Verfahren zur Züchtung von gegenüber Schistosomen hochpathogenen
Bakterien
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Züch tung von gegenüber Schistosomen hochpathogenen Bakterien.
Schistosomiase (Bilharziasis) stellt eine Gruppe von
Erkrankungen dar, die durch Schistosomen verursacht werden, eine Gattung von parasitischen Würmern der Familie Schistosomatidae, die zu der Klasse Trematoda gehört. Diese kleinen wurmartigen Organismen leben in den Adern verschiedener innerer Organe des infizierten Menschen oder Tieres. Die Krankheit ist epidemiologisch, was auf das Vorhandensein von reichlichem Oberflächenwasser zurückgeht, da Wasserschnecken als Zwischenwirte wirken und so die Infektion auf den Wirbeltier-Wirt übertragen. Die Krankheit ist in weiten Teilen der Welt verbreitet und vor allem in wichtigen Teilen von Südamerika, Afrika, dem Kontinent Ostasien, Japan und den Philippinen.
Schätzungsweise leiden 200 Millionen Menschen an Schistosomiase und diese Zahl wächst. Der Grund dafür ist, dass in vielen Teilen der Welt ausgedehnte Bewässerungswerke gebaut werden, die für die Entwicklung des Zwischenwirts, der Schnecken, ideal sind. Solange die Schnecken von einem bestehenden Herd von menschlischer oder tierischer Schistosomiase infiziert werden, tragen solche Bewässerungswerke klarerweise im weiten Masse zu der Verbreitung der Krankheit bei.
Die Krankheit ist die Reaktion des Körpers auf das Zugegensein von in grossen Mengen vom weiblichen Wurm gelegten Eiern. Diese Eier durchdringen alle Gewebe und verursachen alle Arten lokaler Reaktionen. Zusätzlich hat das geschädigte Gewebe eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bakteriellen Infektionen.
Als Gegenmittel werden häufig von dreiwertigem Antimon abgeleitete Präparate zur Behandlung der Krankheit verwendet. Alle diese Derivate aber ergeben schwere Nebenwirkungen und müssen über eine recht grosse Zeitdauer hindurch durch Injektion verabreicht werden.
Der menschliche Patient muss für eine wirksame Behandlung in ein Krankenhaus gebracht werden, was in Gegenden, in denen Schistosomiase endemisch ist, oft unmöglich ist.
Kürzlich ist ein neues Präparat 1-(5-Nitro-2-thiazoly)-2imidazolinon) empfohlen worden. Dieses Präparat soll, wenn es oral während einer Zeitdauer von 7 bis 10 Tagen verabreicht wird, gute Resultate ergeben. Dieses Präparat jedoch ist - wie berichtet wird - ungeeignet für Massenverabreichung ohne genaue medizinische Überwachung.
Die Schistosomen halten sich in den Blutgefässen des infizierten Wirbeltieres auf. Nach allgemeiner Meinung sind die Schistosomen von Mikroorganismen, z. B. Bakterien, frei.
Nach der Erfahrung der Erfinder enthalten aus experimentell infizierten Mäusen isolierte Schistosomen keine Bakterien. Andererseits wurde es als möglich festgestellt, auf im Blutstrom lebende Schistosomen bakteriologische Infektionen zu übertragen. Während manche Bakterien für kürzere oder längere Zeitdauer in Schistosomen zugegen sein können, ohne eine signifikante pathologische Einwirkung auf sie, gibt es andere, die sich heftig im Darmtrakt von sowohl weiblichen als auch männlichen Schistosomen vermehren können; eine solche Vermehrung kann solche Dimensionen annehmen, dass die Schistosomen rasch getötet werden. Das Zugegensein einer grossen Anzahl solcher Bakterien in toten oder kranken Schistosomen kann dann leicht durch mikroskopische Untersuchung oder durch Züchtungsverfahren demonstriert werden.
Zur Durchführung einer solchen Infektion von Schistosomen ist es notwendig, die infizierenden Bakterien in den Blutstrom des befallenen Wirbeltier-Wirtes einzuführen.
Dies kann am wirksamsten durch intravenöse Injektion geschehen. Es wurde festgestellt, dass wenige Stunden nach einer solchen Verabreichung die Bakterien in dem Darmkanal der Schistosomen festgestellt werden können.
Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Züchtung von gegenüber Schistosomen hoch pathogenen Bakterien vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem Nährboden Bakterien eines Stammes der Familie Enterobacteriaceae auf solche Weise gezüchtet werden, dass das Verhätlnis der zur Eliminierung von einem durch Schistosomen infizierten Wirbeltier-Wirt intravenös verabreichten Bakterien, welche einige Stunden nach der Verabreichung von den Schistosomen nicht aufgenommen worden sind, geringsten wirksamen intraperitonealen zur entsprechenden intravenösen Dosis erhöht wird.
