Verfahren zum Schützen von freien Aminogruppen in Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum vorübergehenden Schützen von Aminogruppen in Aminosäuren oder Peptiden oder deren Derivaten durch Acylierung der Aminogruppe mit neuen Schutzgruppen.
Bekanntlich müssen bei der Synthese von Peptiden durch Kupplung von Aminosäuren oder Peptiden im all- gemeinen die an der Kupplungsreaktion nicht beteiligten funktionnellen Gruppen, beispielsweise die berminale Amino- oder die terminale Carboxylgruppe, die Amino- und Carboxylgruppen Ider Seitenketten und gegebenen- falls weitere Gruppen, wie Merkapto-, Guanidino- oder Hydroxylgruppen blockiert werden.
Es stehen heute zwar eine grössere Anzahl von Schutzgruppen zur Ver fügun g, doch vermögen sie noch nicht völlig zu befrie- digen, insbesondere nicht, wenn les sich um die Synthese langkettiger und empfindlicher Peptide handelt.
Das Problem liegt vor allem darin, dass in solchen Fällen hydrogenolytische Abspaltung oft nicht möglich ist (wegen vorhandener schwefelhaltiger Aminosäure) und dass die Peptide gegenüber hydrolytisch wirkenden sauren oder insbesondere alkalischen Agenzien nicht stabil genug sind, so dass die hydrolytische Abspaltung sämtli- cher Schutzgruppen auf der letzten Synthesestufe mit grossen Verlusten kostbaren Materials verbunden ist.
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, dass die am Kupplungsende befindliche Schutzgruppe nach jeder Kupplungsreaktion wie der abgespalten werden muss, während die übrigen Schutzgruppen bis zum Schluss der Synthese beibehalten werden sollen. Diese beiden Arten von Schutzgruppen müssen also einerseits selektiv gegeneinander abspaltbar sein, anderseits aber müs- sen beide Arten unter milden Bedingungen entfernt werden können.
Als unter milden sauren Bedingungen abspaltbare Seitenketten-Schutzgruppen haben sich vor allem die tert.-Butyloxyoarbonyl (BOC)-Gruppe zum Schutz der Aminogruppe und die tert.-Butylester (tBu)-Gruppe zum Schutz der Carboxylgruppen bewährt; hinzu kommt die tert.-Butyläthergruppe zum Schutz von Hydroxygruppen. Neben diesen Gruppen kann die Tritylgruppe, z. B.
als α-Aminoschutzgruppe, selektiv entfernt werden, da sie in schwach saurem Medium sehr viel schneller abspaltbar ist, beispielsweise in 80 % iger Essigsäure bei Zimmertemperatur 20 000mal schn'eller. Leider ist aber die Anwendbarkeit der Tritylgruppe als Schutzgruppe sehr beschränkt. Wegen sterischer Hinderung kann sie bei der Kupplung nach der Methode der aktivierten Ester und der gemischten Anhydride nicht verwendet werden (ausser beim Glycin) und führt auch bei der Carbodiimidmet,hode zu schlechten Ausbeuten. Sie kommt Idaher bei der Synthese von Peptiden vom Carboxylende her, z. B. nach dem neuen Verfahren der Feststoffträgersynthese, $vgl.
Merrifield, J. Am. Chem. Soc.
85, 2149 (1963) nicht in Betracht. Auch sonst weist die Tritylgruppe Nachteile auf, denn sie ist schwierig einzuführen, und die tritylgeschützten Verbindungen sind wenig stabil.
SEs wurde nun gefunden, dass Schiutzgruppen der Formel
EMI1.1
worin R1 für Niederalkyl, R2 für NiederaLkyl oder Phenyl und R3 für Phenyl steht, bei der Synthese langketti- ger empfindlicher Peptide vorteilhaft und bekannten Schutzgruppen, wie z. B. der Tritylgruppe überlegen sind.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Schützen von freien Aminogruppen in Amino- säuren oder Peptiden oder deren Derivaten, das da- durch gekennzeichnet ist, dass man entspnechende freie Aminogruppen aufweisende Verbindungen mit der Gruppe der Formel I
EMI2.1
worin R1 für Niederalkyl, R2 für Niederalkyl oder Phenyl und R3 für Phenyl steht und worin die Phenylreste unsubstituiert oder durch Niederalkyl-, Phenyl- oder Nie deralkytphenylgruppen substituiert sind, einführen- den Mitteln umsetzt.
Die Phenylreste in obiger Formel stehen für einen unsubstituierten oder einen durch eine oder zwei Niederalkyl-, Phenyl- oder Niederalkylphe nylgruppen substituierten Phenylring. Die Substituenten befinden sich vor allem in para-Stellung, sie können auch in ortho- oder ortho- und para-Stellung stehen. Die Niederalkylreste weisen höchstens 5 Kohlenstoffatome auf; sie sind in erster Linie Methyl oder Äthyl, ferner z. B. Propyl oder Butyl. Die Niederalkylgruppen sind geradkettig, können aber auch - insbesondere im Falle der Phenylsubstituenten - verzweigt sein.
Die neuen Gruppen zeichnen sich dadurch aus, dass sie unter sehr milden sauren Bedingungen, z. B. bei Zimmertemperatur in etwa 60-90% iger wässeriger Essigsäure, Chloressigsäure oder Ameisensäure oder einem Gemisch von mindestens zwei dieser Säuren mit
10-40% Wasser abgespalten werden. Da ihre Abspaltungsgeschwindigkeit mehr als 600mal grösser als diejenige der BOC-Gruppe ist, lassen sie sich selektiv gegenüber dieser Gruppe abspalten, ferner auch gegenüber der tert.-Butylestergruppe, der tert.-Butyläthergruppe und der Trityl-Mercaptoschutzgruppe. Sie sind daher besonders geeignet als α-Aminoschutzgruppen bei der Synthese von empfindlichen Peptiden, welche säurelabile Seitenkettenschutzgruppen, wie die genannten Gruppen, aufweisen.
Da sie keinerlei sterische Hinde- rung zeigen, lassen sie sich bei jeder Kupplungsmethode und insbesondere auch bei der Feststoffträgersynthese verwenden.
Die Einführung der neuen Gruppen erfolgt nach an sich bekannten Methoden, analog der Einführung der BOC-Gruppe, beispielsweise mittels der Azidmethode oder der Methode der aktivierten Ester (z. B. Phenyl ester, p-Nitrophenylester, Hydroxysuccinimidester) oder durch Umsetzung von Carbinolen der Formel R1R2R3C OH mit den Aminosäuren entsprechenden Isocyanatsäureestern.
