CH618669A5 - - Google Patents

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CH618669A5
CH618669A5 CH793875A CH793875A CH618669A5 CH 618669 A5 CH618669 A5 CH 618669A5 CH 793875 A CH793875 A CH 793875A CH 793875 A CH793875 A CH 793875A CH 618669 A5 CH618669 A5 CH 618669A5
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CH
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diene
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dhcc
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derivative
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CH793875A
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Toru Takeshita
Yoshinobu Hashimoto
Hiroyuki Kawashima
Sachio Ishimoto
Nobuo Ikekawa
Masuo Morisaki
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Teijin Ltd
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Priority claimed from JP14902074A external-priority patent/JPS5176254A/ja
Priority claimed from JP14901774A external-priority patent/JPS5176252A/ja
Priority claimed from JP14902274A external-priority patent/JPS5176259A/ja
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Priority claimed from JP14901874A external-priority patent/JPS5176253A/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/001—Oxiranes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer la,24-DihydroxychoIecaIciferole, sowie deren Derivate.
Aus den neuen la,24-Dihydroxycholecalciferolen lassen sich pharmazeutische Präparate für Warmblüter herstellen, die den Calcium-Stoffwechsel beeinflussen.
Die neuen la,24-Dihydroxycholecalciferole und deren Derivate lassen sich darstellen durch die folgende Formel
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Das vorgenannte Gemisch von la,24(S)-Epimeren der Formel (5-1) und des la,24(R)-Epimeren der Formel (5-2) wird im folgenden in beliebigem Verhältnis ausgedrückt durch die Formel
(5)
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In dieser Formel sind R1; R2 und R3 gleich oder verschieden und bedeuten Wasserstoff oder von Carbonsäuren abgeleitete Acylreste oder Äther bildende Reste.
Die Formel (5) umfasst la,24(S)-DihydroxycholecaIciferol und seine Derivate (im folgenden bezeichnet als la,24(S)-DHCC und dessen Derivate) der folgenden Formel
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(5-3)
V
Mit anderen Worten, der Rest wird dargestellt durch
•OR3 in der 24-Stellung
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(5-1)
35 In gleicher Weise wie in den obigen Formeln (5), (5-1) und (5-2) werden auch die Präcursoren dieser Verbindungen bezeichnet.
Von den la,24-Dihydroxycholecalciferolen und dessen Derivaten der Formel (5) besitzt das la,24-Dihydroxychole-40 calciferol der Formel (5-a)
In der Formel (5-1) haben Rlt R2 und R3 die oben genannten Bedeutungen. Ferner umfasst die Formel (5) auch das la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol und dessen Derivate (im nachfolgenden benannt mit la,24(R)-DHCC und dessen Derivate) der nachfolgenden Formel worin Ra, R2 und R3 wiederum die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen. Und schliesslich umfasst die Formel (5) auch ein Gemisch des la,24(S)-Epimeren der Formel (5-1) und des la,24(R)-Epimeren der Formel (5-2).
die wertvollsten pharmakologischen Wirkungen, wie sich aus 60 der Arbeit der Erfinder der vorliegenden Erfindung ergeben hat.
Die la,24-Dihydroxycholecalciferole der Formel (5-a) umfassen
(i) la,24(S)-Dihydroxycholecalciferol [la,24(S)-DHCC], 65 (ii) la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol [la,24(R)-DHCC] und
(iii) ein Gemisch von la,24(S)-DHCC und la,24(R)-DHCC [la,24-DHCC-Epimerengemisch].
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Wie in den nachfolgenden Tierversuchen gezeigt werden wird, zeigen das la,24(S)-DHCC allein, das la,24(R)-DHCC allein sowie ein Gemisch dieser beiden Substanzen sehr wertvolle pharmakologische Wirksamkeit als Mittel zur Regelung des Calcium-Stoffwechsels warmblütiger Tiere und es haben diese Substanzen eine bei weitem geringere Giftigkeit (LD50) als 1 a-Hydroxycholecalcif eroi (la-HCC), welches ein bekanntes Analogon von aktiven Formen von Vitamin D3 ist.
Das la-Hydroxycholecalciferol (la-HCC) hat die Formel
OH
HÖ"
Nach der Kenntnis der Erfinder sind die oben genannten la,24-Dihydroxycholecalciferole nirgends beschrieben, mit der einzigen Ausnahme eines Hinweises der Erfinder in Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 5, Nr. 4, June 1974 — Fourth International Congress on Hormonal Steroids — Mexico City, 2.-7. September 1974, Abstracts of Papers Presented (actually published on 16th August, 1974). Dieser Hinweis stellt fest, dass 24-Hydroxycholesterin (24-HC) der folgenden Formel
HO
sowie 24,25-Dihydroxycholesterin (24,25-DHC) der folgenden Formel
HO
und deren la-Hydroxy-Derivate umgewandelt werden können in Vitamin D-Derivate nach an sich bekannten Verfahren. Jedoch zeigte sich, dass allein die Verbindungen der Formel (B-2) und (B-3) in Vitamin D-Derivate umgewandelt werden konnten. Demgemäss wurde im oben erwähnten Kon-gress in Mexico City nur ausgeführt, dass die Umwandlung der 1 a-Hydroxy-Derivate von (B-2) in Vitamin D-Derivate sich noch im Stadium der Forschung befand und es wurde keinerlei Hinweis auf die Umwandlung der la-Hydroxy-
Derivate von (B-3) in Vitamin D-Derivate gegeben. Gemäss den damals vorliegenden Arbeiten der Erfinder und ihrer nachfolgenden Forschungen ergaben die vor der Einreichung der vorliegenden Erfindung bekannten Verfahren keine Vitamin D-Derivate vom Cholecalciferol-Typ aus diesen la-Hydroxy-Derivaten, wie dies im nachfolgenden noch ausgeführt werden wird. Nachher indessen hatten die Erfinder Erfolg bei der Synthese einer Gruppe von neuen la,24-Di-hydroxycholecalciferolen und deren Derivate der Formel (5), vorzugsweise der Formel (5-a), gemäss dem im nachfolgenden beschriebenen erfindungsgemässen Verfahren.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Verbindungen der Formel 5, worin Ru R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff oder von Carbonsäuren abgeleitete Acylreste oder Äther bildende Reste, bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man la,3ß,24(S)- und/oder la,3ß,24(R)-Trihydroxy-cholesta-5,7-diene der Formel
OR,
ìn einem inerten organischen Lösungsmittel ultravioletter Strahlung aussetzt und dann die dabei erhaltenen Produkte isomerisiert.
Verbindungen der Formel 5-a, in der Rl5 R2 und R3 Wasserstoff sind, werden dadurch erhalten, dass man in einer Verbindung der Formel 5', in der R^, R'2 und R'3 den Rest einer Carbonsäure oder eine Gruppe, die mit einer Hydroxylgruppe eine Ätherbindung eingeht, bedeuten, die schützenden Gruppen hydrolytisch oder reduktiv abspaltet.
Das erfindungsgemässe Verfahren, sowie Verfahren zur Herstellung von Ausgangs- und Zwischenprodukten werden im nachfolgenden detailliert beschrieben.
1. Erster Verfahrensschritt:
la,24-Dihydroxycholesterin (nachfolgend bezeichnet mit la,24-DHC) der Formel (2-a)
OH
wird hergestellt durch Umsetzung von la,2a-Epoxy-24-keto-cholesta-4,6-dien-3-on (nachfolgend bezeichnet als la,2a-Ep-oxy) der folgenden Formel
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mit einem Alkalimetall und einem Protonendonator in Gegenwart von flüssigem Ammoniak oder einem flüssigen Amin.
la,24-DHC, ausgedrückt durch die Formel (2-a), bedeutet ein Gemisch von la,24(S)-Dihydroxycholesterin (la,24(S)-DHC) und la,24(R)-Dihydroxycholesterin (la,24(R)-DHC) in beliebigem Verhältnis und, gemäss dem ersten Verfahrensschritt wird la,24-DHC erhalten als ein Gemisch des (S)-Epi-meren und des (R)-Epimeren.
Soweit den Erfindern bekannt, sind la,24-Epoxy der Formel (1) und la,24-DHC der Formel (2-a) beides neue Substanzen, die zuvor nirgends beschrieben worden sind, jedoch im Rahmen der vorliegenden Arbeiten der Erfinder zum ersten Mal synthetisiert wurden. Das vorgenannte la,24-DHC kann umgewandelt werden in eine Gruppe von la,24-DHCC und dessen Derivate der Formel (5), besonders der Formel (5-a), nach dem beschriebenen Verfahren. Weiterhin sind diese Verbindungen wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung anderer Steroide mit physiologischer Wirksamkeit, z.B. Zwischenprodukte für die Synthese von la,24,25-Tri-hydroxycholecalciferol, welches eine wirksame Form von Vitamin D3 ist.
Beispiele von im ersten Verfahrensschritt brauchbaren flüssigen Aminen sind primäre, sekundäre oder tertiäre Amine wie Methylamin, Äthylamin, Diäthylamin oder Tri-äthylamin. Indessen ist die Anwendung von flüssigem Ammoniak vorzuziehen. Obgleich keine besondere Einschränkung für die Verwendung von flüssigen Ammoniak besteht, ist es vorzuziehen, ihn zwecks möglichst weitgehender Befreiung von Wasser vor der Verwendung, z.B. durch Destillation, zu reinigen. Die Anteile an flüssigem Ammoniak oder an flüssigem Amin sollten vorzugsweise 5 bis 500mal, insbesondere 10 bis 200mal das Gewicht des eingesetzten la,2a--Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-ons betragen.
Beispiele von vorzugsweise zu verwendenden Alkalimetallen sind Lithium, Natrium und Kalium. Lithium ist besonders geeignet. Das Alkalimetall wird vorzugsweise im Über-schuss verwendet über die umzusetzende Menge la,2a-Ep-oxy der Formel (1), z.B. 5 bis 250mal (Atomäquivalente), insbesondere 10 bis 200mal, in bezug auf den äquivalenten Anteil la,2a-Epoxy der Formel (1).
Vorzugsweise wird ein inertes organisches Lösungsmittel für das la,2a-Epoxy der Formel (1) verwendet, damit die Reaktion sanft verläuft. Beispiele solcher Lösungsmittel sind Äther wie Äthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan oder 1,2-Di-methoxyäthan, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Ligroin, Pentan, Hexan, Cyclohexan oder Methylcyclohexan sowie Gemische von zwei oder mehr dieser Substanzen.
Die Menge des verwendeten organischen Lösungsmittels beträgt mindestens gleichviel wie das Volumen des verwendeten flüssigen Ammoniaks, vorzugsweise aber 1 bis 2mal soviel.
Geeignete Protonendonatoren sind Ammoniumsalze wie die Ammoniumsalze organischer Säuren und die Ammoniumsalze anorganischer Säuren. Besonders geeignete Ammoniumsalze sind Ammoniumchlorid, Ammoniumbromid, Am-moniumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumacetat, Ammo-
niumformiat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumbenzolsulfonat und Ammonium-p-toluolsulfonat. Von diesen eignen sich die Ammoniumsalze anorganischer Säuren wie Ammoniumchlorid besonders gut. Der einzusetzende Anteil an Ammoniumsalz sollte mindestens äquimolar dem verwendeten Alkalimetall sein, vorzugsweise aber bis zu zehnmal mehr als das Äquivalent ausmachen.
Niedere Alkohole wie Methanol, Äthanol oder tert.-Butyl-alkohol können gleichfalls als Protonendonatoren verwendet werden.
Die Art der Zugabe der Reagenzien ist sehr wichtig bei der Durchführung des ersten Verfahrensschrittes und mit Vorzug wird eine der nachfolgend genannten drei Arbeitsmethoden ausgewählt.
(A) Das la,2a-Epoxy wird zu einem Gemisch aus flüssigem Ammoniak und Alkalimetall hinzugegeben und hernach wird das Ammoniumsalz zugefügt. Dabei ist es besonders vorteilhaft, das Ammoniumsalz nach und nach in zwei oder mehreren geringen Anteilen zuzusetzen.
(B) Ein kleiner Anteil (vorzugsweise weniger als der 0,7-mo-lare Betrag des verwendeten Alkalimetalls) an Ammoniumsalz wird zunächst zum Gemisch hinzugefügt, welches das flüssige Ammoniak und das Alkalimetall enthält. Hernach wird das la,2a-Epoxy zu diesem System zugegeben und schliesslich der Rest des Ammoniumsalzes beigefügt.
(C) Das la,2a-Epoxy und das Ammoniumsalz werden gleichzeitig in geringen Anteilen zu einem Gemisch aus flüssigem Amoniak und Alkalimetall zugegeben.
Von diesen Methoden ist die Methode (A) besonders vorzuziehen.
Die Reaktionstemperatur wird vorteilhafterweise zwischen —70°C und Rückflusstemperatur des flüssigen Ammoniaks im Reaktionssystem liegen.
Es ist vorteilhaft, dass nach Zugabe der gesamten Menge des Protonendonators die Reaktion ausgeführt wird bis das gesamte verwendete überschüssige Alkalimetall vollständig unter Rückfluss des flüssigen Ammoniaks zersetzt ist. Dies bewirkt, dass die Ausbeute an la,24-DHC höher ausfällt.
Es ist bereits ein Verfahren bekannt zur Umsetzung von la,2a-Epoxy-cholesta-4,6-dien-3-on der Formel mit metallischem Lithium und Ammoniumchlorid in Gegenwart von flüssigem Ammoniak zur Bildung von la-Hydroxy-cholesterin (la-HC) der Formel
OH
HO
zum Zweck der Herstellung von la-HydroxychoIecalciferol (b-1) D. H.R. Barton und Mitarbeiter, Journal of American
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Chemical Society, 95, 2748 (1973)]. Es wurde gefunden, dass das la,2a-Epoxy, wie es im Verfahren dieser Erfindung gebraucht wird, substituiert ist durch eine Oxogruppe (=0) in 24-Stellung, so dass erfindungsgemäss die vierstufige Reduktion dieses la,2a-Epoxy die folgende ist:
(i) die Reduktion der Carbonylgruppe in 24-Stellung,
(ii) die Reduktion der la,2a-Epoxygruppe,
(iii) die Reduktion des 4,6-Diens in ein 5-en und
(iv) die Reduktion der Carbonylgruppe in 3-Stellung.
Diese vier Stufen verlaufen glatt in einem einzigen Schritt und es hat sich gezeigt, dass wenn die vorzugsweise einzuhaltenden Versuchsbedingungen angewendet werden, das la,24--Dihydroxycholesterin (la,24-DHC) in hohen Ausbeuten von 60 bis 75 % erhalten werden kann. Die Tatsache, dass ein solches vierstufiges Reduktionsverfahren [Stufen (i) bis (iv)] in einem einzigen Schritt glatt verläuft, wurde bisher nirgends beschrieben und es ist anzunehmen, dass diese Reaktion zum ersten Mal von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung durchgeführt wurde.
2. Herstellung von la,2a.-Epoxy:
Das la,2a-Epoxy der Formel (1), wie es als Ausgangsprodukt für den ersten Verfahrensschritt gebraucht wird, kann leicht hergestellt werden, z.B. nach dem folgenden Verfahren unter Verwendung von Fucosterin als Ausgangsmaterial. Fucosterin hat die folgende Formel und ist in grossen Mengen in braunen Meeralgen vorhanden. Ein solches Verfahren ist beispielsweise:
Fucosterin wird oxidiert mit Ozon bei niedriger Temperatur und das erhaltene Ozonid wird reduziert mit Essigsäure/Zink, wobei 24-Ketocholesterin der folgenden Formel entsteht in einer Ausbeute von ungefähr 60 bis 75%. Das erhaltene 24-Ketocholesterin wird oxidiert, z.B. mit 2,3-Dichlor-5,6--dicyanobenzochinon (DDQ) unter Rückfluss von beispielsweise Dioxan, wobei Cholesta-l,4,6-trien-3,24-dion der nachfolgenden Formel entsteht:
io Anschliessend wird dieses Oxidationsprodukt epoxidiert bei Zimmertemperatur unter alkalischen Bedingungen (pH ungefähr 7,5 bis 9), z.B. unter Verwendung von Wasserstoffperoxid.
Nach diesem Verfahren lässt sich la,2a-Epoxy der For-15 mei (1) in einer Ausbeute von ungefähr 40 bis 55% aus dem 24-Ketocholesterin der Formel (A-2) erhalten.
Das Cholesta-l,4,6-trien-3,24-dion der Formel (A-3) ist gleichfalls eine neue Verbindung, welche von den Erfindern zum ersten Mal hergestellt wurde.