Die besonders geeigneten Spzies und Stämme von Bakterien, die für diesen Zweck ausgewählt werden, haben eine hohe Pathogenität hinsichtlich der Infizierung von Schistosomen, aber eine niedrige System-Pathogenität gegenüber dem Wirt und stammen vorzugsweise aus den Familien Escherichia, Klebsiella, Salmonella oder Serratia.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Bakterien wenn sie einmal im Inneren der Schistosomen sind, gegen die Wirkung von in normalen klinischen Dosen verabreichten Antibiotika geschützt sind. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass die Verabreichung von Kanamycin, Chloramphenicol oder Oxytetracyclin in Dosen, die Blutspiegel weit oberhalb der minimalen hemmenden Konzentration für die betreffenden Bakterien erzeugen, überhaupt nicht auf die Vermehrung der Bakterien im Darmkanal der Schistosomen einwirken. Nichtsdestoweniger blieb die Empfindlichkeit der in den Schistosomen vorhandenen Bakterien gegenüber dem betreffenden Antibiotikum unverändert; von den Schistosomen gelöste Bakterien behielten ihre ursprüngliche Empfindlichkeit gegen über dem betreffenden Antibiotikum.
Die in die Schistosomen gelangten Bakterien beginnen sich zu vermehren und verursachen den Tod der Parasiten. Das Erfordernis der niedrigen Pathogenität für den Wirt bei intravenöser Verabreichung kann zum Beispiel im Falle der Maus festgestellt werden durch Vergleich der kleinsten wirksamen Dosis der Bakterien bei intravenöser Verabreichung mit der intraperitoneal verabreichten. Da es wesentlich ist, dass die verwendeten Bakterien zum
Eindringen in die Schistosomen gelangen, haben die auf eine andere Weise als die direkte intravenöse Verabreichung verabreichten Bakterien den natürlichen Abwehrmechanismus des Wirtes zu überwinden.
Leichtigkeit, mit solchen Abwehrreaktionen fertig zu werden, zeigt üblicherweise eine hohe Pathogenität, und ein erhöhtes Verhältnis von geringster wirksamer intraperitonealer zu intravenöser Dosis (i.pli.v.-Verhältnis) weist auf eine verhältnismässig niedrigere Pathogenität für den Wirt oder eine erhöhte Pathogenität gegenüber den Schistosomen hin.
Weiter wurde gefunden, dass ein Stamm mit einem hohen i.pyi.v.-Verhältnis bei der Maus ein ähnlich hohes Verhältnis beim Hamster hat. Infolgedessen scheint das i.pji.v.-Verhältnis bei einer Spezies von Tieren als verlässliches Indiz für die Eignung des ausgewählten Stammes für den beabsichtigten Zweck zu sein.
Die Wirksamkeit verschiedener für die Zwecke der Erfindung ausgewählter Stämme von Bakterien kann bezüglich der Pathogenität gegenüber den Schistosomen und Wirten in weitem Masse variieren. Es wurde gefunden, dass die Eigenschaften einiger Stämme in dieser Hinsicht durch Kultivieren unter leicht alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 8 und 9,5 verbessert werden können. Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden mit einem Stamm von Klebsiella durch Verwendung einer Nährbrühe (Difco), die auch 0,25 OIo Natriumsulfit (pH 8,2) oder 0,35 C!o des Dikaliumsalzes des sauren Phospats (pH 8,0) enthält.
Weitere Verbesserungen können erreicht werden durch Durchführen des Kultivierens bei einer Temperatur von 35 bis 40 "C während 24 bis 48 Stunden, gefolgt von einer Reifungsperiode bei Raumtemperatur (ungefähr 20 bis 25 "C). Durch Kultivieren dieser Bakterien unter den oben beschriebenen Bedingungen war es möglich, das i.pli.v.-Verhältnis auf 1000 oder darüber zu erhöhen.
Ein anderer Weg, auf dem man Bakterien mit einem hohen i.pji.v.-Verhältnis erhalten kann, besteht in der Behandlung mit einem Antiserum, das aus mit einem geeigneten Stamm von Bakterien der gleichen Art immunisierten Tieren gewonnen wurde, und getrennter Verarbeitung der agglutinierten und der nichtagglutinierten Teile der Kultur. Die Verbesserung des i.pli.v.-Verhältnisses hängt vom verwendeten Antiserum und den Züchtungsbedingungen ab. Die Verwendung der agglutinierten Teile ist dann vorteilhaft, wenn das der Kultur zugesetzte Antiserum mit einer Varietät des gezüchteten Stammes, die gegen Schistosomen sehr wirksam ist, erhalten wurde. Das Kulturmedium soll keine vergärbaren Kohlehydrate enthalten.
