in 20 ml Wasser, ein Trichter 200 mg Natriumborhydrid in 10 ml Wasser und ein anderer die rohe Tosylverbindung, hergestellt aus 500 mg Isopropylidin-Adenosin gelöst in 10 ml 50 % igem wässrigem Methanol. Nach Zugabe des Borhydrids zum Vitamin ändert sich die Farbe sofort von rot zu braun und dann langsam zu einem grünlichen Schwarz.

Nach 15 Minuten ist die Tosylverbindung zugesetzt und die Farbe hat sich langsam rotbraun gefärbt. Etwa verbliebenes reduziertes Vitamin B12 kann durch Luftzutritt bei Zimmertemperatur oxydiert und abgetrennt werden. Das erhaltene Produkt kann weiter aufgearbeitet werden, indem man die alkalische Lösung mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und mit Phenol/Tetrachlorkohlenstoff (3:1) in kleinen Anteilen extrahiert, bis die wässrige Schicht beinahe farblos ist. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, mit ungefähr 10 Teilen Tetrachlorkohlenstoff/ Aceton (10 : 1) gemischt und mit kleinen Anteilen Was ser geschüttelt, bis die rote Farbe ! gänzlich verschwunden ist.

Durch Chromatographie wird das Produkt an Säulen von DEAE-(Diäthylaminoäthyl)-cellulose (75 mal 25 mm) und von CM-(Carboxymethyl)-cellulose (150 x 25 mm) und Entwicklung mit Wasser, gereinigt.

Die Eluierung wird so lange fortgesetzt, bis die Fraktion, insgesamt 850 ml, herauskommt. 425 ml dieser Fraktion werden auf einige ml unter vermindertem Druck konzentriert. Nach Zugabe von Aceton kristallisiert sie langsam unter leichter Trübung. Dieses Produkt zeigt das charakteristische Absorptionsspektrum des Coenzyms bei pH 7 und 2. Auf der Papierchromatographie mit feuchtem sekundärem Butanol ist der RF Wert (im Vergleich zu dem von Cyanocobalamin) 1,65.

Man erhält Adenin nach Säurehydrolyse. Beim Enzymversuch hemmt es wirkungsvoll das natürliche B12-Coen- zym.

Die zweite Hälfte des Produktes wird dann in das B12-Coenzym übergeführt, indem man mit Salzsäure auf 0,1n einstellt und 15 Minuten auf 900 C erhitzt, die Lösung anschliessend neutralisiert, kühlt, konzentriert und durch Extraktion über Phenol/Tetrachlorkohlenstoff von Salzen befreit. Nach der Papierchromatographie ist die Hauptzone von orangener Farbe und hat einen RF-Wert von 0,71 (bezogen auf Cyanocobalamin), d. h. den gleichen wie das natürliche Coenzym.

Das Produkt wird aus sauren und basichen Hydrolyseprodukten durch kleine Säulen von DEAE- und CM-Ionenaustauschcellulose gereinigt, die Lösung konzentriert und das Coenzym aus wässrigem Aceton kristallisiert. Es. hat das gleiche Absorptionsspektrum und die gleiche Wirkung im spezifischen Enzymversuch von Abeles et al. wie das natürliche Coenzym aus Propionibacteria.

Beispiel 2
Herstellung von Coenzym
250 mg Adenosin, getrocknet bei 0,01 mm Hg und 1100 C, werden unter Erhitzen in 20 ml trockenem Pyridin gelöst.

Nach Kühlen auf 0 C wird 1 Äquivalent Essigsäureanhydrid zugesetzt und nach 1 Stunde 1,1 Äquivalent p-Toluolsulfonylchlorid. Die Lösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann mit einigen Tropfen Wasser und 200 ml Äther behandelt.

Der gelbe gummiartige Niederschlag von rohem Tosyladenosin wird in 10 ml Wasser aufgenommen und sofort verwendet.

100 mg Hydroxocobalamin werden mit Chromacetat in 10 ml EDTA-Puffer bei pH 10 reduziert. Wenn das Umschlagen der Farbe in bläuliches Schwarz beendet ist, werden 1 ml n Salzsäure und rohes Tosyladenosin zugesetzt. Nach 45 Minuten Stehen bei Zimmertemperatur wird die Lösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, weiterverarbeitet. Eine schwach rosa Zone und darauf eine orangefarbene Zone laufen durch die CMC-Säule und treten ohne bemlerkbare Grenze zwischen ihnen als rosa Lösung aus, die sich mit Säure gelb färbt und das typische Coenzymspektrum zeigt. Das Produkt zeigt Coenzymwirkun, g im Enzymtest. Es wird durch Chro- matographie auf Whatman-3 MM-Papier mit wasserhalbigem sekundärem Butanol weiter gereinigt. Die Hauptzone ist orangenfarbig und hat den gleichen RF-Wert wie das natürliche Coenzym.