In den folgenden Beispielen wird die Einführung und die Abspaltung der neuen Gruppen an einigen natürlichen a-Aminosäuren und aus natürlichen a-Aminc säuren aufgebauten Peptiden gezeigt. In gleicher Weise werden die Gruppen auch Ibei anderen Aminosäuren und Peptiden angewendet. Die Temperaturen sind in Cel- siusgraden angegeben.
Beispiel I
Einführung der 2-Phenyl-isopropyloxycarbonylgruppe
1. 5,35 g Isocyanatessigsäureäthylester (41,5 mMol), 4 ml Pyridin und 5,64 g Phenyldimethylcarbinol (41,5 mMol) werden 38 Stunden auf 50 erhitzt. Die gelbe Lösung wird in 60 ml Äther aufgencommen, bei 0 mit 1-M. Citronensäure und mit Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum vollständig eingedampft. Den Rückstand verreibt man mit Petroläther, filtriert die feste Substanz ab und kocht sie am Rückfluss in 70 ml Hexan. Man filtriert das ungelöste Material ab, engt das Filtrat auf die Hälfte ein, filtriert über 0,5 g Aktivkohle und lässt den
N-(2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl)-glycin äthylester auskristallisieren. F.69-70 . Das Produkt ist im Dünnschichtchromatogramm in Chloroform einheitlich, Rf = 0,4.
675 mg (2,55 mMol) des Esters werden in 10 ml Dioxan gelöst, mit 1,47 ml 1.91-N. NaOH versetzt und
11/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die klare Lösung wird mit 20 ml Wasser verdünnt, zweimal mit Äther extrahiert, dieser noch zweimal mit wenig wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Lösungen werden bei 0 mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert, zweimal mit Äther extrahiert, dieser neutral gewaschen, getrocknet und fütriert. Zur Atherlösung wird nun Dicyclohexylamin bis zur alkalischen Reaktion zugegeben, worauf beim Kratzen das Salz zu kristallisieren beginnt. Die Ätherlösung wird noch auf ctwa 10 ml eingeengt, einige Stunden bei 0 kristallisieren gelassen, dann die Kristalle von N-(2 Phenylisopropyloxycarbonyl)-glycin-dicyclohexyl-ammoniumsalz abfiltriert und mit Äther gewaschen.
F: 162 bis
1630 (unter schwacher Zersetzung.)
2. 60 g Phenyldimethylcarbinol (0,44 Mol) in 450 ml absolutem. Methylenchlorid und 53 ml absolutem Pyridin (0,66 Mol) werden bei - 5 in 30 Minuten mit 67 ml Chlorkohlensäurephenylester (0,53 Mol) in 250 ml absolutem Methylenchlorid versetzt. Es entsteht eine dicke Suspension. Diese wird noch weitere 20 Std.
bei 0 gerührt, dann auf wenig Eis und 100 ml Methylenchlorid aufgetragen. Die erhaltene Methylenchlorid- lösung wird bei 0 mehrmais mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 20 zur Trockne verdampft. Das erhaltene, unbeständige gemischte Carbonat wird sofort in 180 ml Methanol gelöst, unter Eiskühlung mit 52 ml Hydrazinhydrat (1,06 Mol) versetzt und bei Raumtemperatur 20 Std.
stehengelassen. Die Lösung wird mit 600 ml Äther verdünnt, bei 0 mit Wasswer, fünfmal mit 0,5-N. Natronlauge und mit Wasser bis neutral gewaschen, getrocknet über Natriumsulfat und im Vakuum bei 50 zur Trokkene vendampft. Der Rückstand (61 g) wird im Hochvakuum destilliert und ergibt 52,1 g 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl-hydrazid in Form eines farblosen, viskosen Öls. Kp. 95-98 /10-3 mm Hg.
20,6 g dieses Hydrazids (0,106 Mol) werden in 320 ml Dimethylformamid gelöst, auf - 20 bis - 30 gekühlt und mit 160 ml 1,94-N. salzsäure versetzt, wobei die Temperatur unter - 20 gehalten wird. Anschliessend werden 23,2 ml 5-M. Natriumnitritlösung bei - 15 bis - 100 zugetropft. Nun wird noch 15 Minuten bei gleicher Temperatur gerührt, dann mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung auf pH 6-7 gestellt. Das Gemisch wird mit 800 und 400 ml Äther extrahiert, die beiden Ätherlösungen bei 0 dreimal mit Wasser gewaschen, vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 300 zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird vorsichtig im Hochvakuum destilliert und gibt 17,5 g des Azids als eines gelblichen Ols vom Kp. 47-51 /0,005 mm Hg.
Das IR.-Spektrum weist die erwarteten Banden auf. (Azid-Bande bei 4,6 und 4,7 [aufgespalten] ; Carbonyl-Bande bei 5,8 ).
2,45 g (12 mMol) 2-Phenylisopropyloxycarbonyl
5,75 g N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysin methylester-acetat (18 mMol) und 2 ml Dimethylformamid versetzt. Unter Rühren wird bei 0 in 1 1/2 Stunden 4,15 ml Triäthylamin lang sam zugetropft. Die klare Lösung wird nun 3 Tage im Kühlschrank stehengelassen. Nach Verdünnen mit 50 ml Ather wind bei 0 mehrmals mit 0,1-M. Citronensäurelösung, dann mit Wasser bis neutral ausgeschüttelt, getrocknet über Natriumsulfat und zur Trockene verdampft.
Der Rückstand wird am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und bildet ein chromatographisch einheitliches, viskoses Öl [a] 20 = + 60 @ 0,50 (c = 2 in Chloroform) Ausbeute:
4,83 Ig = 95 % Id. Th. Na-(2-Phenylisopropyloxy- carbonyl)-Na-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin methylester.
Auf gleicher Weise wie unter 1 beschrieben, kann man die para-Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe in Glyoinäthylester einführen. Man erhält so den N-(2-p Diphenylisopropyloxycarbonyl)-glycinäthylester, der aus Methanol kristallisiert. F. 1220.
Beispiel 2
Einführung der 2-p-Tolyl-isopropyloxycarbonylgruppe
6,22 g p-Tolyl-dimethylcarbinol (41,5 mMol), 4 ml absolutes Pyridin und 5,35 g (41,5 mMol) Isocyanatessigsäureäthylester werden 38 Stunden bei 500 gehal- ten und wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.
Man erhält 9,8 g N-(2-p-Tolyl-isopropyloxycarbonyl)- glycinäthylester als gelbes Öl; Rf=0,25-0,35 in Chloroform. Zwecks Verseifung wird der Ester in 100 ml 80 % igem Methanol gelöst am pH-Meter mit 24 ml 1 ,9-N. Natronlauge rasch versetzt, wobei das pH auf 11,8 steigt. Nach 7 Minuten wird 2-N. Salzsäure zugegeben bis pH 8,5. Die erhaltene Lösung wird im Va- kaum auf etwa die Hälfte eingeengt, noch mit 50 mi Wasser versetzt und zweimal mit Äther extrahiert.
