CH650684A5 - Production d'anticorps proteiniques humains. - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1, à savoir un procédé pour la production d'anticorps protéiniques humains, ci-après désignés en raccourci par anticorps.
Des anticorps ont été préparés, de manière classique, par injection d'une protéine humaine dans un animal à sang chaud, suivie de la récolte des anticorps produits, à partir du sérum de cet animal.
Toutefois, ces procédés classiques sont difficiles à appliquer pour la production d'anticorps de grande pureté, à l'échelle industrielle, en raison des faits suivants :
1) le procédé nécessite habituellement une grande quantité de protéine humaine, qui agit comme un antigène pour la production d'anticorps;
2) l'injection de la protéine dans l'animal à sang chaud provoque souvent un choc anaphylactique, avec mort ultérieure;
3) on ne peut produire qu'une petite quantité d'anticorps, et cet anticorps est souvent souillé.
La publication FR-A N° 2319379 concerne un vaccin pour empêcher la gravidité et un procédé de préparation de ce vaccin. Ce vaccin est constitué d'un conjugué d'un support immunogène et d'une préparation de sous-unités ß de gonadostimuline chorionique humaine. Il y est indiqué d'utiliser le dextrane comme support. C'est pourtant l'unique saccharide qui est mentionné et il n'est présenté que comme équivalent de nombreusés autres substances qui ont le désavantage qu'elles ne conduisent pas à un fort accroisement d'im-munoglobulines G avec, simultanément, une réduction considérable des immunoglobulines E. Il faut noter en plus que c'est l'anatoxine tétanique qui est décrite comme support préféré. La publication rélève qu'il ne faut surtout pas utiliser la méthode d'incubation dans des cellules d'animaux à sang chaud.
L'invention a maintenant pour but d'éviter les inconvénients de l'art antérieur. Partant du procédé donné par la description générale non caractérisante de la revendication 1, l'invention a en particulier le but d'obtenir une grande quantité d'anticorps de pureté et de spécificité élevées.
Ce but est atteint, conformément à l'invention, par le procédé défini dans la partie caractérisante de la revendication 1.
La présente invention permet d'obtenir une grande quantité d'anticorps, 4 à 100 fois plus ou même davantage que par les procédés classiques, de pureté et de spécificité élevées, grâce à une plus forte induction de leur production dans les cellules d'animaux à sang chaud capables de les produire, par injection à ces animaux d'un produit conjugué saccharide/protéine humaine, obtenu par liaison de covalence entre cette protéine et un saccharide. L'anticorps résultant réagit de manière spécifique sur la protéine humaine. L'augmentation de la production d'anticorps serait due à la formation d'une grande quantité d'immunoglobulines G, tandis que la formation d'immunoglobulines E, responsable du choc anaphylactique, est très diminuée ou même supprimée; avantageusement disparaît le danger de choc anaphylactique ou de maladies allergiques chez l'animal.
Au cours de la présente description, on entend, par protéine humaine, une protéine ou substance protéinique humaine qui provient de certains fluides corporels ou tissus humains et qui agit comme un antigène lors de son injection chez un animal à sang chaud, en vue de la production d'anticorps. Entrent dans cette appellation des enzymes, hormones, lymphokines, immunoglobulines, sérum et composants du sang, tumeur maligne, urine, sueur, endomètre, placenta, fluide séminal, toutes substances qui sont habituellement purifiées avant leur fixation par covalence au saccharide, au moyen d'un ou de plusieurs modes opératoires dont filtration,
lavage, centrifugation, relargage, adsorption et désorption avec un adsorbant, filtration sur gel, Chromatographie par échange d'ions, Chromatographie par affinité et électrophorèse.
Le mot saccharide, tel qu'utilisé dans la présente description, comprend différents Polysaccharides comme amidon, amylose, dextrane, polysucrose ou Ficoll (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède), pullulane, elsinane, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme xanthane, cellulose, glucomannane, chitosane et hydrolysats partiels de ces différents Polysaccharides, ayant un poids moléculaire moyen compris entre 1000 et 10000000, de préférence de l'ordre de 10000 à 1000000. En particulier, l'utilisation d'elsinane, de pullulane non ioniques ou de leurs hydrolysats partiels constitués principalement de motifs maltotriose répétés aboutit avantageusement à une très forte augmentation de la formation d'immunoglobulines G, laquelle réagit de manière spécifique avec la protéine humaine, et soit à une remarquable réduction de l'immunoglobuline E responsable du choc anaphylactique, soit à sa suppression pratiquement totale, après la fixation par covalence sur la protéine humaine.
