Verfahren zur Herstellung von C25-hydroxyliertem Vitamin D und Vitamin D3
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit Vitamin D-ähnlicher Wirkung, nämlich des 25-Hydroxyergocalciferols (C25-hydroxylier- tes Vitamin Do) und des 2S-Hydroxycholecalciferols (C > 5- -hydroxyliertes Vitamin D3).
Die antirachitische Wirkung der Vitamine D, insbesondere der Vitamine D2 und D3, ist wohlbekannt und durch Veröffentlichungen reichlich belegt. Auch die Anwendung dieser Vitamine als Zusatzstoffe zur Nahrung ist gut fundiert.
Die Derivate der Vitamine D2 und D3 zeigen eine grössere biologische Wirkung als Vitamin D und Ds; diese Derivate werden als C5-hydroxyliertes Vitamin D (25 -Hydroxyergocalciferol) bzw. C25-hydroxyliertes Vitamin Da (25-Hydroxycholecalciferol) erkannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von COs-hydroxyliertem Vitamin D2 bzw. C5- -hydroxyliertem Vitamin D3, dadurch gekennzeichnet, das man Schweine täglich mit hohen Dosen von Vitamin D2 bzw. Vitamin D3 füttert, den Schweinen danach Blutplasma entnimmt und aus dem Blutplasma die gewünschte Verbindung durch Chromatographie isoliert.
Auf der Zeichnung Fig. 1 sieht man die Kurve der mittels einer mit Kieselgel beschickten chrornatographischen Säule bestimmten Radioaktivität von Schweineplasma, das von mit grossen Dosen von Vitamin D2 gefütterten Schweinen gewonnen und mit Tritium markiert wurde.
Die Zeichnung Fig. 2 zeigt die Radioaktivitätskurve der Spitzenfraktion IV aus Fig. 1 mittels einer mit Kie .segel beschickten chromatographischen Säule.
Die Zeichnung Fig. 3 zeigt die Radioaktivitätskurve der Spitzenfraktion IV aus Fig. 1 mittels einer chromatographischen Verteilung auf einer Celitesäule.
Die Zeichnung Fig. 4 gibt die Strukturformel des G- -hydroxylierten Vitamins D2.
Beispiel I
4 Schweine aus gemischter Zucht mit einem Gewicht von je 60 bis 75 kg werden mit Stammrationen gefüttert.
welchen wasser-dispergierbares Vitamin D2 in solcher Menge zugesetzt wurde, dass 0,3732 kg Nahrung 70 000 internationalen Einheiten (IE) von Vitamin D2 entspricht.
Diese ergänzte Ration bewirkt bei jedem Schwein eine tägliche Zufuhr von 500000 IE Vitamin 92. Nachdem die Schweine während 26 Tagen mit dieser Nahrung gefüttert wurden, entnimmt man deren Blut und mischt es sofort mit 1/10 seines Volumens einer 0,1 M Natriumoxalatlösung, um die Gerinnung zu verhindern. Man trennt die Zellen vom Blut durch Zentrifugieren, behandelt das erhaltene Plasma (4,1 Liter) mit genug Ammoniumsulfat, um eine 70%ige Sättigung zu erreichen, und lässt das so behandelte Plasma während 7 Tagen auf 40C stehen, damit die Serumproteine ausfallen.
Durch Zentrifugieren während 25 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 25 000 U/Min, trennt man die entstandene Fällung ab, extrahiert sie mit 6,6 Liter eines 2:1 Gemisches von Methanol und Chloroform und lässt während 24 Stunden stehen, worauf man noch 2,2 Liter Chloroform unter Rühren zusetzt. Man trennt die denaturierten Proteine durch Filtrieren über Glaswolle ab, extrahiert sie nochmals mit 4,4 Liter des Methanol/Chloroform-Gemisches, vereinigt die Filtrate und trennt sie durch Wasserzugabe in eine wässrig-methanolische Phase und eine Chloroformphase.
Man scheidet die wässrige Phase ab, extrahiert sie nochmals mit 2 Liter Chloroform und lässt wiederum stehen.
Man vereinigt die Chloroformschichten, wäscht mit 10 Liter Wasser, lässt während 24 Stdn. stehen und engt am Rotationsverdampfer bis zu einem schwarzen öligen Rückstand von 50 ml ein. Man wäscht den Rückstand mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Man trocknet in einem Rotationsverdampfer und löst in 100 ml Skellysolve B (Markenname, besteht im wesentlichen aus n-Hexan, Siedebereich ca. 65 bis 670C).
