CH522602A

CH522602A - Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids

Info

Publication number: CH522602A
Application number: CH1895670A
Authority: CH
Inventors: Max Dr Brugger; Werner Dr Kahnt Friedrich; Bruno Dr Kamber; Robert Dr Neher; Bernhard Dr Riniker; Werner Dr Rittel; Sieber Peter; Herbert Dr Zuber; Marie Dr Greven Hendrik
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1968-02-06
Filing date: 1968-02-06
Publication date: 1972-06-30

Description

Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids der Formel I
EMI1.1

<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH-COS <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr-Cys-Val-LeuS <SEP> er-Ala- <SEP>
<tb> Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser- Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 worin R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe bedeutet, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, und/oder die Thiogruppe des Methioninrestes zur Sulfinylgruppe oxidiert ist,

oder ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.

Das Peptidamid der Formel I, worin die erste Aminosäure L-Cystein ist, und seine Analogen sind im Schweizer Hauptpatent Nr. 517 074 beschrieben.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwer lösliche Salze wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate zu nennen.

Acylgruppen für die Acylierung der Na-Aminogruppe sind die Reste von Carbonsäuren, wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclylaliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen Alkansäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, von monocyclischen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure, von unsubstituierten und Aryl-substituierten Aryl-niederalkylcarbonsäuren wie Phenylessigsäure, von 5- bis 6gliedrigen heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsäure, worin die Substituenten der Ringe z. B.

Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind. Weiter sind als Acylreste solche von Aminosäuren, besonders a-Aminosäuren, wie z.B. der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z.B. Niederalkyloxycarbonylgruppen wie Äthoxycarbonyl, tert. -Butyloxycarbonyl, ferner unsubstituiertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbamoyl sowie N-substituiertes Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z.B. N-Niederalkylcarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl, N-Phenyl-thiocarbamoyl, worin die Arylreste wie oben angegeben substituiert sein können.

Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z.B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z.B. Calgon N , Calgon 322 , Calgon 188 oder Polyron B 12 . Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.

Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Polyglutaminsäure.

Die neuen Verbindungen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma- Calcium- und -Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren.

Die neuen Verbindungen können daher zur Behandlung von Hypercalcämie und von Knochenkrankheiten wie Osteoporose verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des oben definierten Peptidamids der Formel I und seiner Analogen und der Säureadditionssalze dieser Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu ihrem Auf bau nötige Säuren bzw. deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindungen und unter oxidativer Bildung der Disulfidbrücke zwischen Cys1 und Cys7 in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die nach erfolgter Kondensation abgespalten werden, und zu Beginn oder in einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die N-terminale Aminogruppe in eine Acylaminogruppe überführt und die terminale Carboxylgruppe in die Amidgruppe überführt.

Wenn erwünscht, kann in Verbindungen, welche in 25-Stellung einen Methioninrest enthalten, die Thiogruppe dieses Restes zur Sulfinylgruppe oxidiert werden. Wenn der Acylaminorest R eine abspaltbare Acylgruppe, z.B. die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, enthält, kann man diese Gruppe abspalten. Man erhält so die im Schweizer Patent Nr. 517 074 beschriebenen Dotriacontapeptidamide mit freier a-Aminogruppe.

Erfindungsgemäss werden die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a -Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N' -Carbonyldiimidazols oder Isoxazoliumsalzes, z.B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden.

Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode. ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N Thiocarboxyanhydride. Im Schweizer Patent Nr. 517 074 ist der Aufbau des Dotriacontapeptidamids ausführlich beschrieben und durch Figuren veranschaulicht. In gleicher Weise können die Derivate der vorliegenden Anmeldung aufgebaut werden.

Als Schutzgruppen kommen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die leicht abgespalten werden können, z.B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse. Die Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz und der Schutzgruppen geschieht z.B. mit wasserfreiem Fluorwasserstoff.

Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert.-B.utyläther- gruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1 -tert. -butyloxycarbonyl- amino- oder -1 -benzyloxycarbonylamino-äthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z.B. mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Beim Aufbau des geschützten Dotriacontapeptids unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt.

Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehalgung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen.

Dieses kann zum geschützten Disulfid, z.B. mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan in organischen Lösungsmitteln, mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Patent Nr. 498 805.