En ce qui concerne le procédé utilisé pour réaliser la liaison de covalence, on peut, conformément à l'invention, utiliser tout procédé dans la mesure où il entraîne la formation de liaisons de covalence entre la protéine humaine et le saccharide. Les procédés préférés sont les procédés par diazotation, peptidisation, alkylation, ré-ticulation et disulfuration.
Les groupements fonctionnels utilisables au cours du procédé par diazotation sont les groupements p-aminobenzyle, p-aminoben-zoyle, m-aminobenzyle, m-aminobenzoyle, m-aminoanisoyle, m-aminobenzyloxyméthyle, (p-aminophénoxy)-3 hydroxy-2 propio-nyle, (p-amino m-méthylanilino)-3 chloro-5 triazinyle, ainsi que d'autres groupements aminoaromatiques, et les dérivés de saccha-
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ride dotés de ces groupements selon un procédé classique réagissent facilement par copulation avec une protéine humaine pour former un produit conjugué saccharide/protéine humaine.
Les saccharides, utilisables pour le procédé par peptidisation,
sont des dérivés de carbonate, tels que azide d'acide, chlorure s d'acide, carbodiimide, isocyanate et imidoester, y compris lès saccharides activés par BrCN, qui agissent comme un saccharide activé lors de la réaction de conjugaison avec une protéine humaine.
Pour le procédé par alkylation, on peut utiliser comme saccharide des dérivés d'halogénure d'alkyle comme les dérivés de chloro- io bromo- ou d'iodoacétyle, ou des dérivés d'halogénure de triazinyle, qui réalisent au mieux la réaction d'alkylation avec une protéine humaine.
Les procédés par réticulation que l'on peut utiliser conformément à l'invention comprennent la formation de liaisons réticulées 15 entre une protéine humaine et un saccharide, en présence d'un agent de réticulation tel que glutaraldéhyde, glyoxal, succindialdéhyde, di-isocyanate d'hexaméthylène, diisocyanate de toluène-2,4, bisazoben-zidine ou N,N'-éthylène bismaléimide.
Les proportions préférées protéine humaine/saccharide sont 20 comprises entre 1:1000 et 1000:1, de préférence entre 1:100 et 100:1.
Les conditions de réaction pour la fixation par covalence sont les suivantes: température comprise entre 0 et 100° C; valeurs de pH de l'ordre de 3 à 12; durée de réaction de 5 min à 50 h.
Le produit conjugué saccharide/protéine humaine ainsi obtenu 25 peut être utilisé tel quel pour les stades ultérieurs, ou partiellement purifié, si nécessaire, par fractionnement par poids moléculaire, par filtration sur gel par exemple, préalablement à l'induction de la production d'anticorps.
En ce qui concerne les procédés pour l'induction de la produc- 30 tion d'anticorps dans les animaux à sang chaud, on peut utiliser tout procédé dans la mesure où cette induction s'y produit. Par exemple, une solution, émulsion ou suspension aqueuse du produit conjugué saccharide/protéine humaine est injectée par voie intraveineuse, in-trapéritonéale ou sous-cutanée dans un animal à sang chaud comme 35 poulet, pigeon, chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, rat nu, hamster, souris ou souris nue, qui est ensuite nourri pendant 3 d ou plus afin que s'y effectue l'induction de la production d'anticorps. L'injection peut être éventuellement répétée à intervalles de 3 à 30 d environ, afin d'augmenter encore l'induction. 40
Après cette plus forte induction de la production d'anticorps selon l'invention, des anticorps libérés dans le sérum de l'animal sont récoltés et purifiés selon un procédé classique.