Die Trennung der gewünschten Plasmafraktionen durch Chromatographie setzt die Erstellung einer Radioaktivitätskurve des Plasmas voraus. Diese Kurve wird folgendermassen erstellt:
Radiochemisch reines 3H-Vitamin D2 wird hergestellt, indem man 1 g Vitamin Dt während 2 Wochen der Wirkung von 3,0 Ci Tritium-markierter Essigsäure aussetzt und das Produkt danach bis zum Erreichen einer konstan ten spezifischen Aktivität chromatographiert, nämlich 3 mal auf einer mit Kieselgel beschickten Mehrflussäule und einmal auf einer Säule mit umgekehrter Phase. Das 3H-Vitamin D hat eine spezifische Aktivität von 1200 DPMIIE oder 8,6 mC/Millimol. Die Säulen und die Methode zur Bestimmung des radioaktiven Reinheitsgrades sind in der Veröffentlichung von T. Neville und H.F.
De Luca [Biochemistry 5, 9201 (1966)] beschrieben.
Man nimmt 10 Ratten zu je ca. 400 g, welche mit einer Vitamin D-armen Stammration gemäss H. Steenbock [Science 58, 449 (1923)]eefüttert wurden, und verabreicht ihnen intrapentoneal eine Lösung von 10 000 IE nH-Vita- min D. in 0,1 ml Äthanol. 24 Stunden später entnimmt man ihnen Blut durch Herzpunktion und zentrifugiert das Blut. wodurch 40 ml Plasma erhalten wird. Man ex extrahiert das Plasma mit einem 2 : 1 Gemisch von Methanol und Chloroform wie von Blunt und Mitarbeitern [Biochemistry, 7, 3317 (1968)] beschrieben, trocknet den Chloroformextlakt über wasserfreiem Natriumsulfat und dampft in einem rasch arbeitenden Verdampfer zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in Skellysolve B und vereinigt ihn mit dem aus Schweineblut weiter oben erhaltenen Extrakt.
Man teilt den vereinigten Extrakt in 5 gleichen Teile auf und chromatographiert jeden Teil für sich auf einer Kieselgelsäule wie von Blunt und Mitarbeitern (siehe oben) beschrieben. Die Zeichnung Fig. 1 zeigt die Radioaktivitätskurve des Extraktes in einer solchen Säule, wobei das mit III bezeichnete Maximum unverändertes Vitamin D. darstellt. Man vereinigt die unter jedes der Maxima fallenden Fraktionen (jede zu 10 ml) und prüft sie auf biologische (antirachitische) Wirkung an Ratten im Rachitisbehandlungsversuch mittels des Linientests (US-Pharmakopo- 1955). Die dem Maximum IV entsprechenden Fraktionen sind etwa 1,5 mal stärker wirksam als jene vom Maximum III. während die Fraktionen der Maxima I. II, IVa und V nur eine schwache oder gar keine biologische Wirkung zeigen.
Man vereinigt die dem Maximum IV entsprechenden Fraktionen der 5 Teile, dampft in einem rasch arbeitenden Verdampfer zur Trockne ein und chromatographiert auf einer mit Kieselgel beschickten Mehrfluss-Säule, wobei man jedoch von der von Neville und DeLuca (siehe oben) beschriebenen Methode insofern abweicht, als die Mischkammer 250 ml Skellysolve B und die Vorratskammer 400 ml von 85% Diäthyläther in Skellysolve B enthält. Sobald die Vorratskammer leer wird. füllt man sie mit 300 ml 100cd Diäthyläther nach. Die Zeichnung Fig. 7 zeigt die Elutionsktirve dieser vereinigten Fraktionen. welche anhand von 5 ml-Fraktionen erstellt wurde und worin das Maximum IVa immer noch erscheint.
Man vereinigt die Fraktionen 63-68, dampft im rasch arbeitenden Verdampfer ein und untepvirft den Rückstand einer Verteilungschromatographie auf Celite (Markenname, Kieselgelprodukt aus Diatomeenerde) wie ina folgenden beschrieben:
Man setzt 200 ml Skellysolve B in Gleichgewicht mit dem gleichen Volumen eines Gemisches von Methanol und Wasser 80: 20. Man mischt 20 g Celite mit 15 ml der Methanolphase und füllt damit eine Säule von 60 X 1 cm in Anteilen von je 2 cm und ohne Flüssigkeitsbeihilfe.
Man verwendet die obere Phase als mobile Phase. Man bringt die vereinigten Fraktionen auf die Säule mittels 1 bis 3 ml der mobilen Phase und entwickelt die Säule mit der mobilen Phase, wobei man Fraktionen von 5 ml auffängt. Man vereinigt die Fraktionen 1 bis 17, dampft zur Trockne ein und chromatographiert nochmals an einer gleichen Verteilungssäule. Die Zeichnung Fig. 3 zeigt die Radioaktivitätskurve dieser Säule.