Beispiel 3 a) Herstellung des Isopropyliden-Uridin-Analogen Isopropyliden-uridin wird zum Tosylester umgewandelt. 50 mg des Rohprodukts werden in 2 ml Äthanol gelöst und zu reduziertem Hydroxocobalamin zugesetzt, das aus 50 mg Hydroxocobalamin in 2 ml Äthanol, behandelt mit 10 mg Natriumborhydrid in 1 ml Äthanol und mit 0,2 ml Eisessig, hergestellt wird. Die Reaktion wird in reinem Stickstoff in einem geschlossenen System durchgeführt. Das Reaktionsl,, emisch lässt man 65 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird der Alko- hol unter vermindertem Druck abdestilliert und das Produkt über Phenol wie in Beispiel 1 extrahiert und dann in einige ml wässrige Lösung zurückgebracht. Diese lässt man über eine kleine Säule von DEAE-Cellulose, gefolgt von Wasser, laufen.

Der austretende Feststoff und die Waschflüssigkeiten werden durch eine Säule von Carboxymethylcellulose geschickt. Eine kirschrote Zone passiert die Säule und ist nach Verdünnen mit Wasser eine rote Lösung, welche das charakteristische Absorptionsspektrum des B12-Coenzyms zeigt. Die aus den Dichtewerten errechnete Ausbeute ist 21 mg. Die Lösung schlägt mit Säure in Gelb um. Wenn sie 2 Stunden dem Tageslicht ausgesetzt wird, wird sie wieder rosa und zeigt das charakteristische Absorptionsspektrum von Hydroxocobalamin.

Eine neutrale Lösung wird also, nachdem sie dem Tageslicht ausgesetzt wird, quantitativ zu Hydroxocobalamin umgewandelt. Nach dieser Behandlung wird die rote Farbe durch Carboxymethylcellulose gehalten. Der Rest des Produkts aus der CMC-Säule wird unter vermindertem Druck konzentriert. Nach Zugabe von Aceton kristallisiert es schnell in roten Nadeln. Nach der Papierchromatographie mit wasserhaltigem sekundärem Butanol hat das Produkt einen RF-Wert von 1,29 (im Vergleich zu dem von Cyanocobalamin). b) 5 mg des Isopropyliden-Uridinanalogen werden in 2,5 ml 0, 1n Salzsäure gelöst. Die Lösung wird 38 Stunden im Kühlschrank gelassen und dann 7 Stunden bei Zimmertemperatur. Die Lösung wird darauf durch kleine Säulen von DEAE- und CM-Cellulose laufengelassen.

Etwas Farbe wird am oberen Teil der CMC Kolonne zurückgehalten, aber der grösste Teil des Stoffes durchläuft die Säule als orangerote Zone und kommt nach Entwicklung mit Wasser als rosa Lösung heraus.

Der ausfliessende Stoff wird konzentriert und der Papierchromatographie unterworfen. Man erhält zwei orangefarbene Zonen von ungefähr gleicher Intensität, eine mit einem relativen RF-Wert von 1,30 wegen des un vleränderten Isopropyliden-Uridinanalogen und die andere mit einem RF-Wert von 0,62 wegen des Uridinanalogen.

Beispiel 4
Herstellung des Uridinanalogen
Tosyluridin wird durch saure Hydrolyse der Isopropylidenverbindung gemäss dem Verfahren von J. Baddiley, J. Chem. Soc. 13, (1951) Seite 50, hergestellt.

50 mg des Hydroxocobalamins in 2 ml Wasser werden mit 20 mg Natriumborhydrid in 2 ml Wasser während 15 Minuten bei Zimmertemperatur in einer Stickstoff atmosphäne behandelt. Darauf werden 50 mg in 5 ml Wasser suspendiertes Tosyluridin zugesetzt. Die Farbe ändert sich langsam von graugrün in kirschrot. Nach einer Stunde bei Zimmertemperatur wird die Lösung mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und die erhaltene wässrige Lösung durch Säulen von DEAE- und CM-Cellulose laufen gelassen, wie in Beispiel 1. Der aus der zweiten Säule austretende Stoff wird unter vermindertem Druck konzentriert und mit Aceton kristallisiert, worauf man 42 mg rote Nadeln erhält.

Nach Papierchromatographie liefert dieser Stoff eine einzige Zone mit dem RF-Wert 0,59, woraus ersichtlich ist, dass es sich um das gleiche Produkt handelt, wie es durch Hydrolyse der Isopropylidenverbindung (s. Belispiel 3b) erhalten wird. Dieses Uridin hemmt das natürliche Coenzym beim Enzymversuch in bedeutendem Masse.