Die Ätherlösungen werden noch zweimal mit Wasser gewaschen, die vereinigten wässrigen Lösungen bei 0 mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert und mit Äther extrahiert. Die Ätherlösung wird nach dem Neutralwaschen, Trocknen mit Natriumsulfat und Filtrieren mit Dicyclohexylamin alkalisch gestellt, auf etwa 30 ml eingeengt, mit gleichviel Petroläther versetzt und kristallisieren gelassen. Man erhält
8,4 g des N-(2-p-Tolyl-isopropyloxycarboxyl) glycindicyclohexylammoniumsalzes vom F. 145 bis
1470.
Nach Umkristallisation aus Essigester schmilzt die Substanz bei 147-148 (unter Zersetzung).
Beispiel 3 Abspaltung der 2-Phenyl-isopropyloxyoarbonylgruppe
1. 418,6 mg N-(2-Phenylisopropyloxycarbonyl)-gly- cindicyclohexylammoniumsalz werden bei Raumtemperatur in 4,2 ml einer Mischung aus 7 Vol. Eisessig, 1 Vol. 82,8 S Ameisensäure und 2 Vol. Wasser gelöst.
Nach 4 Stunden zeigt eine dünnschichtchromatogra- phische Analyse, idiass etwa 95 % gespalten ist. Nach 6stündigem Stehen bei Raumetmperatur wird mit 20 ml Aceton versetzt, das ausgefallene Glycin abfiltriert und mit Aceton gut gewaschen. Es ist klar wasserlöslich und chromatographisch leinheitlich. Ausbeute: 68,5 mg 91,4 % d. Theorie. Unter gleichen Bedingungen bleibt tert. - Butyloxycarbonylglycin-äthylester unverändert.
2. 71,7 mg (0,27 mMol) N-(2-Phenylisopropylloxy- carbonyl)glycinäthylester werden bei 250 in 1,35 ml
80 % iger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnommen, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und mit 0,1 N Perchlorsäure in Eisessig titriert (Titration Ides freigesetzten Glycin äthylesters). Die Halbwertszeit für die Abspaltung der Schutzgruppe beträgt etwa 2 Stunden. Nach 24 Stunden ist die Abspaltung quantitativ. Auch im Dünnschichtchromatogramm lässt sich keine Spur Ausgangsmaterial mehr nachweisen.
Unter den gleichen Bedingungen bleibt die N-Schutzgruppe von N-tert.-Butyloxycarbonyl-glycin-äthylester unverändert.
Auf gleiche Weise wird N-(2-p-Diphenyllisopropyl- oxycarbonyl)-glycin-äthylester in 5 1/2 Stunden quantita tiv gespalten.
3. 68,8 ISg N-(2-Phenylisopropyloxycarbonyl)-gly- cinäthylester werden in 2,6 ml 60 % iger Chloressigsäure bei Raumtemperatur gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnommen, in 4 ml Di methylfor,mamid gegeben und mit 0,1 N Perchlorsäure in Eisessig titriert. Nach 15 Minuten ist die Verbindung quantitativ gespalten. Die BOC-Gruppe wird etwa
1900mal langsamer abgespalten. In der folgenden Tabelle sind die Spaltgeschwindigkeiten für verschiedene Säuren bzw. saure Gemische angegeben.
quantitative
Hydrolyse-Medium Spaltung nach 60 % Essigsäure 12 Stunden 90% Essigsäure 50 Stunden
75 % Ameisensäure momentan Methanol-82,8 % Ameisensäure 1:1 11 Stunden Eisessig-82,8 % Ameisensäure- 4 1/2 Stunden
Wasser 7:1:2 Eisessig-82,8 % Ameisensäure- 40 Minuten
Wasser 7:1:
:2 + Natriumchlorid
4. 439,7 mg (1,04 mMol) Na-(2-Phenylisopropyl- oxycarbonyl)-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 4,4 mi 80 % iger Essigsäure gelöst und 48 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Eine dünnschichtchromatographische Analyse nach dieser Zeit zeigt, dass die Na-Schutzgruppe praktisch quantitativ, die Na-tert.-Butyloxycarbonylgruppe nicht abgespalten ist.
Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand im Hochvakuum bei 450 getrocknet, ldann in wenig Äther gelöst, wobei langsam Kristallisation leintritt. Zur Vervollständigung derselben wird noch etwa gleichviel Petroläther zugesetzt, einige Stunden bei 0 stehengelassen und flitriert. Es werden 269 mg kristallisiertes Na-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-acetat erhalten. F. 80-81 . Die Mutterlauge enthält noch weiteren Na-tert.-Butyloxycarbonyl- lysin-methylester.
Beispiel 4 Abspaltung der 2-p-Tolyl-isopropyloxycarbonylgruppe
1. 432,6 mg (1 mMol) N-(2-p-Tolyl-isopropyloxycarbonyl-glycin-dicyclchexylammoniumsalz werden in 4,3 ml einer Mischung von 7 Vol. Eisessig, 1 Vol.
82,8 % Ameisensäure und 1 Vol. Wasser gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 15 Minuten und nach 30 Minuten wird eine dünnschichtchromatographische Analyse durchgeführt, welche zeigt, dass nach 15 Minu ten etwa 95%ige und nach 30 Minuten quantitative Spaltung eingetreten ist. Ebenfalls nach 30 Minuten wird die Lösung mit 20 ml Aceton versetzt, kurze Zeit bei 0 kristallisieren gelassen, dann das Glycin abfiltriert und gut mit Aceton gewaschen. Ausbeute: 69,5 mg = 92,7 % kristallisiertes Glycin.
2. Wenn man N-(2-p-Tolyl-isopropyloxycarbonylglycinäthylester wie für die entsprechende 2-Phenyliso propyloxycarbonylverbindung in Beispiel 3 unter 2 be' schrieben, bei 250 mit 80 % iger Essigsäure behandelt, wird die Schutzgruppe in 1 1/ Stunden quantitativ abge- spalten.
Beispiel 5 Einführunig der 2-p-Diphe nylisopropyloxy- carbonylgruppe a) Mit dem Azid in Aminosäureester
106 g (0,5 Mol) p-Diphenyl-dimethylcarbanol in 500 ml Methylenchlorid und 60 ml Pyridin werden in 30 Minuten bei - 5 mit einer Lösung von 76 mI Chlorkohlensäurephenylester in 250 mi Methylenchlorid versetzt. Die entstandene Suspension wird 14 Stunden bei 0 gerührt, wobei eine fast klare Lösung entsteht.