On peut obtenir une préparation d'anticorps dotée d'une spécificité supérieure par culture in vitro ou in vivo de certaines cellules 45 d'hybridome obtenues par un procédé de fusion cellulaire, par exemple celui qui est reporté par Kohler et coll. dans «Nature», vol. 256, pp. 495-497 (1975) et dans «Eur. J. Immunol.», vol. 6, pp. 511-519 (1976), qui utilise des cellules spléniques provenant d'un animal qui a été soumis à l'induction de la production d'anticorps, et des 50 cellules de myélome d'espèce identique ou différente, clonant la lignée de cellules d'hybridome résultante, capable de produire l'anticorps, et récoltant ensuite l'anticorps à partir du produit de culture. Le procédé in vivo, en particulier, nécessite beaucoup moins — ou même pas du tout — de milieu nutritif contenant du sérum pour la 55 multiplication cellulaire que le procédé in vitro; il réalise un pouvoir de multiplication supérieur des cellules d'hybridome et une production supérieure d'anticorps.
Dans le cas du procédé in vivo>T les cellules d'hybridome sont multipliées par implantation dans un animal à sang chaud de la même 60 espèce que celle qui a été utilisée pour Finduction de la production d'anticorps, ou bien on les laisse se multiplier dans une chambre de diffusion dans laquelle leur est fourni le fluide corporel nutritif, par exemple ascite et/ou sang, puis on recueille les anticorps résultants à partir de ce fluide corporel, ou bien les cellules d'hybridome multi- 65 pliées sont alors soumises à une cultore in vitro de faible durée, dans un milieu exempt de sérum, pendant 1 à 5 d, suivie de la récolte des anticorps résultants à partir du milieu de culture.
Les anticorps ainsi obtenus peuvent être recueillis facilement par des modes de purification et de séparation classiques, comme relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et/ou lyophilisation. Lorsqu'on souhaite disposer d'un anticorps encore plus pur, on peut obtenir une préparation de pureté supérieure par combinaison des modes opératoires mentionnés plus haut avec d'autres modes opératoires classiques, comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité et/ou électrophorèse.
La préparation d'anticorps, obtenue conformément à l'invention, peut être avantageusement utilisée pour une administration de diagnostic, prophylactique ou thérapeutique, en vue de la prévention et du traitement des maladies humaines, aussi bien que lors d'une Chromatographie par affinité utilisant, comme ligand, un anticorps immobilisé.
Tout au long de la présente description, les anticorps qui réagissent de manière spécifique avec la protéine humaine sont dosés par les procédés suivants : pour l'immunoglobuline G, il s'agit de la réaction d'hémoagglutination passive (HAP) décrite dans «Japan J. Med. Sci. Biol.», vol. 28, p. 127 (1975) et, pour l'immunoglobuline E, de la réaction d'anaphylaxie cutanée passive (ACP) décrite dans «Life Science», vol. 8, p. 813 (1969).
Plusieurs formes de réalisation non limitatives de l'invention sont décrites dans les exemples ci-après.
Exemple 1
Anticorps humain à base d'interféron
A. Préparation d'interféron humain
L'interféron humain, utilisé dans cet exemple, est obtenu conformément au procédé décrit dans le brevet US N° 4276282.
Après injection préalable à des hamsters nouveau-nés, afin de réduire leurs immunoréactions possibles, d'antisérum préparé à partir de lapin selon un procédé classique, on implante dans ces animaux par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains, BALL-1, puis on les nourrit de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes,
formées sous la peau et pesant environ 30 g chacune, sont extraites et désagrégées par hachage et mise en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine.
Après mise en suspension des cellules soumises à l'action de la trypsine dans du milieu RPMI additionné de 10% en volume/vo-lume de sérum fœtal de veau pour aboutir à une concentration de 107 cellules/ml, on ensemence cette suspension cellulaire avec un in-terféron de lymphoblastoïde humain, 100 Ul/ml de milieu, et on y ajoute du virus de Sendaï, 500 titres d'hémoagglutination/ml de milieu, puis on laisse incuber pendant 20 h à 37° C pour produire l'interféron humain. Les cellules sont alors centrifugées et la partie surnageante est recueillie.