Beispiel 5
Herstellung des Uridincoenzymanalogen des Bls-Anilids
Vitamin B1--Anilid wird durch Behandlung der von Vitamin B1 abgeleiteten Monocarbonsäuren durch schwache Hydrolyse e mit Äthylchlorformat und Tri- äthylamin in Dimethylformamid erhalten, wie bei Lester Smith et al. Biochem. J. 62, (1956) S. 14p beschrieben. Die erhaltene Cyanoverbindung wird durch Reduktion mit wässrigen Natriumborhydrid, Zugabe von Essigsäure und Konzentration unter vermindertem Druck, um Cyanwasserstoffsäure zu entfernen, in das Aquoanilid umgewandelt. Das Produkt wird mit Phenol extrahiert und aus wässrigem Aceton kristallisiert, 25 mg dieser V, Erfindung werden mit 5 mg Natrium- borhydrid in 3 ml Äthanol in einer Stickstoffatmosphäre reduziert.

Nach 5 Minuten werden 0,05 ml Eisessig und darauf 140 mg in 10 ml Äthanol suspendiertes Tosyluridin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann eine Stunde auf 600 C erhitzt. Der Alkohol wird unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt über Phe nol/Tetrachlorkohienstoff extrahiert und durch DEAEund CMC-Säulen geführt. Eine schwachrosa Zone kommt schnell durch die Säulen und wird beiseitege stellt. Die langsamere orangefarbene Zone wird in ungefähr 50 ml Wasser eluiert.

Beispiel 6 a) Herstellung des Isopropyliden-Inosin-Analogen
100 mg Hydroxocobalamin werden mit 20 mg Natriumborhydrid in 5 ml Äthanol reduziert. Dann gibt man 0,1 ml Eisessig hinzu und darauf rohes Tosylisopropyliden-Inosin, das aus 125 mg Isopropyl.iden-Ino- sin, in 5 ml Äthanol suspendiert, hergestellt wird. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben aufgearbeitet. Die Hauptfraktion aus der CMC-Säule wird konzentriert und aus wässrigem Aceton kristallisiert. Das Produkt hat einen RF-Wert von 1,22 gegenüber dem Vitamin B12 gemäss Papierchromatographie mit wasserhaltigem sek.

Butanol. b) Herstellung des Inosinanalogen
Die Hälfte des Isopropyliden-Inosin-Analogen wird in 10 ml 0,1 n Salzsäure gelöst und 15 Minuten auf 900 C erhitzt. Die Lösung wird gekühlt, mit Natriumhydroxyd neutralisiert und durch Phenol extrahiert.

Nach der Papierchromatographie hat die Hauptzone einen RF-Wert von 0,54.

Beispiel 7
Herstellung des Inosin-Analogen
Aus 125 mg Isopropyliden-Inosin hergestelltes Tosylisopropyliden-Inosin wird zwecks Entfernung der Isopropylidengruppe mit verdünnter Schwefelsäure hydrolysiert. 200 mg Nitritcobalamin in 10 mi Wasser werden mit 75 mg Natriumborhydrid in 4,5 ml Wasser 30 Minuten in einer Stickstoffatmosphäre behandelt.

Das Tosylinosin wird in 10 ml wässriger Lösung zugesetzt und die Mischung eine Stunde bei Zimmertemperatur belassen. Das Reaktionsgemisch wird extrahiert und in den beiden Ionenaustausch-Cellulosen gereinigt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Papierchromatographie des Produkts zeigt eine orangefarbene Zone mit einem RF-Wert von 0,53, woraus ersichtlich ist, dass das Produkt das gleiche ist, wie man es durch Hydrolyse des Isopropyliden-Inosin-Analogen erhält. Der Stoff kristallisiert aus wässrigem Aceton in dunkelroten Körnern. Er hat das typische Absorptionsspektrum des Coenzyms und hemmt das natürliche Coenzym in beachtlichem Masse.

Beispiel 8
Herstellung des Äthylanalogen
50 mg Hydroxocobalamin werden mit 10 mg Natriumborhydrid in 4 ml Äthanol reduziert. Dann gibt man 0,05 ml Essigsäure und 0,25 ml Äthyljodid in 2 ml Äthanol hinzu. Die ganze Reaktion wird in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Die Mischung lässt man über Nacht bei Zimmertemperatur stehen, entfernt darauf den Alkohol durch Destillation unter vermindertem Druck und reinigt das Produkt durch Extraktion mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff und Ionenaustausch-Cellulosesäulen. Ein hellrosa Vorlauf wird verworfen und das Produkt aus einer orangefarbenen Zone in 330 ml Wasser gesammelt. Diese Lösung wird unter vermindertem Druck zu einigen ml konzentriert und durch Zu gab1e von Aceton kristallisiert.

Blei der Papierchromatographie liefert das Produkt eine orangefarbene Zone mit einem relativen RF-Wert von 1,85 und eine hellrosa Zone mit dem RF-Wert von Hydroxocobalamin.