Diese Lösung wird bei 300 am Rotationsverdampfer im Va- kuum zur Trockene verdampft und der kristalline Rückstand bestehend aus 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-phenylester noch 1 Stunde am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Dann wird mit 200 mi Dimethylformamid und 125 ml Hydrazinhydrat versetzt und unter Kühlen mit kaltem Wasser 6 Stunden gerührt. Die klare Lösung wird langsam unter Eiskühlung mit 1 Liter Wasser versetzt, über Nacht bei 0 krist'alli- sieren gelassen, die Kristalle abfiltriert und mit 1-N. Natronlauge und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum bei 50 wird das 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylhydrazid aus 200 ml Tetrachlorkohlenstoff und 40 ml Petroläther umkristallisiert.
Man erhält 103,0 g (76 % der Theorie); F. 108-109 .
27 g (0,1 Mol) dieses Hydrazids werden in 270 ml Acetonitril gelöst und unter Rühren bei - -25 mit einer Lösung von 50 ml 6-N. Salzsäure in 100 ml Acetonitril, dann mit 22 ml 5-M. Natriumnitritlösung versetzt.
Nach 15minütigem Rühren bei - 150 wird mit 2-N.
Sodalösung auf pH 6-7 gestellt und die Lösung auf viel Eiswasser ausgetragen. Nach kurzem Rühren wird das Azid fest. Es wird abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen. Der Rückstand wird in Äther gelöst, das Wasser abgetrennt, die Ätherlösung über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel un Vakuum bei Raumtemperatur verdampft. Man erhält 28,3 g (100 % der Theorie) des Azids in Form eines kristallinen, gelblichen Pulvers vom F. 48-52 .
3,37 g (20 mMol) L-Valin-methylester-lydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei 0 mit 2,8 ml Triäthylamin, 6,2 Ig des obigen Azids und 5 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 10 Minuten werden weitere 2,8 ml Triäthylamin zugegeben, darauf wird über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt.
Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Äther verdünnt, bei 0 mehrmals mit 0,1M. Zitronensäurelösung und Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat ,getrocknet und im Vakuum zur Trockene verdampft. Der erhaltene Ester wird direkt verseift. Zu diesem Zweck löst man das Rohprodukt in 75 ml Isopropanol, versetzt mit 12 ml 2-N. Natronlauge und rührt 2 1/2 Stunden bei 400. Dann gibt man Äther und Wasser zu der Lösung, trennt die wässrige Lösung ab und versetzt noch ein zweites Mal mit Wasser. Die vereinigten wässrigen Lösungen werden mit Äther überschichtet, bei 0 mit lHm. Citronensäure auf pH 2 gestellt und mit Äther extrahiert.
Die Ätherlösung wird nach dem Neutralwaschen und Trocknen mit Cyciohexylamin alkalisiert, wobei das Cyclohexylammoniumsalz kristallin ausfällt.
Man engt die Ätherlösung auf etwa 50 ml ein, versetz mit 50 ml Petroläther und lässt bei 0 kristallisieren.
Das kristalline Produkt wird abfiltriert und mit Äther- Petroläther (1:1) gewaschen. Man erhält
6,5 g des N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl L-valin-cyclohexylammoniumsalzes vom F.178-180 (Zersetzung).
B) Mit dem Azid in Aminosäuren
1,17 g L-Valin (10 mMol) werden warm in 9,1 g eimer 10 % igen wässrigen Lösung von Tetramethylammoniumhydroxid gelöst. Die Lösung wird im Vakuum bei 80 eingedampft, der Rückstand noch dreimal in 5 ml Dimethylformamid aufgenommen und im Vakuum eingedampft. Den kristallinen Rückstand rührt man mit 20 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur, versetzt mit 2,8 g 2-p-Diphenyloxycarbonylazid, dann mit 3 ml Triäthylamin und rührt die Suspension 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Versetzen mit Äther und Wasser wird die wässrige Lösung abgetrennt, die Ather- lösung noch zweimal mit wenig Wasser nachextrahiert und die vereinigten wässrigen Lösungen bei 0 auf pH2 angesäuert.
Nach Extraktion mit Äther und Neutralwaschen der Ätherauszüge wird mit Natriumsulfat getrocknet, fiitriert und mit Cyclohexylamin alkalisiert.
Das Cyclohexylammoniumsalz beginnt sofort zu kristallisieren. Es wird auf gleiche Weise wie unter a) beschrieben, isoliert. Man erhält 2,96 g N-2-(p-Diphenyl)isopropyloxycarbonyl - L-valin - cyclohexylammoniumsalz vom F. 178-180 (Zersetzung).
c) Mit aktiviertem Ester in Aminosäuren
1,17 g L-Valin (10 mMol) werden in 4,55 mi einer 2, 2-n. methanolischen Lösung von B enzyltrimethylam moniumhydroxid gelöst, im Vakuum zur Trockene verdampft, nochmals in 10 ml Dimethylformamid gelöst und erneut im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in 5 ml Dimethylformamid aufgenommen, mit 4,0 g 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylphenylester versetzt und 4 Stunden bei 500 gerührt. Die klare Lösung wird mit 30 ml Wasser und 30 ml Äther versetzt und ausgeschüttelt, die wässrige Phase abgetrennt und bei 0 mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert. Nach Extrahieren mit Äther wird die ätherische Lösung neutral gewaschein, getrocknet, filtriert und mit 1,9 ml Cyclohexylamin versetzt.
Sofort beginnt das Cyclohexylammonium- salz des N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valins zu kristallisieren. Es wird auf gleiche Weise wie unter la) beschrieben, isoliert. Die Ausbeute beträgt: 3,15 g; F. 178-180 (Zersetzung).
In gleicher Weise können die folgenden N-2-(p-Di- phenyl)-isopropyloxycarbonyl-Derivate hergestellt werden:
Derivat F.
Glycin-dicyclohexylammoniumsalz 192-193 (Zers.) L-Leucin 227-230 (Zers.) L-Prolin-dicyclohexylammoniumsalz 173-175 (Zers.)
Derivat F.
Na-tert.-Butyloxycarbonyl-L-Lysin- amorph dicyclohexylammoniumsalz L-Tyrosin-cyclohexylammoniumsalz 248-252 (Zers.) sintert bei 1580 L-Phenylalanin-dicyclohexylammo- 116-119 (Zers.) niumsalz L-Glutaminsäure-ytert.-butylester- 174-175 (Zers.) cyclohexylammoniumsalz L-Serin-tert.-butyläther-cyclohexyl- 180-181 (Zers.) ammoniumsalz L-Methionin-dicyclohexyl- 142-143 ammoniumsalz
Der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-phenylester wird wie folgt hergestellt:
21,2 g p-Diphenyl-dimethylcarbinol (0,1 Mol) in 100 ml Methylenchlorid und 12 mi Pyridin werden bei - 5 in 30 Minuten mit leinen Lösung von 18,8 g Chlorkchlensäurephenylester in 50 mi Methylenchlorid versetzt.