Après inactivation du virus de Sendaï résiduaire dans la partie surnageante par repos à pH 2, le produit résultant est adsorbé à pH 4 sur SP-Sephadex C-25 (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède), puis on élue à pH 8. Le produit d'êlution est soumis à une filtration sur gel avec Sephadex G-100, du même fabricant, pour donner une fraction contenant l'interféron humain. Cette fraction est lyophilisée et le produit résultant est dissous et appliqué sur SP-Sephadex C-25. Le produit d'êlution résultant, contenant l'interféron humain, est finalement dialysé et lyophilisé pour donner une préparation d'interféron ayant une activité spécifique d'environ 5 x 107 Ul/mg de protéine. Le rendement en interféron est de l'ordre de 0,8 mg par animal.
B. Préparation d'un produit de conjugaison pullulane/interféron humain
Une solution aqueuse préparée par dissolution de 5 g de pullulane de poids moléculaire moyen voisin de 140000, dans 400 ml d'eau, est ajustée à pH 10,7 avec NaOH IN, puis on y ajoute progressivement 3 g de BrCN tout en maintenant le pH à cette valeur et
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on laisse reposer pendant 1 h dans ces conditions pour que se produise la réaction d'activation par BrCN. Cette solution est ensuite ajustée à pH 5 avec HCl IN et est dialysée contre de l'eau froide au même pH pour obtenir une solution de pullulane activé par BrCN.
On ajoute à cette solution 50 mg d'interféron humain dans 50 ml 5 d'eau et le mélange résultant est soumis à une réaction de conjugaison dans les conditions ambiantes pendant 24 h. Le produit résultant est précipité avec 3 fois son volume d'acétone et le précipité est recueilli et dissous dans du tampon phosphate 0,01N (pH 7) et le tout est centrifugé pour éliminer les substances insolubles. La partie 10 surnageante est soumise successivement à une filtration sur gel, à une filtration minutieuse avec une membrane filtrante et à une concentration, afin de donner un produit de conjugaison pullulane/in-terféron humain. Le rendement est d'environ 70%, ramené à l'interféron humain utilisé. 15
C. Préparation d'un anticorps humain à hase d'interféron
Après préparation d'une solution isotonique de produit de conjugaison pullulane/interféron humain à l'aide de solution saline, on injecte par voie intraveineuse à des hamsters des portions de 0,2 ml 20 de cette solution, environ 30 mg; cette injection est renouvelée 7 d après et l'alimentation est poursuivie pendant 10 d supplémentaires, puis les animaux sont saignés. Les sangs sont réunis et centrifugés pour donner du sérum qui est ensuite précipité avec du sulfate d'ammonium. La fraction, obtenue à une saturation de 30 à 50%, est re- 25 cueillie et dialysée. Le produit résultant est purifié par Chromatographie par affinité, en utilisant de l'interféron humain immobilisé,
préparé par réaction de copulation d'interféron humain avec du gel de Sépharose activé par BrCN à température ambiante, pour obtenir une fraction contenant l'anticorps d'interféron antihumain. Cette 30 fraction est dialysée et lyophilisée pour donner l'anticorps humain à base d'interféron cherché.
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, sauf que l'on remplace le produit de conjugaison par de l'interféron humain intact. La préparation d'anticorps de cet exemple contient plus d'im- 35 munoglobuline G, environ 30 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et elle contient peu d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin. Cet anticorps peut être avantageusement utilisé pour la purification chromatographique par affinité dans la production à 40 l'échelle industrielle d'interféron humain hautement purifié, lorsqu'il est immobilisé sur un support.
Exemple 2
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Anticorps humain à base d'urokinase
A. Préparation d'urokinase humaine
Une Urokinase d'urine humaine fournie par Sigma Chemical Company, Saint Louis, Missouri, USA, est purifiée comme dans l'exemple 1A par adsorption et désorption au moyen de SP-Sepha- 50 dex C-25 et par filtration sur gel à l'aide de Sephadex G-100. La fraction contenant l'urokinase humaine est ensuite lyophilisée pour donner une préparation d'urokinase ayant une activité spécifique de l'ordre de 4 unités par milligramme de protéine.
55
B. Préparation d'un produit de conjugaison elsinane/urokinase humaine
Une solution aqueuse d'elsinane préparée par dissolution de 8 g d'elsinane de poids moléculaire proche de 800000, dans 200 ml d'eau chaude, suivie de refroidissement à la température ambiante, est ad- 60 ditionnée de 10% en poids/volume de chlorure de cyanuryle dans 40 ml de diméthylformamide. Ce mélange est ensuite soumis à une réaction d'activation à température ambiante pendant 2 h, le niveau du pH étant maintenu à 7 à l'aide de carbonate de sodium IN, et le produit résultant est dialysé à cette valeur de pH et à 4° C, contre de 65 l'eau, une nuit durant, pour donner une solution d'elsinane activé.
