CH506558A - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinantibiotica - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung von   Cephalosporinantibiotica   
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren herstellbaren neuen Cephalosporinverbindungen haben folgende allgemeine Formel:
EMI1.1     
 in der R einen organischen Rest, R' Wasserstoff oder eine Acetoxygruppe und M ein pharmazeutisch annehmbares Kation bedeutet. Die Verbindungen enthalten eine Doppelbindung in der 3-Stellung und einen Dihydrothiazinring mit einem damit verschmolzenem   ss-Lactam.    Einige Verbindungen dieser Klasse haben zu der Annahme veranlasst, dass sie brauchbare Antibiotica zur Bekämpfung von Krankheiten, die durch verschiedene Gram-positive und Gram-negative Mikroorganismen verursacht werden, sind.

  Einige Cephalosporinverbindungen, beispielsweise   Natri umceph alotin- [7-(2'-thi enyl)- acetamidocephalosporansäurenatriumsalz] ,    werden im erheblichem Umfang als parenterale Antibiotica verabreicht, es besteht jedoch weiter ein Bedarf an anderen und besseren Antibiotica. Eine erhebliche Verbesserung wird nun dadurch erzielt, dass sich die erfindungsgemässen herstellbaren Verbindungen bei oraler Verabreichung durch eine beträchtliche Aktivität als Antibiotica auszeichnen.



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von   Cephalosporinantibiotica    der Formel
EMI1.2     
 worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen und R' Wasserstoff oder eine Acetoxygruppe bedeuten, oder deren inneren Salzen oder Salzen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure oder Base, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man 7-Aminocephalosporansäure bzw. 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure oder deren wasserlösliche Salze mit einem entsprechenden Acylierungsmittel acyliert, dessen Aminogruppe geschützt ist, und die Schutzgruppe entfernt.



   Die erhaltenen Verbindungen können Einzelverbindungen oder verschiedene Mischungen stereoisomerer Formen von   optisch    aktiven Isomeren sein. Diese Verbindungen werden im allgemeinen in Form der   Zwitter-     ionen oder inneren Salze hergestellt. Sie können auch in Form von Salzen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Base, beispielsweise in Form von Alkalimetallsalzen, zum Beispiel als Natrium- oder Kaliumsalz und als Ammonium- und substituierte Ammonium- und Aminsalze oder als Anion in einem pharmazeutisch annehmbaren anionischen Salz mit einer starken Säure (d. h. einem Säureadditionssalz einer starken Säure mit einem pK'a unter 4), zum Beispiel als Salz mit Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Trifluoressigsäure und dergleichen verwendet werden.

  Vorzugsweise werden diese Verbindungen in der oben erwähnten Zwitterionen- oder inneren Salzform hergestellt und als Antibiotica verwendet.



  Beispiele für erfindungsgemäss herstellbare Verbindungen sind nachstehend als freie Aminosäureverbindungen angegeben, es ist jedoch zu beachten, dass sie in den verschiedenen Salzformen, die oben genannt wurden, verwendet werden können.



     7-[4-(Aminomethyl)phenylacetamido]-    cephalosporansäure   7-[4-(a-Aminoäthyl)phenylacetamido]-    cephalosporansäure 7-[4-(a-Aminopropyl)phenylacetamido] cepahlosporansäure   7-[4'-(a-Aminoäthyl)phenylacetamido]-    desacetoxycephalosporansäure, und   7-[4'-(a-Aminopropyl)phenylacetarnido]-    desacetoxycephalosporansäure.



   Die neuen Cephalosporansäureverbindungen sind insofern mit Cephalosporin C verwandt, als sie den 5,6-Dihydro-6H-thiazin-Ring mit einem in 5,6-Stellung damit verbundenen   ss-Lactamring    enthalten, der für Cephalosporin C charakteristisch ist. Im Unterschied zu Cephalosporin C, das in 7-Stellung die 5'-Amino N'-adipamylgruppe enthält, zeichnen sich die neuen Verbindungen jedoch durch eine Acylamidogruppe in 7-Stellung mit einem a-Amino-niederalkyl-Substituenten in der 4-Stellung an dem Phenylring eines Phenylessigsäurerest als Acylgruppe aus. Die neuen   Desacetoxycephalosporansäureverbindungen    enthalten ausserdem in 3-Stellung eine Methylgruppe anstelle einer Acetoxymethylgruppe, wie es bei Cephalosporin C der Fall ist.

  Im Gegensatz zu Cephalosporin C, das eine verhältnismässig geringe antibakterielle Wirkung hat, sind die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen ferner hochwirksame antibakterielle Mittel, die das Wachstum zahlreicher Arten von Mikroorganismen in den verschiedensten Umgebungen zu inhibieren vermögen.



