Verfahren zur Züchtung von gegenüber Schistosomen hochpathogenen
Bakterien
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Züch tung von gegenüber Schistosomen hochpathogenen Bakterien.
Schistosomiase (Bilharziasis) stellt eine Gruppe von
Erkrankungen dar, die durch Schistosomen verursacht werden, eine Gattung von parasitischen Würmern der Familie Schistosomatidae, die zu der Klasse Trematoda gehört. Diese kleinen wurmartigen Organismen leben in den Adern verschiedener innerer Organe des infizierten Menschen oder Tieres. Die Krankheit ist epidemiologisch, was auf das Vorhandensein von reichlichem Oberflächenwasser zurückgeht, da Wasserschnecken als Zwischenwirte wirken und so die Infektion auf den Wirbeltier-Wirt übertragen. Die Krankheit ist in weiten Teilen der Welt verbreitet und vor allem in wichtigen Teilen von Südamerika, Afrika, dem Kontinent Ostasien, Japan und den Philippinen.
Schätzungsweise leiden 200 Millionen Menschen an Schistosomiase und diese Zahl wächst. Der Grund dafür ist, dass in vielen Teilen der Welt ausgedehnte Bewässerungswerke gebaut werden, die für die Entwicklung des Zwischenwirts, der Schnecken, ideal sind. Solange die Schnecken von einem bestehenden Herd von menschlischer oder tierischer Schistosomiase infiziert werden, tragen solche Bewässerungswerke klarerweise im weiten Masse zu der Verbreitung der Krankheit bei.
Die Krankheit ist die Reaktion des Körpers auf das Zugegensein von in grossen Mengen vom weiblichen Wurm gelegten Eiern. Diese Eier durchdringen alle Gewebe und verursachen alle Arten lokaler Reaktionen. Zusätzlich hat das geschädigte Gewebe eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bakteriellen Infektionen.
Als Gegenmittel werden häufig von dreiwertigem Antimon abgeleitete Präparate zur Behandlung der Krankheit verwendet. Alle diese Derivate aber ergeben schwere Nebenwirkungen und müssen über eine recht grosse Zeitdauer hindurch durch Injektion verabreicht werden.
Der menschliche Patient muss für eine wirksame Behandlung in ein Krankenhaus gebracht werden, was in Gegenden, in denen Schistosomiase endemisch ist, oft unmöglich ist.
Kürzlich ist ein neues Präparat 1-(5-Nitro-2-thiazoly)-2imidazolinon) empfohlen worden. Dieses Präparat soll, wenn es oral während einer Zeitdauer von 7 bis 10 Tagen verabreicht wird, gute Resultate ergeben. Dieses Präparat jedoch ist - wie berichtet wird - ungeeignet für Massenverabreichung ohne genaue medizinische Überwachung.
Die Schistosomen halten sich in den Blutgefässen des infizierten Wirbeltieres auf. Nach allgemeiner Meinung sind die Schistosomen von Mikroorganismen, z. B. Bakterien, frei.
Nach der Erfahrung der Erfinder enthalten aus experimentell infizierten Mäusen isolierte Schistosomen keine Bakterien. Andererseits wurde es als möglich festgestellt, auf im Blutstrom lebende Schistosomen bakteriologische Infektionen zu übertragen. Während manche Bakterien für kürzere oder längere Zeitdauer in Schistosomen zugegen sein können, ohne eine signifikante pathologische Einwirkung auf sie, gibt es andere, die sich heftig im Darmtrakt von sowohl weiblichen als auch männlichen Schistosomen vermehren können; eine solche Vermehrung kann solche Dimensionen annehmen, dass die Schistosomen rasch getötet werden. Das Zugegensein einer grossen Anzahl solcher Bakterien in toten oder kranken Schistosomen kann dann leicht durch mikroskopische Untersuchung oder durch Züchtungsverfahren demonstriert werden.
Zur Durchführung einer solchen Infektion von Schistosomen ist es notwendig, die infizierenden Bakterien in den Blutstrom des befallenen Wirbeltier-Wirtes einzuführen.
Dies kann am wirksamsten durch intravenöse Injektion geschehen. Es wurde festgestellt, dass wenige Stunden nach einer solchen Verabreichung die Bakterien in dem Darmkanal der Schistosomen festgestellt werden können.
Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Züchtung von gegenüber Schistosomen hoch pathogenen Bakterien vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einem Nährboden Bakterien eines Stammes der Familie Enterobacteriaceae auf solche Weise gezüchtet werden, dass das Verhätlnis der zur Eliminierung von einem durch Schistosomen infizierten Wirbeltier-Wirt intravenös verabreichten Bakterien, welche einige Stunden nach der Verabreichung von den Schistosomen nicht aufgenommen worden sind, geringsten wirksamen intraperitonealen zur entsprechenden intravenösen Dosis erhöht wird.
Die besonders geeigneten Spzies und Stämme von Bakterien, die für diesen Zweck ausgewählt werden, haben eine hohe Pathogenität hinsichtlich der Infizierung von Schistosomen, aber eine niedrige System-Pathogenität gegenüber dem Wirt und stammen vorzugsweise aus den Familien Escherichia, Klebsiella, Salmonella oder Serratia.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Bakterien wenn sie einmal im Inneren der Schistosomen sind, gegen die Wirkung von in normalen klinischen Dosen verabreichten Antibiotika geschützt sind. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass die Verabreichung von Kanamycin, Chloramphenicol oder Oxytetracyclin in Dosen, die Blutspiegel weit oberhalb der minimalen hemmenden Konzentration für die betreffenden Bakterien erzeugen, überhaupt nicht auf die Vermehrung der Bakterien im Darmkanal der Schistosomen einwirken. Nichtsdestoweniger blieb die Empfindlichkeit der in den Schistosomen vorhandenen Bakterien gegenüber dem betreffenden Antibiotikum unverändert; von den Schistosomen gelöste Bakterien behielten ihre ursprüngliche Empfindlichkeit gegen über dem betreffenden Antibiotikum.
Die in die Schistosomen gelangten Bakterien beginnen sich zu vermehren und verursachen den Tod der Parasiten. Das Erfordernis der niedrigen Pathogenität für den Wirt bei intravenöser Verabreichung kann zum Beispiel im Falle der Maus festgestellt werden durch Vergleich der kleinsten wirksamen Dosis der Bakterien bei intravenöser Verabreichung mit der intraperitoneal verabreichten. Da es wesentlich ist, dass die verwendeten Bakterien zum
Eindringen in die Schistosomen gelangen, haben die auf eine andere Weise als die direkte intravenöse Verabreichung verabreichten Bakterien den natürlichen Abwehrmechanismus des Wirtes zu überwinden.
Leichtigkeit, mit solchen Abwehrreaktionen fertig zu werden, zeigt üblicherweise eine hohe Pathogenität, und ein erhöhtes Verhältnis von geringster wirksamer intraperitonealer zu intravenöser Dosis (i.pli.v.-Verhältnis) weist auf eine verhältnismässig niedrigere Pathogenität für den Wirt oder eine erhöhte Pathogenität gegenüber den Schistosomen hin.
Weiter wurde gefunden, dass ein Stamm mit einem hohen i.pyi.v.-Verhältnis bei der Maus ein ähnlich hohes Verhältnis beim Hamster hat. Infolgedessen scheint das i.pji.v.-Verhältnis bei einer Spezies von Tieren als verlässliches Indiz für die Eignung des ausgewählten Stammes für den beabsichtigten Zweck zu sein.
Die Wirksamkeit verschiedener für die Zwecke der Erfindung ausgewählter Stämme von Bakterien kann bezüglich der Pathogenität gegenüber den Schistosomen und Wirten in weitem Masse variieren. Es wurde gefunden, dass die Eigenschaften einiger Stämme in dieser Hinsicht durch Kultivieren unter leicht alkalischen Bedingungen, vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 8 und 9,5 verbessert werden können. Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden mit einem Stamm von Klebsiella durch Verwendung einer Nährbrühe (Difco), die auch 0,25 OIo Natriumsulfit (pH 8,2) oder 0,35 C!o des Dikaliumsalzes des sauren Phospats (pH 8,0) enthält.