On ajoute à cette solution 30 mg d'urokinase humaine dans 40 ml d'eau et le mélange résultant est agité à pH 9 pendant 2 h, afin que s'effectue la réaction de conjugaison. Le produit résultant est purifié et concentré comme dans l'exemple 1B pour donner un produit de conjugaison elsinane/urokinase. Le rendement est de l'ordre de 60%, ramené à l'urokinase humaine utilisée.
C. Préparation d'un anticorps humain à base d'urokinase
On injecte par voie sous-cutanée à des rats des portions de 0,3 ml d'adjuvant total de Freund de produit de conjugaison elsinane/urokinase humaine, teneur en protéine environ 20 (ig, puis l'on traite comme dans l'exemple 1C pour obtenir leurs sérums. Les sérums sont réunis et soumis successivement à relargage, dialyse, purification chromatographique par affinité, dialyse et lyophilisation, pour obtenir l'anticorps humain à base d'urokinase voulu.
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que le produit de conjugaison est remplacé par une préparation d'urokinase humaine intacte.
La préparation d'anticorps obtenue conformément à l'invention contient plus d'immunoglobuline G, environ 16 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin. Cet anticorps peut être avantageusement utilisé comme ligand pour la purification chromatographique par affinité, au cours de la production à l'échelle industrielle d'une préparation d'urokinase humaine hautement purifiée, lorsqu'on l'immobilise sur un support.
Exemple 3
Anticorps humain à base de lymphocyte
A. Préparation d'une protéine de lymphoblastoïde humain
Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains, BALL-1, est multipliée dans du milieu de Eagle, additionné de 5 % en volume/volume de sérum humain, et les cellules humaines multipliées sont récoltées par centrifugation; on les soumet pendant 10 min aux ultrasons, 20 KHz, et les centrifuge à 5000 x g pendant 20 min. La partie surnageante résultante est alors précipitée avec du sulfate d'ammonium et la fraction obtenue à 25-80 % de saturation est recueillie, dialysée, concentrée et lyophilisée pour donner une protéine de lymphoblastoïde humain.
B. Préparation d'un produit de conjugaison hydrolysat partiel de pullulane!protéine de lymphoblastoïde humain
Une solution de pullulane préparée par dissolution de 5,2 g d'hy-drolysat partiel de pullulane de poids moléculaire moyen voisin de 10000, dans 110 ml de diméthylformamide, avec chauffage, suivi de refroidissement à la température ambiante, est additionnée de 10 ml de pyridine. On ajoute en outre, sous agitation, à cette solution de pullulane 1 g de chlorure de p-nitrobenzoyle et on laisse reposer 17 h à température ambiante. Puis le mélange réactionnel est additionné de 2 fois son volume de n-propanol et le précipité résultant est recueilli et dissous dans du diméthylformamide. Les opérations ci-dessus de précipitation et de dissolution sont répétées à 3 reprises. Le précipité obtenu finalement est dissous dans 100 ml de solution aqueuse de dithionite de sodium et y est mis à incuber à 80° C pendant 30 min. Le produit résultant est décoloré avec du charbon activé, puis précipité avec 2 fois son volume de n-propanol. Le précipité obtenu est dialysé contre de l'eau une nuit durant.
La solution aqueuse du précipité est refroidie au-dessous de 2° C et est additionnée de HCl pour donner une concentration voisine de 0,1N, puis on ajoute peu à peu 0,1 g de nitrite de sodium. Le mélange est alors soumis à une réaction de diazotation pendant 30 min. Le sel de diazonium résultant est dialysé contre de l'eau distillée pendant 2 h, au-dessous de 2: C, afin d'obtenir un dérivé de diazonium d'hydrolysat partiel de pullulane.