   Cephalosporin C, das das zweckmässigste Ausgangsmaterial zur Herstellung der neuen Verbindungen darstellt, kann durch Züchten eines Cephalosporin C erzeugenden Organismus in einem geeigneten Nährmedium hergestellt werden, wie es in der britischen Patentschrift   810196    beschrieben ist. Cephalosporin C kann auch nach einem in der USA-Patentschrift   3 082 155    beschriebenen Verfahren hergestellt werden, bei dem Cephalosporin C erzeugende Schimmelpilze der Species, zu der Cephalosporium I.M.I. 49137 gehört, in einem Medium, das geeignete Nährstoffe, hierunter eine Quelle für organischen Stickstoff, enthält, in Gegenwart von molekularem Sauerstoff verwendet und das dabei erzeugte Cephalosporin C abgetrennt wird.



   Cephalosporin C lässt sich leicht in die entsprechende Grundverbindung 7-Aminocephalosporansäure(7-ACA), durch Spaltung der 5'-Amino-N'-adipamyl-Seitenkette zwischen ihrer Amidocarbonylgruppe und deren Amidostickstoff zweckmässig durch Umsetzung von Cephalosporin C mit   Nytrosylchlorid    in Ameisensäure und anschliessende hydrolytische Spaltung nach dem Verfahren der USA-Patentschrift 3 188 311 überführen.



   Wenn die   Desacetoxycephalosporansäureverbindungen    gewünscht werden, kann Cephalosporin C in Desacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) durch übliche Verfahren, zum Beispiel durch katalytische Hydrierung von Cephalosporin C und anschliessende hydrolytische Entfernung der 5-Aminodipoylseitenkette übergeführt werden, wie es beispielsweise in der USA-Patentschrift 3 129 224 beschrieben ist. Die 7-ADCA wird dann anstelle der 7-ACA zur Herstellung der neuen Verbindungen verwendet.



   Die neuen   7-{2'-[4"-(a-Aminoalkyl)phenylj- acetamido)cephalosporansäureverbindungen    werden durch Acylierung der 7-ACA oder 7-ADCA entweder als freie Säure oder als ein geeignetes wasserlösliches Salz, wie sie in der USA-Patentschrift 3 207 755 beschrieben sind, mit einem Acylierungsmittel, das sich von der gewählten 4-(a-Aminoalkyl)-phenylessigsäure ableitet, nach üblichen Acylierungsverfahren hergestellt. Ein zweckmässiges Acylierungsmittel für diesen Zweck ist das entsprechende 4a-Aminoalkylphenylacetylchlorid oder -bromid, in dem die Aminogruppe in üblicher Weise mit einer blockierenden Gruppe, zum Beispiel einer Carbobenzoxy-, Carboallyloxy-, tert.-Butoxycarbonyl-,   ss-Oxoalkyliden-,    Furfu ryloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonylgruppe oder dergleichen geschützt ist.

  Die Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA wird in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchgeführt, vorzugsweise unter praktisch neutralen pH-Bedingungen und vorzugsweise bei oder etwas unter Zimmertemperatur, zum Beispiel oberhalb des Gefrierpunktes der Reaktionsmischung und bis zu etwa 200 C. Nach einer typischen Arbeitsweise wird 7-ACA oder 7-ADCA zusammen mit einer ausreichenden Menge Natriumbicarbonat oder einem anderen geeigneten Alkali, so dass vorzugsweise der pH-Wert der Mischung zwischen 5 und 9 gehalten und die Salzbildung und Auflösung gefördert wird, in wässrigem 50-volumenprozentigem Aceton gelöst, so dass die Konzentration der 7-ACA oder 7-ADCA etwa 1 bis 4   Gewichts- /o    beträgt.

  Man kühlt die Lösung auf etwa 0 bis   5  C    und setzt unter Rühren und Kühlen die Lösung des geschützten   4-Aminoalkylphenylacetylchlorids    oder -bromids als Acylierungsmittel in etwa   200/obigem      Überschuss    zu.

 

  Der pH-Wert der Mischung kann, wenn er sich verändert, durch Zusatz von Natriumbicarbonat oder durch Einleiten von Kohlendioxyd etwa beim Neutralpunkt (pH 6 bis 7,5) gehalten werden. Nach beendeter Zugabe des Acylierungsmittels wird die Reaktionsmischung weiter gerührt und auf Zimmertemperatur erwärmen gelassen. Dann wird das Reaktionsprodukt mit Salzsäure oder einer anderen geeigneten Säure auf etwa pH 2 angesäuert, um die freie 7- {2'-[4"-(blockierte-a-Aminoalkyl)phenyl]-acetamido}cephalosporansäure oder die entsprechende Desacetoxycephalosporansäure zu bilden, die dann mit einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Äthylacetat, extrahiert wird.

  Der organische Lösungsmittelextrakt, der das blockierte Amino  säurederivat von 7-ACA oder 7-ADCA enthält, wird mit einem alkalischen Material, zum Beispiel Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd und einem geeigneten Amin oder einer anderen Base, die nach Bedarf ein Natrium-, Kalium-, Ammonium- oder anderes Kation enthält, auf etwa pH 5,5 eingestellt und mit Wasser extrahiert. Die wässrige Lösung, die das blockierte Aminozwischenprodukt als Anion in der Salzform enthält, wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in der Mindestmenge warmen Methanols aufgenommen, und das gewünschte Produkt wird durch Abkühlen und/oder Ein dampfen gegebenenfalls mit Isopropanol als Antilösungsmittel abgeschieden. Das so erhaltene kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.



