CH496092A

CH496092A - Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz

Info

Publication number: CH496092A
Application number: CH178168A
Authority: CH
Inventors: Hayakawa Shohei; Matsushima Takashi; Minato Hitoshi; Hirose Katsumi
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1968-02-07
Filing date: 1968-02-07
Publication date: 1970-09-15

Description

Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz, die als Zygosporin A bezeichnet wird.

Als entzündungswidrige Mittel wurden bis anhin hauptsächlich Adrenocorticoide, wie z. B. Cortison, Hydrocortison, Prednison und Prednisolon, verwendet.

Diese Adrenocorticoide weisen jedoch im allgemeinen unerwünschte Nebenwirkungen auf, wenn sie während langer Zeit kontinuierlich verabreicht werden. Infolge der mit den Adrenocorticoiden verbundenen Nachteilen wurden gewisse nichtadrenocorticoide entzündungswidrige Mittel vorgeschlagen und entwickelt. Diese nichtadrenocorticoiden Verbindungen sind hinsichtlich ihrer entzündungswidrigen Wirkung den erwähnten Adrenocorticoiden jedoch im allgemeinen unterlegen.

Es erschien daher als wünschenswert, andere nichtadrenocorticoide Verbindungen zu entwickeln, die eine ebenso starke entzündungshemmende Wirkung wie die Adrenocorticoide aufweisen.

Im Verlauf der Suche nach neuen Gärungsprodukten wurde festgestellt, dass die Arten Zygosporium, MFC-61 2, das, wie weiser angeführt, als Zygosporium masonii bestimmt wurde, und MFC-702, das als Zygosporium mycophilum identifiziert wurde, in der Sammlung des Forschungslaboratoriums der Firma Shionogi & Co., Ltd., Osaka, Japan, und bei der American Type Culture Collection unter den Nummern ATCC 20011 und 20012 eingetragen, eine kristalline Substanz erzeugen, die eine starke entzündungshemmende Wirkung aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz, dem Zygosporin A. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Zygosporin erzeugender Stamm von Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum oder deren Mutanten in einem wässrigen Nährmilieu unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die entzündungshemmende Substanz aus der Gärungsbouillon gewonnen wird.

Zygosporium MFC-612 wurde aus einer Probe von toten Blättern von Daphniphyllum macropodum, die 1965 in Kyoto gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende morphologische Merkmale.

Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist mittelmässig und die Kolonie weiss und filzähnlich mit einer dunkelgrauen zentralen Strangpartie, auf der die Sporenbildung erfolgt. Die Konidienfäden sind aufrecht und bestehen aus drei Teilen: 1. Einem aufrechten Grundast, der aus 1-3 Zellen besteht, eine fahlbraune Färbung hat und 5-20 auf
2-2,5 Mikron gross ist.

2. Einem mittleren Teil, der vom Grundast getragen wird und eine aufrechte Kette von 2-4 Ende am
Ende miteinander verbundenen Bläschen bildet.

Jedes Bläschen ist dunkelbraun, 7-12 Mikron lang, von vorn gesehen gespalten, unten 2 Mikron und oben 4 Mikron breit. Von der Seite gesehen, sieht es ungefähr wie die Klinge eines Gartenmessers mit einem 2-4 Mikron langen Schnabel aus. Die Seiten wand ist dick, ausser dort, wo das nächste Bläschen angegliedert ist. Der Schnabel trägt zwei aus Sporen entstandenen Zellen, die divergierend, nach oben gebogen, eiförmig-spitz, hyalin und 46 auf 2 bis
2,5 Mikron gross sind.

3. Einer langen hyalinen apikalen Hyphe am Ende des
Konidienfadens, die 20-30 auf 1-2 Mikron gross, kontinuierlich und oben geschwollen ist und eine ovale Knolle von etwa 2,5-3,5 Mikron Durch messer bildet. Die Konidien werden einzeln aus der
Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind trocken, oval, hyalin, mit zarten Tuberkeln versehen und 6-9 auf 4-6 Mikron gross.

Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-612 als das Zygosporium masonii Hughes (S.J.Hughes: Mycol. Pap., C. M. 1., 44, 15 [1951]) bestimmt. Der gegenwärtig isolierte Stamm, nämlich Zygosporium masonii MFC-612, wurde bei der American Type Culture Collection deponiert und mit der Nummer ATCC 20011 versehen. Vorzugsweise wird das Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) auf Kartoffel-Rüben-Agar, das sich alle 3 Monate verpflanzt, bei 100 C aufbewahrt.

Anderseits wurde das Zygosporium MFC-702 aus einer Probe von toten Blättern von Osmanthus ilicifolius, die 1966 in Asakawa, Tokyo, gesammelt wurde, isoliert und zeigt folgende Merkmale.

Das Wachstum auf Kartoffel-Saccharose-Agar ist verhältnismässig langsam und die Kolonie fahlbraun.

Die Myzelen bestehen aus Hyalinen bis Subhyalinen, verzweigtkettigen und durch eine Trennwand getrennte Hyphen, die 1-3 Mikron breit sind. Sicheln werden unmittelbar vom Myzel als Seitenast getragen. Der Stengel, der das Bläschen stützt, ist zylinderförmig, 4-16 auf 2-3 Mikron gross, durch 0-1 Trennwand getrennt und braun. Das Bläschen ist dunkelbraun und obpyriform und bildet einen einseitigen Schnabel in der Spitze, 13 bis 15 Mikron lang, 6-8 Mikron in der grössten Breite, von vorne gesehen, und 4-5 bis 6 Mikron in der grössten Breite, von der Seite gesehen. Drei divergierende, aus Sporen entstandene Zellen an der Spitze des Schnabels sind Hyalin, eiförmig-spitz, manchmal gebogen und 4 bis 6 auf 3-4 Mikron gross.

Die sterile Zelle, die sich an der Spitze des Bläschens befindet, ist zylinderförmig mit einem runden, leicht geschwollenen und oft zerrissenen Ende und 5-8 auf 2-3 Mikron gross. Die Konidien werden an der Spitze jeder aus Sporen entstandenen Zelle erzeugt und sind oval und 8 bis 10 auf 6 bis 7 Mikron gross.

Auf Grund dieser Merkmale wurde das Zygosporium MFC-702 als Zygosporium mycophilum (Vuill.) Sacc. (S. J. Hughes: Mycol. Pap., C. M. I., 44, 9 [1951]) identifiziert. Der gegenwärtig isolierte Stamm, nämlich Zygosporium mycophilum MFC-702, wurde bei der American Type Culture Collection deponiert und erhielt die Nummer ATCC 20012. Vorzugsweise wird das Zygosporium mycophilum MFC-70Q (ATCC Nr. 20012) auf Kartoffel-Saccharose-Agar unter den oben beim Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) angegebenen Bedingungen aufbewahrt.

Es soll festgehalten werden, dass die erfindungsgemässe Herstellung von Zygosporin A nicht auf die Verwendung der oben beschriebenen beiden Stämme, nämlich Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) und Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nr. 20012), beschränkt ist. Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet auch andere Stämme, die mit der Art der obigen typischen Stämme übereinstimmen. Sie soll auch die Verwendung natürlicher oder künstlicher Mutationen oder Variationen, die von den oben beschriebenen Organismen aus erzeugt werden, einschliessen. Die künstliche Erzeugung von Mutationen oder Variationen kann nach einem herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Röntgenstrahlen, ultraviolette Bestrahlung und Stickstoffsenfen, bewirkt werden.

Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die entzündungshemmende Substanz Zygosporin A bei der Züchtung des Zygosporin-erzeugenden Stamms Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum in einem wässrigen Nährmilieu bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 320 C, vorzugsweise 27-29 C, unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusammensetzung des Nährmilieus kann innerhalb eines sehr weiten Rahmens variieren. Wesentlich sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Elemente. Beispiele geeigneter Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Saccharose, Lactose, Mannitol und Melassen.

