CH507369A - Verfahren zur Entwicklung von zur Herstellung einer Vaccine gegen Röteln geeigneten abgeschwächten Viren - Google Patents

Description

  
 



   Verfahren zur Entwicklung von zur Herstellung einer Vaccine gegen Röteln geeigneten abgeschwächten Viren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Entwicklung von zur Herstellung einer Vaccine gegen Röteln geeigneten abgeschwächten Viren, welche gemeinhin unter dem Namen  Deutsche Masern  bekannt ist, die lebendes abgeschwächtes Rötelvirus enthält, welches nach Injektion in den menschlichen Körper immunisierende Antikörper erzeugt.



   Dank der abgeschwächten Natur des Virus werden bei seiner Applikation nur extrem schwache Fieberwirkungen oder andere klinische Reaktionen hervorgerufen.



  Dagegen bewirkt seine Injektion in den menschlichen oder tierischen Körper die Bildung eines hohen Spiegels von Antikörpern gegen den besagten Virus, der ausreicht, den Körper gegen die Infektion zu immunisieren und somit vor Erkrankung zu schützen.



   Die Röteln ist bei Kindern üblicherweise eine harmlose Krankheit, obgleich dabei auch Komplikationen wie Encephalitis, Arthritis und Neuritis auftreten können.



  Bleibende geistige Schädigungen treten weniger häufig auf. als bei den gewähnlichen roten Masern (rubeola).



   Ernsthaftere Auswirkungen dieser Krankheit können im erwachsenen Alter bei Infektion von Frauen im ersten Trimester der Schwangerschaft auftreten. Der Virus befällt dabei die Frucht mit dem Resultat, dass fehlerhafte Entwicklungen des Embryos, wie Kleinköpfigkeit.



  Taubstummheit, Augenleiden, Herzdeformationen und abnormale Zahnbildung sich abzeichnen können.



   Die möglichen Fehlbildungen der Frucht bei Erkrankung an Röteln von Frauen in den ersten 2 bis 3 Monaten der Schwangerschaft sind derart ernst, dass es bis jetzt anzuraten war, die jungen Mädchen mit dieser Krankheit in Berührung zu bringen, bevor sie das fruchtbare Alter erreicht haben, um im Körper genügend Abwehrstoffe zu produzieren. Die erfindungsgemäss erhältliche Vaccine ermöglicht nun eine Immunisierung des Körpers gegen Röteln auf bekannter Basis.



   Es wurde nun gefunden, dass man zur Herstellung einer Vaccine gegen Röteln geeignet abgeschwächte Viren, in der Weise entwickeln kann, indem man 1) aus mit von infiziertem Gewebe stammendem Rötelvirus ¯inokulierten und bei 30 bis 380C inkubierten Entenembryo- oder Grünaffennierenzellkulturen die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit abscheidet und das Virus, gegebenenfalls nach Inkubation auf Hühnereierembryo oder Grünaffennierengewebekulturen, 2) zur Abschwächung desselben Passagen in einem Medium bestehend aus zerkleinerten und trypsinierten 9 bis 11 Tage alten, des Kopfes und der Extremitäten entledigten Entenembryos in einem Zellwuchsmedium bei 30 bis   38oC,    unterwirft, worauf zweckmässig von jeder einzelnen der genannten Passagen nach dem Ernten in Intervallen von 2 bis 14 Tagen je eine Probe auf Sterilität geprüft wird,

   und die jeweiligen Ernten bis zur Durchführung des Tests eingefroren und falls noch zu virulent befunden in dem Kulturmedium nochmals eingeimpft werden.



   Das Verfahren umfasst also die folgenden Schritte: A) Ausscheidung des virulenten Virus aus einer infizierten Zellkultur und ihre Anpassung z.B. auf Entenembryozellkulturen; B) Entwickeln von abgeschwächtem lebendem Virus mittels einer Mehrzahl von serienweisen Passagen über Entenembryosgewebekulturen. worauf dann C) aus dem abgeschwächten lebenden Virus die Vaccine hergestellt werden kann. Die einzelnen Verfahrensschritte werden nachfolgend eingehender erläutert.