20 Falls ein niederer Alkohol, wie Methanol, verwendet wird als Lösungsmittel für die vorgenannte Epoxidationsreaktion, fällt das erhaltene la,2a-Epoxy aus dem Alkohol aus. Es kann aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert werden und direkt als Ausgangsprodukt im ersten Verfahrensschritt des er-25 findungsgemässen Verfahrens verwendet werden.
3. Trennung der (S)- und (R)-Epimeren von la,24-DCH:
Wie schon ausgeführt, ist das la,24-DHC der Formel (2), wie es im ersten Verfahrensschritt erhalten wird, ein Gemisch von la,24-(S)-DHC und la,24(R)-DHC.
Es hat sich gezeigt, dass das (S)-Epimere und das (R)-Epi-mere glatt voneinander getrennt werden können durch Benzoylierung der Hydroxylgruppen in 3- und 24-Stellung des la,24-DHC vermittels substituierten oder unsubstituierten Benzoylderivaten. Mit anderen Worten: Die 1-Stellung kann selber besetzt sein mit einer Hydroxylgruppe oder eine Schutzgruppe tragen, die in eine Hydroxylgruppe umgewandelt werden kann zwecks Durchführung der Trennung der (S)- und (R)-Epimeren.
Die Benzoylierung der 3- und 24-Stellung im la,24-DHC kann durchgeführt werden durch Umsetzung des letzteren mit substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid, wobei man vorteilhaft in einem anorganischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base oder eines Säureacceptors arbeitet. Diese Umsetzung ist im Prinzip bekannt als Schot-ten-Baumann-Reaktion. Als organische Base kann dabei Pyridin verwendet werden, welches gleichzeitig als Lösungsmittel dient, wobei in diesem Falle kein besonderer Säureacceptor mehr verwendet werden muss.
Die Benzoylierung der 3- und 24-Stellung des la,24-DHC kann selektiv durchgeführt werden durch Umsetzung mit geeignetem substituiertem oder unsubstituiertem Benzoylchlorid, z.B. in einer Pyridinlösung bei einer niedrigen Temperatur (z.B. bei —5 bis + 10°C) während geeigneter Zeitdauer, z.B. während 10 bis 24 Stunden. Die Hydroxylgruppe in der 1-Stellung kann acyliert werden, beispielsweise durch Umsetzung eines Sterins dessen Hydroxylgruppen in 3- und 24-Stellung geschützt sind mit einem Acylchlorid in Pyridinlösung bei 0 bis 50°C. Die Hydroxylgruppe in 1-Stellung kann z.B. trimethylsilyliert sein durch Umsetzung eines Sterins dessen Hydroxylgruppen in 3- und 24-Stellung geschützt sind, mit N-Trimethylsilylimidazol in einer Pyridinlösung bei erhöhter Temperatur (z.B. 50 bis 110°C).
Die Benzoylierung von la,24-DHC bei höherer Temperatur, z.B. 15 bis 100°C, vorzugsweise bei 30 bis 80°C, mit substituierten oder unsubstituierten Benzoylderivaten in der 1-, 3- und 24-Stellung von la,24-DHC kann in einem einzigen Verfahren durchgeführt werden.
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Beispiele substituierter oder unsubstituierter Benzoyl-gruppen sind Benzoyl-, p-Brombenzoyl-, 2,4-Dibrombenzoyl-, p-Chlorbenzoyl- und p-Nitrobenzoylgruppen. Von diesen Substanzen sind Benzoyl und p-Brombenzoyl besonders vorzuziehen.
In 1-Stellung des la,24-DHC kann eine Hydroxylgruppe sitzen. Beispiele geschützter Gruppen sind solche mit den obgenannten substituierten oder unsubstituierten Benzylre-sten, Acylgruppen (Reste organischer Carbonsäuren) oder Gruppen, die befähigt sind zur Bildung einer Ätherbindung. Beispiele solcher Acylgruppen sind Acetyl, Propanoyl, Buta-noyl, Pentanoyl, Caproyl, Cyclohexanoyl, Chloracetyl und Bromacetyl. Beispiele von Schutzgruppen, welche mit der Hydroxylgruppe in 1-Stellung eine Ätherbindung bilden, sind t-Butyl, Benzyl, Triaryl, wie Triphenylmethyl, Tetrahydro-pyranyl, Methoxymethyl oder alkylsubstituierte Silylgruppen wie Trimethylsilyl.
Die vorgenannten Acylgruppen, umfassend auch die substituierten oder unsubstituierten Benzoylgruppen, eignen sich vorzugsweise als Schutzgruppen der Hydroxylgruppe in 1-Stel-lung.
Zur Trennung von la,24-DHC in das (S)-Epimere und das (R)-Epimere wird das la,24-DHC der Formel (2-a) zunächst umgewandelt in ein Benzoylderivat der folgenden Formel worin R"4 eine substituierte oder unsubstituierte Benzoyl-gruppe und R5 Wasserstoff oder eine in Wasserstoff überführbare Schutzgruppe ist.
Danach wird das Benzoylderivat chromatographiert an einen Träger, der mindestens Siliciumdioxid (Si02) enthält, um es in das la,24(S)-Epimere und das la,24(R)-Epimere zu trennen.
Diese Epimeren sind gleichfalls neue Verbindungen, welche zum ersten Mal hergestellt wurden. Der Siliciumdioxid enthaltende Träger kann z.B. sein Silicagel, Kieselsäure, Silica-aluminagel, Diatomeenerde oder Kaolin. Silicagel, Kieselsäure und Silica-aluminagel, bestehend zur Hauptsache aus Si02, sind besonders vorzuziehen.
Die Chromatographie kann nach einem beliebigen Verfahren durchgeführt werden, wie Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie. Zur Durchführung der Trennung in grösserem Massstab ist die Säulenchromatographie vorzuziehen. Die Säulenchromatographie kann z.B. durchgeführt werden unter Verwendung von Silicagel als Träger und N-Hexan, Benzol, Äthylacetat, Methylenchlorid oder Äther als Entwicklerlösung, wobei die Epimeren in reiner Form erhalten werden. Unreine Fraktionen können wiederholt der Säulenchromatographie unterworfen werden oder sie können fraktioniert kristallisiert werden zwecks Entfernung geringer Anteile an Verunreinigungen.
Die Durchflussgeschwindigkeit des la,24(R)-DHC ist hoch, wogegen die Durchflussgeschwindigkeit seiner Ben-zoylderivate langsam ist.
4. Zweiter Reaktionsschritt (Synthese von 5,7-Dien-Deri-vaten):
la,24-DHC der Formel (2-a), erhalten nach dem ersten 5 Reaktionsschritt, wird umgewandelt in ein Derivat von la,3ß, 24-TrihydroxychoIesta-5,7-dien mit geschützten Gruppen, indem die Wasserstoffatome der Hydroxylgruppen in 1-, 3- und 24-Stellung durch diese Schutzgruppen ausgetauscht werden, oder nach Trennung des la,24-DHC Benzoylderivat der For-lo mei (2-b) in das la,24(S)-Epimere und das la,24(R)-Epimere oder nach Umwandlung der schützenden Benzoylgruppen in 1-, 3- und 24-Stellung der Verbindung der Formel (2-a) in andere schützende Gruppen.
So können mindestens ein geschütztes la,3ß,24(S)-Tri-15 hydroxycholesta-5,7-dien-Derivat und ein geschütztes la,3ß, 24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien-Derivat (im nachfolgenden bezeichnet als 5,7-Dien-Derivate) der Formel hergestellt werden durch Umsetzung mindestens eines geschützten Derivates von la,24(S)-Dihydroxycholesterin und eines geschützten Derivates von la,24(R)-Dihydroxychole-
worin R'4, R'.5 und R'6 gleich oder verschieden sind und hydrolytisch oder reduktiv abspaltbare Schutzgruppen bedeuten, durch Umsetzung mit einem Allylbromierungsmittel in einem so inerten organischen Lösungsmittel, worauf man das erhaltene Reaktionsgemisch mit einem Bromwasserstoff abspaltenden Agens zusammenbringt.
Es ist wichtig, dass im zweiten Schritt der Bildung der oben erwähnten 5,7-Dien-Derivate die Hydroxylgruppen in 55 1-, 3- und 24-Stellung des la,24-DHC und seiner Epimeren der Formel (2) geschützt sind. Falls dieser zweite Schritt der Umsetzung durchgeführt wird ohne Schutz dieser drei Hydroxylgruppen von la,24-DHC, kann deren Oxidationund Zersetzung nicht verhindert werden und die Ausbeute der er-60 wünschten 5,7-Dien-Derivate wird nur sehr niedrig.
Als Schutzgruppen werden erfindungsgemäss Carbonsäuregruppen oder Gruppen, die mit einer Hydroxylgruppe eine Ätherbindung zu bilden vermögen, verwendet, d.h. solche, die befähigt sind, in Hydroxylgruppen in 1-, 3- und 24-65 Stellung umgewandelt zu werden, ohne das Cholesta-5,7-dien--skelett nach Umwandlung in die 5,7-Dien-Derivate aufzuspalten. Beispiele derartiger Schutzgruppen sind die folgenden:
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1. Acylgruppen:
Ci-C12 aliphatische oder aromatische Carbonsäurereste oder deren Nitro-, Halogen- und Alkoxy-substituierten Derivate, wie z.B. Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Capro-nyl, Cyclohexanoyl, Chloracetyl, Bromacetyl, Benzoyl, p-Brombenzoyl, p-Nitrobenzoyl, Äthylbenzoyl und Toluyl. Hiervon sind Acetyl, Benzoyl und Propanoyl besonders geeignet.
2. Gruppen, welche Ätherbindungen mit den Hydroxylgruppen bilden:
Tertiäres Butyl, Benzyl, Triarylmethyl wie Triphenylme-thyl, Tetrahydropyranyl, Methoxymethyl sowie alkylsubsti-tuierte Silylgruppen wie die Trimethylsilylgruppe. Von diesen genannten Schutzgruppen sind die Acylgruppen gemäss (1) besonders vorteilhaft. Als Allylbromierungsmittel eignen sich alle Verbindungen, die normalerweise zur Bromierung einer Allylgruppe gebraucht werden, wie z.B. N-Bromsuccinimid, l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydrantoin und N-Bromcaprolactam. In der Regel beträgt die Menge des verwendeten Allylbro-mierungsmittels das 1- bis 2-fache Äquivalent des Anteils an 5-en der Formel (2).
Die Umsetzung zwischen dem la,24-DHC der Formel (2), vorzugsweise einem geschützten 1 a,24-DHC oder einem geschützten Epimeren davon und dem Allylbromierungsmittel verläuft in einem inerten organischen Lösungsmittel. Zweckmässig wird dabei zwischen Zimmertemperatur und 140°C gearbeitet.
Als inertes organisches Lösungsmittel eignen sich solche, die mit dem Bromierungsmittel nicht reagieren. Vorzugsweise können hierfür verwendet werden Kohlenwasserstoffe oder halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Cyclo-hexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan. Ätherartige Lösungsmittel können gleichfalls verwendet werden wie Äthyläther, Tetrahydro-furan, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv. Alle diese Lösungsmittel können entweder allein oder im Gemisch Anwendung finden.
Die Reaktion verläuft zweckmässig bei der vorgenannten Temperatur. Gewünschtenfalls kann sie durchgeführt werden unter Bestrahlung mit actinischem Licht, einer Wellenlänge im Bereich zwischen Infrarot und Ultraviolett. In diesem Fall kann die Reaktion schon bei Temperatur unterhalb Zimmertemperatur durchgeführt werden. Es kann gleichfalls ein Radikalinitiator zugefügt werden wie Azobisisobutyronitril, Benzoylperoxid oder Cyclohexylhydroperoxid.
Als Bromwasserstoff abspaltendes Agens wird vorzugsweise verwendet Trimethylphosphit, s-Kollidin oder Diäthyl-anilin, wobei diese Substanzen auch in Kombination Anwendung finden können. Theoretisch verläuft die Reaktion vollständig, falls die Menge des Bromwasserstoff abspaltenden Mittels äquimolar ist zum bromierten Produkt, welches bei der vorgängigen Bromierungsreaktion erhalten wurde. Indessen ist es vorteilhaft zur Sicherstellung der vollständig ablaufenden Reaktion und guter Ausbeuten das Bromwasserstoff abspaltende Agens in etwa zweifach molarem Überschuss über die Menge des bromierten Produktes zu verwenden. Da das Bromwasserstoff abspaltende Mittel gleichfalls als Reaktionsmedium verwendet werden kann, braucht seine obere Grenze nicht beschränkt zu werden.
In der Regel verläuft die Reaktion befriedigend im Temperaturbereich von 80 bis 250°C, vorteilhafterweise von 120 bis 180°C. Die einzuhaltende Reaktionszeit hängt ab von der Art des Bromwasserstoff abspaltenden Mittels, vom verwendeten Lösungsmittel usw. Zum Beispiel beträgt sie in einer bevorzugten Ausführungsform unter Sieden am Rückfluss mit einem Gemisch von Xylol-s-Kollidin nur ungefähr 20 Minuten.
Nach Vollendung der Reaktion kann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert werden, wobei ein öliges rohes 5,7-Dien-Derivat zurückbleibt.
5. Dritter Reaktionsschritt (Reinigung des rohen 5,7-Dien--Derivates):
Wie oben angegeben, ist eine Methode zur Herstellung von la-HydroxyCholesterin (la-HC) der Formel
OH
HO
bereits bekannt (D. H. R. Barton und Mitarbeiter, Journal of American Chemical Society, 95, 2748, 1973).
Es ist gleichfalls bekannt, dass das oben erwähnte la-Hy-droxycholesterin (la-HC) umgewandelt werden kann in la,3ß--Diacetoxycholesta-5,7-dien der Formel
OA
worin Ac CH3CO- bedeutet, und zwar geht diese Umwandlung nach der gleichen Reaktion vor sich, wie der zweite oben beschriebene Reaktionsschritt, worauf das erhaltene Produkt thermisch umgelagert wird durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht in 1 a,3ß-DiacetoxychoIecalciferoI (Vitamin D-Derivat) der Formel
OA
A
c
Die Erfinder versuchten deshalb die thermische Umlage-rung des 5,7-Dien-Derivates der Formel
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erhalten im zweiten Verfahrensschritt, durch direkte Bestrahlung mit ultraviolettem Licht nach an sich bekannten Methoden zwecks einer Synthese von la,3ß-Diacetoxycholecalci-ferol der Formel (B-l), jedoch konnte das erwünschte la,24-Dihydroxycholecalciferolderivat der Formel
OR
worin R4, R5 und R0 die gleichen Bedeutungen aufweisen wie in der Formel (2), nicht isoliert werden.
Die Erfinder vermuteten als Grund hierfür, dass das 5,7--Dien-Derivat der Formel (3) unrein ist und möglicherweise ein 4,6-Dien-Derivat der Formel
OR
OR
enthält. Aufgrund dieser Vermutung versuchten die Erfinder das rohe 5,7-Dien-Derivat, wie es im obigen zweiten Verfahrensschritt erhalten und abgetrennt wurde, zu reinigen, nach einer bekannten adsorptionschromatographischen Methode unter Verwendung von Silicagel als Adsorbens, d.h. vermittels Dünnschichtchromatographie oder Säulenchromatographie. Jedoch geläng es mit keiner dieser chromatographischen Methoden das 4,6-Dien-Derivat der Formel (6) aus dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abzutrennen.
Es ist ein Verfahren bekannt, bei welchem Chromatographie unter Verwendung von Silbernitrat angewendet wurde zur Trennung und Reinigung von Acetoxycholesta-5,7-dien (Tetrahedron Letters Nr. 40,4147, 1972 und Deutsche Auslegeschrift 2 400 931).
So verfielen die Erfinder auf die Idee die vorgenannte Silbernitratchromatographie anzuwenden auf das rohe 5,7-
-Dien-Derivat der Formel (3) und versuchten letzteres vermittels Säulenchromatographie unter Anwendung eines 2 % Silbernitrat enthaltenden Silicagels zu reinigen. Jedoch schlug auch dieser Versuch fehl und das 4,7-Dien-Derivat konnte nicht abgetrennt werden.
Darauf angestellte Versuche verschiedener Art zur Auffindung einer Methode zur Reinigung des rohen 5,7-Dien--Derivates führten schliesslich zur Entdeckung, dass das freie 5,7-Dien sehr gut vom freien 4,7-Dien und anderen Verunreinigungen abgetrennt werden kann vermittels einer chromatographischen Methode, nachdem vorgängig die Schutzgruppen aus dem rohen 5,7-Dien-Derivat der Formel (3) abgespalten worden sind und es dabei umgewandelt wurde in la,3ß,24-TrihydroxychoIesta-5,7-dien (das freie 5,7-Dien) der Formel
OH
HO
worauf diese Substanz in Berührung gebracht wird mit einem Träger, welcher adsorbiertes Silber in nicht-metallischer Form enthält.