Zu den geeigneten Stickstoffquellen für das Gärungsverfahren gehören Eleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Weizengluten, Baumwollsamenmehl, Casaminosäure (Säurehydrolysat von Casein), NZ-Amin (enzymatisches Hydrolysat von Casein), Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumchlorid. Beispiele geeigneter Quellen anorganischer Elemente sind Mineralsalze, wie z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat. Das Nährmilieu kann vor der Impfung des Mikroorganismus auf etwa pH 7,0 eingestellt werden oder nicht. Bei übermässiger Schaumbildung können Antischaummittel, wie z. B. Pflanzenöle, Schmalzöl und Polypropylenglycol, dem Gärungsmilieu vor oder im Verlauf der Gärung beigefügt werden.

Die maximale Ausbeute an der entzündungshemmenden Substanz Zygosporin A kann unter optimalen Temperatur- und Ventilationsbedingungen in etwa 50 bis etwa 150 und gewöhnlich in etwa 70 bis etwa 100 Stunden Gärung erzielt werden.

Im allgemeinen sammelt sich die erfindungsgemäss erzeugte Substanz Zygosporin A in erster Linie im Gärungsmilieu an. Nach dem Wachstum des Mikroorganismus wird das Myzel unter Verwendung einer herkömmlichen Ausrüstung, wie z. B. Filterpressen und Schleudervorrichtungen, aus der Gärungsbouillon entfernt, worauf Zygosporin A nach einem herkömmlichen Trennverfahren, wie z. B. Extraktion mit einem Lösungsmittel, und einem Adsorptionsverfahren aus dem Filtrat rückgewonnen wird. Gegebenenfalls können die gesammelten Myzelen ebenfalls den Extraktionsverfahren mit einem Lösungsmittel unterzogen werden, da das aktive Produkt bis zu einem gewissen Grad in den Myzelen enthalten ist.

Zu den geeigneten Lösungsmitteln zur Extraktion und zum Eluieren des Wirkstoffs gehören Methanol, Methanol, Propanol, Butanol, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Äther, Äthylacetat, Butylacetat, Amylacetat, Chloroform, Methylenchlorid, Dichloräthan, Trichloräthan, Benzol und dergleichen. Beispiele geeigneter Adsorbentien sind Celite (eine Art Diatomäenerde, Hyflo-Super-Cel (eine Art Diatomäenerde), Kieselsäure, Silicagel, Aktivkohle und dergleichen. Gewöhnlich wird eine Kombination einer Extraktion mit einem Lösungsmittel und einer Kristallisation durch Konzentration verwendet. Zum Beispiel wird das Filtrat der Kulturbouillon mit einem geeigneten mit Wasser unvermischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.

B. Äthylacetat und Chloroform, extrahiert und der Extrakt konzentriert, um den Wirkstoff in Form roher Kristalle zu fällen.

Der auf diese Weise erzielte rohe Wirkstoff wird nach herkömmlichen Verfahren, wie z. B. Umkristallisieren, Chromatographie und dergleichen, weiter gereinigt. Beispiele geeigneter Lösungsmittel für die Umkristallisation sind Aceton, Methanol und Äthanol. Die bevorzugten Adsorbentien für die Chromatographie sind Kieselsäure, Silicagel und dergleichen.

Die erfindungsgemäss erhaltene entzündungshemmende Substanz Zygosporin A besteht aus farblosen nadelartigen Kristallen, die unter Zersetzung bei 268 bis 2700 C schmelzen, wenn sie aus Aceton umkristallisiert werden. Sie ist in Methanol, Äthanol, Chloroform, Methylenchlorid, Aceton, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat und Pyridin löslich, in Äther und Benzol leicht löslich und in Petroläther und Wasser unlöslich.

Sie verhält sich als neutrale Substanz.

Die Elementaranalyse von Zygosporin A ergibt:
Kohlenstoff 71,00 %
Wasserstoff 7,29 %
Sauerstoff 18,93 %
Stickstoff 2,76 %
Die Verbindung weist ein Molekulargewicht von etwa 500 auf, durch die Methode der Herabsetzung des Dampfdrucks bestimmt. Nach der Massenspektrometrie beträgt das Molekulargewicht 507. Aus den Ergebnissen der obigen Analysen geht hervor, dass die Verbindung die Molekül formel C30H370FN aufweist.