Beispiel 9
Herstellung des Hydroxyäthylanalogen
50 mg Hydroxocobalamin in 2 ml Wasser werden mit 20 mg Natriumborhydrid in 2 ml Wasser in einer Stickstoffatmosphäre reduziert. Nach 15 Minuten setzt man 0,25 ml Äthylenbromhydrin in 1 ml Wasser zu.

Die Lösung verfärbt sich fast sofort von graugrün in kirschrot. Nach viertelstündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird die Lösung mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahi ziert, bis die Farbe graugrün ist. Die Lösung wird in einer Stickstoffatmosphäre in ein Gefäss filtriert, das 0,2 ml Dimethylsulfat enthält. Die Farbe ändert sich sofort in rot. Nach 15 Minuten wird die Lösung wie im vorhergehenden Beispiel weiterverarbeitet. Das erhaltene Methylanaloge des Coenzyms hat den gleichen RF Wert wie das Produkt des ersten Teils von Beispiel 10.

Beispiel 12
Herstellung des Benzylanalogen
50 mg Hydroxocobalamin werden mit 12 mg Natriumborhydrid in 5 ml Wasser 15 Minuten reduziert.

Dann werden 0,2 ml Benzylbromid, die in 2 ml Wasser suspendiert sind, zugegeben und die Mischung 1t/, Stunden mit Unterbrechungen gerührt, obwohl der Farbwechsel von bräuniichschwarz in rot nach einigen Minuten beendet zu sein scheint. Die wässrige Lösung wird von einigen verbleibenden Tropfen Benzylbromid dekan- tiert und weiterverarbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben. Das Benzylcoenzym-Analoge durchläuft die CMC Säule als braune Zone e und tritt als rote Lösung aus.

Beispiel 13
Herstellung des Carboxymethyl-Analogen
150 mg Cyanocobalamin in 10 ml Wasser werden mit 1 g Zinkstaub und 1 ml Eisessig behandelt, während das Reaktionsgefäss vorsichtig unter vermindertem Druck, um HCN zu entfernen, erwärmt wird. Nach Beendigung der Reduktion wird Stickstoff eingelassen und die Mischung in ein geschlossenes Stickstoffsystem in 250 mg Monochloressigsäure filtriert. Das fast schwarze Filtrat schlägt sofort in rot um. Nach halbstündigem Stehen wird die Lösung durch ein Holzkohle- bett (1 g Sutcliffe-Speakman Nr. 5) und 1 g Kieselgur geperlt. Der grösste Teil der roten Farbe wird zurückgehalten. Nach gründlichem Waschen des Bettes mit Wasser wird sie mit 70 % igem Aceton eluiert und weiterer Aceton zu dem Eluat zugesetzt, um die Kristallisation zu fördern.

Die Kristalle werden in 3 ml Wasser gelöst und durch ein kleines Bett (50 x 12 mm) DEAE Cellulose geleitet. Ein Teil des roten Stoffes geht hindurch, aber das saure Carboxymethyl-Analoge wird festgehalten und mit n/100-Salzsäure als rote Lösung eluiert. Nach Ansäuern schlägt diese in gelb um und die saure Lösung färbt sich, wenn sie dem Licht ausgesetzt wird, wieder schnell rot. Das Absorptionsspektrum ähnelt dem des Coenzyms, aber es zeigen sich geringfügige Unterschiede. Es zeigt schwache Spitzen bei 350, 422 und 525 my.

Beispiel 14
Herstellung des B1.2-Coenzyms
Rohes Tosyl-adenosin, das durch direkte Tosylierung von Adenosin hergestellt wird und ungefähr 0,5 g reines 5'-Tosyl-Adenosin enthält, wird in 20 ml 50 %igem wässrigem Methanol gelöst.

4 g des kristallinen Hydroxocobalamins und 1 g Natriumborhydrid werden in einen trockenen Kolben eingebracht, der dreimal mit sauerstofffreiem Stickstoff gespült war. 40 ml des entlüfteten Wassers werden unter Stickstoff eingebracht und die Mischung 4 Minuten mit Unterbrechungen geschüttelt. Die Lösung des rohen Tosyl-Adenosins wird entlüftet und nach und nach zugegeben, wobei dafür Sorge getragen wird, dass freigesetzter Wasserstoff entweichen kann. Die Lösung färbt sich von grünlichschwarz in leuchtend orangerot.

Sie wird 1 1ss Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur gelassen.

50 ml Wasser werden dann zugesetzt und die Lösung mit kleinen Teilen Phenol-Tetrachlorkohlenstoff (3 :1) extrahiert, bis die ganze rote Färbung verschwunden ist.