Der so gefundene Reinigungsprozess kann nicht allein auf das rohe geschützte 5,7-Dien-Derivat gemäss dem zweiten Verfahrensschritt angewandt werden, sondern auch auf das 5,7-Dien-Derivat in Form des 24(S)-Epimeren bzw. des 24(R)-Epimeren. Dabei ist in jedem Falle wesentlich, dass die rohe Verbindung dem Reinigungsprozess erst nach Abspaltung der Schutzgruppen in 1-, 3- und 24-Stellung unterworfen wird, zwecks Umwandlung in das freie 5,7-Dien der Formel (3-a).
Geeignete Trägersubstanzen auf Basis von Siliciumdioxid mit daran adsorbiertem Silber in nicht-metallischer Form sind z.B. Silicagel und Silica-aluminagel, enthaltend adsorbiertes Silbernitrat. Silicagel ist besonders geeignet.
Derartiges Silicagel kann hergestellt werden z.B. durch Auflösen von Silbernitrat in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder einem Alkohol, Vermischen der Lösung mit dem Silicagel und hernach Verdampfen des Lösungsmittels aus dem Gemisch. Wenn das Präparat verwendet wird zur Säulenchromatographie, wird es gewünschtenfalls aktiviert und in eine Glassäule eingefüllt. Falls es zur Dünnschichtchromatographie gebraucht wird,
wird zweckmässig ein geeignetes Fixiermittel zugegeben wie Gips oder Stärke und gewünschtenfalls ein fluoreszierendes Agens, worauf das Gemisch auf eine geeignete Platte (Glas oder Polyesterfilm) in der Dicke von 0,2 bis 2 mm ausgebreitet, darauf fixiert und aktiviert werden kann.
Zur Imprägnierung einer Dünnschichtchromatographie-Platte, die nur aus Silicagel besteht, mit Silbernitrat, kann die Platte eingetaucht werden in eine Lösung von Silbernitrat in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Acetonitril oder einem Alkohol) in geeigneter Konzentration, worauf sie getrocknet und hernach aktiviert werden kann.
Der Anteil an Silbernitrat, wie er für dieses Trennverfahren geeignet ist, beträgt beispielsweise 0,1 bis 20 Gew.-% bezogen auf das Silicagel, besonders vorteilhaft 0,5 bis 10 Gew.-%. Wenn der Anteil an Silbernitrat kleiner als 0,1 Gew.-% oder grösser als 20 Gew.-% ist, so wird die Trenn-
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fähigkeit der Schicht ungenügend und das Silbernitrat würde nur verschwendet.
Beispiele einer Entwicklerlösung für die Dünnschichtchromatographie oder einer Eluierlösung für die Säulenchromatographie sind organische Lösungsmittel wie Cyclo-hexan, n-Hexan, Benzol, Toluol, Chloroform, 1,2-Dichlor-methan, 1,2-Dichloräthan, Aceton, Diäthyläther, Tetrahydro-furan, Äthylacetat, Methanol, Äthanol und Propanol sowie Gemische dieser Lösungsmittel. Besonders geeignet sind dabei Gemische mit niedrigsiedenden Lösungsmitteln wie n-Hexan, Benzol, Chloroform, Aceton, Äthylacetat und Methanol. Geeignete Mischungsverhältnisse lassen sich leicht experimentell ermitteln.
Die Methoden zur Entwicklung zum Eluieren sowie zum Nachweis lassen sich in befriedigender Weise durchführen nach üblichen Chromatographietechniken.
Als Ergebnis dieser Reinigungsmethode wurde gefunden, dass das rohe 5,7-Dien-Derivat gemäss dem zweiten Verfahrensschritt 4,6-Diene in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 1 : 2 bis 1 : 4, bezogen auf das gereinigte 5,7-Dien enthält. Ein derart grosser Anteil von 4,6-Dien kann abgetrennt und vom 5,7-Dien praktisch vollständig entfernt werden mittels des neu entdeckten Reinigungsverfahrens.
Es hat sich gezeigt, dass dieses Reinigungsverfahren es ermöglicht, das freie 5,7-Dien leicht und in hoher Reinheit und guter Ausbeute zu erhalten und dass, wie im folgenden beschrieben werden wird, dieses 5,7-Dien entweder als solches oder nach Schutz mindestens einer seiner Hydroxylgruppen in 1-, 3- und 24-Stellung mit den oben genannten schützenden Gruppen umgewandelt werden kann in la,24-Dihydroxycholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten vermittels Bestrahlung mit ultraviolettem Licht und nachfolgender Umlagerung (Isomerisation).
Es kann hieraus geschlossen werden, dass die Reinigungsmethode des dritten Schrittes gemäss der vorliegenden Erfindung von sehr hohem kommerziellen Wert ist.
6. Vierter Schritt (Synthese von la,,24-Cholecalciferol oder seinen geschützten Derivaten):
la,24-Chocecalciferol oder seine Derivate, wie sie resultieren nach Schutz mindestens einer Hydroxylgruppe, darstellbar durch die Formel
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(3-b)
worin Rx, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Was-15 serstoff oder eine ohne Strukturänderung der Substanz gemäss Formel (5) in Wasserstoff überführbare Schutzgruppe bedeuten. Diese Bestrahlung nimmt man vor in einem organischen Lösungsmittel, worauf das erhaltene Produkt isome-risiert wird.
20 Das freie 5,7-Dien oder seine geschützten Derivate der Formel (3-b) können sein l«,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta--5,7-dien oder dessen geschützte Derivate bzw. la,3ß,24(R)--Trihydroxycholesta-5,7-dien oder dessen geschützte Derivate bzw. Gemische davon in willkürlichem Verhältnis. Diese 25 Substanzen können umgewandelt werden in das la,24(S)--Typ-, lœ,24(R)-Typ- oder Mischtyp-Dihydroxycholecalci-ferol oder deren geschützte Derivate nach dem vierten Verfahrensschritt gemäss der Erfindung.
Falls R2, R2 und/oder R3 in den Formeln (3-b) und (5) 30 Schutzgruppen darstellen, können es die gleichen Schutzgruppen sein wie sie umschrieben sind durch R'4, R'5 und/oder R'0 in der Formel (2). Das gereinigte la,3ß,24-Trihydroxy-cholesta-5,7-dien der Formel (3-a) kann umgewandelt werden in sein geschütztes Derivat nach derselben Methode, wie sie 35 oben beschrieben wurde mit Bezug auf die Trennung von la,24-DHC in das (S)- und (R)-Epimere in Paragraph 3 oben.
Im vierten Verfahrensschritt ist die Verwendung eines gereinigten freien 5,7-Diens, worin alle Reste R1; R2 und R3 in der Formel (3-b) Wasserstoffatome darstellen, vorteilhafter 40 als die Verwendung der geschützten Derivate. Da la,24-Di-hydroxycholecalciferol der Formel
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(5)
(5-a)
worin Rls R2 und R3 die gleiche Bedeutung haben wie in der Formel (3-b), können erhalten werden mittels Ultraviolettbestrahlung des freien gereinigten 5,7-Diens, abgetrennt im dritten vorgenannten Verfahrensschritt, oder seines Derivates, erhalten durch Schutz mindestens einer der Hydroxylgruppen in 1-, 3- und 24-Stellung des freien 5,7-Diens, ausgedrückt durch die Formel
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60 ein sogenanntes Analogon einer aktiven Form von Vitamin D3 ist, erlaubt die Verwendung eines gereinigten freien 5,7-Diens der Formel (3-b) die direkte Herstellung des Analogons einer aktiven Form von Vitamin D3 der Formel (5-a). Wenn andererseits ein geschütztes Derivat der Formel (3-b) verwen-65 det wird, sind zwei besondere Schritte zum Schutz der Hydroxylgruppen des gereinigten freien 5,7-Diens sowie zur Abspaltung der Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten 1 a,24-Dihydroxycholecalciferol notwendig. Dabei verur-
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sacht insbesondere das Abspalten der Schutzgruppen eine teilweise Zersetzung oder Entartung des la,24-Dihydroxy-cholecalciferols.
Auch aus diesem Grunde ist der Reinigungsprozess nach dem dritten Verfahrensschritt eine sehr vorteilhafte Reinigungsmethode.
Das gereinigte 5,7-Dien oder dessen geschützte Derivate der Formel (3-b), vorzugsweise aber das freie 5,7-Dien, wird übergeführt in das la,24-Dihydroxycholecalciferol oder dessen geschützte Derivate der Formel (5) oder (5-a), zunächst durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht des freien gereinigten 5,7-Diens oder seiner geschützten Derivate in einem inerten organischen Lösungsmittel. Als ultraviolettes Licht eignet sich solches mit Wellenlängen von ungefähr 200 bis 360 nm, wobei besonders Wellenlängen von 260 bis 310 nm vorteilhaft sind.
Beispiele solcher inerter organischer Lösungsmittel sind Kohlenwasserstoffe und halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Cyclohexan, Ligroin, Benzol, Toluol, Xylol, Brombenzol, Chlorbenzol, Nitrobenzol, Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,2-Dibromäthan, Äther wie Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylcellosolv oder Phenylcellosolv und schliesslich Alkohole wie Methanol, Äthanol, Propanol, Hexanol oder Cyclohexanol. Benzol, Toluol, Diäthyläther, Methanol und Äthanol, entweder allein oder im Gemisch, sind besonders bevorzugte Lösungsmittel für diesen Zweck. Falls ein solches Lösungsmittel verwendet wird, kann die nachfolgende Isomerisation unmittelbar darin nach der vorgängigen Ultraviolettbestrahlung durchgeführt werden.
Geeignete Temperaturen für die Ultraviolettbestrahlung liegen zwischen —20 und +80°C, insbesondere zwischen — 10 und +20°C. Vorzugsweise wird die Bestrahlung durchgeführt in sauerstofffreier inerter Atmosphäre wie in Argon oder Stickstoff.
Es ist anzunehmen, dass als Folge der Ultraviolettbestrahlung die 9,10-Stellungen des la,3ß,24-Trihydroxycho-lesta-5,7-diens oder seiner Derivate gespalten werden und dass dabei la,24-Dihydroxyprächolecalciferolderivate als Hauptprodukt entstehen.
Die Isomerisation des Prächolecalciferols ergibt das la, 24-Dihydroxycholecalciferolderivat der Formel (5) oder (5-a).
Die Temperatur bei der Durchführung der Isomerisa-tionsreaktion ist nicht von wesentlicher Bedeutung.
Das la,24-Dihydroxyprächolecalciferolderivatund das la,24-Dihydroxycholecalciferolderivat zeigen einen gewissen Gleichgewichtswert, welcher von der Temperatur abhängig ist und es besteht bei niedrigen Temperaturen eine Tendenz zur Bildung steigender Anteile des letzteren. Indessen scheint es, dass bei niedrigen Temperaturen die Bildungsgeschwindigkeit der letzteren Verbindung langsamer ist. Demge-mäss ergibt sich die geeignete Temperatur als ein Kompro-miss zwischen der Gleichgewichtslage und der Bildungsgeschwindigkeit. Demzufolge ist die Umsetzungstemperatur für das Fortschreiten der Reaktion selber nicht von wesentlicher Bedeutung.
Für die Praxis werden vorteilhaft Isomerisationstempe-raturen von 10 bis 120°C, vorzugsweise von 40 bis 100°C, eingehalten.
In der Regel wird die Isomerisation durchgeführt in einem inerten organischen Lösungsmittel. Falls Lösungsmittel der oben genannten Art verwendet werden, können sie gleichfalls als Lösungsmittel für die Isomerisationsreaktion dienen.
Es entstehen auf diese Weise das la,24-Dihydroxychole-calciferol oder dessen geschützte Derivate der Formeln (5-a) oder (5).
Falls die Schutzgruppe der geschützten Derivate von la,24-Dihydroxycholecalciferol eine Acylgruppe ist, kann sie abgespalten werden durch Deacylierung, was erreicht werden kann durch Zersetzung in einer Alkalilösung eines Alkohols wie Methanol oder Äthanol oder es kann auch reduktive Zersetzung mit z.B. LiAlH4 in einem Lösungsmittel wie Äther stattfinden. Vorzugsweise wird die Desacylierung durchgeführt bei einer Temperatur von —10 bis +50°C. Wenn die Schutzgruppe eine Ätherbindung mit der Hydroxylgruppe bildet, kann sie teilweise abgespalten werden durch Reduktion oder durch Kontakt mit einer Säure oder mit Alkali.
Die Abspaltung der Schutzgruppen wird vorteilhaft direkt im Reaktionsgemisch des vierten Verfahrensschrittes durchgeführt.
Das so entstandene la,24-DihydroxycholecalciferoI kann abgetrennt und gereinigt werden vermittels Säulenchromatographie, präparativer Dünnschichtchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie oder Umkristallisieren. Es ist gleichfalls möglich zur Chromatographie einen Träger zu verwenden, welcher Siliciumdioxid enthält mit daran adsorbiertem Silber in nicht-metallischer Form, wie dies erläutert wurde im Hinblick auf die Reinigung des rohen 5,7-Diens, wo z.B. Silicagel mit Silbernitrat verwendet wurde. la,24-Dihydroxycholecalciferol kann erhalten werden unter Anwendung von zwei oder mehrerer dieser Reinigungsmethoden.
7. Pharmakologische Wirksamkeit der erfindungsgemäss hergestellten Produkte:
Das la,24-DihydroxycholecaIciferol (la,24-DHCC) der Formel (5-a), erhalten nach der oben beschriebenen erfin-dungsgemässen Methode, und insbesondere (i) la,24(S)-Di-hydroxycholecalciferol, (ii) la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol oder (iii) ein Gemisch der Dihydroxycholecalciferole (i) und (ii) in beliebigem Verhältnis sind neue Verbindungen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in rationeller Weise hergestellt und isoliert werden können. Diese Verbindungen sind Vitamin D3-Analoga mit hervorragender Wirksamkeit und ihre Giftigkeit ist gering.
Es war zuvor schon bekannt, dass la,25-Dihydroxychole-calciferol (la,25-DMCC) und la-Hydroxycholecalciferol (la-HCC) hervorragende Wirksamkeit als Analoga von aktiven Formen von Vitamin Ds besitzen. Kürzlich wurde gefunden, dass la-HCC sehr grosse Giftigkeit aufweist, so dass seine Nebenwirkungen bei anhaltender Verabfolgung ein Problem werden. Über die Giftigkeit von la,25-DHCC gibt es keine Angaben, jedoch ist aus den bekannten Fakten darüber zu folgern, dass es mindestens so giftig sein muss wie la-HCC.
Eines der Ziele ist die Verminderung der Giftigkeit von la-HCC. Das in vivo vorkommende la,24,25-Trihydroxy-cholecalciferol (la,24,25-THCC) scheint einen selektiven, jedoch nicht sehr ausgesprochenen, Effekt auf den intestinalen Calciumtransport auszuüben. Wenn das la,24-DHCC-Epimerengemisch la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC (im nachfolgenden im allgemeinen bezeichnet mit la,24-DHCC) in vivo dem Stoffwechsel unterworfen werden, so wird das la,24-DHCC sehr leicht umgewandelt in la,24,25-THCC. Dies legt den Schluss nahe, dass die Wirkung von la,24--DHCC-Epimerengemisch la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC selektiv sein kann. Das la,24-DHCC ist eine neue Verbindung, die bisher in vivo nicht gefunden wurde und von der anzunehmen ist, dass sie eine vollständig neue Wirksamkeit aufweist.
Ausgehend von diesen Überlegungen machten die Erfinder eine vergleichende Studie über die Aktivitäten der neuen erfindungsgemässen Verbindungen im Vergleich zu la-HCC und fanden, dass diese neuen Verbindungen, wie nachfolgend
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in den Beispielen noch darzutun sein wird, mindestens äquivalente Wirksamkeit in bezug auf den intestinalen Calcium-transport aufweisen, wie la-HCC, dass ihre Wirkung auf die Calciumresorption im Knochen weniger als y3 der Wirkung des la-HCC ist und dass die LD50-Werte weniger als V10 der la-HCC betragen. Insbesondere wurde sichergestellt, dass la,24(S)-DHCC nur eine leicht geringere Wirkung auf den intestinalen Calciumtransport ausübt als la,24(R)-DHCC, jedoch praktisch keine Calciumresorption im Knochen bewirkt.