Weitere Verbesserungen können erreicht werden durch Durchführen des Kultivierens bei einer Temperatur von 35 bis 40 "C während 24 bis 48 Stunden, gefolgt von einer Reifungsperiode bei Raumtemperatur (ungefähr 20 bis 25 "C). Durch Kultivieren dieser Bakterien unter den oben beschriebenen Bedingungen war es möglich, das i.pli.v.-Verhältnis auf 1000 oder darüber zu erhöhen.
Ein anderer Weg, auf dem man Bakterien mit einem hohen i.pji.v.-Verhältnis erhalten kann, besteht in der Behandlung mit einem Antiserum, das aus mit einem geeigneten Stamm von Bakterien der gleichen Art immunisierten Tieren gewonnen wurde, und getrennter Verarbeitung der agglutinierten und der nichtagglutinierten Teile der Kultur. Die Verbesserung des i.pli.v.-Verhältnisses hängt vom verwendeten Antiserum und den Züchtungsbedingungen ab. Die Verwendung der agglutinierten Teile ist dann vorteilhaft, wenn das der Kultur zugesetzte Antiserum mit einer Varietät des gezüchteten Stammes, die gegen Schistosomen sehr wirksam ist, erhalten wurde. Das Kulturmedium soll keine vergärbaren Kohlehydrate enthalten.
Wenn dem Medium vergärbare Kohlehydrate zugesetzt werden, kann es in der Tat nützlich sein, die nichtagglutinierten Bakterien zu verwenden. Die Anwendung eines andersartigen Antiserums verbessert das i.pli.v.-Ver- hältnis nicht.
Zur Auffindung eines geeigneten Elternstammes für die weitere Verbesserung durch Kultivieren, wie oben beschrieben, können alle bekannten Methoden der Selektion durch Cloning (selektive Zurückschneidung) oder andere Trennverfahren verwendet werden. Die gewählten Stämme von Bakterien können natürlich stabile Mutanten enthalten oder auch Mutanten, die durch Bestrahlung, z. B. mit Ultraviolett oder Röntgen-Strahlen, erzeugt sind.
Die bei dem Test mit einem geeigneten infizierten Test tier das Meiste versprechenden Mutanten können dann weiter zur Erhöhung ihres i.pli.v.-Verhältnisses kultiviert werden.
Es können auch Bakterien mit erwünschten Eigenschaften mit Hilfe der bekannten serologischen Verfahren ausgewählt werden.
Durch solche Verfahren erhaltene bevorzugte Stämme können dann bei verschiedenen infizierten Tieren getestet werden und weiter gemäss ihrer konsistenten niedrigen
Pathogenität gegenüber dem Wirt und Wirksamkeit zur Tötung der Schistosomen selektiert werden.
Die allerbesten Stämme können dann klinisch, d. h.
menschlichen Wirten, gegeben werden. Der resultierende
Stamm kann in irgendeinem geeigneten sterilen Verdün nungsmittel für die intravenöse Verabreichung verwendet werden. Die wirksame Dosis hängt von der Pathogenität der Bakterien gegenüber den Schistosomen ab und kann weniger als 5 x 10'log des Körpergewichts des Wirtes (= 5 x 105,kg) bis zu 4 x l041g Körpergewicht des Wirtes (= 4 x 107/kg ) betragen.
Manche Suspensionen lebender Bakterien können bei niedrigen Temperaturen (z. B. 4 "C) während Monate ohne signifikanten Verlust an Wirksamkeit aufbewahrt werden.
Es ist jedoch vorteilhafter, die Suspension mittels einer
Methode zu trocknen, die eine adäquate Lebensfähigkeit nach der Wiederherstellung einer Suspension ergibt. Ge friertrockenverfahren, die für diese Art Bakterien ge braucht werden, sind (wie gefunden wurde) auch hier brauchbar und zufriedenstellend und ergeben mindestens
60 /e Lebensfähigkeit nach Wiederherstellung einer Su spension.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform wird die
Züchtung bei leichtalkalischen pH oder bei 35 - 40 "C durchgeführt, mit nachfolgender Reifung bei Raumtempe ratur. Das für diesen Zweck verwendete Verdünnungsmit tel kann eine injizierbare Lösung sein, wie z. B. eine Salz lösung, die sowohl für den Wirt als auch für die lebenden
Bakterien unschädlich ist.
Beispiel 1
Mäuse vom Stamm RQ des gleichen Geschlechts und gleichen Gewichts (ungefähr 20 Gramm) werden subkutan injiziert mit 80-100 Larven (Cercarien) von S. mansoni.
Die Cercarien sind die für Säugetiere infektiöse Phase des
Lebenscyclus der Schistosomen; sie werden von infizierten Schnecken ausgeschieden.
Nach einer Inkubationszeit von 6 Wochen beherbergen diese Mäuse 20 - 30 Paare männliche und weibliche
Schistosomen.
Eine bis drei Wochen später werden diese Mäuse für einen Test zur Bestimmung der Wirksamkeit der zu studierenden Bakteriensuspensionen verwendet. Wenn in den folgenden Beispielen von Maus die Rede ist, so ist darun ter eine wie oben angegeben infizierte Maus zu verstehen.
Die Bakteriensuspensionen werden intravenös injiziert.
Die Wirkung der Behandlung wird regelmässig nach einer Woche unter Töten der Tiere mit Chloroform festgestellt. Die Sektion wird durchgeführt; Ort und Befinden der Schistosomen wird bestimmt. Zur gleichen Zeit wird ein oo-Gram gemäss dem Verfahren durchgeführt, das von Pellegrino [Am. J. Trop. Med. and Hyg., (1962), 11, 2011 beschrieben ist.
Ein Stamm von Klebsiella pneumoniae E15 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Medium vom pH-Wert 7 und folgender Zusammensetzung pro Liter kultiviert:
Malzextrakt Paste (Trifax): 20 g; Hefeextrakt (Gi stex, KNGSF): 10 g; Maismaische-Feststoffe: 5 g.
Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. Die Anzahl der in dieser Suspension vorhandenen Bakterien wurde zu 4 x los pro ml festgestellt [Methode von Miles und Misra - J.
Hyg. (1938), 38, 732]. Es wurden Verdünnungen in Salzlösung von Verhältnissen 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 hergestellt, worauf 0,2 ml dieser Verdünnungen einschliesslich der unverdünnten Suspension intravenös einer Gruppe von je 6 Mäusen injiziert wurde. Nach einer Woche war die Zahl der Überlebenden 4, 6, 6, 6, 6 und 5 in jeder Gruppe. Die Prüfung ergab, dass alle überlebenden Tiere frei von Schistosomen waren, während alle nichtbehandelten Kontrolltiere entweder infiziert oder tot waren. Die mindestwirksame Heildosis in diesem Falle war also geringer als 8 x 104 Bakterien pro Maus.
Beispiel 2
Ein Stamm von Escherichia coli E2 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einem Flüssigkeitsmedium der folgenden Zusammensetzung bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 kultiviert:
Malzextrakt Paste (Trifax): 20 g pro Liter; He feextrakt (gistex, KNGSF): 10 g pro Liter; Mais maische Feststoffe: 5 g pro Liter.
Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. Diese Suspension enthielt 2,8 x 108 Bakterien pro ml. Es wurden Verdünnungen mit Salzlösungen von 1:10, 1:30, 1:100, 1:300 und 1:1000 hergestellt. Alle Verdünnungen und auch die unverdünnte Suspension wurden in einer Dosis von 0,2 ml intravenös Gruppen von fünf infizierten Mäusen injiziert. Nach sieben Tagen überlebten von diesen Gruppen 5, 4, 5, 5, 5 bzw. 5 Tiere. Alle Tiere mit Ausnahme der der Gruppe, die mit einer Verdünnung von 1:1000 injiziert worden waren, wurden als frei von lebenden Schistosomen befunden, während die 1:1000 Gruppe eine normale Infektion und ein normales oo-Gram zeigte.
Die kleinste wirksame Heildosis ist infolgedessen in disem Falle 2 x 10" Bakterien pro Maus.
Beispiel 3
Ein Stamm Salmonella paratyphi, Gruppe E, Nr.