   Vor oder nach dem Kristallisieren kann das so erhaltene Zwischenprodukt in üblicher Weise zur Entfernung der Schutzgruppe der Aminoalkylfunktion behandelt werden, zweckmässig durch Hydrierung unter milden Bedingungen in Gegemwart eines Palladiumkatalysators oder durch Behandlung unter milden sauren Bedingungen während kurzer Zeit (zum Beispiel mit Ameisensäure bei etwa Zimmertemperatur während etwa 1 bis 5 Stunden). Dieses Zwischenprodukt kann auch mit Trifluoressigsäure behandelt werden, um die Schutzgruppe zu entfernen und das Trifluoressigsäuresalz der gewünschten    7-{2'-[4"-(Aminoalkyl)-phenyl]- acetamido) cephalosporansäure    oder desacetoxycephalosporansäure zu bilden.

  Durch Behandlung dieses Säuresalzes mit einem geeigneten Anionenaustauscherharz in Basen- oder Acetatform nach üblichen Verfahren kann man die Trifluoressigsäuresalzgruppe entfernen und die   Zwitterionenform    des Produkts erzeugen. Zu Anionenaustauscherharzen, die für diesen Zweck geeignet sind, gehören beispielsweise die schwachen Anionenaustauscher, zum Beispiel die unter den Handelsbezeichnungen  Amberlite IR4B  und  De-acidite-E  bekannten Harze in der Acetatform und die starken Anionenaustauscher, die zur Entfernung von Chlorid und anderen Anionen aus der Cephalosporinlösung verwendet werden, beispielsweise  Amberlite IRA-400 ,  Dowex 1  oder  De-acidite FF .

  Zu geeigneten organischen Anionenaustauscherharzen, die zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden können, gehören beispielsweise diejenigen, die von der Rohm and Haas Co. unter der Handelsbezeichnung  Amberlite La-1  und  Amberlite La-2  auf den Markt gebracht werden und in der USA-Patentschrift 2 870 207 beschrieben sind. Das Anionenaustauscherharz  Amberlite   La-1      ist ein Vertreter einer Gruppe von hochmolekularen flüssigen sekundären Aminen, die wasserunlöslich, jedoch in Kohlenwasserstoffen und anderen nichtwässrigen Lösungsmitteln gut löslich sind.



    Amberlite   La-1  -Harz    hat beispielsweise eine Konfiguration aus zwei hochverzweigten aliphatischen Ketten, die an das Stickstoffatom gebunden sind. Diese Struktur ist für seine hervorragende Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und seine ausserordentlich geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen verantwortlich. Diese Löslichkeitseigenschaften in Verbindung mit der Fähigkeit von sekundären Aminen, mit Säuren unter Bildung der entsprechenden Aminsalze zu reagieren, machen das Harz für die Entfernung von sauren Bestandteilen aus einer wässrigen Lösung geeignet.



   Die Acylierung der 7-ACA oder 7-ADCA kann auch mit einer geeigneten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure in Verbindung mit einem Carbodiimid durchgeführt werden. Die Acylierung erfolgt in solchen Fällen bei gewöhnlichen Temperaturen. Für diesen Zweck sind beliebige Carbodiimide geeignet, die als aktive Gruppe die -N=C=N=-Struktur aufweisen. Zu Beispielen dafür gehören   N,N'-Diäthylcarbodiimid,    N,N'-Di-n -propylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Diallylcarbodiimid,    N,N'-Bis(p-dimethylaminophenyl)carbodiimid, N-Athyl-N'(4"-Athyl-2"-oxazinyl)carbodiimid    und dergleichen. Andere geeignete Carbodiimide sind in der USA-Patentschrift 3 252 973 beschrieben.



   Alternativ kann die Acylierung von 7-ACA oder7 ADCA mit einem aktivierten Derivat der gewählten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure, zweckmässig dem entsprechenden Säureanhydrid oder einem gemischten Anhydrid oder einem aktivierten Ester, zum Beispiel dem p-Nitrophenyl- oder Cyanmethylester, durchgeführt werden.



   Einige dieser 4-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäureverbindungen enthalten als solche oder in einer für die Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA geeigneten Form, zum Beispiel in Form des Acylhalogenids, gemischten Anhydride oder Halogenformiats asymmetrische Kohlenstoffatome und können daher in optisch aktiven isomeren Formen vorliegen. Diese stereoisomeren Verbindungen können in Form der getrennten Isomeren oder als verschiedene stereoisomere Mischungen der optischen Isomeren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden.