Demgemäss kann la,24-DHCC verwendet werden als Pharmaceutikum, welches lediglich verminderte Nebenwirkungen und hohe Sicherheit aufweist im Vergleich mit den bekannten Analoga der aktiven Formen von Vitamin D3,
wenn es z.B. angewendet wird bei Krankheiten, die durch abnormalen Calciumstoffwechsel bedingt sind. Pharmakologische Versuche der Erfinder haben klargestellt, dass verschiedene optimal wirkende pharmazeutische Präparate hergestellt werden können, die unterschiedlichen Krankheitsbedingungen angepasst werden können.
Aus den Ergebnissen pharmazeutischer Versuche folgt, dass geeignete Dosierungen der neuen aktivierten Vitamin D3-Derivate zur klinischen Anwendung ungefähr 0,04 bis 0,4 [ig (96,2 bis 962 p-Mol) pro kg Körpergewicht betragen. Die la,24-DHCC-Verbindungen der Formel (5-a) dürften erwartungsgemäss anwendbar sein für verschiedene klinische und veterinär-medizinische Zwecke und dabei nützlich sein zur Behandlung von abnormalem Calcium- und Phosphorstoffwechsel, wie er verursacht sein kann durch Leberversagen, Nierenversagen, Krankheiten des Verdauungstraktes, Versagen der Nebenschilddrüse und damit verbundene Knochenerkrankungen, wie Vitamin D-abhängige Rachitis, renale Osteodystrophy, Hyperparathyroidismus, Osteoporosis, Oste-malacie, Pegets Krankheit, Malabsorptionssyndrom, Hypo-calcämie verursacht durch Lebercirrhose, Hypocalcämie verursacht durch Steatorrhoea, Hypocalcämie verursacht durch Vitamin D-resistente Rachitis. Es lässt sich voraussehen, dass diese Verbindungen sicherere Medikamente sind als die bekannten la-HCC und la,25-DHCC. Es ist gleichfalls möglich, Präparate zu verwenden, welche la,24(R)-DHCC und/ oder la,24(S)-DHCC zusammen enthalten mit anderen den Calciumstoffwechseln regulierenden Agenzien. Zum Beispiel können sie verwendet werden zusammen mit Calcitonin zur Behandlung von Pagets-Krankheit.
Geeignete Wege zur Verabfolgung sind oral, buccal und paranteral (intramuskulär, subkutan, intravenös und rectal). Dosierungsformen können z.B. sein gepresste Tabletten, überzogene Tabletten, harte oder weiche elastische Gelatinekapseln, Äthylalkohollösungen, Öllösungen und wässrige Suspensionen. Als Lösungsmittel für die Öllösungen sind geeignet vegetabile Öle wie Mais-, Baumwollsamen-, Kokosnuss-, Mandel- oder Erdnussöl sowie Fischlebertran oder ein öliger Ester wie «Polysorbat 80».
Für rectale Anwendung können die erfindungsgemässen Verbindungen eingearbeitet werden in pharmazeutische Präparate, welche als Suppositorienbasis Cacaobutter oder andere Triglyceride enthalten. Zur Verbesserung der Lagerungsdauer enthalten die Zubereitungen vorteilhafterweise ein Antioxi-dans wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hy-drochinon.
Futterzubereitungen für Haustiere, welche das erfindungs-gemässe la,24-DHCC enthalten, lassen sich herstellen mit Gehalten, welche keine Giftwirkung ausüben und dienen zur Verhinderung von Hypocalcämie bei Kühen, vor oder zur Zeit der Entbindung, oder zur Verhinderung von Hypocalcämie bei Haustieren, welche in dieser Richtung nicht vorbelastet sind. Wenn diese Verbindungen an Federvieh während der Eierlegeperiode verabfolgt werden, so verhindert dies das
Legen von Eiern mit weichen Schalen. Es sind dies weitere besondere Eigenschaften des erfindungsgemäss hergestellten I a,24-DHCC.
In den nachfolgenden Beispielen wird das erfindungsge-s mässe Verfahren sowie Verfahren zur Herstellung von Ausgangs- und Nebenprodukten noch eingehender erläutert. Die in diesen Beispielen aufgeführten Testmethoden zur Bestimmung der Eigenschaften der neuen Produkte sind die folgenden:
io Sofern nicht anders vermerkt, wurden die NMR-Spektren bestimmt mit einem «Varian EM 360» oder «JEOL PS/PFT-100»-Spektrometer (Nippon Electronics Co., Ltd.) in Deuterochloroform (CDC13) unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard.
15 Massenspektren und hoch aufgelöste Massenspektren wurden erhalten mit einem Gerät «Shimadzu LKB-9000» (Handelsmarke für ein Erzeugnis der Shimazu Seisakusho Co., Ltd.).
Die UV-Spektren wurden bestimmt mit einem Gerät 20 «Hitachi EPS-3T» (Handelsmarke eines Produktes der Hitachi Limited) unter Verwendung einer Äthanollösung.
Die Schmelzpunkte wurden ermittelt mit einem Heizmikroskop, wobei die erhaltenen Werte nicht korrigiert wurden.
25 Die absolute Konfiguration von la,24-Dihydroxychole-sterin wurde folgendermassen bestimmt:
Ein Epimerengemisch von 24,24-Epoxycholesterin-3--benzoat, d.h. ein Gemisch von worin B2 die Benzoylgruppe bedeutet, wurde chromatogra-phiert unter Verwendung von Silicagel als Träger zwecks Tren-55 nung und Gewinnung der beiden Epimeren. Die beiden Epimeren wurden methanolisiert zur Bildung eines 24-OH-Deri-vates und eines 25-OCH3-Derivates. Anschliessend wurde eine modifizierte Methode nach Horean angewendet zur Bestimmung der absoluten Konfiguration der beiden Epimeren, 60 welche Methode veröffentlicht ist in Tetrahedron Letters 1, 15, 1975, Durch Reduktion der beiden Epimeren, deren absolute Konfiguration auf diese Weise bestimmt worden war, mit AlCl3-LiAlH4 wurde ein 24(R)-Hydroxyderivat erhalten aus dem 24(R),25-Epoxyderivat und ein 24(S)-Hydroxyderi-65 vat aus dem 24(S),- 25-Epoxyderivat. Da bekannt ist, dass das letztgenannte S-Derivat stärker polar als das vorher genannte R-Derivat kann angenommen werden, dass sich diese Tatsache gleichfalls anwenden lässt auf das la,24-Dihydroxy-
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Cholesterin. Dementsprechend wurde dieses la,24-Dihydroxy-cholesterin umgewandelt in seine Tribenzoat- oder Dibenzoat-Derivate, welche hernach chromatographiert wurden an einer Silicagel-Säule. Auf diese Weise wurde das stärker polare Epimere umgewandelt in ein la,24(S)-Derivat und das weniger polare Epimere in ein la,24(R)-Derivat.
Wo in der nachfolgenden Beschreibung keine besondere Angabe auf ein R-Derivat oder ein S-Derivat erfolgt, d.h. wenn z.B. lediglich ein Hinweis gemacht wird auf la,24-DHCC, so ist dabei ein äquimolares Gemisch von la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC gemeint.
A) Synthese von Ausgangsprodukten Beispiel 1
la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on wurde hergestellt gemäss den folgenden drei Verfahrensschritten 1 bis 3:
1. Synthese von 24-Ketocholesterin aus Fucosterin:
4,1 g Fucosterin wurden gelöst in 100 ml Methylenchlorid und unter Kühlen der Lösung mit Trockeneis-Aceton auf ungefähr — 20°C wurde das Fucosterin während 30 Minuten mit Ozon oxidiert bei einer Herstellungsrate von 0,86 g/ Stunde und in einer Konzentration von 17,2 g/m5 (02). Nach Vollendung der Reaktion wurden 8 g Zinkpulver und 200 ml Essigsäure hinzugefügt, worauf das erhaltene Ozonid während 24 Stunden bei Zimmertemperatur reduktiv zersetzt wurde. Das entstandene Zinkacetat wurde abfiltriert und gewaschen mit einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonat. Die abgetrennte Methylenchloridphase wurde gründlich gewaschen mit Wasser und getrocknet mit wasserfreiem Natriumsulfat. Das Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck abgedampft und die erhaltenen weissen Kristalle wurden an einer Säule chromatographiert unter Verwendung von Silicagel als Träger, wobei mit einer Mischung von Benzol und Hexan eluiert wurde. Erhalten wurden auf diese Weise 2,8 g 24-Ketocholesterin in einer Ausbeute von 70,3 %.
2. Synthese von 24-Ketocholesta-l,4,6-trien-3-on aus 24-Ketocholesterin:
4,0 g 24-Ketocholesterin in 7,0 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-benzochinon wurden aufgelöst in 140 ml Dioxan und die Lösung wurde am Rückfluss des Dioxans während 27 Stunden gerührt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Gemisch auf Zimmertemperatur gekühlt. Das erhaltene Hy-drochinonderivat wurde abfiltriert und gewaschen mit 30 ml Dioxan. Filtrat und Waschlösung wurden vereinigt und das Dioxan unter vermindertem Druck abgedampft, wobei eine schwarzbraune ölige Substanz zurückblieb.
Das Öl wurde abgetrennt und gereinigt vermittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Alumina als Träger, wobei eluiert wurde mit einer Mischung aus Methylenchlorid und Aceton. Erhalten wurden 2,76 g 24-Ketocholesta--l,4,6-trien-3-on als Kristalle. Die Analyse des Produktes zeigte die folgenden Resultate.
NMR-Spektrum:
0,86 (3H, s, C-18-CH3),
1,20 (3H, s, C-19-CHa),
1,15 (6H, d, J=10 Hz, C-26,27-CH3),
5,95 - 6,10 (3H, m, C-4, 6,7-H),
6,29 (1H, dd, J=ll, 15Hz, C-2-H),
7,10 (IH, J=llHz, C-l-H).
Molekulargewicht (durch Gas-Massenspektrum): 394 (M+).
3. Synthese von la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on aus 24-Ketocholesta-l,4,6-trien-3-on:
3,53 g 24-Ketocholesta-l,4,6-trien-3-on wurden gelöst in einem Gemisch von 100 ml Methanol, 20 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Dioxan, worauf 1,6 ml einer 5% igen Methanollösung von Natriumhydroxid und 5 ml einer 30% igen wässrigen Waserstoffperoxid-Lösung hinzugegeben wurden. Die Reaktion wurde bei Zimmertemperatur während 24 Stunden durchgeführt. Nachher wurde ein geringer Anteil Essigsäure hinzugegeben, um die Lösung auf den pH-Wert 7 zu neutralisieren. Dann wurde das Reaktionsgemisch extrahiert durch Zugabe von Wasser und Äther. Die ätherische Phase wurde gründlich gewaschen mit Wasser und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wurde unter vermindertem Druck abgedampft und hinterliess 4,04 g einer hellgelben festen Substanz. Diese Substanz wurde chromatographiert an einer Säule von Silicagel und eluiert mit einem Benzol-Äther-Gemisch. Erhalten wurden 2,52 g la,2a-Epoxy--24-ketocholesta-4,6-dien-3-on mit den folgenden Charakteristiken:
Schmelzpunkt: 150 bis 151,5°C.
UV-Spektrum: X ^ano1 291 nm.
Hochauflösendes Massenspektrum:
gefunden = 410,2793 berechnet (M+) = 410,2821 (C27H3803).
NMR-Spektrum:
0,80 (3H, s, C-18-Hs),
1,15 (3H, s, C-19-Hs),
3,43 (1H, dd, J=4Hz, J=l,5Hz, C-2-H),
3,60 (1H, d, J=4Hz, C-l-H),
5,68 (1H, d, J= 1,5Hz, C-4-H),
6,10 (2H, s, C-6, C-7-Hs).
Synthese von lot,24-DihydroxyCholesterin gemäss dem ersten Verfahrensschritt
10 ml flüssiger Ammoniak, der getrocknet war mit metallischem Natrium, wurden eingegeben in einen Dreihalskolben, der einen Tropftrichter und einen Trockeneiskühler trug, wobei der Kolben gekühlt wurde mit einer Mischung aus Aceton und trockenem Eis. 150 mg metallisches Lithium wurden dem flüssigen Ammoniak zugesetzt und darin während 10 Minuten verrührt. Das Gemisch wurde aufgelöst in 15 ml Tetrahydrofuran, wonach im Verlauf von 10 Minuten tropfenweise 100 mg la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien--3-on hinzugefügt wurden.
Nach Vollendung der Zugabe wurde der Kolben aus dem Kühlmedium weggenommen und Ammoniak 20 Minuten lang am Rückfluss sieden gelassen. Nun würde der Kolben wieder in das Kühlmedium eingesetzt, worauf im Verlauf von zwei Stunden 1,5 g gründlich getrocknetes pulveriges Ammoniumchlorid nach und nach zugesetzt wurden. Dann wurde der Kolben wieder vom Kühlmedium weggenommen und die Reaktion unter Rühren fortgesetzt.
Mit dem Rühren wurde aufgehört, nachdem die blaue Farbe der Lösung vollständig verschwunden war. Nun wurde der Kühler vom Kolben entfernt und Stickstoffgas eingeleitet zwecks Entfernung des Ammoniaks.
Zum Rückstand wurden 60 ml Äthylacetat und 60 ml 1-n Salzsäure hinzugefügt, um ihn der Verteilungsextraktion zu unterwerfen. Die Äthylacetatphase wurde abgetrennt und gründlich gewaschen mit Wasser, hernach getrocknet, worauf das Äthylacetat unter vermindertem Druck abgetrieben wurde. Der Rückstand wurde aufgelöst in 3 ml Äthylacetat und chromatographiert an einer Silicagel-Säule, wobei eluiert wurde mit einer Mischung aus Benzol und Aceton. Erhalten wurden auf diese Weise 61 mg des gereinigten Produktes mit den folgenden Eigenschaften:
NMR-Spektrum (in CSDSN), S (ppm):
0,70 (3H, s, 18-CH3),
0,99 (3H, s, 19-CH3),
3,28 (4H, m, 24-H und Hydroxy H),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
618669
14
3,82 (IH, m, lß-H),
4,00 (IH, m, 3«-H),
5,50 (IH, m, 6-H).
Massenspektrum (vgl. Fig. 1). 418 (M+), 400, 382. Hochauflösungs-Massenspektrum:
gefunden = 418,3428 berechnet M+(C27H4ti03) = 418,3449.
Aufgrund dieser Daten wurde das erhaltene Produkt identifiziert als la,24-Dihydroxycholesterin.
Beispiel 2
Synthese von la,24-Dihydroxycholesterin (erster Schritt):
15 ml Ammoniak, welcher getrocknet worden war mit metallischem Natrium, wurden eingebracht in einen Drei-halskolben, welcher einen Tropftrichter und einen Trockeneiskühler aufwies. Dabei wurde gekühlt mit Aceton und Trockeneis. Anschliessend wurden 400 mg metallisches Natrium hinzugefügt und es wurde während 10 Minuten gerührt. Dann wurde die Mischung aufgelöst in 18 ml Tetrahydrofuran, worauf im Verlauf von 10 Minuten 100 mg la,2a-Epoxy-24-ketocholesta-4,6-dien-3-on tropfenweise hinzugefügt wurden.
Nach Vollendung der Zugabe wurden im Verlauf von einer Stunde und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 1,8 g pulveriges Ammoniumchlorid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei 69 mg (Ausbeute 68%) eines Produktes erhalten wurden, welches das gleiche NMR-Spektrum, Massenspektrum und hochaufgelöstes Massenspektrum wie in Beispiel 1 zeigte. Demgemäss wurde das Produkt identifiziert als la,2a, 24-Dihydroxycholesterin.
Beispiel 3
Synthese von la,24-Dihydroxycholesterin-tribenzoat
1,25 g la,24-Dihydroxycholesterin wurden gemischt mit 1,55 g Benzoylchlorid und 20 ml Pyridin, worauf das Gemisch einen Tag lang bei 40°C reagieren gelassen wurde. Nun wurden 5 ml Wasser hinzugefügt und extrahiert mit 50 ml Diäthyläther. Die ätherische Phase wurde gewaschen mit Säure und hernach mit Alkali, anschliessend getrocknet und zur Entfernung des Äthers eingedampft. Dabei wurde das rohe la,3ß,24-Tribenzoyloxycholest-5-en erhalten.
Trennung des 24(R)-Derivates und 24(S)-Derivates von 1 x,3$,24-T ribenzoyloxycholest-5-en
Eine Lösung von 1,58 g des rohen la,3ß,24-Tribenzoyl-oxycholest-5-en in n-Hexan wurde chromatographiert durch eine Säule, welche 100 g Silicagel enthielt und wobei das Eluat aufgeteilt wurde in Fraktionen von je 50 ml. Die Reinheit jeder dieser Fraktionen wurde bestimmt vermittels Hoch-druckflüssigkeits-Chromatographie und die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, wonach das Lösungsmittel daraus abgedampft wurde. Erhalten wurden zwei Epimere mit den folgenden NMR-Spektren. 500 mg des weniger polaren Epimeren, zuerst eluiert, stellten das 24(R)-Derivat dar und 490 mg des stärker polaren Epimeren gegen Ende der Eluie-rung waren das 24(S)-Derivat.