Die spezifische Drehung von Zygosporin A ist [ ]25 - 7,50 (+ 0,60) (c = 0,55 % in Dioxan). Zygosporin A zeigt kein charakteristisches Absorptionsband im Ultraviolettbereich.

Das infrarote Absorptionsspektrum von Zygosporin A, als Kaliumbromidscheibe bestimmt, zeigt folgende Frequenzen (S = stark): 3404(S), 3240, 1742(S), 1703(S), 1693(S), 1645, 1605, 1498, 1456, 1427, 1375, 1351, 1277, 1233(S), 1178, 1127, 1049(S), 1039, 1009(S), 962 (S), 936, 907(S), 780, 751(S), 726 und 706(S) cm-l (in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt). Bei Verwendung einer Chloroformlösung zeigt das Spektrum folgende Frequenzen (S = stark): 3409(S), 1742(S), 1702(S), 1605, 1495, 1455, 1435, 1371, 1350, 1322, 1302, 1270, 1111, 1069, 1043, 1006(S), 966(S) und 911(S) cm-1 (in Fig.2 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt).

Das in Deuterochloroform (CD13) bestimmte kernmagnetische Resonanzspektrum von Zygosporin A (Fig. 3) zeigt folgende Signale (s = Singlett, d = Doublet, m = Multiplet, J = Kupplungskonstante):
9,07 (d, J = 6,8, CH3, 8,82 (d, J = 6,3, CH3),
EMI3.1

5,42 (s), 4,95 (m, 1 H), 4,75 (m), 4,43 (m),
4,02 (d, J = 3,1), 3,70 (d, J = 3,1) und
2,77 (m) z in ppm (in Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt).

Das auf diese Weise erzeugte Zygosporin A weist eine hochgradige entzündungshemmende Wirkung auf.

Zum Beispiel wurde die Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei Ratten bei oraler Verabreichung untersucht; die Ergebnisse sind zusammen mit denjenigen eines im Handel erhältlichen entzündungshemmenden Mittels, nämlich Phenylbutazon, in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1
Hemmende Wirkung gegen Oedem
Hemmung von Oedem in Prozent Dosis Zeitdauer nach der Verabreichung des Versuchsverbindung (mg/kg) entzündungshemmenden Mittels (in Stunden)
2 3
Zygosporin A 5,0 80,6 82,7
Zygosporin A 2,5 44,3 32,7
Zygosporin A 1,0 19,7 2,0
Phenylbutazon 50,0 13,7 16,8
Anmerkung: Die Ratten wurden mit der Versuchsverbindung oral vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, 1 % iges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das hervorgerufene Oedem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Oedem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.

Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei oraler Verabreichung etwa 50 Mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.

Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem wurde ferner bei Ratten bei subkutaner Verabreichung untersucht; die Ergebnisse und die mit Phenylbutazon erzielten sind in der nachstehenden Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2
Hemmende Wirkung gegen Oedem
Hemmung von Oedem in Prozent Dosis Zeitdauer nach der Verabreichung des Versuchsverbindung (mg/kg) entzündungshemmenden Mittels (in Stunden)
2 3
Zygosporin A 0,5 80,7 73,4
Zygosporin A 0,25 64,1 50,4
Zygosporin A 0,1 36,9 20,8
Phenylbutazon 100 45,9 46,3
Phenylbutazon 50 28,9 34,1
Anmerkung: Die Ratten wurden mit der Testverbindung subkutan vorbehandelt, worauf ihnen das entzündungshemmende Mittel, nämlich 1 % iges Carrageenin, subkutan verabreicht wurde. Das erzeugte Oedem wurde gemessen und mit dem ohne Vorbehandlung hervorgerufenen verglichen. Die hemmende Wirkung gegen Oedem wird als prozentuale Hemmung ausgedrückt.

Aus der obigen Tabelle 1 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Oedem bei subkutaner Verabreichung etwa 500mal grösser als diejenige von Phenylbutazon ist.

Dann wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Abszesse bei Ratten untersucht: die Ergebnisse werden in den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 gezeigt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.