Anschliessend rührt man noch 18 Stunden bei 00, giesst dann auf Eiswasser aus, trennt die organische Phase ab, wäscht mehrmals mit Wasser, trocknet und verdampft sdas Lösungsmittel im Vakuum bei 300. Nach Umkristallisieren aus Essigester wird das kristallista mit Essigester-Petroläther (2: 1) gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 25,8 g des 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-phenylesters vom F. 115-116 (Zersetzung).
Beispiel 6 Abspaltung der N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe aus verschiedenen Aminosäuren
90,9 mg (0,20 mMol) N-2-(p-Diphenyl)-isopropyl- oxycarbonyl - L-valin-cyclohexylammoniumsalz werden bei 250 in 2,0 ml 80 % iger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnom- men, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und mit 0,1 -n. Perchlorsäure in Eisessig titriert. In 3 t/ Stunden ist die Schutzgruppe quantitativ, abgespalten.
Auf gleiche Weise werden die Spaltzeiten in 80 % iger Essigsäure von folgenden Verbindungen bestimmt: N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- Quantitative
Aminosäure Abspaltung in Std.
Glycin-dicyclohexylammoniumsalz 3 1/2 L-Leucin 3 L-Prolin-dicyclohexylammoniumsalz 32/3 Na-tert.-Butyloxycarbonyl-L-Lysin- 4 2/3 dicyclohexylammoniumsalz L-Tyrosin-cyclohexylammoniumsalz 21/3 L-Phenylalanin-dicyclohexyl- 31/2 ammoniumsalz L-Glutaminsäure-y-tert.-butylester- 4 1/5 cyclohexyl ammoniumsalz L-Serin-tert.-butyläther-cyclohexyl- 3 ammoniumsalz
Beispiel 7 Abspaltung der N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl Gruppe aus N -2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl N-BOC-L-lysyl-N-BOC-L-lysin-methylester a) 160,0 mg Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxy- carbonyl-Np-BOC-L-lysyl-Na-BOC-L-lysin methylester werden in 2,2 ml eines Gemisches aus Fisessig-82,8 % Ameisensäure-Wasser (7:1: 2 Vol.-Teile) gelöst.
Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,30 ml entnommen, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und mit 0,1-N. Perchlorsäure in Eisessig titriert. Nach 55 Minuten ist die Na-Schutzgruppe quantitativ abgespalten, während die Na-BOC-Gruppen nicht angegriffen sind.
tb) 240 mg des obigen Dipeptidderivates werden in
1,7 mi IMethylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur mit 1,3 ml einer Lösung von 37,5 g Chloressigsäure in
12,5 ml Wasser versetzt. Aus der homogenen Lösung werden nach verschiedenen Zeiten Proben von 0,5 mi entnommen, in 1,5 mi Methanol gegeben und sofort im System sec.-ButanolLEisessig-Wasser (67:10: 23) an Silicagel chromatographiert. Es zeigt sich, dass nach
15 Miouten die Na-Schutzgruppe vollständig abgespalten ist und die Na-BOC-Gruppen nicht angegriffen sind.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
666 mg (1 mMol) Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl - Na-BOC-lysin-dicyclohexylammoniumsalz m 4 ml Dimethylformamid werden bei - 150 mit 0,125 ml Plvaloylchlorid versetzt. Nach 15mintitigem
Rühren bei - 100 wird eine Lösung von 320 mg (1 mMol) Na-BOC-lysin-methylesteracetat in 3 ml Dimethylformamid zugefügt und 2 Stunden bei 0 gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird in Fssigester aufgenommen, bei 0 mehrmals mit 0.1-M. Citronensäurelösung, 2-N.
Sodalösung und Wasser gewaschen, dann getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedalmpft. Der Rückstand wird in wenig Äther gelöst, worauf rasche kristallisation einsetzt. Man erhält
632 mg Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl
Na-BOC-lysyl-N -BOC-lysin-merthylester vom F. 87-89 (Zersetzung). Nach Umkristallisation aus Essigester-Petroiäther verändert sich der F. nicht.
Beispiel 8 Abspaltung der N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-Gruppe aus N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxy carbonyl-L-prolyl-L-leucyl-L-(#-tert.-butylester)- glutamyl-L-phenylalanin-tert.-butylester
1,10 g N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-Pro Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu werden mit 6,5 ml einer Mischung aus Eisessig-82,8 % Ameisensäure-Wasser (7:1: 2) (Vol.) während 2 1/4 Stunden gerührt. Unter Eiskühlung wird mit gesättigter Pottaschelösung alkali- siert, mit Essigester extrahiert, neutral gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird mit wenig Petroläther verrieben, dann aus 75 % igem Methanol umkristallisiert. Man erhält 0,65 g H-Pro-Leu-Glu(Ot Bu)-Phe-OdBu vom F. 188-190 .
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
5,35 g 910 mMol) N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-Prolin-dicyclohexylammoniumsalz in 40 ml Dimethylformamid werden bei -15 mit 1,25 ml Pivaloychlorid versetzt. Nach 15minütigem Rühren bei - 10 wird eine Lösung von 5,8 g H-Leu-Giu'(OtBu)- Phe-OtBu-acetat in 30 ml Dimethylformamid zugetropft und die Mischung 2 Stunden bei 0 reagieren gelassen. Dann verdünnt man mit Essigester und schaut telt die Lösung bei 0 je zweimal mit Wasser, 0,1-M.
Citronensäurelösung, 2-N. Sodalösung und Wasser aus.
Die Essigesterlösung wird nach dem Trocknen über Natriumsulfat zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Äther gelöst und zur Kristallisation gebracht. Man erhält so 6,75 g N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu, das nach Umkristalli- sieren aus 85 % igem Methanol bei 188 (Zersetzung) schmilzt.
Beispiel 9 Anwendung der N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- Gruppe bei der Feststoffträger-Synthese
Herstellung von Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L (Na-tert.-butyloxycarbonyl)-lysyl-glyein-hydrazid
2,15 g BOC-Glycinharz (Stryol-Divinylbenzol-Copolymer enthaltend 0,25 m Aeq BOC-Glycin/g Harz 0,5 mMol) werden 3 Minuten mit 10 mi Dioxan gerührt, dann filtriert. Nach Zugabe von 10 ml 4-N.