4286/63 wurde während 24 Stunden bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einer Brain Heart Infusion Brühe (Difco) der Inkubation unterzogen. Nach der Inkubation wurden die Bakterien abzentrifugiert und in Salzlösung suspendiert. (5,4 x 108 Bakterien pro ml). Sowohl die unverdünnten Suspensionen als auch Verdünnungen in Salzsäure von 1:10, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000 und 1:10 000 wurden mit je 0,2 ml intravenös Gruppen von fünf infizierten Mäusen injiziert. Von diesen Mäuse-Gruppen überlebten nach einer Woche 1, 2, 0, 2, 2 und 2 Tiere. Alle überlebenden Tiere waren frei von lebenden Schistosomen. Die Mindest-Heildosis betrug in diesem Falle also 104 Bakterien oder weniger pro Maus.
Beispiel 4
Sieben Gruppen von 5 infizierten Mäusen wurden durch intravenöse Injektion mit einem Stamm von Klebsiella pneumoniae E15 behandelt, der auf Endo-Agar (Difco) aufgestrichen und bei 37 "C während 24 Stunden, gefolgt von einer Reifung bei Raumtemperatur (20 bis 25 "C) kultiviert worden war. Das für die Injektion verwendete Präparat enthielt die geernteten Kolonien, suspendiert in Salzlösung bei einer Konzentration von 3 bis 7 x 108 Bakterien/ml.
Sechs Gruppen Mäuse wurden mit einer einzigen Dosis Kanamycin behandelt. Diese Dosis, 50 mg/kg, wurde entweder intraperitoneal oder intravenös verabreicht. Die intraperitoneale Behandlung wurde durchgeführt bei vier Gruppen zwei Stunden vor, eine Stunde vor bzw. eine Stunde nach der Injektion der Bakterien. Die intravenöse Verabreichung wurde bei zwei Gruppen eine Stunde vor bzw. eine Stunde nach der bakteriellen Injektion durchgeführt. Die siebente Gruppe erhielt keine Kanamycin-Behandlung und diente als Kontrolle. Nach 7 Tagen wurden alle Mäuse getötet und der Einfluss der Behandlung festgestellt.
Die Resultate sind folgende: Zeitpunkt der Kanamycin- Art der Wirkung der Verabreichung (Stunde Kanamycin- Bakterien-Injektion vor bzw. nach der Injek- Injektion auf Schistosome tion der Bakterien) -2 Stunden i.p. sporadisches Leben
Wurm-Paar oo-gram: hauptsächlich reife Eier -1 Stunde i.p. Schistosome in mesenterialen
Blutgefässen oo-gram:
Vorhandensein von reifen und unreifen Eiern -1 Stunde i.v. ebenso -0 Stunden i.p. ebenso +1 Stunde i.p. keine lebenden
Schistosome +1 Stunde i.v. ebenso keine Kanamycin Verabreichung ebenso Beispiel 5
Klebsiella pneumoniae E10 wurde während 24 Stun den bei 37 "C unter aeroben Bedingungen in einer Nährlö sung (Difco) der 0,25 % Natriumsulfit zugegeben war, kul tiviert.
Nach der Inkubierung wurde die Kultur während
48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, wonach sie zen trifugiert und in Salzlösung suspendiert wurde. Nach der
Methode, die in den Beispielen 1, 2 und 3 dargelegt ist, wurde die mindestwirksame Heildosis bestimmt, die die
Mäuse von allen Schistosomen befreite. Es wurde gefun den, dass diese Dosis 2 > < x 103 103 Bakterien pro Maus betrug.
Beispiel 6
Eine Kultur von Klebsiella pneumoniae E10 wurde auf
Agar (Blutagar Easis Nr. 2, Difco) derart aufgesät, dass nach der Inkubation getrennte Kolonien gebildet wurden.
Unter Verwendung des Replica-Verfahrens von Leder berg, (Lederberg und Lederberg, J. Bact. 63 (1952) 339) wurden Replica-Platten auf Agar-Medien unter ihnen
Endo-Agar (Difco) und McConkey-Agar (Difco) hergestellt.
Die Platten wurden bei 37 "C während 24 Stunden der
Inkubation unterworfen und dann bei 20-24 "C aufgeho ben. In regelmässigen Intervallen wurden die Platten inspi ziert und die entsprechenden Kolonien verglichen. Alle
Kolonien oder Teile von Kolonien mit einer abweichen den Morphologie wurden untersucht. Auf diese Weise wurde eine Kolonie mit einem blanken Aussehen isoliert und mit Nr. E1ORS bezeichnet.
Es wurden Kulturen von E10 und eines Unterstammes E1ORS in Nährbrühe (Difco) bei pH 6,6 und pH 8,9 hergestellt. Der hohe pH-Wert wurde erzeugt durch Zugeben von Dikaliumwasserstoffphosphat (saurem Dikaliumphosphat) (4 Liter) und Natriumhydroxyd eingestellt. Diese Kulturen wurden der Inkubation bei 37 "C während 24 Stunden unterworfen und dann dem Reifen bei 20-24 "C während 3 Tagen überlassen.
Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Bakterien aus dem Medium durch Zentrifugierung gewonnen, ein Mal in Salzlösung gewaschen und in Salzlösung mit einer Konzentration von 2,6 x 108 Bakterien pro ml suspendiert. Die genaue Zahl der lebenden Bakterien wurde nach der Methode von Miles und Misra festgestellt. Von diesen Suspensionen wurden die folgenden Verdünnungen in Salzlösung hergestellt: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 und 1/3000. Von diesen Verdünnungen wurden je 0,2 ml intravenös Gruppen von 5 Schistosomen infizierten Mäusen injiziert. Weiteren Gruppen von 5 Mäusen wurde intraperitoneal je 0,2 ml die unverdünnte Suspension und das gleiche Volumen von Verdünnungen 1:10 und 1:100 injiziert.
Sieben Tage nach der Injektion wurden alle Mäuse getötet und die Wirkung der Behandlung nach der Methode von Pellegrino festgestellt. Auf diese Weise wurde die Minimal-Wirksamkeits-Dosis (MED) jeder Bakterienkultur festgestellt je nach der Verabreichungsart.
Resultate
Nährbrühe MEDI) Stamm pH Reife in.2) i.p9 Verh.
i.pJi.v.
E10 6,6 - > 3 x lo6 3 x 107 < 10:1
6,6 + 1,2 x 108 1,2 x 107 10:1
8,9 - 2 x 105 2 x 107 100:1 EIORS 6,6 - 5x105 x 107 100:1
6,6 + 1,3 x 105 1,3 x 108 1000:1
8,9 - I x 104 3 x 107 > 3000:1 1) Die MED ist als Zahl der Bakterien pro Maus (20 g) gegeben.
2) > Die höchste gegebene Dosis war unwirksam.
Beispiel 7
Der Unterstamm EIORB, isoliert aus einer Kultur von K. peumoniae E10, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben auf Nährbrühe (Difco), die mit saurem Dikaliumphosphat auf pH 8,9 gebracht worden war, ausgesät.
Ein Teil der Kultur wurde bei 37 "C während 24 Stunden inkubiert. Ein anderer Teil wurde nach der Inkubation bei 37 "C bei Raumtemperatur während 3 Tagen gereift.
Beide Kulturen wurden zentrifugiert, gewaschen und in Salzlösung suspendiert zu 2,6-106 Bakterien pro ml.
Die Zahl der lebenden Bakterien jeder Suspension wurde nach der Methode von Miles und Misra festgestellt.
Von beiden Suspensionen wurden die folgenden Verdünnungen in der Salzlösung hergestellt: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 und 1/3000. Von diesen Verdünnungen wurden je 0,2 ml intravenös Gruppen von 5 mit Schistosomen infizierten Mäusen injiziert. Andere Gruppen von 5 Mäusen wurde intraperitoneal 0,2 ml der unverdünnten Suspension und das gleiche Volumen von Verdünnungen 1:10 und 1:100 injiziert.
Sieben Tage nach der Injektion wurden alle Mäuse getötet und die Wirkung der Behandlung unter Verwendung der Methode von Pellegrino festgestellt. Auf diese Weise wurde die mindestwirksame Dosis (MED) der zwei Kulturen für beide Arten der Verabreichung festgestellt.
Resultate MEDI)
Stamm Reifung i.V.2) i.p.3) Verhältnis i.pSi.v.
EIORB - 3,6 x 105 3,6 x 106 10:1 + < 1,2 > < x 104 104 > 1,2 x 107 1000:1 1)MED ist als Zahl der Bakterien pro Maus (20 g) gegeben.
2) Die geringste gegebene Dosis war noch wirksam.