Tabelle 3
Hemmende Wirkung gegen Abszesse
Abszess Gesamtdosis Versuchsverbindung (mg/kg) Mittleres Gewicht Hemmung (mg) (%)
Kontrollversuch - 2096 + 129
Zygosporin A 5 1310 + 86 37,5
Zygosporin A 10 976 + 70 53,4
Phenylbutazon 25 1815 + 98 13,4
Anmerkung: Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2 % igem Carrageein in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen. Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht. Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 Stunden später verabreicht. Die Ratten wurden 24 Stunden nach der injektion getötet und der Abszess seziert und gewogen.

Tabelle 4
Hemmende Wirkung gegen Abszesse
Abszess
Gesamtdosis Versuchsverbindung (mg/kg) Mittleres Gewicht Hemmung (mg) (%)
Kontrollversuch - 1991 + 87
Zygosporin A 1 1728 ,1106 13,2
Zygosporin A 2,5 1532 + 76 23,1
Phenylbutazon 50 1516, 112 23,9
Anmerkung: Der Abszess wurde durch die subkutane Injektion von 2 %igem Carrageenin in die Kreuzbeingegend von Ratten hervorgerufen. Dann wurden die Versuchsverbindungen oral verabreicht. Die Hälfte der Gesamtdosis wurde unmittelbar nach der Einspritzung und die zweite Hälfte 3 Stunden später verabreicht. Die Ratten wurden 24 Stunden nach der Einspritzung getötet und der Abszess seziert und gewogen.

Aus den obigen Tabellen 3 und 4 geht hervor, dass Zygosporin A bei oraler Verabreichung in seiner hemmenden Wirkung gegen Abszesse etwa 20mal wirksamer als Phenylbutazon ist.

Die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Granulation wurde durch orale Verabreichung an 6 aufeinanderfolgenden Tagen untersucht; die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 5 und 6 angeführt und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.

Tabelle 5
Hemmende Wirkung gegen Granulation
Granulom Hemmung Versuchsverbindung Tägliche Dosis mittleres Gewicht der Granulation (mg/kg) (mg) (%)
Kontrollversuch - 277,6 + 15,1
Zygosporin A 1 264,6 + 19,3 4,7
Zygosporin A 2,5 265,1 ist 20,5 4,5
Phenylbutazon 25 235,6 + 15,8 15,1
Anmerkung: Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten gesteckt wurden. Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.

Tabelle 6
Hemmende Wirkung gegen Granulation
Granulom Dosis . Granulom Hemmung Versuchsverbindung Tägliche Dosis mittleres Gewicht der Granulation (mg) (mg) (%)
Kontrollversuch - 294 + 8,4
Zygosporin A 5 263,9 + 16,9 10
Phenylbutazon 50 199,5 i 11,5 34
Anmerkung: Die Granulome wurden hervorgerufen, indem mit Carrageenin durchtränkte Kügelchen aus Filterpapier in die lacterovetrale Gegend von Ratten eingelegt wurden. Dann wurden die Versuchsverbindungen 6 Tage einmal im Tag oral verabreicht. 20 Stunden nach der letzten Verabreichung wurden die Ratten getötet, und das Granulom wurde seziert und gewogen.

Aus den Tabellen 5 und 6 geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A mindestens das Mehrfache von der von Phenylbutazon ist.

Ferner wurde die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen lokale Exudation bei Ratten bestimmt; die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 wiedergegeben und mit den mit Phenylbutazon erzielten verglichen.

Tabelle 7
Hemmende Wirkung gegen Exudation Versuchsverbindung Dosis (mg/kg) Volumen des Exudats (ml)
Kontrollversuch - 53,9 + 3,5
Zygosporin A 50 6,8 + 0,6
Zygosporin A 5 15,7 + 0,8
Zygosporin A 0,5 26,2 t 3,0
Phenylbutazon 50 27,6 + 1,7
Phenylbutazon 5 43,9 + 4,9
Anmerkung: Am ersten Tag wurden 20 ml Stickstoffgas in die Ratten subkutan injiziert, um einen Beutel zu bilden, in welchem 0,5 ml 10 W iges Krotonöl injiziert wurden. Am 6. Tag wurde die Versuchsverbindung lokal in den Beutel injiziert. Am 11. Tag wurden die Ratten getötet, und das Volumen des Exudats wurde gemessen.