Alle bestimmungen der Radioaktivität sind mittels eines Flüssigkeits-Scintiilations-Zählers durchgeführt worden, welcher mit einem automatischen externen Standardisierungssystem versehen war. Die zu analysierenden Proben werden im Luftstrom zur Trockne eingedampft, in der Toluol-Scintillationslösung gelöst (2 g 2,5-Diphenyloxazol und 100 mg 1 ,4-Bis[2-(4-methyl-5-phenyloxazolyl) benzol] pro Liter Toluol) und bestimmt.
identifizienitig
Zu diesem Zweck musste zuerst das Tetmmethylsilyl- äther-Derivat des Produktes vom Maximum IV hergestellt werden. Man trocknet 30 Ig des isolierten Produktes in einem Strom von trockenem Stickstoff, setzt dann einige Tropfen eines Reagenz (aus 14 ml trockenem Pyridin, 4 ml Hexamethyldisilazan und 2 ml Trimethylsilylchlorid) zu, leitet Stickstoff durch und lässt das Gemisch in der Dunkelheit bei Raumtemperatur während 3 Stunden stehen. Man setzt 3 ml Skellysolve B und danach 2 ml 10%ige Schwefelsäure zu, rührt das Gemisch kräftig durch und lässt die beiden Phasen voneinanderscheiden. Man trocknet die Skellysolve B-Phase über einer kleinen Menge wasserfreiem Natriumsulfat und chromatographiert auf einer Kieselgelsäule wie von Lund und Mitarbeitern [Arch. Biochem.
Biophysics, 120, 513 (1967)] beschrieben. Das Disilyläther-Derivat konnte in den Röhren 19 bis 27 (15 , mg) wiedergefunden und durch Gas-Flüssig Chromatographie als im wesentlichen rein erkannt werden. Dieses Derivat wurde zur Bestimmung der Massenspektra verwendet.
Das ultraviolette Spektrum und die Angaben der Gas -Flüssig-Chromatographie deuten darauf hin, dass in dem Produkt vom Maximum IV die Trien-Struktur des Vitamins D vorhanden ist. Das Massenspektrum des Produktes vom Maximum IV zeigt starke Maxima bei m/e
136 (C"H..O) und 118 (C.Hl"), welche vom Ring A der Moleküle inklusive C-6 u. 7 herrühren und im Spektrum von Vitamin D ebenfalls auftreten.
Das Massenspektrum des Produktes Vom Maximum IV deutet auf ein Molekularion von mie 412 hin, wobei die Zunahme um 16 Masseneinheiten gegenüber dem Molekulargewicht von Vitamin D die Aufnahme eines zusätzlichen Sauerstoffatoms nahelegt. Die Bestätigung dafür findet sich im hoch auflösenden Massen spektrum, da die genaue Masse des Molekularions - 412.341 - die Bruttofonel C2sH4s0.. (berechnet 412,3341) verlangt. Die Verknüpfungsstelle des zusäztlichen Sauerstoffatoms in der Seitenkette wird durch den Vergleich der Spektrum des Vitamins D und des Produktes vom Maximum IV offenbar.
Beide zeigen Maxima bei m/e 271 (C11H .O 271,2065, durch hoch-auflösende Massenspektrometrie).
welche vom Verlust der gesamten Seitenkette durch Spal- tung der Cl,/C2,.-Bindung stammen. Zudem enthält das hoch-auflösende Massenspektrum des Produktes vom Maximum IV kleinere Maxima, welche vermutlich von der Seitenkette selber herrühren: m,/3 141,1255 (C,.H"O) und 123,1181 (C9HT
Ein Bruchstück der Masse 59 (C3H,O, durch hochauflösende Massenspektrometrie bestimmt) und das Verschwinden von 58 Masseneinheiten aus dem Molekularion unter Bildung eines Maximums bei m/e 354 (354,2900 - G27H-,,sO) liefern den Beweis einer Hydroxylfunktion an C-25, da beide im Massenspektrum des Produktes vom Maximum IV vorkommen,
hingegen in jenem von Vitamin D fehlen. Das erste Maximum dürfe durch ein fache Spaltung der C24/25-Bindung unter Bildung des Ions (CH3)2C = OH entstehen, letzteres durch Wasserstofftransposition unter Austritt der Bruchstücke von Aceton, welcher Mechanismus bei Homoallylalkoholen nicht selten vorkommt.
Den Beweis der Haftstelle der Hydroxylgruppe liefert das Massenspektrum des Silyläther-Derivates des Produktes vom Maximum IV: Dieses Spektrum zeigt ein Molekularion bei m/e 556 - wie für ein Di-(trimethylsilyl)-äther Zwd erwarten ist, und das ebenfalls erwartete starke Maximum bei m/e 131 (Basismaximum) - wel- ches gemäss der hoch-auflösenden Massenspektrometrie der Bruttoformel CsH1dSiO, (CH)2C = O-Si(CH3)3, entspricht.
Da dieses Maximum auch in den Spektren der Trimethylsilyläther-Derivate von 25-Hydroxycholesterin und C25-hydroxyliertem Vitamin D5, jedoch nicht in den Spektren der Silyläther der Vitamine D5 oder D5 vorkommt, so muss C-25 eben die Haftstelle der zusätzlichen Hydroxylfunktion sein.