3) Höchst gegebene Dosis war unwirksam.
Beispiel 8
Der Stamm Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infu sions-Brühe (Difco) 18 Stunden bei 37 "C gezüchtet und danach 3 Tage bei Raumtemperatur gereift. Zu gleichen Teilen dieser Kultur wurde je eines von 3 Antiseren zugesetzt. Ein Serum (S 182) wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit einem serologisch definierten und andersartigen Stamm (E 15) hergestellt. Die beiden anderen Antiseren wurden mit zwei Varianten des Stammes E10 hergestellt, von denen die erste bei Mäusen gegen Schistosomen hochwirksam war (Serum S 224), während die zweite nur eine sehr geringe Wirksamkeit gegen Schistosomen hatte (Serum S 228). Die agglutinierten und die nichtagglu tinierten Bakterien wurden gesammelt, in Salzlösung ge waschen, wieder in Salzlösung suspendiert und auf ihre
Aktivität bei Mäusen geprüft.
In einer zweiten Versuchsreihe wurde der Stamm E10 in Nährbrühe (Difco), die mit K2HPO4 (ca. 5 g/Liter) auf pH 8,9 gebracht worden war, gezüchtet. Diesem Nährmedium wurden 1 0/0 Glucose und 2 /0 Antiserum S 224 zugesetzt. Im Verlauf der Züchtung bei 37 "C während 18 Stunden wurde ein Teil der Bakterien agglutiniert. Die agglutinierten und nichtagglutinierten Bakterien wurden gesammelt, in Salzlösung gewaschen, wieder in Salzlösung suspendiert und auf ihre Aktivität geprüft.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Wirksamkeit des Stammes Klebsiella E10 bei Mäusen nach Behandlung mit Antiseren Medium Glucose Antiserum Bakte- MED i.pli.v.- (2 /o) rien aus i.p. i.v. Verhältnis BHI S 182 S 1,2 X 108 1,2 x 107 10
A 1,3 x 107 4 x 105 30 BHl S 5 224 S 5 x 107 5 x 105 100
A > 6 x 107 6 x 104 > 1000 BHI S 5 228 S 6 x 107 6 x 104 1000
A 2x106 2x107 0,1 NB 8,9 + S 224 S 1,2 x 107 4 x 104 300
A 1,2 x 107 1,2 x 105 100 Erkärung:
:
BHI = Brain Heart Infusions-Brühe (Difco)
NB 8,9 = Nährbrühe (Difco), auf pH 8,9 gebracht
S = Aus der überstehenden Flüssigkeit gesammelte Bakterien
A = Aus dem Agglutinat gesammelte Bakterien
MED = Mindestwirkungsdosis in Anzahl Bakterien pro Maus i.p. = intaperitoneal mit Bakterien infiziert iN. = intravenös mit Bakterien infiziert Beispiel 9
Der Stamm Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infusions-Brühe, der 2 % Kaninchenantiserum zugegeben war, kultiviert. Zwei Seren wurden verwendet. Ein Serum (S 224) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einer Suspension von Klebsiella E10, die sich als sehr aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen gezeigt hatte.
Das andere Serum (S 228) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einer Suspension von Klebsiella E10, die eine sehr geringe Aktivität gegenüber Schistosomen bei Mäusen gezeigt hatte.
In beiden Kulturen waren Teile der Bakterien während ihres Wachstums agglutiniert. Diese agglutinierten Bakterien wurden gesammelt, mit Salzwasser gewaschen und in Salzlösung suspendiert. Beide Suspensionen wurden bezüglich ihrer Aktivität gegenüber Schistosomen in Mäusen geprüft. In der folgenden Tabelle sind die Resultate dieses Versuches wiedergegeben.
Die Suspension E10-S 224, hergestellt mit Hilfe eines Antiserums eines aktiven El 0-Stammes, zeigte eine niedrigere MED und ein höheres i.p./i.v.-Verhältnis als die Suspension E10-S 228.
Stamm Verdünnung Bakterien Art Zahl der oo-gram .pJiN.- pro Maus der Mäuse bei Verhältnis
Injek- Ende/ tion Beginn E10- unverd. 6 x 107 i.v. 4/5 S224 1/10 6 x 106 i.v. 5/5 +++/+++/+++/+++/+++
1/100 6 x 105 i.v. 4/4 +++/+++/+++/+++ 1000 < 1
1/300 2 x 105 i.v. 5/5
1/1000 6 x 104 i.v. 4/5 +++/-/-/-
1/3000 2 x 104 i.V. 5/5 unverd. 6 x 107 i.p. 1/5 -
1/10 6 x 100 i.p. 5/5
1/100 6 x 105 i.p.
5/5 Stamm Verdünnung Bakterien Art Zahl der obgram i.pji.v pro Maus der Mäuse bei Verhältnis
Injek- Ende/ tion Beginn E10- unverd. 2 x 106 i.v. 4/5 +++/+++/+++/+++ S228 1/10 2 x 10' i.v. 4/5 +++/+++I+++I+++ 10 > 100 1/100 2 x 106 iN. 5/5 ¯/-
1/300 6 x 10' i.v. 5/5 -/-/-/-/
1/1000 2 x 105 i.v. 5/5 -/-/-/-/-
1/3000 6 x 104 i.v. 5/5 -/-/-/-/- unverd. 2 x 106 i.p. 3/5 ++/++/+++
1/10 2 x l07 i.p. 3/5 +++/+++/+++
1/100 2 x 106 i.p. 5/5 +++/+++/-/-/- oo-gram:
: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = niedriger Prozentsatz unreifer Eier festgestellt - = normales oo-gram iN. = Intravenöse Injektion (0,2 ml pro Maus) i.p. = Intraperitoneale Injektion (0,2 ml pro Maus) Beispiel 10
Klebsiella E10 wurde in Brain Heart Infusions-Brühe (Difco) während 18 Stunden bei 37 C kultiviert. Zu diesem Medium waren 2 0/0 Kaninchen-Antiserum zugefügt worden. Das Serum (S 204) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einem Stamm von Klebsiella E15. Dieser spezielle Stamm war nur mässig aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen bei intravenöser Injektion. Während des Wachstums in diesem Medium agglutinierte ein Teil der Bakterien und lag als schwere Absetzung im Züchtungsrohr vor.
Diese agglutinierten Bakterien wurden entfernt, die Bakterien in der überstehenden Flüssigkeit wurden gewonnen, gewaschen und in Salzlösung suspendiert. Diese Suspension E10-204 wurde bei den Versuchen mit Mäusen und Hamstern folgendermassen verwendet.
Eine zweite Kultur von Klebsiella E10 wurde hergestellt durch Aussäen in einer Nährbrühe (Difco) mit 1 0/0 Glucose mit saurem Dikaliumphosphat auf pH 8,9 gebracht. Die Kultur wurde bei 37 C während 18 Stunden der Inkubation überlassen. Zu dieser Kultur wurden 2 0/0 Kaninchen-Antiserum zugegeben. Dieses Serum (S 224) wurde hergestellt durch Immunisieren von Kaninchen mit einem speziellen Stamm von Klebsiella E10, der sich als sehr aktiv gegenüber Schistosomen bei Mäusen bei intravenöser Injektion erwiesen hatte. Die schwere Ausfällung, die sich bei der Zufügung des Antiserums ergab, wurde entfernt. Die Bakterien in der überstehenden Flüssigkeit wurden gewonnen, in Salzlösung gewaschen und in Salzlösung suspendiert.
Diese Suspension E10-224 wurde mit der Suspension E10-204 bezüglich der Wirksamkeit bei mit Schistosomen infizierten Mäusen und Hamstern verglichen.
In der Tabelle list die Aktivität der beiden Stämme im Mäuse-Test wiedergegeben. Der Stamm E10-204 zeigte ein niedriges i.pJi.v.-Verhältnis, der Stamm E10-224 besass ein höheres i.pJi.v.-Verhältnis (3 bzw. 300). Beide Stämme wurden bei Hamstern getestet. In Tabelle 2 dieses Beispiels wird der Wurmbefall und das oo-Gram von unbehandelten Hamstern wiedergegeben. In Tabelle 3 und 4 dieses Beispiels wird die Wirksamkeit der beiden Stämme im Hamster-Test wiedergegeben. Der Stamm E10-204 zeigte wiederum ein niederes i.pJi.v.-Verhältnis (100:10 =
10), während der Stamm E10-224 ein sehr hohes Verhält nis (1000:1 = 1000) zeigte.