Wenn dem Medium vergärbare Kohlehydrate zugesetzt werden, kann es in der Tat nützlich sein, die nichtagglutinierten Bakterien zu verwenden. Die Anwendung eines andersartigen Antiserums verbessert das i.pli.v.-Ver- hältnis nicht.
Zur Auffindung eines geeigneten Elternstammes für die weitere Verbesserung durch Kultivieren, wie oben beschrieben, können alle bekannten Methoden der Selektion durch Cloning (selektive Zurückschneidung) oder andere Trennverfahren verwendet werden. Die gewählten Stämme von Bakterien können natürlich stabile Mutanten enthalten oder auch Mutanten, die durch Bestrahlung, z. B. mit Ultraviolett oder Röntgen-Strahlen, erzeugt sind.
Die bei dem Test mit einem geeigneten infizierten Test tier das Meiste versprechenden Mutanten können dann weiter zur Erhöhung ihres i.pli.v.-Verhältnisses kultiviert werden.
Es können auch Bakterien mit erwünschten Eigenschaften mit Hilfe der bekannten serologischen Verfahren ausgewählt werden.
Durch solche Verfahren erhaltene bevorzugte Stämme können dann bei verschiedenen infizierten Tieren getestet werden und weiter gemäss ihrer konsistenten niedrigen
Pathogenität gegenüber dem Wirt und Wirksamkeit zur Tötung der Schistosomen selektiert werden.
Die allerbesten Stämme können dann klinisch, d. h.
menschlichen Wirten, gegeben werden. Der resultierende
Stamm kann in irgendeinem geeigneten sterilen Verdün nungsmittel für die intravenöse Verabreichung verwendet werden. Die wirksame Dosis hängt von der Pathogenität der Bakterien gegenüber den Schistosomen ab und kann weniger als 5 x 10'log des Körpergewichts des Wirtes (= 5 x 105,kg) bis zu 4 x l041g Körpergewicht des Wirtes (= 4 x 107/kg ) betragen.
Manche Suspensionen lebender Bakterien können bei niedrigen Temperaturen (z. B. 4 "C) während Monate ohne signifikanten Verlust an Wirksamkeit aufbewahrt werden.
Es ist jedoch vorteilhafter, die Suspension mittels einer
Methode zu trocknen, die eine adäquate Lebensfähigkeit nach der Wiederherstellung einer Suspension ergibt. Ge friertrockenverfahren, die für diese Art Bakterien ge braucht werden, sind (wie gefunden wurde) auch hier brauchbar und zufriedenstellend und ergeben mindestens
60 /e Lebensfähigkeit nach Wiederherstellung einer Su spension.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die
Züchtung bei leichtalkalischen pH oder bei 35 - 40 "C durchgeführt, mit nachfolgender Reifung bei Raumtempe ratur. Das für diesen Zweck verwendete Verdünnungsmit tel kann eine injizierbare Lösung sein, wie z. B. eine Salz lösung, die sowohl für den Wirt als auch für die lebenden
Bakterien unschädlich ist.
Beispiel 1
Mäuse vom Stamm RQ des gleichen Geschlechts und gleichen Gewichts (ungefähr 20 Gramm) werden subkutan injiziert mit 80-100 Larven (Cercarien) von S. mansoni.
Die Cercarien sind die für Säugetiere infektiöse Phase des
Lebenscyclus der Schistosomen; sie werden von infizierten Schnecken ausgeschieden.
Nach einer Inkubationszeit von 6 Wochen beherbergen diese Mäuse 20 - 30 Paare männliche und weibliche
Schistosomen.
Eine bis drei Wochen später werden diese Mäuse für einen Test zur Bestimmung der Wirksamkeit der zu studierenden Bakteriensuspensionen verwendet. Wenn in den folgenden Beispielen von Maus die Rede ist, so ist darun ter eine wie oben angegeben infizierte Maus zu verstehen.
Die Bakteriensuspensionen werden intravenös injiziert.
Die Wirkung der Behandlung wird regelmässig nach einer Woche unter Töten der Tiere mit Chloroform festgestellt. Die Sektion wird durchgeführt; Ort und Befinden der Schistosomen wird bestimmt. Zur gleichen Zeit wird ein oo-Gram gemäss dem Verfahren durchgeführt, das von Pellegrino [Am. J. Trop. Med. and Hyg., (1962), 11, 2011 beschrieben ist.
Ein Stamm von Klebsiella pneumoniae E15 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Medium vom pH-Wert 7 und folgender Zusammensetzung pro Liter kultiviert:
Malzextrakt Paste (Trifax): 20 g; Hefeextrakt (Gi stex, KNGSF): 10 g; Maismaische-Feststoffe: 5 g.
Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. Die Anzahl der in dieser Suspension vorhandenen Bakterien wurde zu 4 x los pro ml festgestellt [Methode von Miles und Misra - J.