NMR-Spektrum von la,3{i,24(R)-Tribenzoyloxycholest-5-en: 0,65 (3H, s, C-18),
0,92 (3H, s, C-21),
1,01 (6H, b, s, C-25, 26),
1,20 (3H, s, C-19),
5,00 (1H, m, C-24),
5,20 (1H, m, C-3),
5,44 (1H, m, C-l),
5.70 (1H, m, C-6),
7,50 (9H, m, Benzoyl),
8,10 (6H, m, Benzoyl).
5 NMR-Spektrum von la,3$,24(S)-Tribenzoyloxycholest-5-en: 0,63 (3H, s, C-18).
Die anderen Spektraldaten waren die gleichen wie beim 24(R)-Derivat.
10
Beispiel 4
Synthese von la,24-Dihydroxycholesterin-dibenzoat
2.5 g la,24-Dihydroxycholesterin wurden gemischt mit 15 2,10 g Benzoylchlorid und 40 ml Pyridin, worauf das Gemisch einen Tag lang bei 20°C stehen gelassen wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise behandelt wie in Beispiel 3 a), wobei rohes 1 a-Hydroxy-3 ß,24-dibenz-oyloxycholest-5-en erhalten wurde.
20
Trennung des 24(R)-Derivates und 24(S)-Derivates von 1 a-Hydroxy-3 ß ,24-dibenzoyloxycholest-5-en
2,1 g des rohen 1 a-Hydroxy-3 ß,24-dibenzoyloxycholest-5--en wurden chromatographiert durch eine Säule mit 30 g Sili-25 cagel unter Verwendung einer Eluierlösung, welche aus einem Gemisch von Benzol und Äthylacetat im Verhältnis von 200 : 1 bestand, wobei die Eluierflüssigkeit in Fraktionen von je 50 ml geteilt wurde. Jede der Fraktionen wurde der Hoch-druckflüssigkeits-Chromatographie unterworfen, um ihre 30 Reinheit sicherzustellen. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und die Lösungsmittel daraus abgedampft. Erhalten wurden dabei die Epimeren mit den folgenden NMR-Spektren. Das weniger polare Epimere im Gewicht von 500 mg mit dem Schmelzpunkt 168 bis 169°C war das 24(R)-35 Derivat und das stärker polare Epimere im Gewicht von 600 mg mit dem Schmelzpunkt 139,5 bis 140,5 war das 24(S)-De-rivat.
NMR-Spektrum von la.-Hydroxy-3$,24(R)-dibenzoyloxy-cholest-5-en:
40 0,67 (3H, s, C-18),
0,96 (6H, b, s, C-19,21),
1,00 (6H, d, J=6Hz, C-25,26),
3,96 (1H, m, C-l),
5.06 (1H, m, C-24),
45 5,36 (1H, m, C-3),
5.71 (1H, m, C-6),
7,52 (6H, m, Benzoyl),
8,12 (4H, m, Benzoyl).
NMR-Spektrum von 1 a,-Hydroxy-3ß,24(S)-dibenz,oyloxy-50 cholest-5-en:
0,70 (3H, s, C-18).
Die anderen Spektraldaten waren dieselben wie beim 24(S)-Derivat.
55
Beispiel 5
Synthese von 1 a,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en
300 mg la,24-Dihydroxycholesterin wurden umgesetzt 60 mit 40 ml Essigsäureanhydrid und 125 ml Pyridin während drei Stunden bei 95°C. Das Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 A) behandelt und ergab rohes la,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en. Das Rohprodukt wurde chromatographiert durch eine Silicagel-Säule unter Verwen-65 dung von Benzol als Lösungsmittel, wobei 325 mg gereinigtes la,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en als öliges gereinigtes Produkt erhalten wurde, mit den folgenden NMR- und Massenspektren.
15
618669
NMR-Spektrum:
0,67 (3H, s, C-18),
2,02 (9H, s, 3-Acetyl),
4,80 (2H, m, 3a und 24-H2),
5,05 (lH,m, lß-H),
5,65 (IH, m, 6-H).
Massenspektrum: 484 (M+ -CH3COOH), 424, 364.
Synthese von 1 a,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweiter Schritt)
300 mg la,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en wurden umgesetzt mit 90 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 4,5 ml n-Hexan unter Rückfluss während 15 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und das erhaltene 5,5-Dime-thylhydantoin sowie das überschüssige l,3-Dibrom-5,5-dime-thylhydantoin wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und ergab 349 mg einer gelben öligen Substanz. Zu dieser Substanz wurden 2,5 ml Xylol hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zugegeben zu einer Lösung von 0,85 ml s-Kollidin in 1,9 ml Xylol, die auf 165°C gehalten wurde. Hernach wurde während 10 Minuten reagieren gelassen. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Hydrobromid von s-Kollidin abfiltriert und das s-Kollidin und Xylol wurden unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde aufgelöst in Diäthyläther. Die Ätherphase wurde gewaschen mit 1-n Salzsäure und einer 5%igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat und hernach wiederholt mit Wasser. Nun wurde behandelt mit Aktivkohle und der Äther abgedampft unter vermindertem Druck, wobei 310 mg eines gelben Öles zurückblieben. Diese ölige Substanz wurde sorgfältig zweimal durch Säulenchromatographie getrennt (Eluie-ren mit Benzol) unter Verwendung von Kieselsäure, wobei 69 mg (Ausbeute 23%) eines nicht-kristallinen gereinigten Produktes erhalten wurden. Aus den nachfolgend angegebenen Spektraldaten wurde dieses Produkt identifiziert als 1 a,3 ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien.
UV-Spektrum: X £|*ano1 (nm) = 262, 271, 282, 294. NMR-Spektrum:
2,02 und 2,04 (9H, s, CH3COO-),
4,75 (2H, b, 3a- und 24-H),
5,01 (1H, b, lß-H),
5,35 (1H, d, J=5,5Hz, 6- oder 7-H), 5,69 (1H, d,J=5,5Hz, 6-oder 7-H).
Massenspektrum: 542 (M+, 514, 482, 422, 362, 249, 204).
Beispiel 6
Synthese von la,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweiter Schritt)
150 mg la,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en wurden umgesetzt mit 45 mg l,3-Dibrom-5,5-dimethylhydantoin in 3 ml n-Hexan während 15 Minuten unter Rückfluss. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und die erhaltenen Kristalle abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt unter vermindertem Druck, wobei eine gelbe ölige Substanz zurückblieb. Zu dieser Substanz wurden 1,3 ml Xylol zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zu einer Lösung von 0,25 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückfluss hinzugefügt, wonach das Gemisch weitere 90 Minuten lang reagieren gelassen wurde. Die Reaktionsmischung wurde hernach bei einer Temperatur von unter 75°C eingeengt und ergab 148 mg einer öligen Substanz.
Diese Substanz wurde behandelt in gleicher Weise wie in Beispiel 5 B). Das schliesslich erhaltene Produkt zeigte das gleiche UV-, Massen- und NMR-Spektrum wie das la,3ß,24--Triacetoxycholesta-5,7-dien, erhalten in Beispiel 5 B).
Beispiel 7
Synthese von la,3$,24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweiter Schritt)
5 200 mg la,3ß,24-Tribenzoyloxycholest-5-en, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 5 A), wurden während 15 Minuten unter Rückfluss zusammen mit 55 mg N-Brom-succinimid in 15 ml Tetrachlorkohlenstoff erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und die erhaltenen Kristalle io wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt, wonach 5 ml Xylol hinzugegeben wurde zwecks Auflösung. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten zugegeben zu einer Lösung von 0,2 ml Trimethylphosphit in 4 ml Xylol unter Rückfluss, wonach das Gemenge weitere 90 15 Minuten lang am Rückfluss erwärmt wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde hernach konzentriert bei einer Temperatur von unter 75°C und der Rückstand sorgfältig zweimal chromatographiert durch eine Säule, welche Kieselsäure enthielt mit Benzol als Eluierflüssigkeit. Man er-2o hielt so 50 mg (Ausbeute 25%) eines gereinigten nicht-kri-stallinen Produktes. Dieses Produkt zeigte die folgenden Spektren und wurde daraus identifiziert als la,3ß,24-Tribenzoyl-oxycholesta-5,7-dien.
UV-Spektrum. X max*™' (nm) = 231, 262, 271, 282, 294. 25 NMR-Spektrum:
4,95 (2H, b, 3a-H und 24-H),
5,32 (2H, b, lß-H und 6- oder 7-H),
5,72 (1H, d, J= 6Hz, 6- oder 7-H),
7,49 und 8,02 (15H, m, aromatisches H).
30
Massenspektrum: 728 (M+), 638, 620, 606, 484, 362.
Beispiel 8
Synthese von la,3fi,24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien 35 (zweiter Schritt)
1 a-Hydroxy-3 ß ,24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 4 B), wurden reduziert mit Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH4) in trockenem Diäthyl-40 äther unter Bildung von la,3ß,24(S)-Trihydroxycholest-5-en. 180 mg dieses Produktes wurden hernach umgesetzt mit 24 ml Acetanhydrid und 75 ml Pyridin bei 95°C während 3% Stunden. Das erhaltene Produkt wurde in gleicher Weise aufgearbeitet wie in Beispiel 3 A) und chromatographiert durch eine Silicagel-Säule, wobei 195 mg la,3ß,24(S)-Tri-acetoxycholest-5-en erhalten wurden. 150 mg dieses Produktes wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 gereinigt und ergaben 43,5 mg (Ausbeute 29%) eines gereinigten Produktes mit den folgenden Spektraldaten. Daraus wurde das Produkt identifiziert als la,3ß-24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien.
UV-Spektrum: X ^ano1 (nm) = 262, 271, 282, 294. NMR-Spektrum:
2,02 und 2,04 (9H, s, CH3COO-),
4,75 (2H, b, c-3-, C-24-H),
5,01 (1H, b, c-l-H),
5,35 (1H, d, J=5-6Hz, C-6- oder C-7-H),
5,69 (1H, d, J=5-6Hz, C-6- oder C-7-H).
Massenspektrum: 542 (M+), 514,482, 422, 362, 249, 209. Beispiel 9
Synthese von la,,3$,24(S)-Tribenzoyloxycholesta-5-dien (zweiter Schritt)
100 mg la,3ß,24(S)-Tribenzoyloxycholest-5-en, erhalten in gleicher Weise wie in Beispiel 3 B), wurden am Rückfluss während 15 Minuten erhitzt zusammen mit 23 mg 1,3-Di-brom-5,5-dimethy!hydantoin in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff.
50
55
618669
16
Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert, wonach 2,5 ml Xylol zum Rückstand hinzugegeben wurden. Die Lösung wurde tropfenweise im Verlauf von 15 Minuten hinzugegeben zu einer Lösung von 0,3 ml s-Kollidin in 2 ml Xylol, die am Rückfluss siedete, wonach weitere 10 Minuten am Rückfluss erwärmt wurde. Nach Vollendung der Zugabe wurde das Hydrobromid von s-Kollidin abfiltriert und das s-Kollidin und das Xylol unter vermindertem Druck abgetrieben. Der Rückstand wurde aufgelöst in Diäthyläther. Die Ätherphase wurde gewaschen mit 1-n Salzsäure und einer 5%igen Lösung von Natriumbicarbonat und schliesslich wiederholt mit Wasser. Anschliessend wurde die ätherische Phase getrocknet und der Äther unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei eine gelbe ölige Substanz zurückblieb.
Diese ölige Substanz wurde sorgfältig zweimal chromatographiert durch eine Kieselgelsäure unter Verwendung von Benzol als Eluiermittel und ergab 28 mg (Ausbeute 28%) eines gereinigten nichtkristallinen Produktes. Dieses Produkt zeigte die folgenden Spektren und wurde daraus identifiziert als 1 a,3 ß,24(S)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien.
UV-Spektrum: X ^ano1 (nm) = 231, 262, 271, 282, 294. NMR-Spektrum:
4,95 (2H, b, C-3- und C-24-Hs),
5.32 (2H, b, C-l- und C-6- oder C-7-H),
5,72 (1H, d, J=6Hz, C-6- oder C-7-H),
7,49 und 8,02 (15H, m, aromatisches H).
Massenspektrum: 728 (M+), 638, 620, 606,484, 362.
Beispiel 10
Synthese von la-Acetoxy-3ß,24(S)-dib.enzoyloxycholesta-5,7--dion (zweiter Schritt)
la-Hydroxy-3ß,24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet in gleicher Weise wie in Beispiel 4 B), wurden umgesetzt mit Acetanhydrid und Pyridin in gleicher Weise wie in Beispiel 5. Das Reaktionsprodukt wurde gereinigt, wie in Beispiel 5, und ergab la-Acetoxy-3ß,24(S)-di-benzoyloxycholest-5-en.
462 mg la-Acetoxy-3ß,24(S)-dibenzoyloxycholest-5-en wurden umgesetzt mit 188,6 mg N-Bromsuccinimid in 16 ml Tetrachlorkohlenstoff unter Rückfluss während 30 Minuten. Das Reaktionsgemenge wurde abgekühlt und die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde konzentriert unter vermindertem Druck und ergab eine gelbe ölige Substanz. Zu dieser Substanz wurden 6,8 ml Xylol hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wurde tropfenweise hinzugesetzt zu einer Lösung von 0,4 ml Trimethylphosphit in 8 ml Xylol, welche am Rückfluss siedete und das Reaktionsgemisch wurde weitere 90 Minuten lang reagieren gelassen. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter vermindertem Druck konzentriert und hinterliess ein öliges Produkt. Dieses Produkt zeigte die folgenden Spektren, woraus es identifiziert wurde als 1 a-Acetoxy-3ß,24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien. UV-Spektrum: X ^ano1 (nm) == 231, 262, 271, 282, 294. NMR-Spektrum:
2,04 (3H, s, CH3COO-),
4,7 - 5,4 (3H, m, lß-, 3a- und 24-Hs),
5.33 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H),
5,70 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H),
7,4 - 8,2 (10H, m, aromatisches H).
Beispiel 11
Synthese von la,3ß,24(R)-Triacetoxycholesta-5,7-dien (zweiter Schritt)
la-Hydroxy-3ß,24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet in gleicher Weise wie in Beispiel 4 B),
wurden dem gleichen Verfahren unterworfen wie in Beispiel 8. Es bildete sich ein Produkt, welches genau die gleichen UV-, NMR- und Massenspektren aufwies wie das entsprechende S-Epimere, erhalten in Beispiel 8, mit einer Ausbeute von 5 28%. Dieses Produkt wurde identifiziert als la,3ß,24(R)-Tri-acetoxycholesta-5,7-dien.
Beispiel 12
10 Synthese von la,3ß,24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien (zweiter Schritt)
la,3ß,24(R)-TribenzoyIoxycholest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 3, wurden in gleicher Weise um-is gesetzt wie in Beispiel 9. Mit einer Ausbeute von 27 % wurde ein Produkt erhalten, welches genau die gleichen UV-, NMR-und Massenspektren aufwies wie das entsprechende S-Epimere, erhalten in Beispiel 9. Daraus wurde das Produkt identifiziert als la,3ß,24(R)-Tribenzoyloxycholesta-5-dien.
Beispiel 13
Synthese von la-Acetoxy-3ß,24(R)-dibenzoyloxycholesta-5,7--dien (zweiter Schritt)
la-Hydroxy-3ß,24(R)-dibenzoyIoxycholest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 4 B), wurden dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 10 unterworfen.
Es bildete sich ein gereinigtes Produkt mit genau den glei-30 chen UV- und Massenspektren wie das entsprechende S-Epimere, erhalten gemäss Beispiel 10. Hieraus wurde das Produkt identifiziert als la-Acetoxy-3ß,24(R)-dibenzoyloxycho-lesta-5,7-dien.
35
Beispiel 14
Synthese von la,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien aus la,,3 ß,24-Triacetoxycholest-5-en
4o In Übereinstimmung mit dem Verfahren des Beispiels 5 B) wurde la,3ß,24-Triacetoxycholest-5-en umgesetzt mit 1,3-Di-brom-5,5-dimethylhydantoin und s-Kollidin in n-Hexan. Das Reaktionsprodukt wurde gewaschen mit Säure und Alkali in Äther und hernach mit Aktivkohle behandelt, wobei ein rohes 45 Reaktionsgemisch erhalten wurde, welches la,3ß,24-Tri-acetoxycholesta-5,7-dien enthielt.