On ajoute à la solution 2 g de protéine de lymphoblastoïde humain dans 70 ml d'eau et le mélange résultant est ajusté à pH 8,5 par addition de solution de carbonate de sodium, puis on laisse pendant 2 h sous agitation, à 4 C, au même pH, pour que s'effectue
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la réaction de copulation. Le produit résultant est purifié et concentré comme dans l'exemple 1B pour donner un produit de conjugaison hydrolysat partiel de pullulane/protéine de lymphoblastoïde humain. Le rendement est de l'ordre de 40%, ramené à la protéine de lymphoblastoïde humain.
C. Préparation d'un anticorps humain à base de lymphocyte
On injecte par voie sous-cutanée à des souris des portions de 0,2 ml d'adjuvant total de Freund de produit de conjugaison hydrolysat partiel de pullulane/protéine de lymphoblastoïde humain, teneur en protéine environ 20 ng, puis l'on traite comme dans l'exemple 1C afin d'obtenir leurs sérums. Les sérums sont réunis et soumis successivement à relargage, dialyse, purification chromatographique par affinité, dialyse et lyophilisation, pour donner l'anticorps humain à base de lymphocyte cherché.
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que le produit de conjugaison est remplacé par une préparation de protéine de lymphoblastoïde humain intact.
L'anticorps obtenu conformément au mode opératoire de cet exemple contient plus d'immunoglobuline G, environ 24 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin.
Comme cet anticorps présente une immunoréaction comparable avec les lymphocytes humains provenant du sang périphérique aussi bien qu'avec la protéine de lymphoblastoïde humain, il peut être avantageusement utilisé comme immunosuppresseur lors de la transplantation d'organes humains ou de peaux.
Exemple 4
Anticorps humain à base de gonadotrophine chorionique
A. Préparation de gonadotrophine chorionique humaine (GCh)
La GCh utilisée dans cet exemple provient de Calbiochem Co.
Ltd. San Diego, Californie, USA, et son activité spécifique est de l'ordre de 11500 Ul/mg de protéine.
B. Préparation de produit conjugué elsinane/GCh
Une solution aqueuse d'elsinane préparée par dissolution de 10 g d'elsinane de poids moléculaire moyen de l'ordre de 200000, dans 200 ml d'eau distillée, avec chauffage, est refroidie à température ambiante, additionnée de 5 g d'hexaméthylènediamine, puis ajustée à pH 11 avec NaOH IN. On ajoute à ce mélange 5 g de BrCN et on le soumet à la réaction d'activation pendant 30 min tout en maintenant, à valeur constante, le niveau de pH et la température au-dessous de 20e C grâce à un bain d'eau glacée. Le mélange réaction-nel est dialysé contre de l'eau distillée à 4" C pendant 1 h, ce qui donne une solution d'elsinane activé.
On ajoute à cette solution 2 ml de solution aqueuse à 25 % en poids/volume de glutaraldéhyde et 10 mg de GCh pour aboutir à un volume total d'environ 20 ml, puis on y ajoute 10 ml de tampon acétate IM (pH 5). Ce mélange est soumis à la réaction de conjugaison à 4e C pendant 24 h, sous agitation, puis l'on suspend la réaction par addition de glycine jusqu'à une concentration finale voisine de 1M et on laisse reposer 24 h dans les conditions ambiantes. Puis on centrifuge le produit résultant, purifie et concentre la partie surnageante comme dans l'exemple 1B pour obtenir le produit conjugué elsinane/GCh. Le rendement est de l'ordre de 60%, rapporté à la GCh utilisée.
C. Préparation d'anticorps à base de GCh
On injecte par voie intraveineuse à des souris des portions de 0,2 ml de solution saline isotonique de produit conjugé elsinane/GCh, teneur en protéine voisine de 20 |ig, puis on les traite comme dans l'exemple 1C pour obtenir leurs sérums. Les sérums sont ensuite réunis et soumis successivement à relargage, dialyse, purification chromatographique par affinité, dialyse et lyophilisation,
pour obtenir l'anticorps à base de GCh cherché. L'anticorps témoin est obtenu comme décrit plus haut, à ceci près que l'on remplace le produit conjugué par une préparation de GCh intacte.
La préparation d'anticorps obtenue dans cet exemple contient plus d'immunoglobuline G, environ 20 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin.
L'anticorps préparé dans cet exemple peut être avantageusement utilisé pour un essai clinique de gonadotrophine chorionique de l'urine humaine.