Hyg. (1938), 38, 732]. Es wurden Verdünnungen in Salzlösung von Verhältnissen 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 hergestellt, worauf 0,2 ml dieser Verdünnungen einschliesslich der unverdünnten Suspension intravenös einer Gruppe von je 6 Mäusen injiziert wurde. Nach einer Woche war die Zahl der Überlebenden 4, 6, 6, 6, 6 und 5 in jeder Gruppe. Die Prüfung ergab, dass alle überlebenden Tiere frei von Schistosomen waren, während alle nichtbehandelten Kontrolltiere entweder infiziert oder tot waren. Die mindestwirksame Heildosis in diesem Falle war also geringer als 8 x 104 Bakterien pro Maus.
Beispiel 2
Ein Stamm von Escherichia coli E2 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einem Flüssigkeitsmedium der folgenden Zusammensetzung bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 kultiviert:
Malzextrakt Paste (Trifax): 20 g pro Liter; He feextrakt (gistex, KNGSF): 10 g pro Liter; Mais maische Feststoffe: 5 g pro Liter.
Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. Diese Suspension enthielt 2,8 x 108 Bakterien pro ml. Es wurden Verdünnungen mit Salzlösungen von 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 hergestellt. Alle Verdünnungen und auch die unverdünnte Suspension wurden in einer Dosis von 0,2 ml intravenös Gruppen von fünf infizierten Mäusen injiziert. Nach sieben Tagen überlebten von diesen Gruppen 5, 4, 5, 5, 5 bzw. 5 Tiere. Alle Tiere mit Ausnahme der der Gruppe, die mit einer Verdünnung von 1:1000 injiziert worden waren, wurden als frei von lebenden Schistosomen befunden, während die 1:1000 Gruppe eine normale Infektion und ein normales oo-Gram zeigte.
Die kleinste wirksame Heildosis ist infolgedessen in disem Falle 2 x 10" Bakterien pro Maus.
Beispiel 3
Ein Stamm Salmonella paratyphi, Gruppe E, Nr.
4286/63 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einer Brain Heart Infusion Brühe (Difco) der Inkubation unterzogen. Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. (5,4 x 108 Bakterien pro ml). Sowohl die unverdünnten Suspensionen als auch Verdünnungen in Salzsäure von 1:10, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000 und 1:10 000 wurden mit je 0,2 ml intravenös Gruppen von fünf infizierten Mäusen injiziert. Von diesen Mäuse-Gruppen überlebten nach einer Woche 1, 2, 0, 2, 2 und 2 Tiere. Alle überlebenden Tiere waren frei von lebenden Schistosomen. Die Mindest-Heildosis betrug in diesem Falle also 104 Bakterien oder weniger pro Maus.
Beispiel 4
Sieben Gruppen von 5 infizierten Mäusen wurden durch intravenöse Injektion mit einem Stamm von Klebsiella pneumoniae E15 behandelt, der auf Endo-Agar (Difco) aufgestrichen und bei 37 "C während 24 Stunden, gefolgt von einer Reifung bei Raumtemperatur (20 bis 25 "C) kultiviert worden war. Das für die Injektion verwendete Präparat enthielt die geernteten Kolonien, suspendiert in Salzlösung bei einer Konzentration von 3 bis 7 x 108 Bakterien/ml.
Sechs Gruppen Mäuse wurden mit einer einzigen Dosis Kanamycin behandelt. Diese Dosis, 50 mg/kg, wurde entweder intraperitoneal oder intravenös verabreicht. Die intraperitoneale Behandlung wurde durchgeführt bei vier Gruppen zwei Stunden vor, eine Stunde vor bzw. eine Stunde nach der Injektion der Bakterien. Die intravenöse Verabreichung wurde bei zwei Gruppen eine Stunde vor bzw. eine Stunde nach der bakteriellen Injektion durchgeführt. Die siebente Gruppe erhielt keine Kanamycin-Behandlung und diente als Kontrolle. Nach 7 Tagen wurden alle Mäuse getötet und der Einfluss der Behandlung festgestellt.
Die Resultate sind folgende: Zeitpunkt der Kanamycin- Art der Wirkung der Verabreichung (Stunde Kanamycin- Bakterien-Injektion vor bzw. nach der Injek- Injektion auf Schistosome tion der Bakterien) -2 Stunden i.p. sporadisches Leben
Wurm-Paar oo-gram: hauptsächlich reife Eier -1 Stunde i.p. Schistosome in mesenterialen
Blutgefässen oo-gram:
Vorhandensein von reifen und unreifen Eiern -1 Stunde i.v. ebenso -0 Stunden i.p. ebenso +1 Stunde i.p. keine lebenden
Schistosome +1 Stunde i.v. ebenso keine Kanamycin Verabreichung ebenso Beispiel 5
Klebsiella pneumoniae E10 wurde während 24 Stun den bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einer Nährlö sung (Difco) der 0,25 % Natriumsulfit zugegeben war, kul tiviert.