Die zusammengegebenen Extrakte werden nacheinandermit kleinen Portionen Natronlauge (Zugabe bis die wässrige Schicht nach Schütteln bei ungefähr pH 8 bleibt), Wasser, 0,05n Salzsäure und nochmals mit Wasser gewaschen. Dann werden etwa 20 ml Aceton und 50 ml Wasser zugegeben und genügend Äther, um nach Schütteln praktisch die ganze Farbe in die wässrige Schicht zu bringen. Diese wird abgetrennt und mit weiter rem Äther gewaschen, um Phenol zu entfernen.

Säulen werden mit DEAE-Cellulose und CM-Cellulose, beide in Flockenform, in einer Höhe von ungefähr 100 x 25 mm bepackt. Das Produkt wird in Serien durch diese Säulen geleitet, darauf destilliertes Wasser, bis keine Farbe mehr aus der zweiten (CM-)Säule herauskommt. Der ausfliessende Stoff wird auf ungefähr 50 ml unter vermindertem Druck konzentriert und durch kleinere Säulen (ungefähr 75 x 12 mm) von zwei Ionenaustauschcellulosen geschickt. Der ausfile ssende Stoff wird nochmals konzentriert, dann Aceton zugesetzt, um die Opaleszenz zu vermindern. Wenn sich Kristalle bilden, wird mit Unterbrechungen mehr Aceton zugesetzt, bis die Hauptmenge des Produkts kristallisiert. Die Ausbeute an luftgetrocknetem kristallinem BIO-Coenzym ist 3,25 g.

In allen Stufen wur- den die Arbeitsvorgänge vor Licht geschützt.

Beispiel 15
Herstellung von Bl -Coenzym über 2',3'-Diacetyl- tosyl-Adlenosin
267 mg trockenes Adenosin und 279 mg Triphenylmethylchlorid werden in 25 ml trockenem Pyridin gemischt und 5 Stunden unter zeitweiligem Schütteln stehengelassen. Danach ist vollständige Lösung eingetreten. Man setzt 1,0 ml Essigsäureanhydrid zu der hellgelben Lösung zu und lässt die Mischung 18 Stunden bei Zimmertemperatur steten. Die Lösung wird unter hohem Vakuum zu ungefähr 10 ml konzentriert und Äther zugegeben. Kräftiges Schütteln führt dazu, dass sich ein braunes Ö1 an der Seite des Kolbens absetzt.

Der Ather wird abgegossen und nach weiterem Waschen mit Ather und nachfolgender Entfernung von Äther- spuren unter Vakuum wird das braune Ö1 in 10 ml 80 % iger Essigsäure gelöst und 30 Minuten auf einem siedenden Wasserbad erhitzt, um den Triphenylmethyl äther zu hydrolysieren. Nach Abkühlen bei Zimmertemperatur wird die erhaltene Lösung gefriergetrocknet.

Das unter Frieren getrocknete Material wird in 5 ml trockenem Pyridin gelöst, die Lösung in Eis gekühlt und 187 mg p-Toluolsulfonylchlorid zugesetzt Es wird dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.

2 ml Wasser werden zu der Lösung zugegeben und darauf 20 ml eiskalte gesättigte Natriumbicarbonatlösung. Diese Mischung wird dann dreimal mit je 20 ml eiskaltem Chloroform extrahiert und die vereinigten Chloroformextrakte zweimal mit je 40 ml eiskalter gesättigter Natriumhydrosulfatlösung gewaschen. Schliesslich wäscht man den Extrakt zweimal mit je 40 ml eis kaltem Wasser. Chloroform wird unter er Vakuum bei Zimmertemperatur entfernt und das Reaktionsgefäss schliesslich auf 0,01 mm evakuiert, worauf ein gelbes Öl zurückbleibt.

Hydroxocobalamin wird durch Umsetzung von 250 mg Hydroxocobalamin mit 125 mg Natriumborhydrid in 5 ml Wasser unter anaeroben Bedingungen zu einem grünen Material reduziert und dann 0,25 ml Essigsäure in 2 ml Wasser zugegeben. Zu diesem Gemisch wird das Tosyldiacetyl-Adenosin, gelöst in 1 ml Wasser und 1 ml Methanol, zugegeben. Das Gemisch schlägt fast sofort in rot um und nach Stehenlassen im Dunkeln während 3 Stunden wird das Diacetylcoenzym nach bekannten Verfahrensweisen weiterverarbeitet. Unverändertes Hydroxocobalamin wird an einer Carboxymethylcellulose-Ionenaustauschsäule nach erstem Durchleiten der Lösung durch eine Diäthylaminoäthylcellulose-Ionen- austauschsäule entfernt.

Das gereinigte Diacetylcoenzym, das nach Chromatographie in sek. Butanol/Wasser (RF bezüglich Bl. l= 1,75) homogen ist, wird unter Frieren Igetrocknet und liefert 40 mg Material. Das ganze Material wird in 20 ml wasserfreiem Methanol und 10 mg wasserfreiem Morpholin zugesetzt. Nach zweistündigem Stehen bei Zimmertemperatur im Dunkeln isoliert man das Produkt durch Ausfällen mit Äther. Die Papierchromatographie des Produkts in sek. Butanol/Wasser zeigt an, dass die Hydrolyse beider Acetylgruppen beendet ist und man reines Vitamin B1. > -Coenzym erhalten hat.