Salzäure in Dioxan wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und je dreimal mit 10 ml Dioxan und -Methylenchlorid gewaschen, wobei jeweils 3 Minuten mit dem Lösungsmittel gerührt wird. Nun wird 10 Minuten mit 10 ml eines Gemisches von Methylenchlorid Triäthylamin (9 :1) gerührt und sechsmal mit 10 ml Methylenchlorid nachgewaschen. Das H-Glycin-Harz wird unter Methylenchlorid aufbewahrt.
0,83 g Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl
Na-BOC-lysin-dicyclohexylammoniumsalz (1,25 mMol) werden in Methylenchlorid gelöst, bei 0 dreimal mit 0,2-M. Citronensäurelösung und dreimal mit Wasser ausgeschüttelt. Die Methylenchloridlösung wird getrocknet, filtriert und im Vakuum auf wenige ml eingeengt. Diese Lösung wird zum obigen Harz gegeben, 5 Minuten gerührt, ldann werden 290 mg Di cyclohexylcarbodiimid, gelöst in wenig Methyienchio- rid, zugefügt.
Nach 2stündigem Rühren wird filtriert und je dremial mit je 10 ml Methylenchlorid, Dimethylformamid, Dimethylformamid-Methanol (1 : 1) und Methylenchlorid gewaschen. Hierauf wird das
Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-Na
BOC-Lys-Gly-Harz in 5 ml Methylenchlorid suspendiert und mit 3,7 ml einer Lösung von 37,5 g Chloressigsäure in 12,5 ml Wasser versetzt. Es wird noch 1 · Stunden gerührt, darauf, wie oben, mit Methylenchlorid, Dioxan, Me- thylenchlorid, Methylenchlorid-Triäthylamin (9:1) und Methylenchlorid gewaschen.
Das erhaltene H-Lys (BOC)-Gly-Harz wird nach Zugabe von 0,37 g Carbo- benzoxy-L-phenylalanin (Z-Phe-OH) in 8 ml Methylenchlorid 5 Minuten gerührt, dann mit 290 mg Dicyclo- hexvlcarbodiimid in wenig Methylenchlorid versetzt und 3 Stunden ,gerührt. Das Z-Phe-Lys(BOC)-Gly-Harz wird wiederulm wie oben filtriert und mit Meithylen- chlorid, Dimethylformamid, Dimethylformamid-Methanol (1:1), Methanol und Äthanol gewaschen. Hierauf wird das Harz mit 10 ml Äthanol-Hydrazinhydrat (3 1) 15 Stunden gerührt, abfiltriert und mehrmals mit Äthanol gewaschen.
Die vereinigten Filtrate werden im Va kuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand zur Entfernung des Hydrazinhydrats im Hochvakuum bei 50 über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet.
Den Rückstand löst man in 5 mi siedendem Äthanol, filtriert von wenig unlöslichem Material ab und versetzt in der Wärme mit etwa 15 ml Wasser. Nach Animpfen lässt man langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Das auskristallisierte Produkt wird abfiltriert und mit Atha- nol-Wasser (1: 3) gewaschen. Man erhält 185 mg Z-Phe-Lys (BOC)-Gly-NHNH2 vom F. 163-164 .
Beispiel 10 Herstellung von L-Prolyl-L-tyrosyl-(NE-tert.-butyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-methionin-hydrazid unter Verwendung der 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe a) 6,7 g (10 mMol) Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxy oarbonyl-Na-BOC-L-lysin-dicyclohexyl ammoniumsalz in 40 ml Dimethylformamid werden bei - 150 unter Rühren mit 1,25 ml Pivaloylchlorid versetzt und 5 Min.
bei - 100 gerührt. Darauf werden unter Überleiten von Stickstoff 2,0 g L-Methionin-methylester-hydrochlorid und 1,4 ml Triäthylamin zugefügt und 3 Stunden bei 0 gerührt. Man verdünnt mit Essigester, schüttelt bei 0 je dreilmlal mit 0,1-m. Citronensäurelösung und bei Raumteenperatur mit 2-n. Kaliumcarbonatlösung und Wasser aus, trocknet und verdampft im Vakuum zur Trockne. Das Rohprodukt (6,5 g) wird in Chloroform durch eine Säule aus 150 Ig Kieselgel filtriert. Man erhält so 4,7 g Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl Na-BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester in Form eines farblosen Harzes, Rf = 0,55 in Chloroform-Aceton (8:2).
b) 3,15 g (5 mMol) dieses Dipeptidesters werden mit 50 ml eines Gemisches aus Eisessig-82,8 % iger Ameisensäure-Wasser (7 : 1 : 2; Vol.) 1 1/2 Stunden gerührt, dann in eine Mischung von 50 mi Essigester und 20 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung bei 0 gegossen. Die Essigesterlösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und sohonend eingedampft. Der erhaltene Na-BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester ist unbeständig und muss sofort weiterverarbeitet werden.
c) Zu diesem Zweck wird der Rückstand unter Stickstoff bei 0 in 18 ml Acetonitril gelöst, mit einer Lösung von 2,10 g (5 mMol) N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-tyrosin (aus dem Cyclohexylammoniumsalz mit Citronensäure freigesetzt) in 2 ml Dimethylformamid und 1,15 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 20 Stunden bei 0 gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat ein gedampft, der Rückstand mit Äther-Petroläther verrieben, abfiltriert und aus Essigester-Petrolätber umge- fällt. Man erhält
2,8 g N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L tyrosyl-Na-BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester als dünnschichtchromlatographisch einheitliches Pulver; Rf = 0,2 in Chloroform-Aceton (8 : 2).
d) 2,38 g (3 mMol) dieses Tripeptidesters werden mit 30 ml eines Gemisches aus Eisessig-82,8% iger Ameisensäure-Wasser (7:1:2; Vol.) 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Eiswasser gegossen, zweimal mit Äther extrahiert, die wässrige Lösung mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung alkalisiert und mit Essigester extrahiert. Nach Verdampfen des Essigesters hinterbleiben 1,33 g L-Tyrosyl-Na-BOC-L- lysyl-L-methionin-methylester in Form eines farblosen Schaumes, Rf = 0,5 in Chloroform-Methanol (85 : 15).
e) 1,11 g (2 mMol) dieses Tripeptidesters werden mit
0,71 g (2 mMol) N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxy- carbonyl-L-prolin (aus dem Dicyclohexylammoniumsalz freigesetzt) in 6 ml Acetonitril gelöst, bei 0 mit 450 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 18 Stunden bei 0 gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird ab filtriert, das Filtrat mit Essigester verdünnt, bei 0 drei- mal mit 0,1-m. Citronensäure, bei Raumtemperatur mit 2-n. Kaliumcarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der N-2- (p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-prolyl L-tyrosyl-N; -BO;C-L-lysyl-L-methionin-methylester wird in quantitativer Ausbeute (1,8 g) erhalten.