Nach der Inkubierung wurde die Kultur während
48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, wonach sie zen trifugiert und in Salzlösung suspendiert wurde. Nach der
Methode, die in den Beispielen 1, 2 und 3 dargelegt ist, wurde die mindestwirksame Heildosis bestimmt, die die
Mäuse von allen Schistosomen befreite. Es wurde gefun den, dass diese Dosis 2 > < x 103 103 Bakterien pro Maus betrug.
Beispiel 6
Eine Kultur von Klebsiella pneumoniae E10 wurde auf
Agar (Blutagar Easis Nr. 2, Difco) derart aufgesät, dass nach der Inkubation getrennte Kolonien gebildet wurden.
Unter Verwendung des Replica-Verfahrens von Leder berg, (Lederberg und Lederberg, J. Bact. 63 (1952) 339) wurden Replica-Platten auf Agar-Medien unter ihnen
Endo-Agar (Difco) und McConkey-Agar (Difco) hergestellt.
Die Platten wurden bei 37 "C während 24 Stunden der
Inkubation unterworfen und dann bei 20-24 "C aufgeho ben. In regelmässigen Intervallen wurden die Platten inspi ziert und die entsprechenden Kolonien verglichen. Alle
Kolonien oder Teile von Kolonien mit einer abweichen den Morphologie wurden untersucht. Auf diese Weise wurde eine Kolonie mit einem blanken Aussehen isoliert und mit Nr. E1ORS bezeichnet.
Es wurden Kulturen von E10 und eines Unterstammes E1ORS in Nährbrühe (Difco) bei pH 6,6 und pH 8,9 hergestellt. Der hohe pH-Wert wurde erzeugt durch Zugeben von Dikaliumwasserstoffphosphat (saurem Dikaliumphosphat) (4 Liter) und Natriumhydroxyd eingestellt. Diese Kulturen wurden der Inkubation bei 37 "C während 24 Stunden unterworfen und dann dem Reifen bei 20-24 "C während 3 Tagen überlassen.
Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Bakterien aus dem Medium durch Zentrifugierung gewonnen, ein Mal in Salzlösung gewaschen und in Salzlösung mit einer Konzentration von 2,6 x 108 Bakterien pro ml suspendiert. Die genaue Zahl der lebenden Bakterien wurde nach der Methode von Miles und Misra festgestellt. Von diesen Suspensionen wurden die folgenden Verdünnungen in Salzlösung hergestellt: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 und 1/3000. Von diesen Verdünnungen wurden je 0,2 ml intravenös Gruppen von 5 Schistosomen infizierten Mäusen injiziert. Weiteren Gruppen von 5 Mäusen wurde intraperitoneal je 0,2 ml die unverdünnte Suspension und das gleiche Volumen von Verdünnungen 1:10 und 1:100 injiziert.
Sieben Tage nach der Injektion wurden alle Mäuse getötet und die Wirkung der Behandlung nach der Methode von Pellegrino festgestellt. Auf diese Weise wurde die Minimal-Wirksamkeits-Dosis (MED) jeder Bakterienkultur festgestellt je nach der Verabreichungsart.
Resultate
Nährbrühe MEDI) Stamm pH Reife in.2) i.p9 Verh.
i.pJi.v.
E10 6,6 - > 3 x lo6 3 x 107 < 10:1
6,6 + 1,2 x 108 1,2 x 107 10:1
8,9 - 2 x 105 2 x 107 100:1 EIORS 6,6 - 5x105 x 107 100:1
6,6 + 1,3 x 105 1,3 x 108 1000:1
8,9 - I x 104 3 x 107 > 3000:1 1) Die MED ist als Zahl der Bakterien pro Maus (20 g) gegeben.
2) > Die höchste gegebene Dosis war unwirksam.
Beispiel 7
Der Unterstamm EIORB, isoliert aus einer Kultur von K. peumoniae E10, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben auf Nährbrühe (Difco), die mit saurem Dikaliumphosphat auf pH 8,9 gebracht worden war, ausgesät.
Ein Teil der Kultur wurde bei 37 "C während 24 Stunden inkubiert. Ein anderer Teil wurde nach der Inkubation bei 37 "C bei Raumtemperatur während 3 Tagen gereift.
Beide Kulturen wurden zentrifugiert, gewaschen und in Salzlösung suspendiert zu 2,6-106 Bakterien pro ml.
Die Zahl der lebenden Bakterien jeder Suspension wurde nach der Methode von Miles und Misra festgestellt.
Von beiden Suspensionen wurden die folgenden Verdünnungen in der Salzlösung hergestellt: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 und 1/3000. Von diesen Verdünnungen wurden je 0,2 ml intravenös Gruppen von 5 mit Schistosomen infizierten Mäusen injiziert. Andere Gruppen von 5 Mäusen wurde intraperitoneal 0,2 ml der unverdünnten Suspension und das gleiche Volumen von Verdünnungen 1:10 und 1:100 injiziert.
