CH514650A - Procédé de préparation de dérivés de peptides insolubles dans l'eau - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    de dérivés de     peptides        insolubles    dans l'eau    La présente invention a pour objet un procédé de  préparation de dérivés insolubles dans l'eau de pep  tides contenant un ou plusieurs groupes de formule  -YH, dans laquelle -YH représente un groupe amino  primaire ou secondaire, suivant lequel on fixe le pep  tide, par des ponts à liaisons covalentes, à des poly  mères insolubles dans l'eau contenant au moins un  groupe amino primaire ou secondaire, en opérant en  milieu alcalin.  



  Dans la suite de cet exposé, l'expression  peptide   comprend les protéines contenant un ou plusieurs  groupes amino primaires au secondaires. (On sait que  les protéines sont des peptides à haut poids molécu  laires.)  Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce  que l'on utilise un halogénure de cyanogène comme  agent formateur des ponts.    On peut conduire la réaction dans un milieu faible  ment alcalin. On peut la conduire en présence d'eau,  ce qui est particulièrement important, et la température  est variable, par exemple comprise entre 0  et 50  C.  La réaction est basée sur la formation de ponts, avec  des liaisons de covalence entre le polymère et le pep  tide.

   Des recherches faites indiquent que les ponts  auraient la formule  
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    dans laquelle A est le résidu du polymère et B est  résidu du peptide et Z représente un groupe imino  (=NH) ou oxygène (=O). On attribue le fait que Z peut  aussi représenter un oxygène à ce que le groupe imino  puisse se convertir, dans certains cas, en oxygène par  hydrolyse concomitante.  



  On peut conduire la réaction en un ou plusieurs  stades, cependant en règle générale, en deux stades.  Habituellement, on conduit le premier de ces stades de  manière que le polymère contenant un au plusieurs  groupes amino primaires au secondaires sait mis. en  contact avec l'halogénure de cyanogène, ce dernier  étant présent sous forme de la substance pure ou d'une  solution de celui-ci. Comme halogénure de cyanogène,  on peut utiliser habituellement le composé     iodo-chloro-          ou    bromo- ou éventuellement un mélange de ceux-ci.  On peut conduire la réaction dans des     conditions    alca  lines, fournies par l'addition d'une substance appro  priée à réactivité alcaline, par exemple l'hydroxyde de  sodium.

   Les pH appropriés sont en premier lieu ceux  compris entre 8 et 13. On peut, par de simples essais  préalables., déterminer aisément le pH ou la gamme de  pH appropriés. On peut conduire la     réaction    à diffé  rentes températures, par exemple comprises entre 0 et  50  C. On peut conduire la réaction dans une solution  aqueuse, mais il y aura certaines pertes en halogénure  de     cyanogène    dues à ce qu'une partie de ce dernier est  consommée par hydrolyse. De la réaction résulte la  formation de dérivés réactifs du polymère que l'on  peut immédiatement, éventuellement après isolement,  faire réagir avec un peptide. Le dérivé réactif ainsi  formé peut aussi être conservé dans des conditions  appropriées et mis en réaction avec le     peptide    plus  tard.

   Avant sa liaison au peptide, le dérivé réactif peut  être purifié, par exemple par lavage, dans le case d'un  polymère insoluble dans l'eau. La structure du produit       intermédiaire    réactif n'a pas été déterminée avec préci  sion.  



  De préférence on conduit le deuxième stade du  procédé dans une solution faiblement     alcaline    à une      température qui peut être comprise par exemple entre  0 et 50  C. par exemple la température ordinaire. C'est  aussi un avantage que de pouvoir conduire ce stade  dans une solution aqueuse.    Un avantage essentiel atteint par le procédé selon  la présente invention est que les peptides sensibles.  contenant un ou plusieurs groupes -YH peuvent aussi  être liés à des polymères aminés insolubles dans l'eau,  sans que le peptide soit détruit ou ne subisse une     autre     modification désavantageuse. Il est possible de lier des  peptides sensibles sans que les liaisons peptidiques  soient détruites.