   A) Ausscheidung und Adaptation des virulenten Virus. Die Ausscheidung und Adaptation von Rötelvirus kann aus Entenembryogewebekulturen, welche mit entsprechenden den Virus enthaltenden Gewebe klinisches Material, wie z.B. ein Rachenabstrich infiziert sind, erfolgen oder das Virus kann vorgängig auf einer anderen Art von Zellkulturen, wie beispielsweise solche Affennieren oder von embryonierten Eiern gezüchtet und dann abgeerntet werden. Die Inkubation von infizierten Kulturen kann bei beliebigen Temperaturen die zwischen 30 und 380C liegen, vorzugsweise 30 bis 340C (optimal 320C) oder bei 35 bis 380C (optimal 360C) erfolgen.



  Typische Ausscheidungsverfahren sind die folgenden:
Verfahren 1. Das Rötelnvirus wird aus mit klinischem Material (z.B. Rachenabstrich) einer an Röteln erkrankten Person, infizierten Gewebekulturen von Entenembryos ausgeschieden.  



   Verfahren 2. Das Rötelvirus wird aus mit klinischem Material infizierten Gewebekulturen von Grünaffennieren ausgeschieden.



     B)      Es2tavickelel    von   ab gesc!i wächtern    lebendem Rötel   virrrs.    Das unter A erhaltene Rötelvirus wird in Glaskolben mit Entenembryogewebekulturen, welche durch Zerkleinern und Trypsinieren von ungefähr 10 Tage alten Entenembryos hergestellt wurden, eingetragen. Als Kul   turmdium    kommt dabei jedes in Frage, das das Zellwachstum fördert, wie z.B. das bekannte  Medium   199     zu welchem noch Kälberserum zugesetzt werden kann.



     Stacil    der   Infizierung    werden die Zellkulturen in auf   einanderfolgenden    Passagen bei 30 bis 380C, vorzugsweise 30 bis   34C    (optimal 320C) und 35 bis 380C (optimal   36OC)    inkubiert. Während diesen Passagen wird der Virus in grossen Mengen produziert und abgeschwächt.



   Die obigen serienweisen Passagen werden unter Verwendung von verdünntem oder unverdünntem Impfstoff durchgeführt, wobei eine Mehrzahl von Ernten in gewis   sen    Zeitintervallen erfolgen können. Der   Virusgehalt    wird   dadurch    Titrierung auf Gewebekulturen von Grünaffennieren bestimmt. In passenden Intervallen werden die   Kulturen    einem Immunitätstest mit ungefähr 1000   TDIDio    eines beeinflussende Eigenschaften aufweisenden Virus   (ECHO, 1    Bunyamwera usw.) unterworfen. Kulturen, welche mit Rötelnvirus infiziert worden sind, zeigen dabei eine Abwesenheit von cytopathologischen Gegenviren bei der Prüfung nach 3 bis 4 Tagen auf.



   Das Virus wird anschliessend eiskalt oder bei anderer niedriger Temperatur, um der Verseuchung des Mittels entgegen zu wirken. gerührt.



   C) Es wurde festgestellt, dass nach diesen mehrmaligen serienweisen Passagen geernteter Rötelnvirus bei Affen und Nagetieren nicht phatogen wirkt und beim Mcnschen nur schwaches Unwohlsein hervorruft. dagegen die Bildung eines befriedigenden Spiegels von neutralisierend wirkenden Antikörpern hervorruft. Das infektiöse Virus wird mit geeigneten Stabilisatoren wie Sucrose, humanes Albumin, Glutamin, Phosphat oder mit .Mischungen davon stabilisiert. Nach der ihre Wirkung ermittelnden Titration wird die Versuchssuspension aufgeteilt und zum Gebrauch in Ampullen abgefüllt. Das Produkt wird dabei gerührt und eingefroren und vorzugsweise zur Entfernung von Feuchtigkeit gefriergetrocknet.



   Beispiel 1
Als Anfangsimpfstoff kommt ein solcher, der nach dem oben beschriebenen Verfahren I erhältlich ist, zur Anwendung.