Sieben Tage nach der Injektion wurden alle Mäuse getötet und die Wirkung der Behandlung unter Verwendung der Methode von Pellegrino festgestellt. Auf diese Weise wurde die mindestwirksame Dosis (MED) der zwei Kulturen für beide Arten der Verabreichung festgestellt.
Resultate MEDI)
Stamm Reifung i.V.2) i.p.3) Verhältnis i.pSi.v.
EIORB - 3,6 x 105 3,6 x 106 10:1 + < 1,2 > < x 104 104 > 1,2 x 107 1000:1 1)MED ist als Zahl der Bakterien pro Maus (20 g) gegeben.
2) Die geringste gegebene Dosis war noch wirksam.
3) Höchst gegebene Dosis war unwirksam.
Beispiel 8
Der Stamm Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infu sions-Brühe (Difco) 18 Stunden bei 37 "C gezüchtet und danach 3 Tage bei Raumtemperatur gereift. Zu gleichen Teilen dieser Kultur wurde je eines von 3 Antiseren zugesetzt. Ein Serum (S 182) wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit einem serologisch definierten und andersartigen Stamm (E 15) hergestellt. Die beiden anderen Antiseren wurden mit zwei Varianten des Stammes E10 hergestellt, von denen die erste bei Mäusen gegen Schistosomen hochwirksam war (Serum S 224), während die zweite nur eine sehr geringe Wirksamkeit gegen Schistosomen hatte (Serum S 228). Die agglutinierten und die nichtagglu tinierten Bakterien wurden gesammelt, in Salzlösung ge waschen, wieder in Salzlösung suspendiert und auf ihre
Aktivität bei Mäusen geprüft.
In einer zweiten Versuchsreihe wurde der Stamm E10 in Nährbrühe (Difco), die mit K2HPO4 (ca. 5 g/Liter) auf pH 8,9 gebracht worden war, gezüchtet. Diesem Nährmedium wurden 1 0/0 Glucose und 2 /0 Antiserum S 224 zugesetzt. Im Verlauf der Züchtung bei 37 "C während 18 Stunden wurde ein Teil der Bakterien agglutiniert. Die agglutinierten und nichtagglutinierten Bakterien wurden gesammelt, in Salzlösung gewaschen, wieder in Salzlösung suspendiert und auf ihre Aktivität geprüft.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Wirksamkeit des Stammes Klebsiella E10 bei Mäusen nach Behandlung mit Antiseren Medium Glucose Antiserum Bakte- MED i.pli.v.- (2 /o) rien aus i.p. i.v. Verhältnis BHI S 182 S 1,2 X 108 1,2 x 107 10
A 1,3 x 107 4 x 105 30 BHl S 5 224 S 5 x 107 5 x 105 100
A > 6 x 107 6 x 104 > 1000 BHI S 5 228 S 6 x 107 6 x 104 1000
A 2x106 2x107 0,1 NB 8,9 + S 224 S 1,2 x 107 4 x 104 300
A 1,2 x 107 1,2 x 105 100 Erkärung:
:
BHI = Brain Heart Infusions-Brühe (Difco)
NB 8,9 = Nährbrühe (Difco), auf pH 8,9 gebracht
S = Aus der überstehenden Flüssigkeit gesammelte Bakterien
A = Aus dem Agglutinat gesammelte Bakterien
MED = Mindestwirkungsdosis in Anzahl Bakterien pro Maus i.p. = intaperitoneal mit Bakterien infiziert iN. = intravenös mit Bakterien infiziert Beispiel 9
Der Stamm Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infusions-Brühe, der 2 % Kaninchenantiserum zugegeben war, kultiviert. Zwei Seren wurden verwendet. Ein Serum (S 224) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einer Suspension von Klebsiella E10, die sich als sehr aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen gezeigt hatte.
Das andere Serum (S 228) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einer Suspension von Klebsiella E10, die eine sehr geringe Aktivität gegenüber Schistosomen bei Mäusen gezeigt hatte.
In beiden Kulturen waren Teile der Bakterien während ihres Wachstums agglutiniert. Diese agglutinierten Bakterien wurden gesammelt, mit Salzwasser gewaschen und in Salzlösung suspendiert. Beide Suspensionen wurden bezüglich ihrer Aktivität gegenüber Schistosomen in Mäusen geprüft. In der folgenden Tabelle sind die Resultate dieses Versuches wiedergegeben.
Die Suspension E10-S 224, hergestellt mit Hilfe eines Antiserums eines aktiven El 0-Stammes, zeigte eine niedrigere MED und ein höheres i.p./i.v.-Verhältnis als die Suspension E10-S 228.