Tabelle 1
Aktivität der Stämme E10-224 und E10-204 in dem Mäuse-Test.
Stamm Verdünnung BaktJ i.vJi.p. Zahl der oo-gram i.pyi.v.-
Maus Art der Mäuse bei Verhältnis
Injektion Endet
Beginn E10- unverd. 1,2 x 106 i.v. 4/5 +++I+++I+++I+++ 224 1/10 i.v. 4/5
1/100 i.v. 4/5 +++1+++1+++1-
1/300 0,4 x 106 3/5 +++/+++/+++ 300:1 = 30
1/1000 i.v. 3/5 -/-/
1/3000 i.v. 5/5 unverd. 1,2 x 106 i.p. 4/5 +++/+++/+++/
1/10 1.p. 5/5 -/-/-/-/- i.p. 5/5 -/-/-/-/- Stamm Verdünnung Baktl i.vJi.p.
Zahl der oo-gram i.p./i.v.-
Maus Art der Mäuse bei verhältnis
Injektion Ende/
Beginn E10- unverd. 8 x 10' i.v. 3/5 +++/+++/+++ 204 1/10 i.v. 3/5 +++/+++/+++
1/100 i.v. 4/5 +++l++l++l+++
1/300 2,7 x 105 i.v. 4/5 +++/++/++/+++ 300:100 = 3
1/1000 i.v. 3/5
1/3000 i.v. 5/5 unverd. 8 x 10' i.p. 3/5 -/+++/+++
1/10 i.p. 3/5 +++/+++/+++
1/100 i.p. 3/5 -/++/++ oo-gram: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = geringer Prozentsatz unreifer Eier - = normal oo-gram i.v. = Intravenöse Injektion (0,2 ml pro Maus) i.p. = Intraperitoneala Injektion (0,2 ml pro Maus)
Tabelle 2
Unbehandelte Hamster (Kontroll-Gruppe, keine Todes fälle) Wurmbefall und oo-gram.
Wurmpaare in oo-gram v. porta vv mesent.
15 12 normal
15 15 normal
12 8 normal
14 10 normal
5 5 normal
Tabelle 3
Wirksamkeit des Stammes E10-224 im Hamster-Test Verdünnung Art der Baktd Wurmpaare in oo-gram Thera
Injektionen Hamster peutisches v. porta vv mesent. Resultat
1/10 Lc. 2,4 x 107 0 0 +++ +
1/100 i.c. 3(4 66) 0 ++
4(4 66) 0 - +
8(4 b6) 12
1/300 i.c. 1 5 0(266) 0 ++ +
15 10 1/1000 i.c. 0(2 66) 3(4 66) +++
4 6 - +
2 1 Unverd. i.p. 2,4 x lOS 0(6 66) 0
3(3 66) 0 +++ + 1/10 i.p. 15 5
15 10
15 10
1/100 i.p. 15 10
15 20 oo-gram:
: +++ = nur reife Eier zugegen ++ = niedriger Prozentsatz unreifer Eier - = normales oo-gram i.c. = Intrakardiale Injektion (0,4 ml pro Hamster) i.p. = Intraperitoneale Injektion (0,4 ml pro Hamster)
Tabelle 4
Wirksamkeit des Stammes E10-204 im Hamster-Test.
Verdünnung Art der Bakt.l Wurmpaare in oo-gram Thera
Injektion Hamster peutisches v. porta vv mesent. Resultat 1110 i.c. 1,6 x 107 0 0 +++ +
0 0 1/100 i.c. O O
15 6 + +
10 12 1/300 i.c. 12 20 -
20 15 1/1000 i.c. 0 0 +++ unverd. i.p. 1,6 x 108 0 0 +++ + 1/10 i.p. 4 10
3(6 ÏÏ) 0 ++ +
4 10 1/100 i.p. 20 20 -
15 15 Beispiel 11
Albinomäuse vom Clarkes O.S.I. Stamm erhielten auf percutanem Wege ungefähr 150 Cercarien (Larven) von Schistosoma mansoni. Zwei Wochen später wurde das Vorhandensein von reifen Infektionen durch Entdeckung von lebenden Schistosomen-Eiern in den Ausscheidungen der Mäuse festgestellt.
Zu dieser Zeit wurde jeder Maus eine einzelne intravenöse Injektion einer Salzlösungssuspension von Serratia marcescens gegeben, die geschätzt 108 Bakterien/ml enthielt. Jede der 5 Mäuse erhielt geschätzt 3,2 x 10' Bakterien.
Diese Suspension wurde hergestellt durch Inkubierenlassen über Nacht einer gefriergetrockneten Probe von S, marcescens (Wellcome CN 1999) auf Nähragar bei 28 C hergestellt. Die Kultur wurde geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen, dann für die Verwendung in physiologischer Salzlösung verdünnt. Die Schätzungen der Zahl der Organismen in den Suspensionen wurde nach dem Durchscheintest durchgeführt.
Die drei überlebenden Mäuse wurden 9 Tage später getötet und untersucht. Man fand, dass 93,5 0/0 der Schistosomen getötet waren und in einem Zustand der Zersetzung in den intrahepatischen Gefässen vorlagen.
Process for the cultivation of highly pathogenic towards schistosomes
bacteria
The invention relates to a method for breeding of bacteria that are highly pathogenic to schistosomes.
Schistosomiasis (bilharziasis) represents a group of
Represent diseases caused by schistosomes, a genus of parasitic worms of the family Schistosomatidae belonging to the class Trematoda. These small worm-like organisms live in the veins of various internal organs of the infected human or animal. The disease is epidemiological, due to the presence of abundant surface water, as water snails act as intermediate hosts, thus transmitting the infection to the vertebrate host. The disease is common in much of the world, and especially in important parts of South America, Africa, the continent of East Asia, Japan, and the Philippines.
It is estimated that 200 million people have schistosomiasis and that number is growing. The reason for this is that extensive irrigation works are being built in many parts of the world, which are ideal for the development of the intermediate host, the snails. As long as the snails are infected by an existing herd of human or animal schistosomiasis, such irrigation works clearly contribute to the spread of the disease to a large extent.
The disease is the body's reaction to the presence of large quantities of eggs laid by the female worm. These eggs penetrate all tissues and cause all kinds of local reactions. In addition, the damaged tissue has an increased sensitivity to bacterial infections.
As an antidote, preparations derived from trivalent antimony are often used to treat the disease. However, all of these derivatives have severe side effects and must be administered by injection over a fairly long period of time.
The human patient must be hospitalized for effective treatment, which is often impossible in areas where schistosomiasis is endemic.
Recently, a new preparation (1- (5-nitro-2-thiazoly) -2imidazolinone) has been recommended. This preparation is said to give good results when administered orally for a period of 7 to 10 days. However, this preparation is reported to be unsuitable for bulk administration without close medical supervision.
The schistosomes reside in the blood vessels of the infected vertebrate. According to general opinion, the schistosomes of microorganisms, e.g. B. bacteria, free.
In the inventors' experience, schistosomes isolated from experimentally infected mice do not contain bacteria. On the other hand, it has been found possible to transmit bacteriological infections to schistosomes living in the bloodstream. While some bacteria may be present in schistosomes for shorter or longer periods of time without any significant pathological effect on them, there are others that can proliferate in the intestinal tract of both female and male schistosomes; such an increase can take on such dimensions that the schistosomes are quickly killed. The presence of a large number of such bacteria in dead or diseased schistosomes can then easily be demonstrated by microscopic examination or by cultivation methods.
In order to carry out such an infection of schistosomes it is necessary to introduce the infecting bacteria into the bloodstream of the infected vertebrate host.
This can most effectively be done by intravenous injection. It has been found that a few hours after such administration, the bacteria can be detected in the intestinal tract of the schistosomes.
According to the invention, a method for cultivating bacteria that are highly pathogenic towards schistosomes is proposed, which is characterized in that bacteria of a strain of the Enterobacteriaceae family are cultivated in a nutrient medium in such a way that the ratio of the vertebrate organisms required to eliminate a vertebrate infected by schistosomes is Host intravenously administered bacteria which have not been absorbed by the schistosomes a few hours after administration, the lowest effective intraperitoneal dose is increased to the corresponding intravenous dose.