   Ainsi, il est possible par exemple de  lier des enzymes à de tels polymères sans perte essen  tielle de l'activité enzymatique et de lier un anticorps  au polymère sans perte de la possibilité de l'anticorps  de fixer son antigène. On peut donc dire que le  procédé selon l'invention représente une méthode éton  namment douce et simple de lier les peptides à des  polymères du type indiqué plus haut.  



  Le polymère aminé insoluble dans l'eau peut être  un polysaccharide insoluble dans l'eau, substitué par  des groupes amino primaires ou secondaires. Comme  exemple d'un dérivé insoluble dans l'eau de polysac  charide, on peut citer le dextran réticulé et substitué  par un ou plusieurs groupes     p-aminophénoxy-hydroxy-          propyles.     



  Le poids moléculaire moyen du polymère choisi,  contenant un ou plusieurs groupes amino primaires ou  secondaires peut varier dans de très larges limites.  Cependant, de préférence, il dépasse 1000, et est par  exemple de plus de 10 000.  



  Le polymère peut aussi être insoluble, mais gon  flable dans l'eau. Ainsi, il peut consister en un réseau  réticulé tridimensionnel contenant des groupes amino,  primaires ou secondaires. Ces     copolymères    présentent  une activité variable d'absorption d'eau. Comme     copo-          lymères    on peut aussi citer ceux qui sont substitués par  des groupes p-aminophénoxyhydroxypropyliques.  



  Comme peptides contenant un ou plusieurs groupes  amino primaires ou secondaires, que l'on va soumettre  à la réaction de liaison avec le dérivé réactif, on peut  citer les, protéines. Des exemples de ces biopolymères  sont les enzymes, les anticorps, les hormones     protéini-          ques    et/ou peptidiques ou les protéines antigéniques.  Les produits du procédé sont très intéressants. Une  enzyme qui a été liée à un produit     polymère    insoluble  selon l'invention peut ainsi être introduite dans un lit  et ce lit utilisé comme réactif pour des réactions chimi  ques. Sous ce rapport, une solution de substrat peut  être passée à travers le lit d'enzyme pour     convertir    ce  substrat en un produit utile.

   La réaction est automati  quement interrompue lorsque la solution quitte le lit.  On peut utiliser l'enzyme solide pendant longtemps  dans une opération continue.    Un autre exemple utile est les anticorps liés à des  polymères insolubles dans l'eau par le procédé selon la  présente invention. On peut lier de tels produits spéci  fiquement à l'antigène correspondant, par exemple  pour la détermination analytique de ce dernier.    <I>Exemple 1</I>  Liaison d'une -globuline  (gonadotropine antichorionique) à un  copolymère amino-substitué  (p-aminophénoxyhydroxypropyléther)  de dextran avec l'épichlorhydrine.    A. Activation du p-aminophénoxyhydroxy  propyléther du copolymérisat.  



  On gonfle 100 mg de  p-aminophénoxyhydroxypropyléther  du dextran réticulé contenant environ 250   mole de  groupes amino par gramme aminopolymère dans 3 ml  d'eau. On dissout 50 mg de bromure de cyanogène  dans 3 ml d'eau et les additionne au gel en agitant; on  ajuste le pH à 8 et le maintient à cette valeur pendant  5 min par l'addition d'hydroxyde de sodium 0,5M.  Lorsque la réaction est terminée, on lave rapidement le  gel avec de l'eau froide et une solution de bicarbonate  de sodium 0,114, puis l'utilise immédiatement pour le  procédé de liaison.    B. Liaison avec la y -globuline  (gonadotropine antichorionique).    On obtient l'antisérum contre la gonadotropine  chorionique humaine à partir de lapins après injection  des hormones dans l'adjuvant de  Freund .

   On préci  pite les immunoglobulines par l'addition d'un demi  volume de solution saturée de sulfate d'ammonium à la  température ordinaire, puis on répète deux fois cette  opération. Le dernier précipité obtenu est dissous puis  dialysé contre une solution de bicarbonate de sodium       0,1m.     