  Ein Beispiel für gemischte Verbindungen nach dieser Erfindung ist eine stereoisomere Mischung von 7-{2'-[4"-(d- und l-a-Aminoäthyl)   phenyl] acetamidocephalosporansäure    die beispielsweise durch Umsetzung von 7-ACA mit Mischungen von 4'-(d und 1-a-Aminoäthyl)phenylessigsäure oder deren reaktiven Derivaten oder durch Vermischen der einzelnen d- und   Isomeren    der 7-{2'-[4"-(a-Aminoäthyl)   phenyl] acetamido) cephalosporansäureverbindungen,    die wie in den folgenden Beispielen 1 bis 4 beschrieben hergestellt werden, erhalten werden.



   Wenn die einzelnen optischen Cephalosporinisomeren gewünscht werden, kann die als Ausgangsmaterial gewählte 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure in üblicher Weise aufgetrennt werden, zum Beispiel indem man die freie Säure mit Cinchonin, Strychnin, Brucin oder dergleichen umsetzt, dann die entstandenen Salze zur Trennnung der diastereoisomeren Salze fraktioniert kristallisiert und anschliessend die getrennten isomeren Salze getrennt ansäuert, um die gewünschte optisch aktive d- oder 1-Säure freizusetzen. 

  Jede der so erhaltenen d- und   1-4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäuren    kann als solche mit einem Carbodiimid zur Acylierung von 7-ACA oder 7-ADCA eingesetzt oder nach üblichen Verfahren in das entsprechende Säurehalogenid, gemischte Anhydrid oder Halogenformiat als Acylierungsmittel übergeführt werden, wobei dafür gesorgt wird, dass extreme Bedingungen vermieden werden, die zur   Racemisierungen    führen könnten.  



   Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.



   Beispiel I
Eine Mischung aus 475 mg (5 mMol) Methylenchlorformiat in 25 ml Aceton, das 2 Tropfen Dime   thylbenzylamill    enthält, wird in einem Eis-Alkohol-Bad gekühlt. Die gekühlte Mischung wird unter Rühren während 30 Minuten tropfenweise mit 1,4 g (5 mMol)    4-[N-(tert.-Butoxycarbonyl)d- fl-aminoäthyl] phenylessigsäure    in 25 ml Aceton, das 500 mg Triäthylamin enthält, versetzt, um das gemischte Anhydrid zu bilden. Dann wird langsam unter Rühren während 5 Minuten eine vorher mit Aktivkohle behandelte und gekühlte Mischung von 1,5 g (5,5 mMol) 7-ACA in 30 ml Wasser, das 550 mg (5,5 mMol) Triäthylamin enthält, zugesetzt.

  Die Mischung wird in der Kälte eine weitere Stunde gerührt, um eine möglichst vollständige Umsetzung zu der blockierten   Amino-7-(2'-4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl d-a-aminoäthyl)phenyl]-acetamido}cephalosporansäure    zu gewährleistcn.



   Zur Reinigung der erhaltenen Säure entfernt man das Aceton, wäscht den Rückstand mit Wasser, kühlt die Mischung und extrahiert in ein nichtwässriges   Lösungsmittel    indem man die Mischung in Gegenwart von Äthylacetat mit   1n    Salzsäure auf pH 2,5 ansäuert.



  Eine Abscheidung von 7-ACA wird nicht festgestellt.



  Das Lösungsmittelsystem wird getrennt, und das Produkt in der   Äthylacetatschicht    wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des   Athylacetats      werden      2,5 g      (930/,    Ausbeute) des gewünschten N-blockierten Cephalosporins als amorpher Rückstand erhalten, der nicht kristallisiert werden kann.

  Das blokkierte Aminosäurederivat von 7-ACA wird mit Diisopropyläther verrieben und im Vakuum getrocknet, wodurch 2.0 g   7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-d-a-      aminoäthyl)phenyl]acetamido)    cephalosporansäure mit folgenden Analysenwerten erhalten werden:
Analyse für   C2oH3tN306:   
Berechnet: C   56,28 6/0    H   5,86 0/o    N   7,88 0/0   
Gefunden: C   55,94wozu    H   6,41 0/0    N   6,91 0/0   
Der pK'a der Verbinduno beträgt 4,95. Das Ultraviloettspektrum ergibt   Am2ss0      =   8050 in Äthylalkohol.



   Beispiel 2
1 g der wie in Beispiel 1 hergestellten   7- {2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-d-a-aminoäthyl- pheny]acetamidocephalosporansäure    wird in 10 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden in der Kälte gehalten, um die tert,-Butoxycarbonylschutzgruppe abzuspalten und das Trifluoressigsäuresalz von   7- {2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)-phenyl] acetamido} -    cephalosporansäure zu bilden. Dieses Salz wird aus der Lösung durch Zusatz von wasserfreiem   Äthyl äther    in 3 Anteilen von jeweils   30ml    abgeschieden. Das Salz wird von der Flüssigkeit abgetrennt, in einer Zentrifuge mit Äthyl äther gewaschen und in einem Vakuumexsikkator getrocknet.