The particularly suitable species and strains of bacteria which are selected for this purpose have a high pathogenicity with regard to the infection of schistosomes, but a low system pathogenicity towards the host and preferably come from the families Escherichia, Klebsiella, Salmonella or Serratia.
It has surprisingly been found that once these bacteria are inside the schistosomes, they are protected against the action of antibiotics administered in normal clinical doses. For example, it has been shown that administration of kanamycin, chloramphenicol or oxytetracycline in doses that produce blood levels well above the minimum inhibitory concentration for the bacteria in question has no effect at all on the reproduction of the bacteria in the intestinal canal of the schistosomes. Nevertheless, the sensitivity of the bacteria present in the schistosomes to the antibiotic in question remained unchanged; Bacteria released from the schistosomes retained their original sensitivity to the antibiotic in question.
The bacteria that have entered the schistosomes begin to multiply and cause the parasites to die. For example, in the case of the mouse, the requirement of low pathogenicity to the host when administered intravenously can be ascertained by comparing the smallest effective dose of the bacteria when administered intravenously with that administered intraperitoneally. Since it is essential that the bacteria used to
To enter the schistosomes, the bacteria administered in a manner other than direct intravenous administration have to overcome the host's natural defense mechanism.
Ease of dealing with such defense reactions usually indicates a high pathogenicity, and an increased ratio of the lowest effective intraperitoneal to intravenous dose (i.pli.v. ratio) indicates a relatively lower pathogenicity for the host or an increased pathogenicity towards the schistosomes.
It was further found that a strain with a high i.pyi.v. ratio in the mouse has a similarly high ratio in the hamster. As a result, the i.pji.v. ratio in a species of animals appears to be a reliable indicator of the suitability of the selected strain for the intended purpose.
The effectiveness of various strains of bacteria selected for the purposes of the invention can vary widely in terms of pathogenicity towards the schistosomes and hosts. It has been found that the properties of some strains in this regard can be improved by culturing under slightly alkaline conditions, preferably at a pH between 8 and 9.5. This can be done, for example, with a strain of Klebsiella by using a nutrient broth (Difco), which also contains 0.25% sodium sulfite (pH 8.2) or 0.35% of the dipotassium salt of acid phosphate (pH 8.0) contains.
Further improvements can be achieved by carrying out the culturing at a temperature of 35 to 40 "C for 24 to 48 hours, followed by a ripening period at room temperature (about 20 to 25" C). By cultivating these bacteria under the conditions described above, it was possible to increase the i.pli.v. ratio to 1000 or more.
Another way in which bacteria with a high i.pji.v. ratio can be obtained is by treatment with an antiserum obtained from animals immunized with a suitable strain of bacteria of the same species and processing them separately agglutinated and the non-agglutinated parts of the culture. The improvement in the i.pli.v. ratio depends on the antiserum used and the culture conditions. The use of the agglutinated parts is advantageous if the antiserum added to the culture has been obtained with a variety of the cultivated strain which is very effective against schistosomes. The culture medium should not contain any fermentable carbohydrates.
Indeed, when fermentable carbohydrates are added to the medium, it may be useful to use the non-agglutinated bacteria. The use of a different type of antiserum does not improve the i.pli.v. ratio.
To find a suitable parent strain for further improvement by culturing, as described above, all known methods of selection by cloning (selective cutting back) or other separation methods can be used. The selected strains of bacteria can of course contain stable mutants or mutants that have been produced by irradiation, e.g. B. with ultraviolet or X-rays generated.
The mutants that show the most promise when tested with a suitable infected test animal can then be cultured further to increase their i.pli.v. ratio.
Bacteria with desired properties can also be selected using known serological methods.
Preferred strains obtained by such methods can then be tested in different infected animals and further according to their consistent low levels
Pathogenicity towards the host and effectiveness in killing the schistosomes can be selected.
The very best strains can then clinically, i.e. H.
human hosts. The resulting
Strain can be used in any suitable sterile diluent for intravenous administration. The effective dose depends on the pathogenicity of the bacteria towards the schistosomes and can be less than 5 x 10'log of the body weight of the host (= 5 x 105 kg) up to 4 x 1041 g body weight of the host (= 4 x 107 / kg) be.
Some suspensions of live bacteria can be stored at low temperatures (e.g. 4 "C) for months without significant loss of effectiveness.
However, it is more advantageous to use a
Drying method that gives adequate viability after suspension restoration. Freeze-dry processes that are used for this type of bacteria are (as has been found) also useful and satisfactory here, and at least give
60 / e viability after restoration of a pension.
According to a preferred embodiment, the
Cultivation carried out at slightly alkaline pH or at 35-40 "C, with subsequent ripening at room temperature. The diluent used for this purpose can be an injectable solution, such as a saline solution, which is useful for both the host and for the living
Bacteria is harmless.
example 1
Mice of the same sex and weight (approximately 20 grams) of strain RQ are injected subcutaneously with 80-100 larvae (cercariae) of S. mansoni.
The cercariae are the infectious phase of the mammals
Life cycle of the schistosomes; they are excreted by infected snails.
After an incubation period of 6 weeks, these mice harbor 20-30 pairs of male and female
Schistosomes.
One to three weeks later, these mice are used for a test to determine the effectiveness of the bacterial suspensions to be studied. When mouse is mentioned in the following examples, this is to be understood as meaning a mouse infected as indicated above.
The bacterial suspensions are injected intravenously.
The effect of the treatment is determined regularly after a week by killing the animals with chloroform. The dissection is carried out; The location and condition of the schistosomes is determined. At the same time, an oo-gram is performed according to the procedure described by Pellegrino [Am. J. Trop. Med. And Hyg., (1962), 11, 2011.
A strain of Klebsiella pneumoniae E15 was cultivated for 24 hours at 37 "C under aerobic conditions in a liquid medium with a pH of 7 and the following composition per liter:
Malt extract paste (Trifax): 20 g; Yeast extract (Gi stex, KNGSF): 10 g; Corn mash solids: 5 g.
After the incubation, the bacteria were centrifuged off and suspended in saline. The number of bacteria present in this suspension was determined to be 4 times per ml [method by Miles and Misra - J.
Hyg. (1938), 38, 732]. Dilutions in saline solution in the ratios 1:10, 1:30, 1: 100, 1: 300 and 1: 1000 were made, and 0.2 ml of these dilutions including the undiluted suspension was injected intravenously into a group of 6 mice each. After one week, the number of survivors was 4, 6, 6, 6, 6, and 5 in each group. The test showed that all surviving animals were free of schistosomes, while all untreated control animals were either infected or dead. The minimum effective therapeutic dose in this case was therefore less than 8 × 10 4 bacteria per mouse.
Example 2
A strain of Escherichia coli E2 was cultured for 24 hours at 37 "C under aerobic conditions in a liquid medium of the following composition at an initial pH of 7.0:
Malt extract paste (Trifax): 20 g per liter; He fee extract (gistex, KNGSF): 10 g per liter; Corn mash solids: 5 g per liter.
After the incubation, the bacteria were centrifuged off and suspended in saline. This suspension contained 2.8 × 10 8 bacteria per ml. Dilutions with saline solutions of 1:10, 1:30, 1: 100, 1: 300 and 1: 1000 were made. All dilutions and also the undiluted suspension were injected intravenously into groups of five infected mice at a dose of 0.2 ml. After seven days, 5, 4, 5, 5, 5 or 5 animals of these groups survived. All animals except the group injected at a 1: 1000 dilution were found to be free of live schistosomes, while the 1: 1000 group showed normal infection and normal oo-gram.
The smallest effective therapeutic dose is consequently 2 x 10 "bacteria per mouse in this case.
Example 3
One strain of Salmonella paratyphi, Group E, No.
4286/63 was incubated for 24 hours at 37 ° C. under aerobic conditions in a Brain Heart Infusion broth (Difco). After the incubation, the bacteria were centrifuged off and suspended in saline solution (5.4 × 10 8 bacteria per ml). Both the undiluted suspensions and dilutions in hydrochloric acid of 1:10, 1: 100, 1: 300, 1: 1000, 1: 3000 and 1:10 000 were injected intravenously with 0.2 ml each into groups of five infected mice 1, 2, 0, 2, 2 and 2 animals survived in these groups of mice after one week.All surviving animals were free from living schistosomes, so the minimum therapeutic dose in this case was 104 bacteria or less per mouse.