   9 bis 11 Tage alte Entenembryos werden nach Entfernung des Kopfes und der Extremitäten unter antiseptischen Bedingungen fein zerhackt und anschliessend mehrere Male mit  Hanks   BBS -Lösung    gewaschen. Die gewaschene Gewebemasse wird dann mit   0.25%indem    Trypsin (Difco 1: 250) in einem Drei Salzpuffer bei   360C    während 2 bis 3 Stunden trypsiniert.



  Die Trypsinzellsuspension wird gewonnen und dann durch zwei sterile dicke Käsetücher hindurch gelassen und anschliessend mit 1500 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Zellkuchen wird zur Einstellung der Zellkonzentration in einem Wachstumsmedium suspendiert. Als Wachstumsmedium kommt dabei  Medium 199  (Morgan, J.F., Morten, H.J.. and Parker, R.C., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 73: 1 bis 8, 1950) in Frage, das noch während 30 Minuten auf   560C    erhitzte Kälberserum und 50 mcg/ml Neomycin enthält. Es werden nun Kulturkolben mit obgenannten Zellen in einer Konzentration von 350 000 lebensfähigen Zellen pro ml bepflanzt. Nach einer 36 bis 48stündigen Inkubationszeit bei 360C können die enthaltenen Kulturflüssigkeiten zur Durchführung der serienweisen Passagen und zur Vaccineherstellung verwendet werden.



   Es werden Entenembryogewebekulturen derart hergestellt, indem die Gewebemasse zusammen mit dem   Wachstumsmedium    bestehend aus  Medium   199     welches ausserdem noch 2% inaktiviertes   Kälberseruin    enthält, in Glaskolben gegeben. Nach 3 bis Stägiger Kultur wird das Kulturmedium antiseptisch entfernt und die Kulturen 5mal mit je 100 ml Hanks'BSS-Lösung gewaschen, dann pro Kolben mit 2,5 ml der gemäss vorangehendem Abschnitt erhaltenen unverdünnten Rötelvirus enthaltenen Kulturflüssigkeit geimpft. Danach werden jedem Kolben noch 60 ml  Medium 199  welches noch   10%    eines geeigneten Stabilisators gegen virale Infektion enthält, zugesetzt und sodann die Kulturen bei 30 bis 340C geimpft. Anschliessend wird dem Wachstums- bzw.

  Kulturmedium noch Neomycin in einer Konzentration von 50 mcg/ml einverleibt. Nach   2    bis   4    Tagen wird die Kulturflüssigkeit geerntet. Zu den übrig gebliebenen Zellen wird frisches Nährmedium. welches ebenfalls den obgenannten Stabilisator enthält, neu hinzugegeben und die Züchtung wie vorher wiederholt. Es werden so 5 aufeinanderfolgende Passagen alle bei ungefähr   320C    durchgeführt. Die geernteten Virussuspensionen werden unter Rühren bei   - 700C    in einer elektrisch arbeitenden Kühleinheit aufbewahrt und können so für die Vaccineproduktion in Vorrat gehalten werden. Von den einzelnen antiseptisch gewonnenen Ernten werden Proben entnommen. die auf Sterilität geprüft und auf ihren Virusgehalt in einer Grünaffennierengewebekultur titriert werden.

  Die als einwandfrei befundenen Ernten werden in sterile Sammler gegeben, und in einem trockenen   EislAlkoholbad    eingefroren.



  Nach komplett erfolgter Prüfung wird das selektionierte und einwandfrei befundene Material der Einfrierapparatur entnommen und aufgetaut. Dem aufgetauten Material werden dann Proben zu nochmaliger Kontrolle und Sicherheitstesten entnommen. Die übrige Flüssigkeit wird geklärt und eine Probe für den Sicherheitstest am Affen entnommen. Zur verbleibenden Flüssigkeit wird zusätzlich ein passender Stabilisator addiert. Das Ganze wird sodann in einzelne Fläschchen eingefüllt und getrocknet.



  Nach dem Trocknungsvorgang werden die Fläschchen verschlossen und versiegelt und so für die   Rekonstitution    als Vaccine mittels Zusatz von sterilem Wasser zur Verfügung gehalten.