  Man erhält 800 mg   (78 0/0    Ausbeute) des Trifluoressigsäuresalzes von   7-[-d-4-a-Aminoäthylphenylacetamido] -    cephalosporansäure mit pK'a-Werten von 4,7 und 9,2. Das Ultraviolettspektrum in Äthanol ergibt   Am260    =7730.



   500 mg (0,9 mMol) des Trifluoressigsäuresalzes von   7-(2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)phenyl]-    acetamido}cephalosporansäure werden in 4 ml Wasser gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur in 20 ml einer flüssigen Mischung von 25   o/o    Anionenaustauscherharz ( Amberlite La-1 ) in der Acetatform in Methylenisobutylketon gerührt.



  Die wässrige Phase wird abgetrennt, mit Methylisobutylketon und dann mit Äthyläther gewaschen. Das Zwitterionenprodukt (inneres Salz)   7-{2'-[4"-d-a-Aminoäthyl)phenyl]-    acetamido}cephalosporansäure fällt beim Einengen der Mischung im Vakuum aus, kristallisiert jedoch nicht. Das Gewicht des gewonnenen Produkts beträgt 265 mg (68    /n    Ausbeute). Das Infrarot- und Ultraviolettspektrum stimmen mit der angenommenen Struktur überein. Die Verbindung hat pK'a-Werte von   4,8    und 9,35 und einen spezifischen   Drehwertvon T 103,6 .   



   Dieses Produkt   7-{2'-[4"-(d-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido)-cephalosporansäure    weist minimale   Hemmkonzentrationen    (MIC) gegen über vier klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von 0,2 bis   0,8,ug/ml    in Gegenwart menschlichen Blutserums und von 0,3 bis   0,8,zug/    ml in Abwesenheit von Serum gegenüber einer MIC von Serum und von 0,9 bis   2,2,ug/ml    für Cephaloglyvon Setum und von 0,0 bis   2,2cg/ml    für Cephaloglycin in Abwesenheit von Serum, aufgrund von Messungen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren auf.

  Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis   (ED,o),    gegenüber   13-hämolytischem    Streptococcus pyogenes, Stamm 0203 bei zweimaliger oraler Verabreichung an Mäuse von 7,5 mg/kg
Gegenüber Gram-negativen Organismen werden nach einem standardisierten Gradienten-Platten-Verfahren folgende minimale Hemmkonzentrationen festgestellt:

  : Organismus MIC    Fgiml    N- 9   Shigellasp.    24 N-10   Escherichia coli    15 N-26   Escherichia coli    16 X-26 Klebsiella   pneumoniae    10 X-68 Aerobacter aerogenes 10 K- 1 Klebsiella pneumoniae  >  50
Shigella sonnei 20
Beispiel 3
Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird   7- {2'-[4"-(N-tert.-ButoxycarbonyM-a- aminoäthyl)phenyl] acetamido) cephalosporansäure    durch Umsetzung von  2-[4'-(N-tert. -Butoxycarbonyl-la-aminoäthyl)phenyl] acetylchlorid mit 7-ACA hergestellt.



   Nach Verreiben der Verbindung in Diisopropyl äther werden 1,8 g   7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-l-a- aminoäthyl)phenyl] acetamido) cephalosporansäure    als Produkt erhalten, das nicht schmilzt, sich aber bei etwa   1100 C    zersetzt. Die Ultraviolett-Hauptabsorption bei   Am362      mit    beträgt in Äthylalkohol 7400 und in Wasser 8200. Die Verbindung weist einen pK'a von 4,9 auf.



  Das Infrarotspektrum stimmt mit der Struktur überein.



  Das Produkt weist folgende Analysenwerte auf:
Analyse für   C2sH3tN308S:   
Berechnet: C   56,270/o    H   5,860/o    N   7,880/o   
Gefunden: C   55,690/0    H   6,39 0/o    N   7,64 0/   
Beispiel 4
1 g   7-(2'-C4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl)-l-a-      aminoäthyl)phenyl acetamido)cephalosporansäure    (wie in Beispiel 3 hergestellt) wird in 10 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden in der Kälte gehalten, um die Schutzgruppe abzuspalten und das Trifluoressigsäuresalz von   7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido}cephalosporansäure    zu bilden.

  Das Salz wird aus der Lösung durch Zusatz von wasserfreiem   Athyläther    in drei Anteilen von jeweils 30 ml abgeschieden. Das abgeschiedene Salz wird von der flüssigen Phase abgetrennt, auf einer Zentrifuge gewaschen und in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Das Gewicht des   Trifluoressigsäuresalzes    von   7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido) cephalosporansäure    beträgt   820 mag.    Das Salz weist pK'a-Werte von und 9,2 auf. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260   m       6700.   