Exemple 5
Anticorps humain à base d'interféron
A. Préparation d'interféron humain
L'interféron humain utilisé au cours de cet exemple est obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 A.
B. Préparation d'un produit conjugué dextrane/interféron humain
On prépare un produit conjugué dextrane/interféron comme dans l'exemple 1B, mais en remplaçant le pullulane de cet exemple par du dextrane de poids moléculaire moyen voisin de 70000. Le rendement est de l'ordre de 40%, rapporté à l'interféron humain utilisé.
C. Préparation d'anticorps humain à base d'interféron
On injecte à des souris une solution saline isotonique de produit conjugué dextrane/interféron, puis on traite leurs sérums de manière similaire à ce qui est décrit dans l'exemple 1C pour obtenir l'anticorps humain à base d'interféron cherché.
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, mais avec remplacement du produit conjugué par une préparation d'interféron humain intact.
L'anticorps obtenu dans le présent exemple contient plus d'immunoglobuline G, environ 12 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et peu d'immunogobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin.
L'anticorps peut être avantageusement utilisé comme ligand pour la purification chromatographique par affinité.
Exemple 6
Anticorps humain à base de lymphocyte
Après avoir fortement induit, comme dans l'exemple 3, la production d'anticorps humain à base de lymphocyte dans les cellules de souris capables de produire cet anticorps par injection d'un produit conjugué hydrolysat partiel de pullulane/protéine de lymphoblastoïde humain, on extrait les rates des animaux, les hache et les désagrège. On met ensemble en suspension dans un récipient renfermant une solution saline contenant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2P04 et 2 mM de CaCl2 les cellules spléniques et une lignée de myélomes MPC-11, ATCC CCL-167 de la souris, de manière à avoir pour chacune une concentration cellulaire voisine de 104 cellules/ml. Ensuite, ces cellules sont mélangées sous refroidissement à la glace avec une préparation fraîche de la même solution saline contenant du virus de Sendaï préalablement inactivé par irradiation aux UV, puis l'on transfère le tout dans un incubateur à 37° C environ, 5 min après le mélange, et on agite doucement pendant 30 min afin de réaliser la fusion cellulaire.
Des souris reçoivent une injection par voie intrapéritonéale des cellules d'hybridome résultant, à raison de 106 cellules/animal environ, puis sont nourries pendant 2 semaines, après quoi ces animaux sont sacrifiés et on recueille leurs fluides corporels, y compris sang et ascite. Le fluide corporel ainsi obtenu est purifié et lyophilisé comme dans l'exemple 3C, afin de donner l'anticorps humain à base de lymphocyte cherché.
5
io
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
650 684
6
L'anticorps témoin est obtenu comme indiqué plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait la rate n'ont pas reçu d'injection de produit conjugué, mais une injection de préparation de protéine de lymphoblastoïde humain intact.
L'anticorps préparé dans cet exemple contient plus d'immuno- 5 globuline G, jusqu'à environ 570 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et sans formation d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin.
10
Exemple 7
Anticorps à base de GCh
On induit fortement, comme dans l'exemple 4, la production •d'anticorps à base de GCh dans des cellules de souris capables d'en 15 produire par injection d'un produit conjugué elsinane/GCh, puis on extrait les rates des animaux, les hache et les désagrège. Les cellules spléniques sont fusionnées avec une lignée hybride de myélomes de la souris P3-X63-Ag8, provenant de Flow Laboratories Inc., Maryland, USA, par mise en suspension à 4° C dans un récipient conte- 20 nant du milieu essentiel minimal de Eagle, exempt de sérum pH 7,2, renfermant 50% en poids/volume de polyéthylèneglycol 1000, de manière à avoir des concentrations respectives d'environ 104 cellules/ml et l'on maintient ce milieu dans les mêmes conditions pendant 5 min avant de diluer 20 fois à l'aide d'une préparation fraîche du 25 même milieu.