Da vom Produkt des Maximums IV nur wenig Mate- rial isoliert wurde, hat man sein NMR-Spektrum in CDC1,-Lösung mit einem an einem elektronischen zeitlichen Mittelwertsrechner gekoppelten Spektrophotometer und unter Verwendung von Tetramethylsilan als interne Referenzsubstanz aufgenommen. Das NMR-Spektrum hat die obigen Schlussfolgerungen restlos bestätigt und einen unabhängigen Strukturbeweis geliefert. Die Angaben werden auf Tetramethylsilan (8=O) bezogen und als c in Teilen pro Million (ppm) ausgedrückt.
Ein starkes Singulett bei 8 1,24 ppm kann den beiden Methylgruppen an C-25 zugeteilt werden, während zwei Dublette bei 8 0,79 (J = 6,5 cps) und 0,81 ppm (J = 7,0 cps) von den übrigen Methylsubstituenten der Seitenkette (C-21 und C-28) herrühren müssen. Die NMR-Spektra des 25-Hydroxycholesterin und des C55-hydroxylierten Vitamins D weisen an praktisch gleicher Stelle (3 1,20 ppm) ein Singulett für die Methylgruppen C-26 und C-27.
Es muss hier im Spektrum des Produktes vom Maximum IV das Fehlen von zwei Dubletten vermerkt werden, welche ursprünglich bei 8 0,87 (J = 7,0 cps) und 8 0,98 (J = 6,0 cps) im Spektrum des Vitamins D vorhanden waren. Dieses Verschwinden von zwei Dubletten, welche zwei Methylgruppen entsprechen müssen, kann nur durch eine Hydroxylsubstitution an C-25 erklärt werden. Das restliche identifizierbare Merkmal ist das der angularen Methylgluppe C- 18 entsprechende Singulett. Diese Daten beweisen also die Struktur des Produktes vom Maximum IV als das C25-hydroxylierte Vitamin D2 (Zeichnung Fig. 4).
Die hoch-auflösenden Massenspektra sind mit einem Spektrophotometer ermittelt worden. welches mit einem elektronischen Rechner Sigma Modell 7 der Firma Seien- tific Data Systems gekoppelt war.
Weitere ausführliche Angaben zur Identifizierung der Verbindung können in der Publikation von T. Suda, H.F.
DeLuca, H.K. Schnoes und J.W. Blunt, The Isolation and Identification of 25-Hydroxyergocalcilerol (im Druck), gefunden werden.
Biologische Wirkung
Rachitisbehdndlungsversuch: Man füttert entwöhnte
Ratten während 21 Tagen mit der Rachitis-erzeugenden
Diät von Steenbock und Black (J. Biol. Chem. 64, 263 [1925]); diese Diät wird insofern abgeändert, als man wasserlösliche Vitamine wie von DeLuca und Mitarbei tern beschrieben (J. Nutr. 75, 175 [1961]) zugibt. Nach dieser Zeitspanne verabreicht man den Ratten in einer Einzeldosis 0,25 ,u,g des üblichen Vitamins D2 oder des Produktes vom Maximum IV. Sieben Tage später werden die Ratten getötet und der Linienversuch ( Line test ) auf Radius- und Ellenschnitten der einzelnen Ratten durchgeführt. Die Bestimmung der biologischen Aktivität er folgt gemäss US-Pharmacopoe, 14. Ausgabe [Mack Publishing Co., Eaton, Pa., USA (1955)].
Das isolierte Produkt vom Maximum IV, Csr,-hydroxy- liertes Vitamin D2, ergibt im Durchschnitt einen Wert von ca. 60 internationalen Einheiten per pg, während das Vitamin D2 Werte von nur 40 internationalen Einheiten per tlg liefert.
Calcircmaansit - Versuch ililit usngestülptem In restinalsack: Man hält in hängenden Gitterkäfigen entwöhnte männliche Ratten und füttert sie ad libitum mit einer gereinigten, Vitamin D-defizienten Diät, wie von De Luca und Mit. (J. Nutr., 75, siehe oben) beschrieben wurde. Diese Diät erzeugt bei Ratten keine Rachitis, sondern innerhalb von 3 bis 4 Wochen einen ausgesprochenen Vitamin D-Mangel, der sich durch einen tiefen Calciumspiegel im Serum unsl durch ein vermindertes Wachstum äussert [H. Steenbock und D.C. Herting, J. Nutr., 57, 449 (1955)].
Nachdem man die Ratten während 5 - 6 Wochen mit dieser Diät gefüttert hat, verabreicht man den Tieren eine Lösung von 0,25 pg Vitamin D2 bzw. isoliertem Produkt vom Maximum IV (25-OH-D2) in 0,02 ml Äthanol intrajugular. Zu dem in der folgenden Tabelle angeführten Zeitpunkt werden die Ratten getötet und die Prüfung auf Calciumtransport mittels umgestülpter Intesti nalsäcke nach der Methode von J.E. Zull und Mit.