f) Er wird mit 22 ml eines Gemisches aus Eisessig82,8 % iger Ameisensäure-Wasser (7:1:2) 1 Stunde gerührt. Die Lösung versetzt man mit Eiswasser, extrahiert zweimal mit Äther, stellt die wässrige Lösung mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung alkalisch und extrahiert mit Essigester. nach dem Trocknen verdampft man den Essigester im Vakuum vollstädig. Zurück bleiben 1,02 g L-Prolyl-L-tyrosyl-Na-BOC-L-lysyl-Lmethionin-methylester, Rf=0,25 in Chloroform-Methanol (85 : 15). Das Produkt kann aus Acetonitril kristallisiert werden, F. 177-180 .
g) 326 mg (0,5 mMol) des Tetrapeptidesters werden in 1 ml heissem Methanol gelöst, unter Überleiten von Stickstoff bei Raumtemperatur mit 0,25 ml Hydrazinhydrat versetzt und verschlossen 18 Stunden stehengelassen. Das auskristallisierte Produkt wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Man erhält
225 mg L-Prolyl-L-tyrosyl-Na-BOC-L-lysyl-L methioninhydrazid vom F. 206-207 .
Beispiel 11 Herstellung von L-Prolyl-L-tyrosyl-L-(Na-tert.-butyloxycarbonyl)-lysyl-L-methionin-hydrazid nach der Feststoffträgersynthese unter Verwendung der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe.
a) 4,9 g BOC-Methioninharz (Styrol-Divinylben zol-Copolymer enthaltend 0,18 m Aeq. BOC-methio- nin/g Harz - 0,88 mMol) werden in einem 50 ml Reaktionsgefäss nach Merrifield unter Stickstoff nacheinwander mit folgenden Reagenzien geschüttelt, die jeweils wieder abfiltriert werden:
1. mit 25 ml Dioxan während 4 Minuten;
2. mit 20 ml 4-n. HCl in Dioxan während 60 Min.;
3. 3mal mit je 20 ml Dioxan je 3 Minuten;
4. 3 mal mit je 20 ml Äthanol je 3 Minuten;
5. 3mal mit je 20 ml Chloroform je 3 Minuten;
6. mit 20 ml Chloroform-Triäthylamin (9: 1) während 10 Minuten;
7. 3mal mit je 20 ml Chloroform je 3 Minuten;
8. 4mal mit je 20 ml Methylenchlorid je 3 Minuten.
Das erhaltene Methioninharz wird methylenchloridfeucht aufbewahrt (enthält total 17 ml Methylenchlorid).
Aus
1,87 g Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl
Na-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-dicyclohexyl ammoniumsalz wird wie im Beispiel 9 beschrieben, das geschützte L Lysin freigesetzt. Die erhaltene Methylenchloridlösung wird zum obigen Harz gegeben, 10 Minuten geschüttelt, dann eine Lösung von 730 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 3 ml Methylenchlorid zugefügt und das Ganze während 4 Stunden geschüttelt. Das Harz wird darauf wie folgt unter Schütteln gewaschen:
3mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten);
3mal mit je 20 ml Methanol (je 3 Minuten) und
3mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten).
Das erhaltene
Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl
Na-BOC-L-lysyl-L-methioninharz enthält 17 ml Methyleuchlond) wird zur Abspaltung der
Na-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-gruppe mit 12,6 ml einer 75 % igen wässrigen Chloressigsäurelösung versetzt und 1 1/2 Stunden geschüttelt. Das Harz wird abfiltriert und unter Schütteln wie folgt gewaschen:
3mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten);
4mal mit je 20 ml Äthanol (je 3 Minuten);
1mal mit 25 ml Chloroform (3 Minuten); 1 mal mit 20 ml Chloroform-Triäthylamin (9 1) (10 Minuten);
3mal mit je 20 ml Chloroform (je 3 Minuten);
3mal mit je 20 ml Methanol (je 3 Minuten) und
3mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten).
Das erhaltene N-BOC-L-lysyl-L-methioninharz wird nun auf analoger Weise wie oben mit N-2 (p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-tyrosin umgesetzt.
Zu diesem Zweck werden 1,6 g des Cyclohexylammoniumsalzes dieser Verbindung bei 0 mit 25 ml Essigester und 20 ml 1-m. Citronensäurelösung gerührt, bis alles gelöst ist. Die wässrige Schicht wird abgetrennt, die Essigesterlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der kristalline Rückstand wird in 1 ml Dimethylformamid gelöst, mit 10 ml Methylenchlorid verdünnt und die Lösuug zum obigen Harz gegeben, Gleichzeitig werden noch 710 mg Hydroxysuccinimid zugefügt. Nach 10minütigem Schütteln wird eine Lösung von 700 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Methylenchlorid zugegeben und 4 Stunden geschüttelt. Anschliessend wäscht man das Harz wie oben beschrieben mit Methylenchlorid, Methanol und Methylenchlorid.
Auch zur Abspaltung der N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe mit Chloressigsäure verfährt man genau nach dem obigen Verfahren.
Man erhält so das L-Tyrosyl-N@-BOC-L-lysyl-L- methioninharz, das mit N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-prolin in Methylenchlorid (erhalten aus einer Lösung von 1,34 g des Dicyclohexylammoniumsalzes in Methylenchlorid durch Freisetzen mit Citronensäure) kondensiert wird. Die erhaltene Methylenchoridlösung wird 10 Minuten mit dem Harz geschüttelt, dann ein Lösung von 580 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Methylenchlorid zugegeben und 18 Stunden geschüttclt. Man filtriert das Harz ab, wäscht gleich aus wie oben beschrieben und spaltet die
N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe mit Chloressigsäure ab. Nach den üblichen Waschprozessen wird das erhaltene L-Prolyl-L-tyrosyl-Na-BOC L-lysyl-L-methioninharz mit 20 ml Äthanol geschüttelt, filtriert und unter einem schwachen Stickstoffstrom mit 7 ml Äthanol und 3 ml Hydrazinhydrat während 17 Stunden gerührt.
Das Harz wird abfiltriert und zehnmal mit je 10 ml 95 % igem Äthanol ausgewaschen. Die ver e,inigten Filtrate dampft man im Vakuum bei 5,00 ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man löst das Rchprodukt in 25 mi 0,1-n. Essigsäure und 80 ml Essigester, und schüttelt die wässrige Lösung noch zweimal mit je 50 ml Essigester aus. Die drei Essigesterlösungen extrahiert man noch zweimal mit je 10 ml 0, l-n. Fssigsäure. Alle drei wässrigen Extrakte werden vereinigt und lyophilisiert.
Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographie an 7 g CM-Sephadex mit Hilfe eines Gradienten, be- ste-hend aus je 300 ml 0,ül-m. und 0,05-m. Ammo- ninmacetat vom pH 6,5. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 320 mg des Acetats von L-Prolyl-L-tyrosyl-N-BOC-L-lysyl-L-methionin-hydrazid. Das Produkt ist vollständig identisch mit dem im Beispiel 10 beschriebenen Produkt. Rf 0,35 im Dünnschichtchromatogramm im System s-Butlanol- Eisessig-Wasser (67: 10: 23). Nach Freisetzen aus dem Acetat mit Kaliumcarbonatlösung kristallisiert das Produkt aus wässrigem Methanol, F. 206-207 (Zers.).
Beispiel 12 Herstellung von N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-leucyl-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L glutaminsäure-di-tert.-butylester.
Der als Ausgangsmaterial benötigte S-Trityl-L cysteinylHglycyl-L-gl,utaminsäure-di terr.-ibultylester kann folgendermassen hergestellt werden: Aus Carbobenzoxy- glycin und L-Glutaminsäure-di-tert.-butylester wird mit der gemischten Anhydridmethode
Carbobenzoxy-glycyl-L-glutamin säure-di-tert.-butylester erhalten, F. 74-76 . Der daraus Durch Hydrieren gewonnene
Glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester wird mit N.S-Di-trityl-L-cystein und Dicyclohexylcarbodümid umgesetzt und liefert N,s-Di-trityl-L-cysteinylglycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester, F. 98-110 .
Durch Abspaltung ,der N-Tritylgruppe mit 80 % iger Essigsäure erhält man S-Trityl-cysteinyl-glycyl-L glutaminsäure-di-.ert.butylester.
N-2- (p-Diphenyl)-isopropyloxyearbonyl-L-valin (aus 1,91 g (4*2 mMol) des Cyclohexylammoniumsalzes mit Citronensäure freigesetzt) löst man in 20 ml Essig- ester, gibt 0,59 ml (4,2 mMol) Triäthylamin und, nach Abkühlen auf - 100, 0,56 ml (4,2 mMol) Chlorkohlen- säure-isobutylester zu. Nach 10minütigem Rühren bei - 100 tropft man eine Lösung von 2,78 ,g (4,2 mMol) des obigen Tripeptiddiesters in 25 ml Essigester zu und rührt noch 15 Minuten bei - 100 und 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Verdünnen mit Essigester schüttelt man bei 0 mit 0,5 -m. Citronensäure, 1-n.
Natriumhydrogencarbonat und Wasser aus, trocknet und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand, aus Ace- ton-Äther kristallisiert, ergibt 2,91 g N-2-(p-Diphenyl)isopropyloxycarbonyl-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl L-glutaminsäure-di-tert.-butylester vom F.184-186 .
Rf = 0,6 in Chloroform-Methanol (95 : 5).
1 g (1 mMol) dieses Tetrapeptidesters werden mit 10 ml einer Mischung aus Eisessig-82,8 %iger Ameisensäure-Wasser (7:1: 2, Vol) 1 Sunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Versetzen mit 10 ml Wasser und 40 ml Chloroform wird bei 0 mit konzentriertem Ammoniak alkalisiert, die Chloroformlösung abgetrennt, gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Petrol äther verrieben. wobei man
0,76 g L-Valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L glutaminsäure-di-tert.-butylester als dünnschichtchromatographisch einheitliches Öl erhält.
Rf = 0,25 in Chloroform-Methanol (95 : 5). Zu 370 mg (1 mMol) N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycar bonyl-L-leucin und 768 mg des obigen Tetrapeptidesters in 7 ml Tetrahydrofuran werden bei 0 238 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und 4 Stunden bei 0 gerührt. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird mit Essigester verdünnt, bei 0 mit 0,5-m.-Citronensäure, 1-n. Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Durch Eluieren mit Essigester bei der Chromatographie an Silicagel werden
775 mg N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl
L-leucyl-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L glutaminsäure-di-tert.-butylester als einheitliches Produkt erhalten. Rf @ 0,55 in Chloroform-Methanol (9:1); Rf = 0,63 in Toluol- Aceton (1:1).
Beispiel 13 Einführung der 1,1 -Diphenyl-äthoxycarhonylgruppe
8,2 g Diphenyl-methyl-carbanol, 5,35 g Isocyanat essigsäureäthylester und 4 mll Pyridin werden 48 Stunden auf 500 erhitzt. Die Lösung wird mit 100 ml Äther verdünnt bei 0 mit 0,1-m. Citronensäurelösung und Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum vollständig eingedampft. Man erhält 10,6 g eines zähen Öls, bestehend aus
1,1-Diphenyl-äthoxycarbonyl-glycin-äthylester; Rf = 0,7 im Dünnschichtchromatogramm in Chloro form-Methlanol (95 : 5).
Beispiel 14 Abspaltung der 1,1-Diphenyl-äthoxy-carbonylgruppe
207,8 mg 1,1-Diphenyläthoxycarbonyl-glycin-äthylester werden bei 250 in 3,15 ml 80 % iger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnommen, in 4 mi Dimethylformamid gegeben und der freigesetzte Glycinäthylester mit 0,1 -n.
Perchlorsäure titriert. Die Halbwertszeit für die Ab- spaltung der Schutzgruppe beträgt etwa 30 Minuten.
Nach 5 Stunden ist die Abspaltung quantitativ.
Beispiel 15 Einführung der 1,1 1-Diphenyl-propyloxycarbonylgruppe
3,2 g Diphenyl-äthyl-carbinol, 1,9 g Isocyanatessigsäureäthylester und 1,6 ml' Pyridin werden 72 Stunden auf 500 erwärmt. Die Lösung wird mit 50 ml Äther verdünnt, bei 0 mehrmals mit 0,1 -m. Citronensäure- lösung un!d Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum vollständig eingedampft.
Nach Abtrennung von 2.3 g Diphenyläthylcarbinol mit tels Petroläther wird der 1 ,1--Diphenyl-propyloxycar- bonyl-glycin-äthylester als Öl erhalten; Rf = 0,2 im Dünnschichtchromatogramm in Chlorform.
Beispiel 16 Abspaltung der 1,1-Diphenyl-propyloxycarbonylgruppe
409 mg 1,1-Diphenyl-propyloxycarbonyl-glyein äthylester werden bei 220 in 80 % iger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,5 ml entnom- men, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und der freigesetzte Glycinäthylester mit 0,1 -n. Perchlorsäure titriert. Die Halbwertszeit für die Abspaltung der Schutzgruppe beträgt etwa 50 Minuten. Nach 8 Stunden ist die Verbindung quantitativ gespalten.