Example 4
Seven groups of 5 infected mice were treated by intravenous injection with a strain of Klebsiella pneumoniae E15 which was streaked on endo-agar (Difco) and stored at 37 "C for 24 hours, followed by maturation at room temperature (20-25" C) had been cultivated. The preparation used for injection contained the harvested colonies suspended in saline at a concentration of 3 to 7 x 10 8 bacteria / ml.
Six groups of mice were treated with a single dose of kanamycin. This dose, 50 mg / kg, was administered either intraperitoneally or intravenously. The intraperitoneal treatment was carried out on four groups two hours before, one hour before and one hour after the injection of the bacteria, respectively. Intravenous administration was carried out for two groups one hour before and one hour after the bacterial injection, respectively. The seventh group received no kanamycin treatment and served as a control. After 7 days, all mice were sacrificed and the effect of the treatment was determined.
The results are as follows: Time of the Kanamycin type of effect of the administration (hour of Kanamycin bacteria injection before or after the Injek injection on Schistosome tion of the bacteria) -2 hours i.p. sporadic life
Worm pair oo-gram: mainly ripe eggs -1 hour i.p. Schistosomes in mesenteric
Blood vessels oo-gram:
Presence of ripe and immature eggs -1 hour i.v. also -0 hours i.p. also +1 hour i.p. no living
Schistosome +1 hour i.v. likewise no kanamycin administration, likewise example 5
Klebsiella pneumoniae E10 was cultivated for 24 hours at 37 ° C. under aerobic conditions in a nutrient solution (Difco) to which 0.25% sodium sulfite was added.
After the incubation, the culture was during
Maintained for 48 hours at room temperature, after which it was centrifuged and suspended in saline. After
Method, which is set out in Examples 1, 2 and 3, the minimum effective therapeutic dose was determined which the
All schistosomes were removed from mice. It was found that this dose was 2 x 10 3 103 bacteria per mouse.
Example 6
A culture of Klebsiella pneumoniae E10 was raised
Agar (blood agar Easis No. 2, Difco) was sown in such a way that separate colonies were formed after the incubation.
Using the replica method of Lederberg, (Lederberg and Lederberg, J. Bact. 63 (1952) 339), replica plates on agar media were placed among them
Endo agar (Difco) and McConkey agar (Difco).
The plates were kept at 37 "C for 24 hours
Subjected to incubation and then canceled at 20-24 "C. The plates were inspected at regular intervals and the corresponding colonies compared. All
Colonies or parts of colonies with a different morphology were examined. In this way, a colony with a shiny appearance was isolated and named No. E1ORS.
Cultures of E10 and a sub-strain E1ORS were prepared in nutrient broth (Difco) at pH 6.6 and pH 8.9. The high pH was established by adding potassium dipotassium phosphate (dipotassium acid phosphate) (4 liters) and sodium hydroxide. These cultures were incubated at 37 "C for 24 hours and then allowed to mature at 20-24" C for 3 days.
At the end of the incubation period, the bacteria were recovered from the medium by centrifugation, washed once in saline and suspended in saline at a concentration of 2.6 x 10 8 bacteria per ml. The exact number of living bacteria was determined by the Miles and Misra method. The following saline dilutions were made of these suspensions: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 and 1/3000. Groups of 5 schistosome-infected mice were injected intravenously with 0.2 ml of these dilutions. Further groups of 5 mice were injected intraperitoneally with 0.2 ml each of the undiluted suspension and the same volume of dilutions 1:10 and 1: 100.
Seven days after the injection, all the mice were sacrificed and the effect of the treatment by the Pellegrino method was assessed. In this way, the minimum effective dose (MED) of each bacterial culture was determined according to the mode of administration.
Results
Nutrient broth MEDI) strain pH maturity in.2) i.p9 Verh.
i.pJi.v.
E10 6.6 -> 3 x lo6 3 x 107 <10: 1
6.6 + 1.2 x 108 1.2 x 107 10: 1
8.9 - 2 x 105 2 x 107 100: 1 EIORS 6.6 - 5x105 x 107 100: 1
6.6 + 1.3 x 105 1.3 x 108 1000: 1
8.9 - I x 104 3 x 107> 3000: 1 1) The MED is given as the number of bacteria per mouse (20 g).
2)> The highest dose given was ineffective.
Example 7
The sub-strain EIORB, isolated from a culture of K. peumoniae E10, was sown as described in Example 6 on nutrient broth (Difco) which had been brought to pH 8.9 with acidic dipotassium phosphate.
Part of the culture was incubated at 37 "C for 24 hours. Another part was matured after incubation at 37" C at room temperature for 3 days.
Both cultures were centrifuged, washed and suspended in saline at 2.6-106 bacteria per ml.
The number of live bacteria in each suspension was determined by the Miles and Misra method.
The following dilutions in saline were made for both suspensions: 1/10, 1/100, 1/300, 1/1000 and 1/3000. Groups of 5 mice infected with schistosomes were injected intravenously with 0.2 ml of these dilutions. Other groups of 5 mice were injected intraperitoneally with 0.2 ml of the undiluted suspension and the same volume of dilutions 1:10 and 1: 100.
Seven days after the injection, all the mice were sacrificed and the effect of the treatment was assessed using the Pellegrino method. This established the minimum effective dose (MED) of the two cultures for both modes of administration.
Results MEDI)
Strain maturation i.V. 2) i.p. 3) Ratio i.pSi.v.
EIORB - 3.6 x 105 3.6 x 106 10: 1 + <1.2> <x 104 104> 1.2 x 107 1000: 1 1) MED is given as the number of bacteria per mouse (20 g).
2) The lowest dose given was still effective.
3) Maximum dose given was ineffective.
Example 8
The Klebsiella E10 strain was cultured in Brain Heart Infusion broth (Difco) for 18 hours at 37 ° C. and then matured for 3 days at room temperature. One of 3 antisera was added to equal parts of this culture. A serum (S 182) was added by immunizing rabbits with a serologically defined and different strain (E 15). The other two antisera were produced with two variants of the E10 strain, the first of which was highly effective against schistosomes in mice (serum S 224), while the second was only had very little activity against schistosomes (Serum S 228). The agglutinated and non-agglutinated bacteria were collected, washed in saline, resuspended in saline, and replicated
Activity tested in mice.
In a second series of experiments, the strain E10 was grown in nutrient broth (Difco) which had been brought to pH 8.9 with K2HPO4 (approx. 5 g / liter). 10/0 glucose and 2/0 antiserum S 224 were added to this nutrient medium. In the course of the cultivation at 37 ° C. for 18 hours, some of the bacteria were agglutinated. The agglutinated and non-agglutinated bacteria were collected, washed in saline, resuspended in saline, and their activity was checked.
The results of these tests are given in the table below.
Efficacy of the strain Klebsiella E10 in mice after treatment with antisera medium glucose antiserum bacteria MED i.pli.v. (2 / o) ria from i.p. i.v. Ratio BHI S 182 S 1.2 X 108 1.2 x 107 10
A 1.3 x 107 4 x 105 30 BHl S 5 224 S 5 x 107 5 x 105 100
A> 6 x 107 6 x 104> 1000 BHI S 5 228 S 6 x 107 6 x 104 1000
A 2x106 2x107 0.1 NB 8.9 + S 224 S 1.2 x 107 4 x 104 300
A 1.2 x 107 1.2 x 105 100 Explanation:
:
BHI = Brain Heart Infusion Broth (Difco)
NB 8.9 = nutrient broth (Difco), brought to pH 8.9
S = bacteria collected from the supernatant
A = bacteria collected from the agglutinate
MED = minimum effective dose in number of bacteria per mouse i.p. = intaperitoneally infected with bacteria iN. = infected intravenously with bacteria Example 9
The Klebsiella E10 strain was cultured in Brain Heart Infusion broth to which 2% rabbit antiserum was added. Two sera were used. A serum (S 224) was prepared by immunizing a rabbit with a suspension of Klebsiella E10, which had been shown to be very active against schistosomes in mice.
The other serum (S 228) was prepared by immunizing a rabbit with a suspension of Klebsiella E10, which had shown very little activity against schistosomes in mice.
In both cultures, parts of the bacteria were agglutinated during their growth. These agglutinated bacteria were collected, washed with salt water and suspended in salt solution. Both suspensions were tested for their activity against schistosomes in mice. The results of this experiment are given in the following table.