Beispiel 16
Herstellung des Äthylanalogen
50 mg Hydroxocobalamin werden mit Chromacetat in EDTA-Puffer bei pH 10 reduziert. Überschüssiges Triäthylphosphat wird zugegeben und die Mischung mit Unterbrechungen geschüttelt. Die Farbe ändert sich nach und nach in rot, und nach zwei Stunden wird die Mischung mit Phenol-Chloroform extrahiert. Man reinigt das Produkt durch Chromatographie durch DEAEund CM-Cellulose und kristallisiert es aus wässrigem Aceton. Das Absorptionsspektrum und das Verhalten nach der Papierchromatographie sind die gleichen wie die des Sithylanalogen, hergestellt unter Verwendung von Äthyljodid, wie in Beispiel 8 beschrieben.

Beispiel 17
Herstellung des Äthylanalogen
100 mg Hydroxocobalamin werden in Stickstoff mit 25 mg Natriumborhydrid reduziert. Darauf setzt man 200 mg ethylester von p-Toluolsulfonsäure in 2 ml Äthanol zu, worauf die Farbe sofort von dunkelgrün zu leuchtendem Rot umschlägt. Das Produkt wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, gereinigt und kristallisiert. Die Ausbeute an Äthylanalogen beträgt 90 mg. Es hat den gleichen Wert wie das Produkt des vorhergehenden Beispiels und des Bei- spiels 8.

Beispiel 18
Herstellung des Methylanalogen
Man reduziert 100 mg Hydroxocobalamin mit Natriumborhydrid vollständig und behandelt mit 0,2 g Methyloxalat, die in 2 ml Methanol gelöst sind. Die Farbe ändert sich langsam in rotbraun. Die Mischung wird dann, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, weiterverarbeitet und gereinigt. Die Ausbeute an kristallinem Methylanalogen beträgt 25 mg.

Beispiel 19
Herstellung des Brom-Uridin-Analogen
120 mg Hydroxocobalamin werden in Stickstoff mit 20 ml 10 % iger Essigsäure und 3 g Zinkstaub behandelt. Wenn die Farbe in grün umgeschlagen ist, wird die Reaktionsmischung durch gesintertes Glas in Stickstoff auf 100 mg Tosylbrom-Uridin filtriert. Nach einer Stunde wird die Lösung mit Luft geschüttelt, mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und der Extrakt wiederum mit verdünntem Natriumhydroxyd, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Dann wird er mit Wasser, Aceton und überschüssigem Tetrachlorkohlenstoff geschüttelt. Die wässrige Schicht und hinterher Wasser lässt man durch Säulen von DEAE- und CM Cellulose laufen. Der austretende Stoff wird konzentriert und aus wässrigem Aceton kristallisiert.

Er liefert 50 mg des Brom-Uridin-Analogen des Coeuzyms. Sein RF Wert mit Bezug auf B32 ist 0,75.

Beispiel 20
Herstellung des Methylanalogen von 1312-Monocarbonsäure
200 mg gereinigte Monocarbonsäure, die man durch milde Hydrolyse von Vitamin B12 erhält, werden mit 100 mg Natriumborhydrid und 5 ml Wasser reduziert.

Darauf gibt man 0,2 ml Methyljodid in 5 ml Methanol in Stickstoff zu, worauf die Farbe sofort von dunkelgrün in rot umschlägt. Nach 10 Minuten wird der Methanol durch Erwärmen unter vermindertem Druck entfernt und die Lösung über Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Das Produkt kann nicht zum Kristallisieren gebracht werden und wird unter Frieren getrocknet. Es besitzt ein Absorptionsspektrum, das dem des B12- Coenzyms sehr ähnlich ist und die gleiche Farbänderung von rot in gelb nach Ansäuern zeigt.

Beispiel 21
Herstellung des Uridinanalogen von Ba-Monocarbonsäure
200 mg der gereinigten Monocarbonsäure von B12 werden mit 10 ml 10 % iger Essigsäure und 1 g Zinkstaub behandelt. Man erwärmt die Mischung unter vermindertem Druck zwecks Entfernung der Cyanwasserstoffsäure. Darauf lässt man Stickstoff eintreten und filtriert die Lösung durch einen Sinterfilter auf eine Suspension von 200 mg Tosyluridin in 5 ml Wasser.