  On fait réagir 0,5 ml de solution de gonadotropine  antichorionique correspondant à 0,5 ml d'antisérum  avec le polymère activé pendant 5 h à 23  C. On lave  le produit avec une solution de bicarbonate de sodium  0,1M, une solution de chlorure de sodium 0,5M, de  l'eau, de l'acide chlorhydrique     10-4M    et de l'eau. Une  portion du produit est rétrécie et séchée pour l'analyse  et on trouve qu'elle contient environ 3,5 mg de pro  téine par gramme de polymère.  



  On utilise la majeure partie du produit pour la  détermination radioimmunologique de la     gonadotro-          pine    chorionique. Le produit présente d'excellentes  propriétés de liaison de la gonadotropine chorionique.    <I>Exemple 2</I>  Fixation de la chymotrypsine  à un polyacrylamide substitué  par des groupes amino aromatiques.    A. Activation du polymère par réaction  avec du bromure de cyanogène.

      Un polyacrylamide réticulé, substitué par des  groupes p-aminophényles, dont les caractères structu  raux principaux sont évidents d'après la formule sui  vante, a été utilisé.     (Enzacryl    9; un produit vendu par  The United     Kingdom        company        Koch-Light        Laborato-          ries        Ltd.,        Colmbrook,    Buckingham     Shire)       
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    Pour activer le polymère, on a ajouté à 100 mg de  ce dernier 4 ml d'une solution de bromure de cyano  gène contenant 25 mg de bromure de cyanogène par  ml d'eau, après quoi on a effectué le processus d'acti  vation à un pH de 9,

  0 pendant 6 min à la température  ordinaire. On a lavé le gel activé sur un filtre de verre  avec aspiration pendant 5 min avec une solution de  bicarbonate de sodium 0,1M.  



  B. Fixation sur la chymotrypsine.  



  On a suspendu le gel activé dans 2 ml d'une solu  tion de bicarbonate de sodium 0,1M et on a ajouté  25 mg de chymotrypsine. On a laissé la copulation  s'effectuer à 4  et sous lente agitation pendant 16 h.  



  On a lavé le produit obtenu à la température ordi  naire dans une petite colonne. Les solutions de lavage  ont été fournies à un débit de 8 ml/h grâce à une  pompe péristaltique. Les solutions de lavage suivantes  ont été utilisées dans l'ordre: solution de bicarbonate  de sodium 0,1M (24 h); acide chlorhydrique 10-3M  (1h); solution de chlorure de sodium 0,5M (24 h); eau  distillée (3 h); tampon à l'acétate de sodium 0,01M     die     pH 5,4 (1 h). Le produit peut être conservé sous forme  de suspension dans le tampon mentionné en dernier  lieu.  



  L'activité enzymatique de ce conjuguat a été déter  minée vis-à-vis d'une solution de 15 millimoles d'ester  éthylique de la N-acétyl-N-tyrosine dans un milieu  aqueux contenant 50/o d'éthanol. Ce substrat a été  hydrolysé à la vitesse de 3,5  moles par min par mg  de conjuguat séché. La teneur en protéines a été de  105 mg par g de conjugat séché. L'activité de l'enzyme  fixé a donc été d'environ 35 mmoles par min par mg.  



  L'activité de la chymotrypsine libre était de 180   moles par min par mg.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de dérivés insolubles dans l'eau de peptides contenant au moins un groupe amino primaire ou secondaire, suivant lequel an fixe le pep tide, par des ponts à liaisons covalentes, à des poly mères insolubles dans l'eau, contenant au moins un groupe amino primaire ou secondaire, en opérant en milieu alcalin, caractérisé en ce que l'on utilise un halogénure de cyanogène comme agent formateur des ponts. SOUS-REVENDICATIONS sous-revendication 1. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le polymère aminé insoluble dans l'eau est un dérivé de polysaccharide. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le polymère aminé insoluble dans l'eau est gon flable dans l'eau. 3.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le polymère aminé insoluble dans l'eau est un réseau réticulé tridimensionnel gonflable dans l'eau. 4. Procédé selon la revendication ou l'une des sous-revendications .précédentes, caractérisé en ce que le peptide est une protéine. 5. Procédé selon la 4, caracté- risé en ce que le peptide est un enzyme. 6. Procédé selon la sous-revendication 4, caracté risé en ce que le peptide est un anticorps. 7.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le peptide est un antigène.