Aus der obigen Tabelle geht hervor, dass die hemmende Wirkung von Zygosporin A gegen Exudation ungefähr 100mal grösser als die von Phenylbutazon ist.

Die akute Toxizität von Zygosporin A wurde bei Mäusen untersucht; die mittlere letale Dosis, das heisst der Wert LD50, beträgt subkutan 1,85 mg/kg und oral 36,0 mg/kg.

Somit ist Zygosporin A im Vergleich zu einem im Handel erhältlichen nichtadrenocortikalen entzündungshemmenden Mittel bemerkenswert wirksam. Daher kann es als wirksames nichtadrenocortikales entzündungshemmendes Mittel verwendet werden.

Der Wirkstoff Zygosporin A wird in einer Einheitsdosierungsform mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger dem lebenden Organismus zur Bekämpfung verschiedener Entzündungen und Oedeme, z. B. Rheumatismen, verabreicht. Normalerweise wird das Präparat oral verabreicht, obwohl es ebenso wirksam ist, wenn es auf eine andere Weise verabreicht wird.

Zu den verschiedenen festen Trägern, die verwendet werden können, gehören z. B. Lactose, Mannitol, Maisstärke, Talk und Magnesiumstearat sowie andere Tablettenhilfsstoffe und Füller. Gegebenenfalls können gewisse andere Ingredienzien, wie z. B. Hydrocortison, Prednisolon, Aminopyrin, Chloroquine, Phenylbutazon und dergleichen, mit dem erwähnten Wirkstoff vermischt werden.

Folgende Beispiele sollen die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.

Beispiel 1
Eine Samenkultur wird nach folgendem Dreistufenverfahren hergestellt: 1. Eine schräg im Reagensglas angelegte Kartoffel
Saccharose-Agar-Kultur wird erzeugt, indem 1,5%
Agar in ein Kartoffel-Saccharose-Milieu gegeben wer den, das aus (durch 20minutiges Kochen von 200 g geschnittenen Kartoffeln in 500 ml Wasser erzeug tem) Kartoffelsaft, 10 g Saccharose und genügendem
Wasser, damit man im Ganzen 1 Liter erhält, besteht. Zygosporium masonii MFC-6t12 (ATCC
Nr. 20011) wird in die Kultur geimpft und 7 bis
10 Tage bei 27-28 C gezüchtet, bis die Sporen bildung zu Ende ist.

2. 100 ml Kartoffel-Saccharose-Milieu, das dieselbe
Zusammensetzung wir das oben beschriebene auf weist, werden in einen 500-ml-Kolben gegeben, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge Sporen aus der obigen Kultur geimpft. Die Zucht erfolgt
3 Tage bei 27-280 C unter Schütteln.

3. 50 ml der Kulturbouillon werden in 500 ml eines neuen Kartoffel-Saccharose-Milieus gegeben, das aus den oben beschriebenen Materialien besteht, in einen 2-Liter-Kolben gegossen und vorgängig sterili siert. Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27-280 C, und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als
Impfmaterial verwendet.

20 Liter Kartoffel-Saccharose-Milieu der oben beschriebenen Zusammensetzung werden in ein 30-Liter Gärungsgefäss gegeben, sterilisiert und mit 500 ml des oben hergestellten Impfmaterials geimpft. Die Zucht erfolgt 4 Tage bei 27-28 C unter Rühren (250 Umdrehungen/min), bei Lüftung (20 Liter/min) und bei einem Druck von 0,5 bis 0,7 kg/cm2.

500 g Celite (Diatomäenerde) werden in die Kulturbouillon gegeben und ausgeschleudert, um (1,1 kg einschliesslich des Celits) Myzelen und 17 Liter oben schwimmende Flüssigkeit zu erzielen.

Den Myzelen werden 1,5 Liter Methanol beigefügt, und das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren wird das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert und der Rückstand mit Athylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser, 2n Natriumcarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50-600 C verdampft, wobei ein öliger Rückstand zurückbleibt, der durch Behandlung mit Aceton kristallisiert wird; man erhält 18,1 mg Zygosporin A.