Nach 2 Stunden wird die Lösung mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und durch alkalisches Waschen die Essigsäure entfernt. Die wässrige Lösung wird in eine Säule von DEAE-Cellulose gegeben. Das saure Produkt wird zurückgehalten und Verunreinigungen mit Wasser durchgewaschen. Das Produkt wird mit verdünnter Natriumchloridlösung eluiert. Dieses Eluat zeigt nach Ansäurern den üblichen Farbwechsel von rot zu gelb. Das Produkt wird nochmals mit Phenol-T, etra- chlorkohlenstoff extrahiert und unter Frieren getrocknet.

Beispiel 22
Herstellung des BI2-Coenzyms über Mesyl-Adenosin
Rohes Methansulfonyl-(Mesyl)-Adenosin, das durch direkte Mesylierung von Adenosin hergestellt wird und ungefähr 0,1 g wirldiches Mesyl-Adenosin enthält, wird in 10 ml 50 % igem wässrigem Methanol gelöst.

0,8 g Hydroxocobalamin werden mit 0,2 g Natriumborhydrid und 8 ml Wasser in einer Stickstoffatmosphäre behandelt. Nach 5 Minuten wird die entlüftete Lösung von Mesyl-Adenosin zugegeben und die rote Lösung nach einstündigem Stehen im Dunkeln, wie in Beispiel 14 beschrieben, weiterverarbeitet. Die Ausbeute an kristallinem Produkt ist 0,595 g. Die Papierchroma tographie zeigt, dass es hauptsächlich aus Coenzym B1- besteht, das in geringem Masse mit zwui schneller laufenden coenzymähnlichen Substanzen verunreinigt ist.

Beispiel 23
Herstellung der Coenzymform des B1e-Anilids
Das Vitamin B12-Anilld in seiner Aquo-Form wird wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. 200 mg dieser Verbindung werden in 4 ml Wasser gelöst und unter Stickstoff mit 60 mg Natriumborhydrid in 2 ml Wasser behandelt. Rohes Tosyl-Adenosin, das ungefähr 50 mg der rohen Substanz enthält, wird in 5 ml 50 % igem Methanol gelöst, entgast und zu dem völlig reduzierten Anilid zugesetzt. Nach einer Stunde wird die rote Lösung wie in den früheren Beispielen beschrieben weiterverarbeitet. Das Produkt kristallisiert nicht und wird in der gefriergetrockneten Form aufbewahrt.

Beispiel 24
Herstellung der Coenzym-Form von Faktor B (Cobinamid)
Cobinamid wird durch Entfernung des Nucleotiden aus Vitamin B12 mit Perchlorsäure [Armitage, Cannon, Johnson, Parker, Lester Smith, Stafford und Todd, J. Chem. Soc. (1953) S. 3849], hergestellt. 200 mg der chromatographisch reinen gefriergetrockneten Substanz und 60 mg Natriumborhydrid werden unter Stickstoff in 7 ml Wasser umgesetzt. Darauf gibt man 0,12 ml Eisessig in 2 ml Wasser zu und lässt die Lösung unter vermindertem Druck langsam erwärmen, um HCN zu entfernen. Rohes Tosyl-Adenosin, das ungefähr 50 mg der reinen Substanz enthält, gelöst in 5 ml 50 % igem Methanol, wird zugesetzt. Das Material schlägt langsam von grünlichschwarz in dunkelgelb um.

Nach einer Stunde wird das Produkt wie in den vorhergehenden Beispielen mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff extrahiert und durch eine kleine Säule DEAE-Cellulose geschickt.

Der ausfliessende Stoff wird konzentriert und unter Freie ren getrocknet. Bei allen pH-Werten ist das Produkt in Lösung gelb. Das Spektrum ähnelt dem des Adenyl
Coenzyms, das sich vom Pseudovitamin B12 herleitet.

Beispiel 25
Herstellung von Methylcobinamid
Faktor B (Cobinamid) wird wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben hergestellt. 75 mg in 2 mi Wasser werden mit 25 mg Natriumborhydrid reduziert, dann im Vakuum mit 0,061 ml Essigsäure in 1 ml Wasser zwecks Entfernung von HCN erwärmt. Um die voll ständige Reduktion sicherzustellen, werden weitere 25 mg Natriumborhydrid in 1 ml Wasser und später 0,2 ml
Methyljodid zugesetzt. Die gelbe Lösung wird wie im vorhergehenden Beispiel zu einem gefriergetrockneten
Feststoff weiterverarbeitet. Das Spektrum ähnelt dem des Cobinamid-Coenzyms.

Beispiel 26
Herstellung des Desoxyadenosin-Coenzym-Analogen
225 mg trockenes Desoxyadenosin werden mit einer gleichen Menge Toluolsulfonylchlorid in 5 ml Pyridin behandelt. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertempera tur werden 5 ml eiskalte gesättigte Natriumbicarbonat lösung zugegeben und die rohe Tosylverbindung mit
10 ml und dann mit 5 mi Chloroform extrahiert. Die
Extrakte werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand nochmals in 3 ml Methanol gelöst. 250 mg Hydroxocobalamin iin 7 ml Wasser werden mit 35 mg Natriumborhydrid unter Stickstoff reduziert und nach 15 Minuten wird diese Lösung zu einer Lösung der Tosylverbindung hinzugefügt.