[Science, 149, 182 (1965)] durchgeführt. Die Versuchsergebnisse stehen in der folgenden Tabelle, wobei der Calciumtransport durch das Verhältnis 45Ca(Serum)45Ca (Schleimhaut) ausgedrückt wird.
TABELLE I Stunden nach Transportverhältnis Verabreichung D2 2S-OH-D2 Kontrollgruppe 1,50 * 0,14 (25)*
3 1,40 + 0,39 (5) 1,94 + 0,41 (5)
4 1,54 * 0,36 (5) 2,09 * 0,65 (5)
6 1,88 * 0,30 (4) 2,74 * 0,49 (5)
8 2,06 + 0,12 (5) 3,51 + 0,23 (5)
12 3,35 * 0,70 (5) 3,58 t 0,59 (5) * Die in Klammern stehende Zahl gibt die Anzahl Ratten in jener Gruppe an.
Wirkung auf das Senrrnccrlcalm (Calciuniutnsetzung in Knochen)
Man füttert entwöhnte mänliche Ratten während 3 4 Wochen mit der von DeLuca u. Mit. (J. Nutr., 75, siehe oben) beschriebenen, Vitamin D-defizienten Diät, wobei das Calcium jedoch aus dieser Diät entfernt wurde. Den Ratten verabreicht man dann intrajugular eine Lösung von 2,5 tag synthetischem C25-hydroxyliertem Vitamin D2 (25-OH-D2) bzw. Vitamin D2 in 0,02 ml Äthanol. Zu dem in der untenstehenden Tabelle angeführten Zeitpunkt entnimmt man den Tieren Serum und unterwirft es einer Calciumbestimmung nach der Methode von Webster raum. J. Clin.
Pathol, 131, 330 ( IQ6f sX1. Alle Versuche werden zweifach durchgeführt; die Ergebnisse stehen in der folgenden Tabelle.
TABELLE II Stunden nach Seriumcalcium in mg % Verabreichung D2 2S-OH-D2 Kontrollgmppe 3,7 + 0,2 (6)*
4 3,7 7 zu 0,5 (4) 4,3 * 0,3 (4) 3,7 + 0,3 (4) 4,6 + 0,3 (5) 5 3,6 * 0.3 (4) 4,8 * 0,3 (5) 4,2 * 0,1 (3) 5.1 t 0,2 (4) 24 5,7 * 0.3 (6) 6,0 + 0,4 (6)
Aus dem vorangehenden geht eindeutig hervor, dass .
-hydroxyliertes Vitamin D2 die Calciumumsetzung im Knochen (Steigerung des Calciumspiegels im Serum) viel rascher als Vitamin D2 hervorruft.
Auf Gewichtsbasis verglichen erweist sich C25-hydroxyliertes Vitamin D2 in Bezug auf curative Wirkung wirksamer als Vitamin D2 im Rachitisversuch bei Ratten und bewirkt im Tierversuch ein rascheres Einsetzen des intestinalen Calciumtransports und der Calciumumset zunge im Knochen als Vitamin D2, Bekanntlich stellt der eurative Rachtitisversuch (Linietest) bei Ratten das aner kannte Mass der antirachitischen Aktivität (Vitamin D ähnlichen Aktivität) von Produkter dar, welche für Nah rungsmittelzwecke vorgesehen sind;
da C2,-hydroxyliertes Vitamin D! in diesem Versuch ein hervorragende antirachitische Wirkung entfaltet, ist es klar, dass die Verbindung als Zusatzstoff zu Nahrungsmitteln das Vitamin D..
bei allen seien Anwendungen, z.B. in Futtermitteln, ersetzen kann.
Beispiel
Vier Schweine e von 78 bis 90 kg werden während 6 6 Tagen mit einem normalen Futter gefüttert, das täglich mit 250 000 internationalen Einheiten Vitamin D3 ergänzt wird. Nach dieser Zeitspanne entnimmt man den Tieren das Blut, behandelt es mit 1,6 Liter 0,1 M Natriumoxalatlösung und erhält auf diese Weise 6,8 Liter Plasma.
Man versetzt das Plasma mit Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer 65 - 70zeigen Sättigung, wodurch die Serumproteine ausgeschieden werden. lässt den entstandenen Niederschlag durch Stehenlassen während 3 Tagen bei einer Temperatur von 40C ausfallen, trennt ihn durch 25minütiges Zentrifugieren bei einer Geschwindigkeit von
15 00 UlMin ab und extrahiert ihn mit 9 Liter eines 2:1 Gemisches von Methanol und Chloroform nach der Methode von Bligh und Dyer [Canadian J. Biochen. Physiol.