Hydrolyse von la,,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien
Das im vorgängigen Verfahrensschritt A) erhaltene rohe 50 Produkt wurde hydrolysiert in einer 5% igen Methanollösung von Kaliumhydroxid und ergab ein rohes Reaktionsgemisch, welches la,3ß,24-TrihydroxychoIesta-5,7-dien enthielt.
C) Bestimmung der Reinheit des la,3ß,24-Trihydroxy-55 cholesta-5,7-diens
Im UV-Spektrum von 100% reinem la,3ß,24-Trihydroxy-cholesta-5,7-dien liegt X ma'x3"01 bei 282 nm und im UV-Spektrum von 100% reinem la,3ß,24-Trihydroxy-4,6-dien liegt X max an<>1 in etwa 240 nm. Es wurde gefunden, dass 60 das Mischungsverhältnis zwischen diesen beiden Verbindungen bestimmt werden kann durch Vergleich ihrer Xmax-Werte.
Das Mengenverhältnis des 5,7-Dienderivates und des 4,6--Dienderivates im rohen Reaktionsprodukt, erhalten gemäss 65 dem obigen Verfahrensschritt B), wurden nach diesem Verfahren ermittelt, und es zeigte sich, dass das molare Verhältnis von la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien zu la,3ß,24-Trihydroxycholesta-4,6-dien ungefähr 3 :1 betrug.
17
618669
D) Trennung von la,3$,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1 a,3$,24-Trihydroxychoiesta-4,6-dien (dritter Schritt)
D-l) Trennung durch präparative Dünnschichtchromatographie:
Eine im Handel erhältliche Platte für die präparative Dünnschichtchromatographie (Silicagel, Produkt der Merck Company, 20 cm x 20 cm x 0,5 mm) wurde eingetaucht in eine Lösung von Silbernitrat in Acetonitril, um sie mit einem Anteil von ungefähr 1,5 Gew.-% Silbernitrat zu imprägnieren. Hernach wurde erhitzt auf 70°C während zwei Stunden. Die so erhaltene Chromatographieplatte wurde für die nachfolgend beschriebene Trennungsoperation verwendet.
30 mg des im obigen Verfahrensschritt B) erhaltenen rohen Reaktionsproduktes wurden auf der Platte adsorbiert und entwickelt über eine Distanz von ungefähr 20 cm mit einer 6%igen Methanol-Chloroform-Mischung. Nach Trocknen an Luft wurde das Reaktionsgemisch mit demselben Lösungsmittel erneut entwickelt. Es zeigten sich zwei Banden mit einem Rf vôn ungefähr 0,23 und ungefähr 0,33. Diese Fraktionen wurde abgekratzt und mit Äthylacetat aus dem Silicagel extrahiert. Erhalten wurden 17,1 mg (57%) einer weissen festen Substanz (Rf = 0,23) und 6,0 mg (20%) einer weissen festen Substanz (Rf = 0,33).
Ein Teil der Platte wurde angefärbt unter Verwendung von Schwefelsäure, wobei noch eine Bande bei Rf 0,38 nachgewiesen wurde. Diese Fraktion wurde gleichfalls abgekratzt und in gleicher Weise wie vorständig angegeben extrahiert, wobei ungefähr 1 mg feste Substanz erhalten wurde.
Diese Produkte hatten die folgenden Spektren. Daraus wurden sie identifiziert als die Substanz mit Rf 0,23 = la,3ß, 24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, das Produkt mit Rf von 0,33 als la,3ß,24-Trihydroxycholesta-4,6-dien und das Produkt mit Rf 0,38 als la,24-Dihydroxycholesterin.
1. Produkt mit Rf = 0,23 ( 1 a,3fi,24-Trihydroxycholesta--5,7-dien
UV-Spektrum: vgl. Fig. 2), X (nm) = 262, 271,
(e = 11,000), 282 (e = 12,000), 294 (s = 7000). NMR-Spektrum: (in C3D60)
0,63 (3H, s, 18-CHS),
3,30 (1H, m, 24-H),
3,70 (1H, m, lß-H),
4,08 (1H, m, la-H),
5,30 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H),
5,60 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: (vgl. Fig. 3) = 416 (M+), 398, 380, 357,
251, 227,197, 157.
Schmelzpunkt: (°C) 102 bis 103°C.
2. Produkt mit Rf = 0,33 ( 1 a,3 ß,24-Trihy droxy choies ta--4,6-dien):
UV-Spektrum: X ^ano1 (nm) = 233, 240, 248. Massenspektrum: 416 (M+), 398, 380.
3. Produkt mit Rf — 0,38 (la,24-Dihydroxycholesterin):
Die Daten dieses Produktes stimmen überein mit einer Standardprobe vom gleichen Rf-Wert 0,38.
D-2) Trennung vermittels Säulenchromatographie:
Im Handel erhältliches Silicagel zur Verwendung in der Säulenchromatographie («C-200», Handelsmarke eines Produktes der Wako Jyunyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) wurden imprägniert mit ungefähr 2 Gew.-% Silbernitrat aus einer Lösung des letzteren und Wärmebehandlung bei 70°C während zwei Stunden. Das so erhaltene Silicagel wurde hernach in eine Glassäule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer
Länge von 30 cm eingefüllt. 40 mg des rohen Reaktionsgemisches, erhalten gemäss dem obigen Verfahren B), wurden auf die Säule aufgegeben, wonach eluiert wurde mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat. Es wurde unterteilt in 5 Fraktionen von je 20 ml. Diese Fraktionen wurden getrennt aufgrund einer dünnschichtchromatographischen Analyse und ihres UV-Spektrums.
Wenn ein Volumen Verhältnis Benzol zu Äthylacetat von 2 : 1 bis 1 : 1 eingehalten wurde, erhielt man 7,6 mg (Aus-10 beite 19%) eines Produktes entsprechend dem Rf-Wert 0,33 in D-l). Wenn dieses Verhältnis 1: 1 betrug, erhielt man 19,6 mg (49% Ausbeute) eines Produktes entsprechend dem Rf-Wert von 0,23.
Diese Produkte wurden identifiziert durch ihre verschiedenen Spektraldaten.
Vergleichsbeispiel 1 Dieses Beispiel beschreibt den Versuch zur Trennung von 20 la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien und la,3ß,24-Trihy-droxycholesta-4,6-dien mittels Siliciumdioxid, welches kein Silber in nicht-metallischer Form enthält (Vergleich im Hinblick auf den dritten Verfahrensschritt).
30 mg einer Mischung von la,3ß,24-Trihydroxycholesta-25 -5,7-dien und la,3ß,24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem molaren Verhältnis von 3 : 1, welche gemäss Beispiel 14 A) und B) hergestellt worden waren und gemäss Beispiel 14 C) identifiziert worden waren, wurden chromatographiert an einer Säule mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Länge von 30 30 cm unter Verwendung von Silicagel, mit dem Versuch, sie in ihre Bestandteile aufzutrennen.
Ein Lösungsmittelgemisch von Benzol und Äthylacetat wurde zur Entwicklung verwendet, wobei dessen Volumverhältnisse im Betrag von 10 : 1 bis 1 : 1 variierten. Unter-35 teilt wurde in Fraktionen mit einem Volumen von je 20 ml. Die Trennung wurde versucht unter Registrierung vermittels Dünnschichtchromatographie und UV-Spektrum. Wenn das Mischungsverhältnis Benzol zu Äthylacetat ungefähr 2 : 1 betrug, begann der Hauptanteil auszulaufen. Die Analyse aller 40 dabei erhaltenen Fraktionen mit dem UV-Spektrum zeigte, dass in allen diesen Fraktionen eine Absorption beobachtet werden konnte bei 283, 240, 248, 262, 271, 282 und 294 nm. Daraus ergab sich, dass unter Verwendung von Silicagel als Adsorbens das la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien nicht 45 getrennt werden konnte vom la,3ß,24-Trihydroxycholesta--4,6-dien. Weiterhin zeigte sich, dass kaum ein Unterschied bestand in der Zusammensetzung dieser Fraktionen sowie dass das molare Verhältnis von 5,7-Dien zu 4,6-Dien bei ungefähr 3 : 1 bestehen blieb. (Vergleiche das Vergleichsbeispiel 50 3 nachfolgend).
Vergleichsbeispiel 2 Dieses Beispiel beschreibt den Versuch zur Trennung von 55 la,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien und la,3ß,24-Triacet-oxycholesta-4,6-dien unter Verwendung von Silicagel, jedoch ohne Anwendung von Silber in nicht-metallischer Form (vergleiche dritter Verfahrensschritt).
Eine Mischung von la,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien 60 und la,3ß,24-Triacetoxycholesta-4,6-dien im molaren Verhältnis von 3 : 1, welche hergestellt worden war gemäss Beispiel 14 A) und identifiziert worden war gemäss Beispiel 14 C), wurde der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen, mit Verwendung der gleichen Platte wie in Bei-65 spiel 14 D-l) und einem mit Silicagel behandelten Träger (Entwicklerlösung 0,4% Methanol-Chloroform). Es ergab sich dabei nur ein im UV-Spektrum erkennbarer Fleck mit einem Rf von ungefähr 0,4.
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Diese Fraktion wurde isoliert und ergab eine ölige Substanz^ deren UV-Spektrum Absorptionen zeigte bei 233,240, 248,262,271,282 und 294 nm.
Daraus ergab sich, dass die Trennung von la,3ß,24-Tri-acetoxycholesta-5,7-dien aus la,3ß,24-Triacetoxycholesta--4,6-dien missriet, obgleich Silicagel verwendet wurde, welches Silber in nicht-metallischer Form adsorbiert enthielt (vergleiche das Vergleichsbeispiel 4).
10
Beispiel 15
Trennung von la,,3 ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und 1 a,3 $,24-(R)-Trihy droxy choies ta-4,6-dien (dritter Schritt)
1 a-Hydroxy-3 ß,24(R)-dibenzoyloxycholest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 4 B), wurden behandelt in gleicher Weise wie in Beispiel 5 A) zur Bildung von la-Acetoxy-3ß,24(R)-dibenzoyIoxycholest-5-en. Dieses Produkt wurde behandelt gemäss Beispiel 10 und ergab ein rohes Reaktionsgemisch, welches la-Acetoxy-3ß,24(R)-dibenzoyl-oxycholesta-5,7-dien enthielt Dieses rohe Gemisch wurde gemäss Beispiel 14 B) hydrolysiert und aufgearbeitet vermittels präparativer Dünnschichtchromatographie gemäss dem vorbeschriebenen Verfahrensweg D-l).
Dabei ergab sich, dass das Reaktionsgemisch als ein la, 3ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und la,3ß,24(R)-Tri-hydroxycholesta-4,6-dien im molaren Verhältnis von ungefähr 3 : 1 eindeutig getrennt werden konnte in diese beiden Bestandteile.
Das aus dem la,3ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien entsprechende Chromatographiefleck abgetrennte Produkt zeigte die folgenden Eigenschaften.
UV-Spektrum: X ™*ano1 (nm) = 262, 271, (e = 11,000),
282, (11,800), 294 (7,000).
NMR-Spektrum: (C3DgO)
3,25 (1H, m, C-24-H),
3,68 (1H, m, lß-H),
4,10 (1H, m, 3a-H),
5,30 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H),
5,60 (IH, d, J—6Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: 416 (M+), 398, 380, 357,251, 227,197,157. Schmelzpunkt: 96 - 99°C.
Beispiel 16
Trennung von 1 a,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und lcc,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien (dritter Schritt)
la-Hydroxy-3ß,24(S)-dibenzoyIoxychoIest-5-en, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 4 B), wurde gemäss dem Beispiel 5 A) behandelt und ergab la-Acetoxy-3ß,24(S)--dibenzoyloxycholest-5-en. Dieses Produkt wurde behandelt gemäss Beispiel 10 und ergab ein rohes Reaktionsgemisch, welches 1 a-Acetoxy-3 ß,24(S)-dibenzoylcho!esta-5,7-dien enthielt. Dieses Reaktionsgemisch wurde hydrolysiert gemäss Beispiel 14 B) und getrennt vermittels präparativer Dünn-schichtchromatographie gemäss dem vorbeschriebenen Verfahren D-l).
Dabei ergab sich, dass das rohe Reaktionsgemisch, welches la,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien und la,3ß,24-(S)-Trihydroxycholesta-4,6-dien im molaren Verhältnis von ungefähr 3 :1 enthielt, eindeutig in seine Bestandteile auf-trennbar war. Das dem Chromatographiefleck für la,3ß,24-(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien zuzuschreibende Produkt zeigte die folgenden Charakteristika.
UV-Spektrum: X £t*ano1 (nm) = 262,271 (10,800), 282 (11,500), 294 (6,900).
NMR-Spektrum: (in CaDcO)
3,27 (1H, m, C-24-H),
3,67 (1H, m, lß-H),
4,10 (1H, m, 3a-H),
5,30 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H),
5,60 (1H, d, J=6Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: 416 (M+), 398,380, 357,251,227, 197, 157.
Schmelzpunkt: 120 bis 124°C.
B) Erfindungsgemässe Verfahren
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Beispiel 17
Synthese von l<x,24-Dihydroxycholecalciferol (vierter Schritt)
16 mg la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 14 D-l), wurden aufgelöst in 500 ml Diäthyläther und diese Lösung wurde bestrahlt mit Ultraviolettlicht während 2% Minuten bei 5°C in einer Atmo-20 Sphäre von Argon unter Verwendung einer Hochdruck-Quecksilberdampflampe von 200 W Leistung («654A-36», Handelsmarke eines Produktes der Hanovia Company). Ein Teil der Lösung wurde herausgenommen u. ihr UV-Spektrum bestimmt. Es zeigte sich eine Steigerung der Absorption bei 25 262 bis 263 nm, welche dem la,24-Dihydroxy-prä-chole-calciferol zuzuschreiben ist Nachher wurde der Äther abgedampft bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck. Nun wurden 50 ml Benzol zum Rückstand hinzugegeben und die Isomerisation während zwei Stunden unter Sieden am 30 Rückfluss in Benzol durchgeführt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde das Benzol unter vermindertem Druck abgetrieben, wobei 16 mg einer weissen festen Substanz zurückblieben. Dieses Produkt wurde sorgfältig vermittels präparativer Dünnschichtchromatogra-35 phie getrennt unter Verwendung von Silicagel, welches ungefähr 1,5 % Silbernitrat adsorbiert enthielt gemäss der oben beschriebenen Arbeitsweise D-l) in Beispiel 14. Entwickelt wurde zweimal mit 6% Methanol-Chloroform. Es ergaben sich im Ultraviolettlicht drei verschiedene Banden. Aus der 40 am wenigsten polaren Bande wurden 2,8 mg einer weissen festen Substanz erhalten. Dieses Produkt zeigte die folgenden Eigenschaften und wurde daraus identifiziert als la,24-Di-hydroxycholecalciferol.
UV-Spektrum: (Fig. 4) X ^,ano1 (nm) = 265. 45 X ^ano1 (nm) = 228.
NMR-Spektrum: (C3D60):
0,57 (6H, d, 18-CH3),
0,87 (6H, d, J=7Hz, 26-und 27-CHa),
50 0,96 (3H, d, J=5Hz, 21-CH3),
3,19 (1H, m, 24-H),
4,15 (1H, m, lß-H),
4,36 (1H, m, 3a-H),
4,85 (1H, b, s, 19-H),
5,30 (1H, b, s, 19-H),
6,05 (1H, d, JAB = 11Hz, 6- oder 7-H),
6,26 (1H, d, JAB = 11Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: (Fig. 5) 416 (M+), 398, 380,269,251,134. Hochaufgelöstes Massenspektrum:
60 gefunden = 416,32768
berechnet: M+ (C27H4403) = 416,32927 Schmelzpunkt: 84 bis 85°C.
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Beispiel 18
Synthese von la.,24(R)-Dihydroxycholecalciferol (vierter Schritt)
10 mg la,3ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 15, wurden aufgelöst in 140 ml Diäthyläther und die erhaltene Lösung wurde mit Ultraviolettlicht während zwei Minuten bei 5°C bestrahlt. Ein Teil der Lösung wurde herausgenommen und ihr UV-Spek-trum bestimmt. Ein Anstieg der Absorption bei 262 bis 263 nm, die dem Präcursor zuzuschreiben ist, wurde beobachtet. Nach der Reaktion wurde der Äther bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck abgedampft. Nun wurden 50 ml Benzol zum Rückstand hinzugefügt und die Isomerisation in einer Atmosphäre vom Stickstoff während zwei Stunden unter Rückfluss vollendet.