   500 mg des Trifluoressigsäuresalzes von   7-{2'-[4"-Qa-Aminoäthyl)- phenyl] acetamido) cephalosporansäure    werden in   10ml    Wasser gelöst und eine Stunde bei Zimmertemperatur mit 20 ml einer flüssigen Mischung von 25   o/o    Anionenaustauscher  Amberlite   LA-1     in der Acetatform in Methylisobutylketon gerührt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit Methylisobutylketon und dann mit Wasser gewaschen. Durch Einengen der wässrigen Mischung, bis sie fast trocken ist, erhält man 275 mg (70   O/o    Ausbeute) eines kristallinen Zwitterionenprodukts (inneres Salz) von   7-{2'-[4"-(1-a-Aminoäthyl)phenyl]- acetamido) cephalosporansäure.   



  Das Ultraviolettspektrum zeigt   Am260    =7720.



  Die Verbindung weist zwei pK'a-Werte bei 4,7 und 9,3 auf. Das Infrarotspektrum stimmt mit diesem Produkt überein Der spezifische Drehwert der Verbindung beträgt   +      97,8 .   



   Das Produkt 7-{2'-[4"-(l-a-Aminoäthyl)phenyl]acetamido}cephalosporansäure weist aufgrund von Messungen nach dem Gradienten Platten-Verfahren eine minimale Hemmkonzentration (MIC) gegenüber klinischen Isolaten von   penidllinresi-    stenten   Staphyiococcus    aureus von 0,1 bis 1   ,t4g/ml    in Gegenwart von menschlichem Blutserum und von 0,4 bis   0,5,ug/ml    in Abwesenheit von Serum im Vergleich zu einer MIC von 1,4 bis   9,ug/ml    für Cephaloglycin in Gegenwart von Serum und 0,9 bis 2,2 g/ml für Cephaloglycin in Abwesenheit von Serum auf. Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis   (ED;,)    von 5,14 mg/ kg gegenüber ss-hämolytischem Streptococcus pyogenes, Stamm 203 bei zweimaliger Verabreichung an Mäuse.

  Gegenüber Gram-negativen Organismen weist es folgende minimale Hemmkonzentrationen auf: Organismus MIC mcg/ml N-9 24 N-10 10 N-26 11 X-26 7 X-68 4   X-l    750 Shigella sp. 16
Beispiel 5
2,75 g (10,4 mMol)   2-[4'-(tert.-Butoxycarbonyl-      aminomethyl)-phenyl l    essigsäure werden in einer Mischung aus 30 ml Dioxan und 15 ml Aceton gelöst. Die Mischung wird mit 1,05 g (10,4 mMol) Triäthylamin in 5 ml Aceton versetzt. Man kühlt die Mischung in einem Eis-Alkohol-Bad und gibt dann in 20 Minuten tropfenweise unter Rühren eine Lösung von 1,41 g   Isobutylchlorformiat    in 5 ml Dioxan zu. Die Mischung wird weitere 10 Minuten bei etwa   -5  C    gerührt, um eine vollständige Umsetzung zu dem gewünschten gemischten Anhydrid zu gewährleisten.

  Die gekühlte Mischung wird dann auf einmal mit einer frisch zubereiteten Lösung von   2,S3    g (10,4 mMol) 7-ACA und 1,05 g Triäthylamin in 20 ml kaltem Wasser versetzt. Man lässt die Mischung bei   0     C über Nacht stehen. Die Mischung wird im Vakuum eingeengt, um einen Teil des Dioxans und Acetons zu entfernen. dann mit 30 ml Wasser verdünnt und mit 150 ml Äthylacetat gewaschen. Dann wird die Mischung mit 200 ml Äthylacetat überschichtet und unter Rühren mit 1 n Salzsäure auf pH 2,8 eingestellt.



  Man trennt die Schichten, wäscht die Athylacetatschicht zweimal mit je 100 ml Wasser, schichtet das   Athylace-    tat, das das blockierte Aminoprodukt enthält, über 150 ml Wasser und stellt den pH-Wert der Mischung mit in Kaliumhydroxyd auf 6,5 ein, um das Kaliumsalz von 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonylaminomethyl)   phenyl]acetamidocephalosporansäure    zu erzeugen. Dieses Salz in der wässrigen Phase wird mit 100 ml   Athylacetat    gewaschen und nach Abtrennung der wässrigen Phase von dem Äthylacetat wird die wässrige Phase im Vakuum eingedampft, wobei das Salz als halbkristalliner Rückstand zurückbleibt. Dieser Rückstand wird durch Auflösen in 15 ml warmem Methanol, Filtrieren der erhaltenen Lösung und anschliessende Zugabe von etwa 15 ml Isopropanol zur Kristallisation des Salzes gereinigt. 

  Die Salzkristalle in der flüssigen Mischung werden auf   0     C gekühlt, abfiltriert und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 1 g des  7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxy   carbonylaminoäthyl)phenylj acetamido }- cephalosporansäure-kaliumsalzes.   



  Das Infrarotspektrum stimmt mit dem angegebenen Produkt überein.



  Das Ultraviolettspektrum ergibt   Am260    =8140.



  Der pK'-a-Wert beträgt 4,8.



   0,75 g dieses Salzes werden in 15 ml Wasser gelöst und dann mit 15 ml 98   0/obiger    Ameisensäure versetzt.