37. 911(1959)]. Man ergänzt den erhaltenen Gesamtextrakt mit Skellysolve B (Markenname, im wesentlichen n, Hexan. Siedebereich ca. 600C bis 680C) bis zu einem Vo lumen von 50 ml und prüft bei Ratten im Linienversuch gemäss der US-Pharmacopoe 1955 auf einen Gesamtgehalt an Vitamin D-Wirkung von 100 000 IE.
Man gibt 20 ml Skellysolve B-Extrakt auf eine 25 g K ieselgel enthaltende chromatographische Adsorptionssäule von 58 X 1,5 cm. Man eluiert die Säule mit einem Gemisch von Äther und Skellysolve B wobei ein Gradiant der Gemischzusammensetzung erzeugt wird, indem man 400 ml eines Gemisches von 85gC Äther in Skellysolve B aus der Vorratskammer in eine anfänglich 250 ml Skellysolve B enthaltende Mischkammer zu 250 ml Inhalt zufliessen lässt. Nachdem man 36 Fraktionen je zu 11 ml aufgefangen hat, setzt man 100zeigen Äther in die Vorratskammer und fängt weitere 30 Fraktionen zu 11 ml auf.
Man vereinigt die Fraktionen 51 bis 60 und gibt sie auf eine Verteilungssäule, welche folgendermassen hergestellt wird: Man mischt 20 g Celite (Markenname, Kieselgelprodukt aus Diatomeenerde) mit 15 ml einer stationären Phase, welche aus 80% Methanol und 20% Wasser im Gleichgewicht mit dem gleichen Volumen Skellysolve B besteht, und gibt etwa 2% dieses Materials in eine Glassäule von 1 cm Durchmesser. Man bringt die Proben (aus den vereinigten Fraktionen 51 bis 60) auf die Säule mittels einer kleinen Menge der mobilen Phase (Skellysolve B im Gleichgewicht mit einem Gemisch von Methanol und Wasser) und eluiert die Säule mit der mobilen Phase, wobei Fraktionen von 5 ml aufgefangen werden. Man vereinigt die Fraktionen 17 bis 21.
Der Rest des 50 ml Skellysolve B-Extrakts wird auf ähnliche Weise chromatographiert und gemäss dem bereits beschriebenen Verfahren verteilt, wobei die gleichen Verteilungsfraktionen aufgefangen und vereinigt werden.
Damit die Reproduzierbarkeit des Verfahrens gewährleistet wird, sollen in jedem Fall jene Fraktionen aufgefangen und vereinigt werden, deren ultraviolettes Spektrum in Diäthyläther ein Absorptionsmaximum bei 264 mtL aufweisen; für das Absorptionsmaximum im ultravioletten Spektrum wird ein Extinktionskoeffizient von 18 200 verwendet.
Identitizierung
Durch ultraviolette Spektrophotometrie und Gas-Flüssig-Chromatographie konnte festgestellt werden, dass das isolierte Produkt eine ähnliche Struktur wie Vitamin Ds besitzt. Darauf wurden hochauflösende Massenspektra mittels eines mit einem elektronischen Rechner Sigma Modell 7 der Firma Scientific Data Systems Sigma gekoppelten Massenspektrometers erhalten, welche Anhaltspunkte über die Unterschiede zwischen Vitamin D2 und dem gemäss dem oben beschriebenen Verfahren isolierten Produkt geben.
Es wurde als Molekulargewicht des isolierten Pro duktes 400 gefunden. welcher Wert der Summenformel C2TH44O2 - d.h. einem hydroxylierten Vitamin D - ent- spricht. Das Auftreten eines Maximums bei m/e 271 (Cl9H2,0) im Massenspektrum des isolierten Produktes bzw. des Vitamins Ds zeigt, dass die zweite Hydroxylgruppe des isolierten Produktes sich an der Seitenkette befinden muss, da das Bruchstück m/e 271 durch den Verlust der Seitenkette infolge einer Spaltung der Bindung zwischen C1 und C20 entsteht.
Zudem kommt im Spektrum des isolierten Produktes ein Maximum bei m/e 59 (C,H;O) vor, im Spektrum von Vitamin D3 jedoch nicht; dieses Maximum könnte durch Spaltung der Bindung zwischen C24 und C2 unter Verknüpfung der Hydroxylgruppe an C5 entstehen. Die Verknüpfung der Hydroxylgruppe an C2 wird durch ein 100 Mc/Sek.
NMR Spektrum bestätigt, welches in CDCI3-Lösung unter Verwendung von Tetramethylsilan (TMS) als interne Referenzsubstanz aufgenommen wurde; das Spektrum zeigt ein starkes Singulett-Maximum bei 8 1.20 ppm - wie für 25-Hydroxycholesterin - und das Fehlen des den sekundären Methylgruppen C2 und C27 entsprechenden Du bletts bei a 0,87 ppm, das man in Vitamin D3 findet.