The suspension E10-S 224, prepared with the aid of an antiserum of an active EI 0 strain, showed a lower MED and a higher i.p. / i.v. ratio than the suspension E10-S 228.
Strain dilution bacteria type number of oo-gram .pJiN.- per mouse of mice at ratio
Injection end / start E10 undam. 6 x 107 i.v. 4/5 S224 1/10 6 x 106 i.v. 5/5 +++ / +++ / +++ / +++ / +++
1/100 6 x 105 i.v. 4/4 +++ / +++ / +++ / +++ 1000 <1
1/300 2 x 105 i.v. 5/5
1/1000 6 x 104 i.v. 4/5 +++ / - / - / -
1/3000 2 x 104 i.V. 5/5 undamaged 6 x 107 i.p. 1/5 -
1/10 6 x 100 i.p. 5/5
1/100 6 x 105 i.p.
5/5 strain dilution bacteria type number of obgram i.pji.v per mouse of mice at ratio
Injection end / start E10 undam. 2 x 106 i.v. 4/5 +++ / +++ / +++ / +++ S228 1/10 2 x 10 'i.v. 4/5 +++ / +++ I +++ I +++ 10> 100 1/100 2 x 106 iN. 5/5 ¯ / -
1/300 6 x 10 'i.v. 5/5 - / - / - / - /
1/1000 2 x 105 i.v. 5/5 - / - / - / - / -
1/3000 6 x 104 i.v. 5/5 - / - / - / - / - undamaged 2 x 106 i.p. 3/5 ++ / ++ / +++
1/10 2 x l07 i.p. 3/5 +++ / +++ / +++
1/100 2 x 106 i.p. 5/5 +++ / +++ / - / - / - oo-gram:
: +++ = only ripe eggs present ++ = low percentage of unripe eggs found - = normal oo-gram iN. = Intravenous injection (0.2 ml per mouse) i.p. = Intraperitoneal injection (0.2 ml per mouse) Example 10
Klebsiella E10 was cultured in Brain Heart Infusion Broth (Difco) for 18 hours at 37 ° C. 2% rabbit antiserum was added to this medium. The serum (S 204) was prepared by immunizing a rabbit with a strain of Klebsiella E15. This particular strain was only moderately active against schistosomes in mice when injected intravenously. While growing in this medium, some of the bacteria agglutinated and were present as heavy sediment in the cultivation tube.
These agglutinated bacteria were removed, and the bacteria in the supernatant were recovered, washed and suspended in saline. This suspension E10-204 was used as follows in the experiments with mice and hamsters.
A second culture of Klebsiella E10 was prepared by sowing in a nutrient broth (Difco) with 10/0 glucose brought to pH 8.9 with acid dipotassium phosphate. The culture was left to incubate at 37 C for 18 hours. 2% rabbit antiserum was added to this culture. This serum (S 224) was prepared by immunizing rabbits with a special strain of Klebsiella E10 which had been found to be very active against schistosomes in mice when injected intravenously. The heavy precipitate that resulted from the addition of the antiserum was removed. The bacteria in the supernatant were recovered, washed in saline and suspended in saline.
This suspension E10-224 was compared with the suspension E10-204 with regard to the effectiveness in mice and hamsters infected with schistosomes.
The table shows the activity of the two strains in the mouse test. The E10-204 strain showed a low i.pJi.v. ratio, the E10-224 strain had a higher i.pJi.v. ratio (3 and 300, respectively). Both strains were tested in hamsters. Table 2 of this example shows the worm infestation and the oo-gram of untreated hamsters. Tables 3 and 4 of this example show the effectiveness of the two strains in the hamster test. The strain E10-204 again showed a low i.pJi.v. ratio (100: 10 =
10), while strain E10-224 showed a very high ratio (1000: 1 = 1000).
Table 1
Activity of strains E10-224 and E10-204 in the mouse test.
Strain dilution BaktJ i.vJi.p. Number of oo-gram i.pyi.v.-
Mouse type of mice at ratio
Injection Ends
Start of E10 undamaged 1.2 x 106 IV 4/5 +++ I +++ I +++ I +++ 224 1/10 i.v. 4/5
1/100 i.v. 4/5 +++ 1 +++ 1 +++ 1-
1/300 0.4 x 106 3/5 +++ / +++ / +++ 300: 1 = 30
1/1000 i.v. 3/5 - / - /
1/3000 i.v. 5/5 undamaged 1.2 x 106 i.p. 4/5 +++ / +++ / +++ /
1/10 1.p. 5/5 - / - / - / - / - i.p. 5/5 - / - / - / - / - strain dilution Baktl i.vJi.p.
Number of oo-gram i.p./i.v.-
Mouse type of mice in proportion
Injection end /
Start of E10 undamaged 8 x 10 'i.v. 3/5 +++ / +++ / +++ 204 1/10 i.v. 3/5 +++ / +++ / +++
1/100 i.v. 4/5 +++ l ++ l ++ l +++
1/300 2.7 x 105 IV 4/5 +++ / ++ / ++ / +++ 300: 100 = 3
1/1000 i.v. 3/5
1/3000 i.v. 5/5 undamaged 8 x 10 'i.p. 3/5 - / +++ / +++
1/10 i.p. 3/5 +++ / +++ / +++
1/100 i.p. 3/5 - / ++ / ++ oo-gram: +++ = only ripe eggs present ++ = low percentage of unripe eggs - = normal oo-gram i.v. = Intravenous injection (0.2 ml per mouse) i.p. = Intraperitoneal injection (0.2 ml per mouse)
Table 2
Untreated hamsters (control group, no deaths) worm infestation and oo-gram.
Pair of worms in oo-gram v. porta vv mesent.
15 12 normal
15 15 normal
12 8 normal
14 10 normal
5 5 normal
Table 3
Effectiveness of the E10-224 strain in the hamster test. Dilution Type of Baktd worm pairs in oo-gram Thera
Injections hamster peutisches v. porta vv mesent. result
1/10 Lc. 2.4 x 107 0 0 +++ +
1/100 i.c. 3 (4 66) 0 ++
4 (4 66) 0 - +
8 (4 b6) 12
1/300 i.c. 1 5 0 (266) 0 ++ +
15 10 1/1000 i.c. 0 (2 66) 3 (4 66) +++
4 6 - +
2 1 undamaged i.p. 2.4 x IOS 0 (6 66) 0
3 (3 66) 0 +++ + 1/10 i.p. 15 5
15 10
15 10
1/100 i.p. 15 10
15 20 oo-gram:
: +++ = only ripe eggs present ++ = low percentage of immature eggs - = normal oo-gram i.c. = Intracardiac injection (0.4 ml per hamster) i.p. = Intraperitoneal injection (0.4 ml per hamster)
Table 4
Efficacy of the E10-204 strain in the hamster test.
Dilution Type of Bakt.l pairs of worms in oo-gram Thera
Injection hamster peutisches v. porta vv mesent. Result 1110 i.c. 1.6 x 107 0 0 +++ +
0 0 1/100 i.c. O O
15 6 ++
10 12 1/300 i.c. 12 20 -
20 15 1/1000 i.c. 0 0 +++ undamaged i.p. 1.6 x 108 0 0 +++ + 1/10 i.p. 4 10
3 (6 ÏÏ) 0 ++ +
4 10 1/100 i.p. 20 20 -
15 15 Example 11
Albino mice from Clarkes O.S.I. Strain received about 150 cercariae (larvae) of Schistosoma mansoni by percutaneous route. Two weeks later, the presence of mature infections was established by the discovery of live schistosome eggs in the excrement of the mice.
At that time, each mouse was given a single intravenous injection of a saline suspension of Serratia marcescens containing an estimated 108 bacteria / ml. Each of the 5 mice received an estimated 3.2 x 10 'bacteria.
This suspension was prepared by allowing a freeze-dried sample from S, marcescens (Wellcome CN 1999) to incubate on nutrient agar at 28 ° C. overnight. The culture was harvested and washed in distilled water, then diluted in physiological saline for use. Estimates of the number of organisms in the suspensions were made using the translucent test.
The three surviving mice were sacrificed and examined 9 days later. It was found that 93.5% of the schistosomes were killed and in a state of decomposition in the intrahepatic vessels.