Anderseits werden die 17 Liter oben schwimmende Flüssigkeit dreimal mit je 7 Liter Äthylacetat extrahiert.

Der etwa 20 Liter ausmachende Extrakt wird mit Wasser, mit 2n Natriumcarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei 50-600C verdampft. Der Rückstand wird mit Äther oder Aceton behandelt, wobei man 277 mg kristallines Zygosporin A erhält.

Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines Zygosporin A, F = 268-2700 C, in Form von farblosen Nadeln erzielt.

Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird mit Zygosporium mycophilum MFC-702 (ATCC Nur.20012) anstelle von Zygosporium masonii MFC-612 (ATCC Nr. 20011) durchgeführt; Zygosporin A wird bei ungefähr gleicher Ausbeute wie in Beispiel 1 aus der Kulturbouillon rückgewonnen.

Beispiel 3
Eine Samenkultur wird nach folgenden Dreistufenverfahren hergestellt: 1. Eine schräg im Reagensglas angelegte Kartoffel
Saccharose-Agar-Kultur wird aus 200 g Kartoffeln,
10 g Saccharose, 5 g Agar und 1 Liter Wasser erzeugt. Die Kultur wird mit Zygosporium masonli MFC > 612 (ATCC Nr. 20011) geimpft und 7 Tage bei 280 C gezüchtet.

2. 100 ml eines 3,0% Glucose, 2,0% Pepton und 0,5 %
Natriumchlorid (pH 6,0) enthaltenden wässrigen
Nährmilieus werden in einen 500-ml-Kolben gege ben, sterilisiert und mit einer geeigneten Menge
Sporen aus der obigen Kultur geimpft. Die Zucht wird 4 Tage bei 280 C unter Schütteln (140 Bewe gungen in der Minute mit einer Amplitude von
7 cm) durchgeführt.

3. 30 ml Kulturbouillon werden in 700 ml eines neuen
Nährmilieus gegeben, das aus den gleichen Materia lien wie in obigem Verfahren 2 besteht, in einen
2-Liter-Kolben gegossen und vorgängig sterilisiert.

Die Zucht erfolgt 3 Tage bei 280 C unter Schütteln (300 Umdrehungen/min), und die auf diese Weise erzielte Kulturbouillon wird als Impfmaterial ver wendet.

70 Liter eines 3,0% Glucose, 2% Pepton und 0,5 % Natriumchlorid (pH 6,8) enthaltenden wässrigen Nährmilieus werden in einem 100-Liter-Behälter gegeben.

84 g P-2000 (Polypropylenglycol, ein von der Firma The Dow Chemical Company hergestelltes Antischaummittel) werden beigefügt, und das Gemisch wird sterilisiert. Das Milieu wird mit 2,1 Liter des oben beschriebenen Impfmaterials geimpft und die Zucht 3 Tage bei 280 C unter Rühren (370-380 Umdrehungen/min), unter Lüftung (70 Liter/min) und bei einem Druck von 0,7 kg/cm2 durchgeführt.

Die Kulturbouillon wird ausgeschleudert, um die Myzelen zu entfernen, und die 67 Liter oben schwimmende Flüssigkeit werden zweimal mit je 20 Liter Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck verdampft, wobei man 5,7 g rohes Zygosporin A erhält. Durch Umkristallisieren aus Aceton werden 5,4 g reines Zygosporin A, F = 268-2700 C (Zers.) in Form von farblosen Nadeln erzielt.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung einer entzündungshemmenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zygosporin erzeugender Stamm von Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum oder deren Mutanten in einem wässrigen Nährmilieu unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die entzündungshemmende Substanz aus der Gärungsbouillon gewonnen wird.

UNTEPANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zygosporin erzeugender Stamm von Zygosporium masonii oder Zygosporium mycophilum 50 bis 150 Stunden bei 25-320 C in einem wässrigen Milieu unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die entzündungshemmende Substanz aus der Gärungsbouillon gewonnen wird.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zygosporin erzeugende Stamm Zygosporium masonii ATCC Nr. 20011 ist.

3. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Zygosporin erzeugende Stamm Zygosporium mycophilum ATCC Nr. 200112 ist.