Diese Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z.B. des Nonapeptids 1-9, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.

Die erhaltenen freien Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden.

Das Sulfoxid wird vorteilhaft durch Oxydation mit verdünnter Wasserstoffsuperoxydlösung in schwach saurem Medium hergestellt.

Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-, z. B. Aluminium- oder Zinkverbindungen werden in analoger Weise wie für AGIH bekannt, z.B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z. B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsäure usw. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B.

solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 45: sec. Butanol-3 WOiges wässriges Ammoniak (70:30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 :7,5 :21) System 54: sec. Butanol-Isopropanol 9 %ige Monochloressig säure (58 :8 :34) System 104: Chloroform-Methanol-17 %iges wässeriges Am- moniak (41:41:18)
Beispiel 1
EMI3.1

<tb> N Acetyl-Cys-S <SEP> er-Asn-Leu-S <SEP> er-ThiCys-Val-LeuS <SEP> er Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Ph e-His-Arg-Phe- Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2
EMI3.2

<tb> (Na-Acetyl-Thyrocalcitonin) <SEP> .

<SEP> -Thyrocalcitonin) <SEP>
<tb> <SEP> 1,2 <SEP> g <SEP> (1,2 <SEP> mMol) <SEP> Nacetyly55erA5nLeu5er <SEP>
<tb>
EMI3.3

<tb> Thrys-Val-LeuOH <SEP>
<tb> werden in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid und 123 mg N-Methylmorpholin gelöst.

Hierauf kühlt man die Lösung auf -15 , gibt unter Rühren
150 mg Pivaloylchlorid hinzu und hält das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf . Dann tropft man eine auf -15 gekühlte Lösung von 2,4 g (0,9 mMol) HS er-Ala-Tyr-Try-Arg- Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-diacetat in 50 ml Dimethylformamid, 100 mg N-Methylmorpholin, und Wasser hinzu. (Die Triacosapeptidlösung erhält man am besten, indem man das Peptid in dem Gemisch von Dimethylformamid und N-Methylmorpholin unter Stickstoff auf 50 erwärmt und unter Rühren sowie Wasser zutropft, bis das Peptid in Lösung geht).

Nach beendeter Zugabe wird über Nacht unter Stickstoff bei 0 belassen und hierauf im Hochvakuum bei 40 Badtemperatur auf ein Volumen von etwa 30 ml eingeengt. Man giesst das Konzentrat in 500 ml peroxydfreien Äther und saugt den entstehenden Niederschlag ab.

Das so erhaltene rohe Na-Acetyldotriacontapeptid wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung über 100 Stufen im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (5 :1 :4) unterworfen.

Aus den Verteilungselementen isoliert man beim Einengen reines Na-Acetyl-thyrocalcitonin.

Rf52 = 0,55 und Rf104 = 0,69.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Nonapeptidderivat kann wie folgt hergestellt werden:
50 ml konzentrierte Salzsäure werden auf -10" gekühlt, hierauf 3,0 g fein gepulvertes
EMI3.4

<tb> BOC-Cys-S <SEP> er(tBu)-Asn-Leu
EMI3.5

<tb> Ser-(tBupThr(tBu)-Cys-Val-Leu-OH <SEP> (vgl.
<tb>

Schweizer Patent Nr. 517 074 unter Rühren eingetragen, die Luft durch Stickstoff verdrängt, auf 0 erwärmt und 10 Minuten bei 0 belassen. Dann gibt man 250 ml Eiswasser und 20 ml Eisessig zu und filtriert über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch., Acetatform. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Lyophilisat löst man in 30 ml Wasser, stellt das pH der Lösung durch Zugabe von Pyridin auf 6,8 und versetzt mit dem dreifachen Volumen Dimethylformamid. Hierauf fügt man eine Lösung von 600 mg p-Nitrophenylacetat in 5 ml Dimethylformamid zu und lässt 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann dampft man bei 35" Badtemperatur und 0,01 mm Hg zur Trockne ein und gibt 100 ml 1 %ige Lösung von Pyridin in Äther zu.