Stamm Verdünnung Bakterien Art Zahl der oo-gram .pJiN.- pro Maus der Mäuse bei Verhältnis
Injek- Ende/ tion Beginn E10- unverd. 6 x 107 i.v. 4/5 S224 1/10 6 x 106 i.v. 5/5 +++/+++/+++/+++/+++
1/100 6 x 105 i.v. 4/4 +++/+++/+++/+++ 1000 < 1
1/300 2 x 105 i.v. 5/5
1/1000 6 x 104 i.v. 4/5 +++/-/-/-
1/3000 2 x 104 i.V. 5/5 unverd. 6 x 107 i.p. 1/5 -
1/10 6 x 100 i.p. 5/5
1/100 6 x 105 i.p.
5/5 Stamm Verdünnung Bakterien Art Zahl der obgram i.pji.v pro Maus der Mäuse bei Verhältnis
Injek- Ende/ tion Beginn E10- unverd. 2 x 106 i.v. 4/5 +++/+++/+++/+++ S228 1/10 2 x 10' i.v. 4/5 +++/+++I+++I+++ 10 > 100 1/100 2 x 106 iN. 5/5 ¯/-
1/300 6 x 10' i.v. 5/5 -/-/-/-/
1/1000 2 x 105 i.v. 5/5 -/-/-/-/-
1/3000 6 x 104 i.v. 5/5 -/-/-/-/- unverd. 2 x 106 i.p. 3/5 ++/++/+++
1/10 2 x l07 i.p. 3/5 +++/+++/+++
1/100 2 x 106 i.p. 5/5 +++/+++/-/-/- oo-gram:
: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = niedriger Prozentsatz unreifer Eier festgestellt - = normales oo-gram iN. = Intravenöse Injektion (0,2 ml pro Maus) i.p. = Intraperitoneale Injektion (0,2 ml pro Maus) Beispiel 10
Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infusions-Brühe (Difco) während 18 Stunden bei 37 C kultiviert. Zu diesem Medium waren 2 0/0 Kaninchen-Antiserum zugefügt worden. Das Serum (S 204) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einem Stamm von Klebsiella E15. Dieser spezielle Stamm war nur mässig aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen bei intravenöser Injektion. Während des Wachstums in diesem Medium agglutinierte ein Teil der Bakterien und lag als schwere Absetzung im Züchtungsrohr vor.
Diese agglutinierten Bakterien wurden entfernt, die Bakterien in der überstehenden Flüssigkeit wurden gewonnen, gewaschen und in Salzlösung suspendiert. Diese Suspension E10-204 wurde bei den Versuchen mit Mäusen und Hamstern folgendermassen verwendet.
Eine zweite Kultur von Klebsiella E10 wurde hergestellt durch Aussäen in einer Nährbrühe (Difco) mit 1 0/0 Glucose mit saurem Dikaliumphosphat auf pH 8,9 gebracht. Die Kultur wurde bei 37 C während 18 Stunden der Inkubation überlassen. Zu dieser Kultur wurden 2 0/0 Kaninchen-Antiserum zugegeben. Dieses Serum (S 224) wurde hergestellt durch Immunisieren von Kaninchen mit einem speziellen Stamm von Klebsiella E10, der sich als sehr aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen bei intravenöser Injektion erwiesen hatte. Die schwere Ausfällung, die sich bei der Zufügung des Antiserums ergab, wurde entfernt. Die Bakterien in der überstehenden Flüssigkeit wurden gewonnen, in Salzlösung gewaschen und in Salzlösung suspendiert.
Diese Suspension E10-224 wurde mit der Suspension E10-204 bezüglich der Wirksamkeit bei mit Schistosomen infizierten Mäusen und Hamstern verglichen.
In der Tabelle list die Aktivität der beiden Stämme im Mäuse-Test wiedergegeben. Der Stamm E10-204 zeigte ein niedriges i.pJi.v.-Verhältnis, der Stamm E10-224 besass ein höheres i.pJi.v.-Verhältnis (3 bzw. 300). Beide Stämme wurden bei Hamstern getestet. In Tabelle 2 dieses Beispiels wird der Wurmbefall und das oo-Gram von unbehandelten Hamstern wiedergegeben. In Tabelle 3 und 4 dieses Beispiels wird die Wirksamkeit der beiden Stämme im Hamster-Test wiedergegeben. Der Stamm E10-204 zeigte wiederum ein niederes i.pJi.v.-Verhältnis (100:10 =
10), während der Stamm E10-224 ein sehr hohes Verhält nis (1000:1 = 1000) zeigte.
Tabelle 1
Aktivität der Stämme E10-224 und E10-204 in dem Mäuse-Test.