Nach einer Stunde wird die rote Lösung wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben weiterverarbeitet und schliesslich aus wässrigem Aceton in einer Ausbeute von 173 mg kristallisiert. Der Stoff hat ein Absorptionsspektrum, das demjenigen des Coenzyms B1- sehr ähnelt.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrrinoiden mit leiner an das Cobaltatom gebundenen Gruppe R, die ein gegebenenfalls substituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cobalticorrinoid reduziert, bis das Cobaltatom in einwertiger Form vorliegt und dass man dann unter nichtoxydierenden Bedingungen die Gruppe R durch Umsetzung mit einem den Rest R abgebenden Mittel einführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mittel eine Verbindung der Formel RX, worin X das Äquivalent eines Anions ist, verwendet.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Halogenatom oder der Rest einer starken anorganischen oder organischen Säure ist.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Chlor-, Brom- oder Jodatom, ein Aryl-, Aralkyl- oder Alkylsulfonatrest oder ein Sulfat- oder Phosphatrest ist.

4 Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch ge- kennzeichnet, dass X eine Methansulfonyl- oder p Toluolsulfonylgruppe ist.

5. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass X ein einwertiger Oxalsäurerest ist.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der aliphatische Kohlenwasserstoffnest R mit mindestens einer aromatischen oder heterocyclischen Gruppe, einer Hydroxyl-, Ather-, Thioäther- oder Carboxylgruppe substituiert ist.

7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass R der Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder Butylrest ist.

8. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R die Hydroxyäthyl-, Carboxymethyl oder Benzylgruppe ist.

9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass R ein durch eine seiner Methylengruppen gebundener Saccharid- oder Glycosidrest ist.

10. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch ge kennzeichnet, dass der Glycosidrest R ein Nucleosid ist.

11. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch ge knnzeichnet, dass das R abgebende Mittel ein Glycosid von Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Benziminazol, Aza purin, Azapyrimidin, Pyrimidin, Purin, Xanthin, Cyt osin, Hypoxanthin, Guanin, Adenin, Uracil, 8-Aza adenin, 6-Aza-uracil oder 5-Brom-uracil mit Gluccose, Fructose, Mannose, Sorbose oder Ribose oder von einem Desoxy-Derivat dieser Kohlehydrate ist.

12. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch ge kennzeichnet, dass das Sacchanid oder Glycosid min festens ein, e geschützte OH-Gruppe trägt.

13. Verfahren nach Unteranspruch 12, dadurch ge kennzeichnet, dass die OH-Gruppe mit einer Acyl-, Acetal- oder Ketalgruppe geschützt ist.

14. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass R eine 5'-Desoxyadenosylgrappe oder eine 2', 3'-Diacetyl- oder 2' 3'-Isopropyliden-5'-desoxy- adenosylgruppe e ist.

15. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man in das vollständig reduzierte Cobalticorrinoid die Gruppe R mit Hilfe von 5'-Tosyl advnosin:einführt, 16. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man in das vollständig reduzierte Cobalticorrinoid die Gruppe R mit Hilfe von 5'-Tosyl2',3'-diacetyl-adenosin einführt.

17. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Auslgangsstoff Vitamin Ble verwendet.

18. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff eine Vitamin B1--Monocarbonsäure: oder deren Anilid oder Lactam verwendet.

19. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in einem inerten Lösungsmittel durchführt.

20. Verfahren nach Unteranspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das inerte Lösungsmittel polar ist.

21. Verfahren nach Unteranspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man als polares Lösungsmittel Wasser, einen Alkanol oder ein substituiertes Amid verwendet.

22. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Hydroxo-, Cyano-, Sulfito-, Thiocyanato- oder Nitritocobalticorrinoid verwendet.

23. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das reduzierte Cobalticorrinoid unmittelbar anschliessend an dessen Herstellung ohne sein Isolierung weiterverarbeitet.

24. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das aus dem Ausgangsstoff durch Reduktion mittels eines Metallhydrids, eines Metallions niederer Valenz, eines metallösenden Reduziermittels oder mittels Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators erhaltene Produkt ohne Zwischenisolierung weiterverarbeitet.

25. Verfahren nach Unteranspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass man den Überschuss des zur Reduktion des Cobalticorsinoids verwendeten Mittels vor, während oder nach der kondensierenden Einführung der Gruppe R zers, etzt.

26. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in einer inerten Atmosphäre durchgeführt wird.

27. Verfahren nach Unteranspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in einer Stickstoff atmosphäre durchgeführt wird.