Man zerreibt das ausgefallene Nonapeptidderivat gut, nutscht es ab, wäscht es mit Äther nach und trocknet es im Vakuumexsikkator über konz. Schwefelsäure. Zur Reinigung wird das Produkt in Butanol-Wasser (3 :1) gelöst und über eine im gleichen Lösungsmittel bereitete Säure (3,8 cm; 95 cm) Sephadex LH-20 chromatographiert. Man fängt Fraktionen à 10 ml auf, kontrolliert ihre Reinheit dünnschichtchromatographisch auf Silicagelplatten (System 121A), vereinigt die reinen Fraktionen, dampft zur Trockne ein und trocknet bei 35 Badtemperatur und 0,01 mm Hg.

Das als Ausgangsmaterial verwendete HSer-Ala-Tyr Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-diacetat wird wie folgt bereitet: 3,4 g DPC-Ser(tBu > Ala-Tyr(tBu)-Try- Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Ph eHis-Arg-PheS er(tBu)-Gly- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2 (vgl. Schweizer Patent Nr. 517 074 werden in 60 ml 80 %iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird 6 Stunden bei 35 stehengelassen. Hierauf dampft man sie zur Trockne ein, zerreibt den Rückstand mit peroxydfreiem Äther, nutscht das erhaltene Pulver ab, trocknet es und löst es in 50 ml 95 %iger Trifluoressigsäure. Man lässt 1,5 Stunden unter Stickstoff bei 25" stehen, dampft dann auf ein Volumen von etwa 5 ml ein und giesst in 300 ml peroxydfreien Äther ein.

Man nutscht den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet über Natriumhydroxyd im Exsikkator. Hierauf löst man in 10 %iger Essigsäure und filtriert über eine Säule von Merck Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform). Man wäscht die Säule so lange mit 10%iger Essigsäure nach, bis das Eluat im UV bei 280 mu keine Absorption mehr zeigt, dampft das Eluat zur Trockne ein, löst den Rückstand in Wasser und lyophilisiert.

Beispiel 2
EMI3.6

<tb> N&alpha;-Acetyl-Cys-S <SEP> er-A <SEP> sn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cys-Val-LeuS <SEP> er- <SEP>
<tb> Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Ph e- Ser-Gly-M et (O > Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (N&alpha;-Acetyl-Thyrocalcitoninsulfoxid).

Man löst 15 mg Thyrocalcitoninsulfoxid (vgl. Schweizer Hauptpatent Nr. 517 074) in 10 ml Wasser und stellt das pH durch Zugabe von Pyridin auf 6,5. Zur Lösung gibt man 4 ml einer frisch hergestellten 0,5 %igen Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid-Wasser (1 :3) und lässt während 3 Stunden bei 45 stehen. Dann fügt man 1,2 ml 5n Essigsäure zu und extrahiert das gebildete p-Nitrophenol und das überschüssige p-Nitrophenylacetat mit Essigester.

Die wässrige Phase wird zur Trockne eingeengt, in 3 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Das so erhaltene Rohprodukt wird in einer Craig-Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (5 :1 Vol.) mit Phasenvolumina von je 3 rpl über 181 Stunfen verteilt. Aus den Verteilungselemen ten Nr. 108-127 (#max=117; K=1,82) isoliert man beim Einengen zur Trockne insgesamt 11,5 mg reines N-Acetyl- Thyrocalcitoninsulfoxid. Die Substanz weist im Dünnschichtchromatogramm auf Aluminiumoxid ( Camag ) folgende Rf-Werte auf: Rf52=0,51 und Rf104=0,64.

Auf Cellulose-Dünnschichtplatten ( Avicel ): Rf54=0,61.

Sie ist, im Gegensatz zu Thyrocalcitoninsulfoxid, Ninhydrin-negativ.

Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat-Streifen ( Cellogel ) wandert sie (bei pH 1,9 und 9 Volt/cm) in 90 Minuten 0,5 cm zur Kathode.

In gleicher Weise kann man ausgehend von Thyrocalcitonin das N-Acetyl-thyrocalcitonin herstellen. An Aluminiumoxid ist Rf52 = 0,55; Rf104=0,69.

Beispiel 3
EMI4.1

<tb> N-Phenylthiocarbamoyl-H-Cys-S <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-His-Arg-PheS er-Gly-Met(O )-Gly-Phely-Pro- Glu-ThrPro-NH2 (N&alpha;-Phenylthiocarbamyl-Thyrocalcito- ninsulfoxid).