Stamm Verdünnung BaktJ i.vJi.p. Zahl der oo-gram i.pyi.v.-
Maus Art der Mäuse bei Verhältnis
Injektion Endet
Beginn E10- unverd. 1,2 x 106 i.v. 4/5 +++I+++I+++I+++ 224 1/10 i.v. 4/5
1/100 i.v. 4/5 +++1+++1+++1-
1/300 0,4 x 106 3/5 +++/+++/+++ 300:1 = 30
1/1000 i.v. 3/5 -/-/
1/3000 i.v. 5/5 unverd. 1,2 x 106 i.p. 4/5 +++/+++/+++/
1/10 1.p. 5/5 -/-/-/-/- i.p. 5/5 -/-/-/-/- Stamm Verdünnung Baktl i.vJi.p.
Zahl der oo-gram i.p./i.v.-
Maus Art der Mäuse bei verhältnis
Injektion Ende/
Beginn E10- unverd. 8 x 10' i.v. 3/5 +++/+++/+++ 204 1/10 i.v. 3/5 +++/+++/+++
1/100 i.v. 4/5 +++l++l++l+++
1/300 2,7 x 105 i.v. 4/5 +++/++/++/+++ 300:100 = 3
1/1000 i.v. 3/5
1/3000 i.v. 5/5 unverd. 8 x 10' i.p. 3/5 -/+++/+++
1/10 i.p. 3/5 +++/+++/+++
1/100 i.p. 3/5 -/++/++ oo-gram: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = geringer Prozentsatz unreifer Eier - = normal oo-gram i.v. = Intravenöse Injektion (0,2 ml pro Maus) i.p. = Intraperitoneala Injektion (0,2 ml pro Maus)
Tabelle 2
Unbehandelte Hamster (Kontroll-Gruppe, keine Todes fälle) Wurmbefall und oo-gram.
Wurmpaare in oo-gram v. porta vv mesent.
15 12 normal
15 15 normal
12 8 normal
14 10 normal
5 5 normal
Tabelle 3
Wirksamkeit des Stammes E10-224 im Hamster-Test Verdünnung Art der Baktd Wurmpaare in oo-gram Thera
Injektionen Hamster peutisches v. porta vv mesent. Resultat
1/10 Lc. 2,4 x 107 0 0 +++ +
1/100 i.c. 3(4 66) 0 ++
4(4 66) 0 - +
8(4 b6) 12
1/300 i.c. 1 5 0(266) 0 ++ +
15 10 1/1000 i.c. 0(2 66) 3(4 66) +++
4 6 - +
2 1 Unverd. i.p. 2,4 x lOS 0(6 66) 0
3(3 66) 0 +++ + 1/10 i.p. 15 5
15 10
15 10
1/100 i.p. 15 10
15 20 oo-gram:
: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = niedriger Prozentsatz unreifer Eier - = normales oo-gram i.c. = Intrakardiale Injektion (0,4 ml pro Hamster) i.p. = Intraperitoneale Injektion (0,4 ml pro Hamster)
Tabelle 4
Wirksamkeit des Stammes E10-204 im Hamster-Test.
Verdünnung Art der Bakt.l Wurmpaare in oo-gram Thera
Injektion Hamster peutisches v. porta vv mesent. Resultat 1110 i.c. 1,6 x 107 0 0 +++ +
0 0 1/100 i.c. O O
15 6 + +
10 12 1/300 i.c. 12 20 -
20 15 1/1000 i.c. 0 0 +++ unverd. i.p. 1,6 x 108 0 0 +++ + 1/10 i.p. 4 10
3(6 ÏÏ) 0 ++ +
4 10 1/100 i.p. 20 20 -
15 15 Beispiel 11
Albinomäuse vom Clarkes O.S.I. Stamm erhielten auf percutanem Wege ungefähr 150 Cercarien (Larven) von Schistosoma mansoni. Zwei Wochen später wurde das Vorhandensein von reifen Infektionen durch Entdeckung von lebenden Schistosomen-Eiern in den Ausscheidungen der Mäuse festgestellt.
Zu dieser Zeit wurde jeder Maus eine einzelne intravenöse Injektion einer Salzlösungssuspension von Serratia marcescens gegeben, die geschätzt 108 Bakterien/ml enthielt. Jede der 5 Mäuse erhielt geschätzt 3,2 x 10' Bakterien.
Diese Suspension wurde hergestellt durch Inkubierenlassen über Nacht einer gefriergetrockneten Probe von S, marcescens (Wellcome CN 1999) auf Nähragar bei 28 C hergestellt. Die Kultur wurde geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen, dann für die Verwendung in physiologischer Salzlösung verdünnt. Die Schätzungen der Zahl der Organismen in den Suspensionen wurde nach dem Durchscheintest durchgeführt.
Die drei überlebenden Mäuse wurden 9 Tage später getötet und untersucht. Man fand, dass 93,5 0/0 der Schistosomen getötet waren und in einem Zustand der Zersetzung in den intrahepatischen Gefässen vorlagen.