  Die Mischung wird etwa 3,5 Stunden bei   40C    C gerührt. Dann engt man sie im Vakuum zu einem gummiartigen Körper ein, der kristallisiert. Das so erhaltene   7-{2'-[4"-(Aminomethyl)-phenyl]- acetamido}-cephalosporanat    ist in heissem oder kaltem Wasser nur wenig löslich, in Äthylacetat und Essigsäure unlöslich, jedoch löslich in Ameisensäure. Man suspendiert das Salz in 10 ml Wasser und stellt mit 1 n Salzsäure auf pH 1 ein, wobei sich die Hauptmenge des Feststoffes löst. Man filtriert die Lösung und stellt den pH-Wert durch Zusatz von 5 n Natriumhydroxyd auf 4,2 ein. Es bildet sich eine kleine Menge eines flockigen Niederschlags, der abfiltriert wird.

  Das Filtrat, das das innere Salz von   7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]-    acetamido}-cephalosporansäure enthält, macht etwa 20 ml aus und wird im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei Kristallisation erfolgt.



  Die kristalline Säure wird dreimal mit je 2 ml kalten Wassers gewaschen und jedesmal filtriert. Das kristalline Produkt   7-( 2'-[4"-(Aminomethyl)-phenyI]- acetamido)cephalosporansäure    weist pK'a-Werte von 4,7 und 9,4 in einer Mischung von 2/3 Dimethylformamid in Wasser auf. Das Infra   lotspektrum    stimmt mit der angegebenen Struktur überein. Das Ultraviolettspektrum ergibt Am260 =6930.



   Das Produkt   7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]-    acetamido}cephalosporansäure weist eine minimale Hemmkonzentration (MIC) gegen über 4 klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von   0,4,ug/ml    in Gegenwart von menschlichem Blutserum und von 0,8 bis   1,ug/ml    in Abwesenheit von Serum, gemessen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren, auf. Das Produkt hat eine mittlere wirksame Dosis   (ED,o)    von 6,75 mg/kg gegenüber   ,,-hämolytischem    Streptococcus pyogenes Stamm C 203 bei zweimaliger Verabreichung an Mäuse.

  Gegen über Gram-negativen Organismen weist es aufgrund von Messungen nach dem Gradienten-Platten-Verfahren folgende minimale Hemmkonzentrationen auf: Organismus MIC    llg/ml    N-9 36 N-10 10 N-26 8   X-26    5 X-68 4 K-1 5 Shigella sonnei 12
Beispiel 6
Aus einer Mischung von 5 g (0,0186 Mol) 2-[4'-(tert.-Butoxycarbonylaminomethyl)phenyl] essigsäure, essigsäure, 1,9 g Triäthylamin und 2,52 g Isobutylchlorformiat in 100 ml Tetrahydrofuran wird das aminblockierte   2-[4'-(tert,-Butoxylcarbonylaminomethyl)- phenyl]-acetylisobutyl-Mischanhydrid    hergestellt.

  Die das gemischte Anhydrid enthaltende Mischung wird unter Rühren und Kühlen mit einer Lösung versetzt, die durch Rühren von 4,0 g 7-Aminobisacetoxycephalosporansäure in 60 ml Tetrahydrofuran und 60 ml Wasser unter Zugabe von Triäthylamin bis zu einem pH-Wert von 8 bereitet wurde.



   Man lässt die erhaltene Reaktionsmischung vollständig reagieren. Das Zwischenprodukt   7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl-      aminomethyl)phenyl]-acetamido}    desacetoxycepahlosporansäure wird dann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert. Es werden 2,06 g dieses Produktes erhalten. Das Ultraviolettspektrum ergibt   Am260 =4770.   



  Die Verbindung weist pK'a-Werte von 5,55 und 7,1 auf.



  Durch Umfällen der Verbindung aus Diäthyläther und Petroläther werden 1,6 g eines reineren Produkts mit Ultraviolettabsorption von   Aa335      = 12800,      Am260 =    5700 und pK'a-Werten von 5,5 und 7,2 erhalten.



      1,6oder 7-{2'-[4"-(N-tert.-Butoxycarbonyl- aminomethyl)phenyl]-acetamido)-    desacetoxycephalosporansäure werden wie in Beispiel 4 mit 6 ml Trifluoressigsäure behandelt, um die Schutzgruppe von der Aminomethylgruppe zu entfernen und das Trifluoressigsäuresalz von   7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl[- acetamido)desacetoxycephalosporansäure    zu bilden, das aus der Lösung durch Zusatz von   Äthyl-    äther abgeschieden wird. Es werden 1,2 g dieses Salzes erhalten. Das Ultraviolettspektrum ergibt   Am260    =6500.



   Das Produkt weist pK'a-Werte von 5,55 und 9,1 auf.