Andere durch das NMR-Spektrum erbrachten Erkennungs merkmale sind für Vitamin Ds und das isolierte Produkt identisch: 8 0,58 ppm - Maxima der TMS internen Referenzsub stanz 8 0,54 ppm - Resonanz der H3-Gruppe an C15 8 0,93 ppm - Dublett der H3-Gruppe an C21 (J = 5 c/Sek.) # 4,81, 503 ppm - Maxima der H2-Gruppe an C19 O 6,2 ppm - (J = 11.5 c/Sek.), 6,24 ppm (J = 10,5 c/Sek.) - Dublett der Protone in 6- und 7-Stellung.
Biologische Wirkung bPachitisbehandluutgsver;ruch: Man füttert entwöhnte Ratten während 21 Tagen mit der Rachitis-erzeugenden
Diät von Steenbock und Black [J. Biol. Chem. 64, 263 (1925)]; diese Diät wird insofern abgeändert, als man wasserlösliches Vitamin wie von DeLuca und Mit. be schrieben [J. Nutr. 75, 175 (1961)] zugibt. Nach dieser Zeitspanne verabreicht man den Ratten in einer Einzeldosis 4 internationale Einheiten des üblichen Vitamins 1 > 3 oder des isolierten Produktes. 7 Tage später werden die Ratten getötet und der Linienversuch ( line test ) auf Radius- und Ellenschnitten der einzelnen Ratten durchgeführt. Die Bestimmung der biologischen Aktivität erfolgt gemäss US-Pharmacopoe, 14. Ausgabe (Mack Publishing Co., Easton, Pa. USA. (1955)].
In diesem Versuch gibt das isolierte Produkt im allgemeinen einen Wert von 56 bis 60 IE per y,g, während Vitamin D3 Werte von nur 40 IE per g gibt.
Calchtn'itransport - Versuch illit uiigestülptein Inte- stiiialsack: Man hält in hängenden Gitterkäfigen entwöhnte männliche Ratten und füttert sie ad libitum mit einer gereinigten, Vitamin D-defizienten Diät, wie von DeLuca und Mit. (J. Nutr., 75, siehe oben) beschrieben wurde. Diese Diät erzeugt bei Ratten keine Rachtis, son dem innerhalb von 3 bis 4 Wochen einen ausgesprochenen Vitamin lD-Mangel, der sich durch einen tiefen Calciumspiegel im Serum und durch ein vermindertes Wachstum äussert [H. Steenbock und D.C. Herting. J. Nutr., 57 449 (1955)].
Nachdem die Ratten während 6 Wochen mit dieser Diät gefüttert wurden, verabreicht man ihnen per os eine Dosis von 0,25 g Vitamin D3 (D3) bzw. die gleiche Dosis des isolierten Produktes (25-OH), beides in Baumwollsaatöl gelöst; die Kontrolltiere (-1 > ) erhalten nur das als Vehikel verwendete Baumwollsaatöl. Nach der in folgender Tabelle angeführten Zeitspanne werden die Ratten getötet und der Calciumtransport durch die umgestülpten Intestinalsäcke wird nach der Methode von J.E. Zull und Mit. [Science, 149, 182 (1965)] untersucht. In den folgenden Versuchsergebnissen wird der Calciumtransport durch das Verhältnis 45Ca(Serum)/4sCa(Schleimhaut) ausgedrückt.
TABELLE III
Versuchs- Stunden nach Anzahl Transport gruppe Verabreichung der Tiere verhältnis (a) Kontroll gruppe 6 0,66 + 0,02 (-D) (b) D3 12 5 0,74 * 0,03 (c) 25-OH 12 6 0,89 + 0,04 (d) D3 24 4 1,16 + 0,06 (e) 25-OH 24 4 1,24 + 0,07
Pab = 0,05 Pbc = 0,02
Pac = 0,001 Pcd = < 0,01 * Durchschnittliche Abweichung vom Mittelwert
Zusätzliche Daten über den Calciumtransport werden unter den oben beschriebenen Bedingungen erhalten, von welchen jedoch folgendermassen abgewichen wird: (1) Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
:
125 mM NaCI
30 mM Tris-Cl
0,25 mM CaCl2 # 2H2O
10 mM Fructose
Man stellt auf pH 7,4 mittels Salzsäure und setzt so viel Ca45-Lösung zu, dass das Medium ca. 105 cpm/ml gibt; (2) In das Medium wird nur Sauerstoff während ¸ bis 1 Stunde und bei 37C C durchgeleitet, und (3) man verabreicht den Ratten intrajugular 0,25 ILg D3 oder 25-OH je in 0,02 ml Äthanol.
Die Kontrolltiere erhalten nur Äthanol. Die Ergebrisse stehen auf der folgenden Tabelle IV, wobei der Calc-umtransport durch das Verhältnis 45Ca(Serum/
43Ca(Schleimhaut) ausgedrückt wird.