Les cellules d'hybridome qui poussent dans un milieu de culture contenant hypoxanthine, aminoptérine et thymidine sont clonées à partir de ce milieu conformément au procédé décrit par Davison et coll. dans «Somatic Cell Genetics», vol. 2, pp. 175-176 (1976). 30
Les cellules d'hybridome clonées sont alors implantées par voie sous-cutanée chez des souris qui sont nourries comme dans l'exemple 6, puis sacrifiées pour recueillir leurs fluides corporels. Ces fluides corporels sont ensuite purifiés et lyophilisés comme dans l'exemple 4C pour donner l'anticorps à base de GCh cherché. 35
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait la rate ne reçoivent pas d'injection de produit conjugué, mais une injection de préparation de GCh intacte.
L'anticorps préparé conformément à cet exemple contient plus d'immunoglobuline G, jusqu'à environ 440 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et sans formation d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve dans l'anticorps témoin une grande quantité d'immunoglobuline E.
Exemple 8
Anticorps humain à base d'interféron
Après avoir fortement induit, comme dans l'exemple 5, la production d'anticorps humain à base d'interféron dans des cellules de souris capables d'en produire par injection d'un produit conjugué dextrane/interféron, on extrait les rates des animaux, les hache et les désagrège. Puis les cellules spléniques sont fusionnées comme dans l'exemple 7 avec une lignée de plasmacytomes de souris MOPC-31-C, ATCC CCL-130.
Les cellules d'hybridome résultant sont alors implantées par voie intrapéritonéale chez des souris, à raison d'environ 5 x 105 cellules par animal, et les animaux sont nourris pendant 2 semaines. Passé ce délai, les cellules d'hybridome multipliées sont récoltées à partir des ascites et mises en suspension dans du milieu essentiel minimal de Eagle (pH 7,2), préchauffé à 37° C, de manière à obtenir une concentration de 5 x 106 cellules/ml. Cette suspension est alors placée dans un incubateur à C02 contenant 5 % en volume/volume de C02, où la culture se déroule pendant 2 d. Le produit de cette culture est ensuite centrifugé et la partie surnageante est précipitée avec du sulfate d'ammonium. La fraction obtenue à 30-50 % de saturation est recueillie, dialysée et soigneusement filtrée à l'aide d'une membrane filtrante et le filtrat résultant est lyophilisé pour donner l'anticorps humain à base d'interféron cherché.
L'anticorps témoin est obtenu comme plus haut, à ceci près que les souris dont on extrait la rate ne reçoivent pas d'injection de produit conjugué, mais une injection d'une préparation d'interféron humain intact.
L'anticorps préparé conformément à cet exemple contient plus d'immunoglobuline G, jusqu'à environ 160 fois plus par animal, que l'anticorps témoin, et sans formation d'immunoglobuline E. Par contre, on trouve une grande quantité d'immunoglobuline E dans l'anticorps témoin.
R
Claims (8)
1. Procédé pour la production d'anticorps humains protéini-ques, qui consiste à induire celte production dans des cellules d'animaux à sang chaud, capables de produire ces anticorps, par injection de la protéine humaine, puis à récolter ces anticorps protéiniques humains résultants, caractérisé en ce que la protéine humaine injectée est un produit conjugué saccharide/protéine humaine, obtenu par liaison de covalence entre les deux constituants, et en ce que le saccharide employé est un Polysaccharide conduisant à une augmentation des immunoglobulines G et à une réduction considérable des immunoglobulines E.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le Polysaccharide est le pullulane, l'elsinane ou leurs hydrolysats partiels.
2
REVENDICATIONS
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le Polysaccharide est amidon, amylose, polysucrose, curdlane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, cellulose, glucomannane, chitosane ou leurs hydrolysats partiels.
4. Procédé selon une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le poids moléculaire moyen^lu saccharide est compris dans l'intervalle de 1000 à 10000000, de préférence de 10000 à 1000000.
5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine humaine est enzyme, hormone, lymphokine, Immunoglobuline, sérum, constituants du sang, tumeur maligne, urine, sueur, endomètre, placenta ou fluide séminal.
6. Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'anticorps protéinique humain est un anticorps à base d'interfé-ron humain, d'urokinase humaine, de lymphocyte humain ou de go-nadotrophine chorionique humaine.
7. Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les cellules d'animal à sang chaud capables de produire l'anticorps sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de myélomes de souris avec des cellules spléniques de souris provenant de l'animal dans lequel a été réalisée l'induction de la production d'anticorps.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la lignée de myélomes de souris est MPC-11, P3-X63-Ag8 ou MOPC-31-C.
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