10 mg Thyrocalcitoninsulfoxid werden in 2 ml Pyridin Wasser (1 :1) gelöst und mit 15 ml Phenylisothiocyanat unter Stickstoff 11/2 Stunden bei 20 reagieren gelassen.

Man extrahiert das Gemisch 4mal mit 3 ml Benzol und bringt die wässrige Lösung im Vakuumexsiccator zur Trockne. Man löst den Rückstand in je 3 ml Unter- und Oberphase des Systems n-Butanol-Eisessig-Wasser (5 :1 :4) und reinigt ihn durch multiplikatve Verteilung in dem genannten System (je 3 ml Ober- und Unterphase) über 177 Stufen. Fraktionen zu je 10 Elementen werden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 6 mg reines Na-Phenylthiocarbamyl- Thyrocalcitoninsulfoxid, das mit Chlor-Tolidin-Reagens, Bartons Reagens und Paulys Reagens positiv, mit Ninhydrin negativ reagiert.

In der Elektrophorese auf kristalliner Cellulose ( Avicel ) zeigt das Produkt bei pH 1,9 eine kathodische Wanderstrecke von 2,7 cm (Ausgangsprodukt 3,5 cm); Rf-Wert auf Alox im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) 0,55 (Ausgangsmaterial (0,45), auf Cellulose im gleichen System 0,29 (Ausgangsmaterial 0,20). Spezifische Aktivität: 40 MRC-Einheiten/mg.

Beispiel 4
EMI4.2

Na-Pvrogutamyi-CysS <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr-Cys-Val LeuS er-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His- Arg-PheS erGly-Met (0 )ly-Phe43ly-Prolu-Thr- PrNH2(N"-Pyrogiutamyl-Thyrocaldtononsulfoxyd).

Man löst 15 mg Thyrocalcitoninsulfoxid in 1 ml Dimethylformamid, 1 ml 0,1 %igem Triäthylamin in Dimethyl.- formamid (pH 6,7) und 0,3 ml Wasser, fügt 0,2 ml 1 sogen Pyroglutamyl-2,4,5-trichlorphenylester hinzu und lässt 72 Stunden bei 20 stehen. Dann gibt man wenig Wasser hinzu, dampft unter vermindertem Druck ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 :1 :5; obere und untere Phase je 3 ml) über 397 Stufen unterworfen. Na-Pyroglutamyl- Thyrocalcitoninsulfoxid befindet sich in den Stufen 270 bis 345 (Maximum in Element 310). Diese Fraktionen werden vereinigt, die Lösung eingeengt und lyophilisiert.

Das erhaltene Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm die folgenden Rf-Werte bezogen auf Thyrocalcitonin sulfoxid =1,0 auf: aus Aluminiumoxid (Alox):Rf52= 1,0:Rf104= 1,0; auf Cellulose:Rf1Ol = 1,05 :Rfs4 = 1,01.

In der Elektrophorese wandert es bezogen auf Thyrocalcitoninsulfoxid = 1,0 gegen die Kathode: auf Cellogel, pH 1,9, 140 Volt :0,39, auf Cellulose Selecta, pH 1,9, 140 Volt:0,81.

PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids der Formel I
EMI4.3

<tb> <SEP> s
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH-COS <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr-Cys-VaiLeuS <SEP> er-Ala- <SEP>
<tb> 'lyr-'ITy-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Ar cly-Met-Gly-PheGly-Pro-Glu-Thr-PrNHz, worin R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe bedeutet, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, und/oder die Thiogruppe des Methioninrestes zur Sulfinylgruppe oxydiert ist, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende, zu ihrem Aufbau nötige Säuren bzw.

deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindungen und unter oxidativer Bildung der Disulfidbrücke zwischen Cysl und Cys7 in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die nach erfolgter Kondensation abgespalten werden, und zu Beginn oder in einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die N-terminale Arninogruppe in eine Acylaminogruppe überführt und die terminale Carboxylgruppe in die Amidgruppe überführt.

UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Carboxylschutzgruppe die tert. -Butyl- estergruppe verwendet.