Das Reaktionsgemisch wurde behandelt gemäss Beispiel 17 und aufgetrennt bzw. gereinigt vermittels präparativer Dünnschichtchromatographie. Aus der am wenigsten polaren Bande wurden 1,8 mg einer weissen festen Substanz isoliert. Dieses Produkt zeigte die folgenden Spektren und wurde daraus identifiziert als la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol.
UV-Spektrum: X ^ano1 (nm) = 265.
X ^ano1 (nm) = 228.
NMR-Spektrum: (C3DbO)
0,59 (3H, s, 18-CHS),
0,87 (6H, d, J=7Hz, 26- und 27-CH3),
3,20 (1H, m, 29-H),
4,14 (1H, m, lß-H),
4,42 (1H, m, 3a-H),
4,87 (1H, b, s, 19-H),
5,32 (1H, b, s, 19-H),
6,08 (1H, d, JAE = 11Hz, 6- oder 7-H),
6,30 (1H, d, JAB = 11Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: 416 (M+), 398, 380,269, 251.
Hochaufgelöstes Massenspektrum:
gefunden = 416,33084 berechnet (M) = 416,32927 (C2TH4403).
Beispiel 19
Synthese von la,24(S)-Dihydroxycholecalciferol (vierter Schritt)
15 mg la,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 16, wurden aufgelöst in 140 ml Diäthyläther und die erhaltene Lösung wurde zwei Minuten lang bei 5°C mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Dann wurde gemäss Beispiel 18 weiter gearbeitet, wobei 2,8 mg einer weissen festen Substanz erhalten wurden. Dieses Produkt zeigt die folgenden Spektren und wurde daraus identifiziert als la,24(S)-Dihydroxycholecalciferol.
UV-Spektrum: X £e*ano1 (nm) = 265.
X ^hano1 (nm) = 228.
NMR-Spektrum: (in CyDßO)
0,58 (3H, s, 18-CH3),
0,87 (6H, d, J=7Hz, 26- und 27-CH3),
3,20 (1H, m, 24-H),
4,14 (1H, m, lß-H),
4,42 (1H, m, 3a-H),
4,87 (1H, b,s, 19-H),
5,32 (1H, b, s, 19-H),
6,08 (1H, d, JAB = 11Hz, 6- oder 7-H),
6,30 (1H, d, JAB = 11Hz, 6- oder 7-H).
Massenspektrum: 416 (M+), 398, 380, 269,251,134.
Hochaufgelöstes Massenspektrum:
gefunden = 416,33095 berechnet (M+) = 416,32927 (C27H4403).
5 Beispiel 20
A) Synthese von la,3ß,24-Triacetoxycholest-5,7-dien aus 1 <x,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien
200 mg la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt io und aufgearbeitet gemäss Beispiel 14 D-l), wurden umgesetzt mit 2 ml Acetanhydrid und 5 ml Pyridin bei 95°C während drei Stunden.- Das Reaktionsgemisch wurde eingegeben in Eiswasser und extrahiert mit 40 ml Diäthyläther. Die ätherische Phase wurde gewaschen mit verdünnter Salzsäure, 15 hernach mit Alkali und schliesslich mit Wasser, worauf sie getrocknet wurde. Der Äther wurde abgetrieben und der _ Rückstand ergab das la,3ß,24-Triacetoxycholesta-5,7-dien als gelbliche ölige Substanz.
2Q B) Synthese von la,24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierter Schritt)
50 mg eines la,24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetats wurden aufgelöst in 500 ml Diäthyläther. Die erhaltene Lösung wurde bestrahlt mit ultraviolettem Licht in einer Atmo-2s Sphäre von Argon während 4 Minuten bei 5°C. Ein Teil dieser Lösung wurde entnommen und ihr UV-Spektrum bestimmt. Ein Anstieg der Absorption bei 262 bis 263 nm war dem Präcursor zuzuschreiben. Nach Vollendung der Reaktion wurde der Äther unter vermindertem Druck bei Zimmertempe-30 ratur abgetrieben. Nun wurden 100 ml Benzol zum Rückstand hinzugefügt und die Isomerisation ausgeführt während zwei Stunden in einer Atmosphäre von Argon unter Rückfluss des Benzols. Nach Vollendung der Reaktion wurde der Hauptanteil des Benzols unter vermindertem Druck abge-35 trieben, worauf der Rückstand versetzt wurde mit 2 ml 5%-igem Kaliumhydroxid in Methanol, 2 ml Methanol und 2 ml Benzol. Das Gemisch wurde einen Tag lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen zur Vollendung der Hydrolyse. Dann wurde das Reaktionsprodukt verdünnt mit Wasser und extra-40 hiert mit Äthylacetat. Die Äthylacetatphase wurde wiederholt gewaschen mit Wasser und schliesslich getrocknet. Dann wurde das Äthylacetat unter vermindertem Druck abgetrieben und hinterliess 35 mg einer hellgelben öligen Substanz. Diese Substanz wurde abgetrennt und gereinigt vermittels 45 präparativer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel, welches Silbernitrat adsorbiert enthielt, gemäss dem Beispiel 7. Aus der am wenigsten polaren Bande erhielt man 5,7 mg einer festen Substanz. Da die Spektren und die übrigen Eigenschaften dieser Substanz vollständig überein-50 stimmten mit den Daten von la,24-Dihydroxycholecalciferol, erhalten gemäss Beispiel 17, wurde das so hergestellte Produkt nach der Isomerisation identifiziert als la,24-Diacetoxy-cholecalciferoI-3-acetat.
Beispiel 21
A) Synthese von la,,3$,24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien aus l<x,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien
60 160 mg la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt und aufgearbeitet gemäss Beispiel 14 D-l), wurden umgesetzt mit 410 mg Benzoylchlorid und 15 ml Pyridin.
Das Reaktionsgemisch wurde verdünnt mit Wasser und extrahiert mit 40 ml Diäthyläther. Die ätherische Phase wur-65 de gewaschen mit verdünnter Salzsäure, dann mit Alkali und schliesslich mit Wasser, worauf getrocknet wurde. Der Äther wurde abgedampft und hinterliess das la,3ß,24-Tribenzoyl-oxycho!esta-5,7-dien als weisses amorphes Produkt.
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B) Synthese von la,24-Dibenzoyloxycholecalciferol-3ß-
-benzoat (vierter Schritt)
30 mg eines l#,3ß,24-Tribenzoyloxycholesta-5,7-diens wurden aufgelöst in 500 ml Benzol und die erhaltene Lösung wurde mit ultraviolettem Licht in einer Atmosphäre von Argon bei 10°C während zwei Minuten bestrahlt. Nach Durchführung dieser Reaktion wurde die Isomerisation während zwei Stunden in einer Argonatmosphäre unter Rückfluss in Benzol durchgeführt. Nach Durchführung dieser Reaktion wurde der Hauptteil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft, wonach zum Rückstand 2 ml 5 % ige Kaliumhydroxid-Methanollösung und 2 ml Benzol hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 28 Stunden lang in einer Atmosphäre von Argon aufbewahrt zur Durchführung der Hydrolyse. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Äthylacetat. Die Äthylacetatschicht wurde wiederholt gewaschen mit Wasser und schliesslich getrocknet. Nun wurde das Äthylacetat unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde dem gleichen Verfahren zur Trennung und Reinigung wie in Beispiel 20 unterworfen und ergab 1,9 mg la,24-Dihy-droxycholecalciferol, welches die gleichen Eigenschaften aufwies wie das gemäss Beispiel 29 erhaltene Produkt.
Hieraus ergibt sich, dass die Isomerisation zum la,24-Di-benzoyIcholecalciferoI-3-benzoat geführt hatte.
Beispiel 22
A) Synthese von 1 a-Hydroxy-3ß-24-dibenzoyloxycholesta-
-5,7-dien aus 1 a,3ß-24-Trihydroxycholesta-5,7-dien
250 mg la,3ß,24-Trihydroxycholesta-5,7-dien, hergestellt gemäss Beispiel 1'4 D-l), wurden gemischt mit 210 mg Benzoylchlorid und 5 ml Pyridin und das Gemisch wurde bei 23 °C einen Tag lang stehen gelassen. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde behandelt gemäs Beispiel 21 und ergab la-Hy-droxy-3ß,24-Dibenzoylcholesta-5,7-dien.
B) Synthese von la-Hydroxy-24-benzoyloxycholecalciferol-
-3 ß-benzoat (vierter Schritt)
20 mg la-Hydroxy-3ß,24-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien wurden aufgelöst in 500 ml Diäthyläther. Die Lösung wurde bestrahlt mit ultriaviolettem Licht, isomerisiert und hydrolysiert gemäss Beispiel 21 B) und ergab 1,9 mg la,24-Dihy-droxycholecalciferol, welches die gleichen Eigenschaften zeigte wie das gemäss Beispiel 20 erhaltene Produkt. Hieraus wurde bestätigt, dass das erhaltene Produkt la-Hydroxy-24--benzoylcholecaIciferol-3 ß-benzoat war.
Beispiel 23
Synthese von la,24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierter Schritt)
Das in Beispiel 15 erhaltene la,3ß,24(R)-Trihydroxy-choIesta-5,7-dien wurde acetyliert gemäss Beispiel 20 A) und ergab ein la,3 ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien. 25 mg dieses Produktes wurden gemäss Beispiel 20 B) behandelt, wobei jedoch die Ultraviolettbestrahlung während zwei Minuten durchgeführt wurde. Es ergaben sich auf diese Weise 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol. Daraus ist zu folgern, dass das nach der Isomerisation vorliegende Produkt la,24(R)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat war.
Beispiel 24
Synthese von I<x,24(R)-Dibenzoyloxycholecalciferol-3ß--benzoat (vierter Schritt)
s la,3ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wurde benzoy-liert in gleicher Weise wie in Beispiel 21 A), wobei la,3ß,24-(R)-Tribenzoyloxycholesta-5,7-dien erhalten wurde. Dieses Produkt wurde gemäss Beispiel 21 B) behandelt, wobei jedoch 30 mg verwendet wurden und die Bestrahlung mit ultravio-10 lettem Licht während zwei Minuten bei 12°C durchgeführt wurde. Man erhielt auf diese Weise 3,4 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(R)-DihydroxycholecalciferoI. Daraus ist zu schliessen, dass nach der Isomerisation la,24(R)-Dibenzoyloxychole-15 calciferol-3 ß-benzoat vorlag.
Beispiel 25
Synthese von la,-Hydroxy-24(R)-benzoyloxycholecalciferol-2o -3ß-benzoat (vierter Schritt)
la,3 ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7-dien wurden benz-oyliert in genau gleicher Weise wie in Beispiel 22 A) zur Bildung von 1 a-Hydroxy-3 ß,24(R)-dibenzoyloxychoIesta-5,7--dien.
25 10 mg dieses Produktes wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 22 B) behandelt und ergaben 1,2 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol.
Hieraus ist zu folgern, dass es sich beim Isomerisations-30 produkt um la-Hydroxy-24(R)-benzoyloxycholecalciferol-3ß--benzoat handelte.
Beispiel 26
Synthese von loc,24(S)-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat (vierter Schritt)
la,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, erhalten gemäss Beispiel 16, wurden gemäss Beispiel 20 A) acetyliert zur Bildung von la,3ß,24(S)-Triacetoxycholesta-5,7-dien. 20 mg 40 dieses Produktes wurden gemäss Beispiel 23 behandelt und ergaben 3,1 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(S)-Dihydroxychole-calciferol.
Auf diese Weise wurde bestätigt, dass das Isomerisations-45 produkt la,24(S)-DiacetoxycholecaIciferol-3ß-acetat war.
Beispiel 27
Synthese von la-Hydroxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol--3ß-benzoat (vierter Schritt)
la,3ß,24(S)-Trihydroxycholesta-5,7-dien, erhalten in Beispiel 16, wurden benzoyliert in genau gleicher Weise wie in Beispiel 22 A) und führten zum 1 a-Hydroxy-3ß,24(S)-di-benzoyloxycholesta-5,7-dien. 15 mg dieses Produktes wurden genau gemäss Beispiel 25 behandelt und ergaben 1,5 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(S)-Dihydroxycholecalciferol. Hieraus bestätigt sich, dass das Isomerisationsprodukt la-Hydroxy--24(S)-benzoyloxycholecalciferol-3 ß-benzoat war.
60
Beispiel 28
Synthese von loc-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalciferol--3 ß-benzoat (vierter Schritt)
65 la-Hydroxy-3ß,24(S)-dibenzoyloxycholesta-5,7-dien, erhalten gemäss Beispiel 27, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 26 acetyliert und ergaben la-Acetoxy-3ß,24(S)-di-benzoyloxycholesta-5,7-dien.
50
55
21
618669
15 mg dieses Produktes wurden gemäss Beispiel 26 behandelt, mit Ausnahme davon, dass die Bestrahlung mit ultraviolettem Licht bei 8°C während einer Minute durchgeführt wurde. Es ergaben sich 1,5 mg eines Produktes, dessen Eigenschaften übereinstimmten mit denjenigen von la,24(S)-Di-hydroxycholecalciferol. Hieraus bestätigt sich, dass das Iso-merisationsprodukt 1 a-Acetoxy-24(S)-benzoyloxycholecalci-ferol-3 ß-benzoat war.
Vergleichsbeispiel 3
Synthese von la,24-Dihydroxycholecalciferol aus la,3$,24--Dihydroxycholesta-5,7-dien, enthaltend la-3$,24-Trihy-droxycholesta-4,6-dien (Vergleich mit Bezug auf den vierten V erfahrensschritt)
10 mg eines Gemisches von la,3ß,24-Trihydroxycholesta--5,7-dien und la,3ß,24-Trihydroxycholesta-4,6-dien in einem molaren Verhältnis von ungefähr 3 : 1, erhalten gemäss dem Vergleichsbeispiel 1, wurden aufgelöst in 500 ml Diäthyläther und die Lösung wurde bestrahlt mit ultraviolettem Licht bei 5°C während zwei Minuten.
Nachher wurde der Diäthyläther sorgfältig abgedampft unter vermindertem Druck. Zum Rückstand wurden 50 ml Benzol hinzugefügt und die Isomerisation ausgeführt in einer Atmosphäre von Argon während zwei Stunden unter am Rückfluss siedendem Benzol. Anschliessend wurde das Benzol abgedampft und hinterliess 10 g eines braunen öligen Materials.
Das UV-Spektrum dieser Substanz war kompliziert. Insbesondere zeigte es keine spezifische Absorption von la,24--Dihydroxycholecalciferol, das ein Absorptionsmaximum bei 265 nm aufweist, so dass die Bildung von la,24-Dihydroxy-cholecalciferol nicht bestätigt werden konnte.
Dieser Schluss wurde erhärtet, indem man die vorgannte Substanz der präparativen Dünnschichtchromatographie unterwarf, wobei Silicagel mit daran adsorbiertem Silbernitrat verwendet wurde. Das erhaltene Chromatogramm wurde verglichen mit demjenigen einer Standardprobe von la,24-Dihy-droxycholecalciferol. Das Produkt zeigte keinen einzigen Flecken der übereinstimmte mit demjenigen der Standardprobe.
Daraus zeigt sich, dass, wenn die Reinheit von la,3 ß,24--Trihydroxycholesta-5,7-dien gering ist, sich überhaupt kein la,3ß,24-Trihydroxycholecalciferol bei der Isomerisation unter Anwendung von Ultraviolettstrahlung bildet.
Vergleichsbeispiel 4
Synthese von la,24-Diacetoxycholecalciferol-3ß-acetat aus la,3ß-24-Triacetoxycholesta-5,7-dien, enthaltend la,3ß,24--Triacetoxycholesta-4,6-dien (Vergleich zum vierten Schritt)
10 mg eines Gemisches, welches aus la,3ß,24-Triacetoxy-
cholesta-5,7-dien und la,3ß,24-Triacetoxy-4,6-dien in einem molaren Verhältnis von 3 : 1 bestand, erhalten gemäss dem
Vergleichsbeispiel 2, wurden aufgelöst in 500 ml Diäthyläther und die Lösung wurde bestrahlt mit ultraviolettem Licht bei
5°C während zwei Minuten. Das erhaltene Reaktionsgemisch verfärbte sich gelblichbraun. Nach der Reaktion wurde Di
äthyläther vorsichtig unter vermindertem Druck abgedampft.