   1 g dieses Trifluoressigsäuresalzes wird zu einer Mischung von 2 ml Wasser und 2 ml Methylisobutylketon gegeben, in der das Salz nicht löslich ist. Man setzt 3 ml Wasser zu und behandelt die erhaltene Suspension mit dem Anionenaustauschharz  LA-1  von Rohm and Haas in der Acetatform. Die Mischung wird etwa eine Stunde gerührt, um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Dann wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert, mit Wasser, Methylisobutylketon und Acetonitril gewaschen und getrocknet, wodurch   390    mg der gewünschten   7- {2'-4"-(Aminomethyl)phenyljacetamido}-    3-methyl-3-cephen-4-carbonsäure in Form des inneren Salzes erhalten werden. Das Infrarotspektrum stimmt mit dieser Struktur überein. Das Ultraviolettspektrum ergibt   Am216 13070,      Am260 =7130.   



  Der Moore Stein-Test ergibt eine grosse Spitze. Das Produkt hat pK'a-Werte von 5,35 und 9,2.



   Diese   7-{2'-[4"-(Aminomethyl)phenyl]- acetamido)-3-methyl-3-cephem-4-    carbonsäureverbindung erweist sich bei einem Test an Mäusen als wirksames orales Antibioticum, wenn es wie oben beschrieben  zweimal an eine Gruppe von Mäusen verabreicht wird.

 

  Der ED50-Wert beträgt 31,2 mg/kg Körpergewicht gegenüber einem   LDs0-Wert    von 3250 mg/kg. Bei Agarverdünnungstests gegenüber verschiedenen Bakterien weist diese Verbindung 48 Stunden MIC-Werte von weniger als 6,25 Mikrogramm/ml gegenüber Streptococcus faecalis und von weniger als 6,25 Mikrogramm/ml gegenüber Escherichiacoli Nr. 2 auf. Die Verbindung   weist    MIC-Werte gegenüber 4 verschiedenen klinischen Isolaten von penicillinresistenten Staphylococcus aureus von 5 bis 8 Mikrogrommiml (,ug/ml) in Abwesenheit von menschlichem Blutserum und von 5 bis 11 Mikrogramm/ml in Gegenwart von menschlichem Blutserum auf. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinanti biotica der Formel EMI7.1 worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen und R' Wasserstoff oder eine Acetoxygruppe bedeuten, oder deren inneren Salzen oder Salzen mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure oder Base, dadurch gekennzeichnet, dass man 7-Aminocephalosporansäure bzw. 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure oder deren wasserlösliche Salze mit einem entsprechenden Acylierungsmittel acyliert, dessen Aminogruppe geschützt ist, und die Schutzgruppe entfernt.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acylierung in einem wässrigen Medium oder einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen dem Gefrierpunkt der Reaktionsmischung und Zimmertemperatur durchführt.

   2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acylierung bei einem praktisch neutralen pH-Wert durchführt.

   3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acylierung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50 C durchführt.

   4. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylierungsmittel ein N-blockiertes 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäurechlorid oder -bromid verwendet.

   5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reaktionsmedium wässriges Aceton verwendet.

   6. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylierungsmittel ein gemischtes Anhydrid aus einer N-blockierten 4'-(a-Aminoalkyl)phenyl-essigsäure und einer niederen Carbonsäure verwendet.

   7. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reaktionsmedium wässriges Tetrahydrofuran verwendet.

   8. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reaktionsmedium eine Mischung aus Aceton und Dioxan verwendet.

   9. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acylierung bei Zimmertemperatur mit einer 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäure in Verbindung mit einem Carbodiimid durchführt.

   10. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Acylierung mit einem aktivierten Ester, z. B.

   p-Nitrophenyl- oder Cyanmethylester, durchführt.

   11. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppe von der Aminogruppe des N-blockierten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäureanteils des Produkts durch Hydrierung unter milden Bedingungen in Gegenwart eines Palladiumkatalysators entfernt.

   12. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppe von der Aminogruppe des N-blockierten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäureanteils des Produkts durch kurze Behandlung unter milden sauren Bedingungen entfernt.

   13. Verfahren nach Unteranspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt 1 bis 5 Stunden bei etwa Zimmertemperatur der Einwirkung von Amei sensäure aussetzt.

   14. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppe von der Aminogruppe des N-blockierten 4'-(a-Aminoalkyl)phenylessigsäureanteils des Produkts durch Behandlung mit Trifluoressigsäure unter Bildung des entsprechenden Trifluoressigsäure salzes der so erhaltenen 7- { 2'-[4"-(Aminoalkyl)phenyl] - acetamido)cephalosporansäure oder -desacetoxycephalosporansäure entfernt.

   15. Verfahren nach Unteranspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man das Trifluoressigsäuresalz der 7-{2'-[4"-(Aminoalkyl)phenyl]- acetamido)cephalosporansäure oder -desacetoxycephalosporansäure durch Behandlung mit einem Anionenaustauschllarz in Basen- oder Acetatform in die Zwitterionenform des Produkts überführt.

   16. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man optisch aktive 4'-(a-Aminoal- kl)phenylessigsäuren oder deren Derivate für die Acy lierung verwendet.