 

   Die Wirksamkeit des Impfstoffs wird anhand infizierter Zellkulturen demonstriert. Parenterale Inokulierung von abgeschwächter Vaccine am Affen bewirkt die Produktion eines   honen    Spiegels von   neutralisierend    wirkenden Antikörpern, deren Wirksamkeit unvermindert mindestens 1 Jahr anhält.



   Test   am    Menschen. An 7 Kindern, die vorgängig nie an Röteln erkrankt waren, wird auf parenteralem Wege eine gewisse Dosis an abgeschwächtem Rötelnvirusvaccin verabreicht. Alle Kinder entwickelten einen hohen Spiegel an neutralisierend wirkenden Antikörpern (1:16 bis 1: 64) schon innerhalb eines Monats nach der Impfung.



  Der so erreichte Antikörpertiter ist annähernd der gleiche, wie wenn er infolge natürlicher Erkrankung an   Röteln erreicht würde. Die geimpften Kinder entwickeln jedoch kein oder nur wenig Fieber und nur einen schwachen vorübergehenden Hautausschlag und eine klinisch unbedeutende Lymphodenopathie.



   Beispiel 2
Das Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, dass die Inkubation des Rötelviruses im Bereich von 35 bis 380C, vorzugsweise bei 360C, durchgeführt wird.



   Beispiel 3
Das Verfahren wird wie in Beispiel 2 wiederholt, indem 3 serienweise Inkubationen des Virus bei   36"C    und 7 bei 320C durchgeführt werden.



   Es können auch mehr als 5 aufeinanderfolgende Passagen über Entenembryokulturen geleitet werden, um weiteres abgeschwächtes Virus zu erhalten. Die serienweisen Passagen können ebenfalls die Inkubation von Grünaffennierenkulturen oder von embryonierten Hühnereiern umfassen. Das gesagte wird anhand der folgenden Beispiele erläutert, 

   in welchen
Beispiel 4
2 GMK + 1 EAM   +    9 GMK + 5 DEF (360C)    +    5 DEF (320C)
Beispiel 5
2 GMK + 1 EAM   +    13 GMK + 2 DEF (360C)  + 8 DEF (320C)
Beispiel 6
2 GMK + 1 EAM + 17 GMK   +    10 DEF (320C)
Beispiel 7
21 GMK + 3 DEF (360C) + 7 DEF   (32ob)   
Beispiel 8
Mittels Durchgang durch Entenembryosgewebekulturen   abgeschwächtes    Rötelvirus wird durch 3 Grenzverdünnungen gefolgt von weiteren Passagen über solche Gewebekulturen gelassen, so dass ein Vaccine-Pool entsteht. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Entwicklung von zur Herstellung einer Vaccine gegen Röteln geeigneten abgeschwächten Viren, welche im menschlichen Körper die Bildung entsprechender Antikörper fördern, ohne stark fieberhafte Erkrankungen hervorzurufen, dadurch gekennzeichnet, das man 1) aus mit von infiziertem Gewebe stammendem Rötelvirus eingeimpften und bei 30 bis 380C inkubierten Entenembryo- oder Grünaffennierenzellkulturen die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit abscheidet und das Virus, gegebenenfalls nach Inkubation auf Hühnereierembryo oder Grünaffennierengewebekulturen, 2) zur Abschwächung desselben Passagen in einem Medium bestehend aus zerkleinerten und trypsinierten 9 bis 11 Tage alten, des Kopfes und der Extremitäten entledigten Entenembryos in einem Zellwuchsmedium bei 30 bis 380C unterwirft.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass etwa 10 Tage alte Entenembryos verwendet werden.

   2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Passagen im Zellwuchsmedium bei 35 bis 380C durchgeführt werden.

   3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Passagen im Zellwuchsmedium bei 30 bis 34GC durchgeführt werden.

   4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass vorgängig der besagten serienweisen Passagen noch Inkubationen des Virus auf Hühnereierembryos oder Grünaffennierengewebekulturen durchgeführt werden.