Nun wurden 50 ml Benzol zum Rückstand hinzugefügt und die Isomerisation ausgeführt während zwei Stunden in einer
Atmosphäre von Argon unter Rückfluss im Benzol. Nach
Vollendung der Reaktion wurde der Hauptteil des Benzols unter vermindertem Druck abgedampft. Zum Rückstand wur den 1 ml 5% ige Kaliumhydroxidlösung in Methanol hinzuge fügt und das Gemisch bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang in einer Atmosphäre von Argon zur Vollendung der Hydro lyse stehen gelassen. Nachher wurde das Benzol abgedampft und das Ultriaviolett-Spektrum der Substanz bestimmt. Das Produkt wurde der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die Ergebnisse waren genau dieselben wie im Vergleichsbeispiel 3 und es konnte keine Bildung von la,24-Dihydroxycholecalciferol beobachtet werden.
Fördernde Wirkung von la,24-Dihydroxycholecalciferol (la,24-DHC.C) auf den intestinalen Calciumtransport a) Vergleich mit la-Hydroxycholecalciferol (la-HCC):
Männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von ungefähr 200 g wurden über Nacht fasten gelassen und hernach gefüttert mit 625 p Mol einer Lösung von je la,24-DHCC und la-HCC in Maisöl. Nach einer vorbestimmten Zeitperiode wurde eine Lösung von radioaktivem Calcium-chlorid (45Ca Cl2, 30 [iCi/ml) oral verabreicht. Die Radioaktivität im Blut wurde verfolgt während eines Zeitintervalls von 10 bis 60 Minuten. Der Maximalwert diente als Index für die intestinale Calciumabsorption.
Eine Gruppe von Kontrolltieren wurde in genau gleicher Weise mit Maisöl allein behandelt. Die Dosierung des Maisöls mit la,24-DHCC bzw. la-HCC und die verwendete Menge Maisöl lagen darart, dass 0,0125 ml pro 100 g Körpergewicht jeder Ratte verabfolgt wurden u. die Dosierung der wässrigen Lösung von radioaktivem Calciumchlorid (pH = 7,0) betrug 0,1 ml/100 g Körpergewicht jeder Ratte.
Der Radioaktivitätspegel wurde gemessen durch Eindringen von 0,2 ml Serum in ein Glasgefäss und Zugabe von 12 ml eines Scintillators, der aufgemischt wurde aus 1200 ml Toluol, 800 ml Äthylcellosolv, 8 g 2,5-Diphenyloxazol und 300 mg 2,2'-p-Phenylen-bis-(5-phenyloxazol). Die Radioaktivität wurde gemessen mittels eines Flüssigkeitsscintillations-zählers. Die Resultate sind in der Tabelle 1 enthalten.
TABELLE 1
Zeit nach der Ver- Radioaktivität im Serum (cpm) abreichung (Stunden) la,24-DHCC 2a-HCC
Vergleich
275
95
(4)*
275 ±
95
(4)
4
360
150
(4)
697 ±
221
(4)
8
996
80
(4)
1035 ±
150
(4)
12
924
130
(4)
643 dt
210
(4)
24
426
61
(4)
332 ±
28
(4)
* Die Zahlen in Klammern entsprechen der Anzahl Tiere in einer Testgruppe.
Die obigen Resultate zeigen,- dass la,24-DHCC nahezu gleiche Wirkung ausübt wie la-HCC im Hinblick auf die Förderung der intestinalen Calciumabsorption.
b) Vergleich zwischen la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC:
Männliche Wistar-Ratten wurden über Nacht fasten gelassen und hernach gefüttert mit 625 p Mol einer Lösung von la,24(R)-DHCC bzw. la,24(S)-DHCC in Maisöl. Acht Stunden nach der Fütterung wurden die Ratten getötet und die intestinale Calciumabsorption wurde bestimmt nach der Methode des nach aussen gestülpten Gedärminneren (Martin, D.L. und H.F. DeLuca, American Journal of Physiology, 216,1351 [1969]). Die Resultate sind in der Tabelle 2 dargestellt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
618669
22
TABELLE 2
«Ca (S/M)
Zusammensetzung des Versuchsmediums: NaCl 125 mM
Vergleich
1,29 ±
0,16 (4)*
5
Tris-Cl-Puffer
30
mM (pH 7,4)
la,24(R)-DHCC
5,86 ±
1,98 (4)
CaCl2
0,25
mM
la,24(S)-DHCC
2,68 ±
0,80 (4)
45CaCl2
10
10
p,Ci/l
* Die Zahlen in Klammern entsprechen der Anzahl Tiere in einer Testgruppe.
Die experimentellen Bedingungen waren die folgenden: Verwendeter Eingeweidetrakt: Duodenum, 7 cm Menge des in das nach aussengestülpte Duodenum gegossenen Versuchsmediums: 0,7 ml
Inkubationsbedingungen: 37°C, 90 Minuten unter Durchleiten eines Gasgemisches aus 95 % 02 und 5 % C02.
Menge der für die Radioaktivitätsmessung gebrauchten Flüssigkeit: 0,1 ml.
is Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie in a) oben angeführt.
Die Resultate der Tabelle zeigen, dass ein la,24(R)-DHCC eine grössere Förderung der intestinalen Calciumabsorption bewirkt als la,24(S)-DHCC.
20
Vergleich von la-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC mit Bezug auf die Förderung der intestinalen Calciumabsorption
Die experimentellen Bedingungen waren genau dieselben 25 wie in Beispiel 29 B). Die dabei erhaltenen Resultate sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
TABELLE 3
Dosis
125 pMol
625 pMol
3,125 pMol
Vergleich
3,31
± 0,12 (15)*
la-HCC
3,59 ± 0,23
(4)
4,10
± 0,27 (4)
5,10 ± 0,27 (4)
.la,24-DHCC
4,12 ± 0,25
(4)
4,84
± 0,32 (4)
5,47 ± 0,33 (4)
la,24(S)-DHCC
3,97 ± 0,28
(4)
4,17
± 0,31 (4)
5,18 ± 0,20 (4)
1 a,24(R)-DHCC
4,42 ± 0,41
(4)
5,93
± 0,33 (4)
5,84 zt 0,39 (4)
* Die Zahlen in den Klammern bedeuten die Anzahl Tiere in jeder Versuchsgruppe.
Die Resultate der Tabelle 3 zeigen zur Bestätigung der experimentellen Ergebnisse des Beispiels 29. Mit anderen Worten: In bezug auf die intestinale Calciumabsorption zeigt la,24-DHCC mindestens die gleiche Wirksamkeit wie la-HCC und unter la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC und la,24-(S)-DHCC ist die Reihenfolge der fördernden Wirkung auf die intestinale Calciumabsorption folgende: la,24(R)-DHCC grösser als la,24-DHCC grösser als la,24(S)-DHCC.
Vergleich der Wirkung auf den Calciumeinbau in die Knochensubstanz zwischen la,24-DHCC und la-HCC
Männliche Wistar-Ratten, jede mit einem Körpergewicht von ungefähr 150 g, wurden subkutan behandelt mit einer wässrigen Lösung von 4sCaCl2 in einer Dosis von 50 [iCi pro Ratte und anschliessend 6 Wochen lang gehalten. Das so verabreichte 45Ca wurde schnell absorbiert und ein grösserer Anteil davon sammelte sich im Verlauf von mehreren Stunden in den Knochen an. Drei Wochen nachher wurde der 45Ca-Spiegel im Blut konstant und lediglich die Knochen befanden sich noch im besonderen markierten Zustand. Es wurde dies ermittelt vermittels einer makroautoradiographi-schen Analyse des gesamten Körpers. Nachdem die Ratten 6 Wochen lang gehalten worden waren, wurde ihnen oral fortlaufend einmal im Tag eine Lösung von 2,125 pMol von
50
55
60
23
618669
la-HCC bzw. la,24-DHCC verabfolgt. Von Zeit zu Zeit wurde den Ratten Blut entnommen und die Serumradioaktivitätsspiegel darin gemessen nach der in Beispiel 29 a) beschriebenen Methode. Ein Ansteigen des Serumradioaktivi-täts-Spiegels diente als Index für den Einbau in die Knochen. 5 Die Kontrolltiere wurden mit Maisöl ohne Zusätze behandelt. Die Anzahl an Ratten in jeder Testgruppe betrug vier. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Fig. 6 dargestellt. In dieser Figur bedeutet das Symbol * eine signifikante Differenz im Serumradioaktivitäts-Spiegel gegenüber dem Kontroll- io versuch.
Aus der Fig. 6 ist ersichtlich, dass mit la-HCC die Calciumabsorption im Knochen zwei Tage nach Versuchsbeginn signifikant anstieg und diese Tendenz mit zunehmender Zeit grösser wurde. Andererseits zeigte sich mit la,24-DHCC, 15 dass die Absorption im Knochen lediglich im Verlauf von vier Tagen signifikant anstieg, dass jedoch nachher der Grad der Zunahme weit geringer war als mit la-HCC (ungefähr y3 am 8. Tag). Daraus kann gefolgert werden, dass la,24-DHCC einen geringeren Effekt auf die Calciumabsorption im Knochen ausübt als dies bei la-HCC der Fall und dass somit seine Giftigkeit geringer ist.
Vergleich der Wirkung auf die Calciumabsorption im Knochen und auf die Körpergewichtsänderung zwischen la-HCC, la,24-DHCC, la,24(R)-DHCC und la,24(S)-DHCC
Es wurde ein ähnlicher Test wie vorstehend beschrieben, durchgeführt mit den oben genannten vier Verbindungen. In Abweichung von Beispiel 31 wurde das Experiment begonnen drei Wochen nach der Verabfolgung von 45CaCL. Sowohl die Serumradioaktivitäts-Spiegel als auch die totale Calciumkonzentration im Serum wurden gemessen. Zur Messung der Calciumkonzentration diente ein Calciumbestimmungsapparat (hergestellt durch Iatron Company). Die erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 4 und 5 zusammengestellt.
TABELLE 4 Serum-l5Ca-Spiegel
Serumradioaktivität (cpm) 0 5
Vergleich
699 ±
53,7
621 dz
48,6
597
± 33,9
608
49,3
la-HCC
690 ±
39,4
1056 ±
66,8
1184
zfc 51,1
904
57,1
la,24-DHCC
675 zfc
54,9
948 ±
64,6
700
dz 32,8
661
78,8
1 a ,24(R)-DHCC
648 dz
44,3
874 dz
30,4
778
zfc 26,9
681
63,7
la,24(S)-DHCC
780 dz
43,5
539 ±
45,2
520
dz 53,8
609
91,5
TABELLE 5 Serum-Ca-Spiegel
Zeit (Tage) Q g Serum-Ca (mg/dl) ^
Vergleich
11,4
dz 0,32
10,0 z!z
0,29
11,1 dz
0,22
10,6 dz
0,15
la-HCC
10,4
dz 0,21
14,1 dz
0,29
14,7 dz
0,33
13,8 dz
0,41
la,24-DHCC
11,7
dz 0,26
12,9 zfc
0,18
11,5 dz
0,23
12,1 dz
0,19
la,24(R)-DHCC
11,3
dz 0,35
12,6 zfc
0,23
13,3 dz
0,25
12,8 dz
0,35
la,24(S)-DHCC
11,2
± 0,16
11,5 dz
0,33
11,2 zfc
0,29
11,5 dz
0,24
Aus den Ergebnissen der Tabellen 4 und 5 ist zu ersehen, 55 dass die experimentellen Resultate des Beispiels 31 bestätigt wurden. Mit anderen Worten: la,24-DHCC bewirkt eine weit geringere Calciumabsorption im Knochen als la-HCC und in der Reihenfolge la,24(DHCC, la,24(S)-DHCC und la,24-(S)-DHCC gilt für die Absorptionswirkung im Knochen die 60 folgende Abstufung: la,24(R)-DHCC grösser la,24-DHCC grösser la,24(S)-DHCC.
Was dabei besonders bemerkenswert ist, dass mit la,24(S)-DHCC kaum eine Absorption im Knochen beobachtet werden kann und dass seine Wirkung nahezu gleich derjenigen 65 bei den Kontrolltieren ist. Demgemäss kann gefolgert werden, dass la,24(S)-DHCC spezifisch die intestinale Calciumabsorption fördert, was von ausserordentlicher Wichtigkeit für klinische Anwendungen ist.
618669 24
Änderungen im Körpergewicht, wie sie sich aus den beschriebenen Versuchen ergeben, sind in der Fig. 7 dargestellt. Es ist interessant festzustellen, dass la,24-DHCC eine geringere Körpergewichtsveränderung verursacht als la-HCC und insbesondere 1«,24(S)-DHCC, nur geringfügige Abweichun- 5 gen von den Resultaten der Kontrolltiere ergibt. Dies legt den Schluss nahe, dass ähnlich wie im Falle der Calciumabsorption im Knochen die Giftigkeit von la524-DHCC geringer ist als diejenige von la-HCC.
10
Vergleich der Giftigkeit zwischen la,,24-DHCC und la-HCC
Die Giftigkeit dieser beiden Substanzen wurde getestet nach einem an sich bekannten Verfahren. Die Resultate davon sind in der Tabelle 6 wiedergegeben.
TABELLE 6
Tierart
Geschlecht
LD50 (P-g/kg)
Methode der Verabreichung la-HCC
la,24-DHCC
Maus
$
S ?
per os intravenös
474 508
167 100
> 2500
33,000 - 3,300 3,300 - 1,000
Ratte per os
330 744
Aus den Resultaten der obigen Tabelle ist zu ersehen,
dass die Giftigkeit von la,24-DHCC lediglich V10 oder sogar weniger als diejenige von la-HCC beträgt. Dieses Ergebnis bestätigt die Resultate der Beispiele 31 und 32.
Aufgrund der Ergebnisse aus den vorstehenden Tests können die Eigenschaften von la,24-DHCC gegenübergestellt werden denjenigen von la-HCC gemäss der Tabelle 7. Darin sind die Aktivitätsdaten von la-HCC willkürliche 1 eingesetzt.
TABELLE 7
la,24-DHCC la-HCC
35'
Förderung der intestinalen
Calciumabsorption 1 1
Wirkung auf den Ca-Einbau
40 im Knochen weniger als V3 1
Akute Giftwirkung weniger als VI0 1
45 Es wurde gezeigt, dass la,24-DHCC, hergestellt gemäss der Erfindung, selektiv die intestinale Calciumabsorption fördert und nur eine schwache Calciumabsorption im Knochen bewirkt im Vergleich zu bekannten Analoga von aktiven Formen von Vitamin D3. Daraus wird gefolgert, dass es sich bei 50 dieser Substanz um ein sehr nützliches Pharmazeutikum handelt, das mit geringen Nebenwirkungen zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden kann, die von abnormalem Calciumstoffwechsel verursacht sind.
v
7 Blätter Zeichnungen

Claims (3)

618669
1
in einem inerten organischen Lösungsmittel ultravioletter Strahlung aussetzt und dann die dabei erhaltenen Produkte isomerisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von la, 24(S) und/oder la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol der Formel
HO
dadurch gekennzeichnet, dass man in einer erhaltenen la,24 (S)-und/oder la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol-Verbindung der Formel
OR'
R',0
worin R'„ R'j und R'3 von Carbonsäure abgeleitete Acylreste oder Äther-bildende Reste bedeuten, die schützenden Gruppen hydrolytisch oder reduktiv abspaltet.
2
PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von la,24(S)-Dihydroxy-cholecalciferol- und/oder la,24(R)-Dihydroxycholecalciferol-Verbindungen der Formel
OR
worin R1, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, von Carbonsäuren abgeleitete Acylreste oder Ätherbildende Reste bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man la,3ß,24(S)- und/oder la,3ß,24(R)-Trihydroxycholesta-5,7--diene der Formel
Or
R
3. Anwendung des Verfahrens gemäss Anspruch 1 zur Herstellung einer Verbindung der Formel (5), worin Ru R2 und R3 Wasserstoff bedeuten dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel (3), worin R„ R2 und R3 Wasserstoff bedeuten, eingesetzt wird, die hergestellt wurde durch Umsetzung eines la,24(S)-Dihydroxycholesterin-Derivats und/oder ein la,24(R)-Dihydroxycholesterin-Derivats, beide dargestellt durch die Formel
OR'
A
worin R'4, R'g, R'o gleich oder verschieden sind und von Carbonsäuren abgeleitete Acylreste oder Äther bildende Reste bedeuten, mit einem Bromierungsmittel in einem inerten organischen Lösungsmittel und Behandlung des erhaltenen Reaktionsgemisches mit einem Bromwasserstoff abspaltenden Agens, Abspaltung der Acylreste bzw. Ätherreste durch Hydrolyse oder Reduktion und Isolierung des reinen la,3ß,24--Trihydroxycholesta-5,7-diens aus dem rohen Reaktionsgemisch durch Chromatographie an einem Träger, der Silber in nicht metallischer Form adsorbiert enthält.
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