TABELLE IV
Stunden nach Transportverhältnis
Verabreichung D5 25-OH 0 (Kontroll gruppe) 1,25 + 0,05(l2)*
3 1,74b + 0,12(4)
4 1,01 * 0,12(4) 1,66 + 0,13(4)
6 1,32 + 0,10(4) 2,6 + 0,4(4) 10 2,0 * 0,3(3) 2,3 + 0,6(4) +) Durchschnittliche Abweichung von dem Mittelwert b) p < 0,01 gegenüber der Kontrollgruppe *) Die in Klammern stehenden Zahlen geben die An zahl Ratten in jener Gruppe an
Die obenstehenden Daten zeigen,
dass das isolierte Produkt (C 5-hydroxyliertes Vitamin D3) das Einsetzen des Calciumtransportes im Darm als Vitamin D, bewirkt.
Wirkung auf das Serumcalcium (Calciumunsetzung im Knochen)
Man füttert entwöhnte männliche Ratten während 11 bis 15 Tagen mit der von DeLuca und Mit. (J. Nutr., 75. siehe oben) beschriebenen, Vitamin D-defizienten Diät, wobei das Calcium jedoch aus der Diät entfernt wurde. Den Ratten verabreicht man dann intrajugular eine Lösung von 2,5 g isoliertem Produkt (25-OH) bzw. Vitamin Din 0,02 ml Äthanol. Zu dem in der un tenstehenden Tabelle angeführten Zeitpunkt entnimmt man den Tieren Serum und unterwirft es einer Calciumbestimmung nach der Methode von Webster [Am. J. Clin.
Patho!. 131, 330 (1960)]. Alle Versuche werden zweifach
Aus den obenstehenden Daten geht eindeutig hervor, dass das isolierte Produkt (25-OH) die Calciumumsetzung im Knochen (Steigerung des Calciumspiegels im Serum) viel rascher als Vitamin D3 einsetzen lässt.
Zusatz tan Geflligelfutter
Ein Küken-Futterversuch wird nach der in Vita- min D in Poultry Feed Supplement- First Action, Methods of Analysis , A.O.A.C. 784 (1965), 10. Ausgabe, beschriebenen Methode durchgeführt. Für den Versuch werden 125 g des isolierten Produktes (25-OH) in 25 g Weizenöl dispergiert. Man gibt die Knochen der einzelnen Küken gruppenweise zusammen, befreit sie von Fett und Feuchtigkeit und ermittelt als jeder Dosis entsprechenden Einzelwert den verbleibenden Prozentgehalt Asche. Die Wirksamkeit des Versuchspräparates (isoliertes Produkt) wird anhand der Kurve der Referenzsubstanz beurteilt.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
TABELLE VI
Internationale Körpergewicht Prozentgehalt Kücheneinheiten * g pro 100 g der Futterration während des Versuches an Knochenasche pro g am Anfang am Ende (Schienbein)
Referenzgruppe: Nur inertes öl
0 0 35 116 28,3
Referenzgruppe: Vitamin D-Zusatz in Form der
Referenzsubstanz gemäss
US-Pharmakopee
400 0,113 35 142 32,4
400 0,158 35 145 33,4
400 0,225 35 151 35,3
400 0,319 35 166 38,7
400 0,450 35 152 41,8
Versuchsgruppe:
Isoliertes Produkt in Getrieideöl
0,158 35 140 32,2
0,225 35 151 36,3
0,319 35 162 41,2 *) entsprechend 0,025 g Vitamin D3 durchgeführt: die Ergebnisse stehen in der folgenden Tabelle:
TABELLE V
Stunden nach Serumcalcium (mg %)
Verabreichung D3 25-OH 0 (Kontrolll- 4,0 # 0,4 (4)* gruppe)
4 3,8 l 0,1(2) 4,4 + 0,3(3)
8 3,9 * 0,1(3) 5,7 + 0,2(4)
12 5,0 * 0,4(3) 7,1 # 0,4(4)
16 6,6 * 0.4(4) 7,2 + 0,4(3) a) Durchschnittlliche Abweichung von dem Mittelwert *) Die in Klammern stehenden Zahlen geben die Anzahl Rat ten in jener Gruppe an
Aufgrund der obenstehenden Zahlen wird geschätzt,
dass jedes Gramm des in öl dispergierten Produktes an Vitamin Ds-Wirkung mindestens 206 internationale Kükeneinheiten enthält.
Es geht daraus eindeutig hervor, dass das isolierte Produkt - C,,-hydroxyliertes Vitamin D, - auf Ge- wichtsbasis wirksamer als nicht umgewandeltes Vitamin D3 in bezug auf kurative Wirkung im Rachitisversuch bei Ratten ist, dass es ein rascheres Einsetzen des Calciumtransportes im Darm und der Calciumumsetzung im Knochen bewirkt und dass es als Zusatz zum Geflügelfutter wirksamer als Vitamin 4 ist. Seine ausführlich nachgewiesene Vitamin D-ähnliche Aktivität legt eine breite Anwendung als Vitamin D-Ersatz nahe.