2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hydroxylschutzgruppe die tert.-Butyl äthergruppe verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aminoschutzgruppe die tert.-Butyloxycarbonylgruppe verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man in erhaltenen Verbindungen mit einem Methioninrest in 25 Stellung die Thiogruppe dieses Restes zur Sulfinylgruppe oxydiert.

5. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel I herstellt, worin R für die Acetylaminogruppe steht.

PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen Peptidamiden zur Herstellung von Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptidamide durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Stoffen mit saurem Charakter, welche durch Komplexbildung die Wirkung basischer Peptide verlängern, in solche Komplexe überführt.

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

**WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **.

Beispiel 3 EMI4.1 <tb> N-Phenylthiocarbamoyl-H-Cys-S <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-His-Arg-PheS er-Gly-Met(O )-Gly-Phely-Pro- Glu-ThrPro-NH2 (Nα-Phenylthiocarbamyl-Thyrocalcito- ninsulfoxid).

10 mg Thyrocalcitoninsulfoxid werden in 2 ml Pyridin Wasser (1 :1) gelöst und mit 15 ml Phenylisothiocyanat unter Stickstoff 11/2 Stunden bei 20 reagieren gelassen.

Man extrahiert das Gemisch 4mal mit 3 ml Benzol und bringt die wässrige Lösung im Vakuumexsiccator zur Trockne. Man löst den Rückstand in je 3 ml Unter- und Oberphase des Systems n-Butanol-Eisessig-Wasser (5 :1 :4) und reinigt ihn durch multiplikatve Verteilung in dem genannten System (je 3 ml Ober- und Unterphase) über 177 Stufen. Fraktionen zu je 10 Elementen werden vereinigt, eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 6 mg reines Na-Phenylthiocarbamyl- Thyrocalcitoninsulfoxid, das mit Chlor-Tolidin-Reagens, Bartons Reagens und Paulys Reagens positiv, mit Ninhydrin negativ reagiert.

In der Elektrophorese auf kristalliner Cellulose ( Avicel ) zeigt das Produkt bei pH 1,9 eine kathodische Wanderstrecke von 2,7 cm (Ausgangsprodukt 3,5 cm); Rf-Wert auf Alox im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) 0,55 (Ausgangsmaterial (0,45), auf Cellulose im gleichen System 0,29 (Ausgangsmaterial 0,20). Spezifische Aktivität: 40 MRC-Einheiten/mg.

Beispiel 4 EMI4.2 <tb> <SEP> II. <SEP> <tb>

Na-Pvrogutamyi-CysS <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr-Cys-Val LeuS er-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His- Arg-PheS erGly-Met (0 )ly-Phe43ly-Prolu-Thr- PrNH2(N"-Pyrogiutamyl-Thyrocaldtononsulfoxyd).

Man löst 15 mg Thyrocalcitoninsulfoxid in 1 ml Dimethylformamid, 1 ml 0,1 %igem Triäthylamin in Dimethyl.- formamid (pH 6,7) und 0,3 ml Wasser, fügt 0,2 ml 1 sogen Pyroglutamyl-2,4,5-trichlorphenylester hinzu und lässt 72 Stunden bei 20 stehen. Dann gibt man wenig Wasser hinzu, dampft unter vermindertem Druck ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird einer multiplikativen Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 :1 :5; obere und untere Phase je 3 ml) über 397 Stufen unterworfen. Na-Pyroglutamyl- Thyrocalcitoninsulfoxid befindet sich in den Stufen 270 bis 345 (Maximum in Element 310). Diese Fraktionen werden vereinigt, die Lösung eingeengt und lyophilisiert.

Das erhaltene Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm die folgenden Rf-Werte bezogen auf Thyrocalcitonin sulfoxid =1,0 auf: aus Aluminiumoxid (Alox):Rf52= 1,0:Rf104= 1,0; auf Cellulose:Rf1Ol = 1,05 :Rfs4 = 1,01.

In der Elektrophorese wandert es bezogen auf Thyrocalcitoninsulfoxid = 1,0 gegen die Kathode: auf Cellogel, pH 1,9, 140 Volt :0,39, auf Cellulose Selecta, pH 1,9, 140 Volt:0,81.

PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids der Formel I EMI4.3 <tb> <SEP> s <tb> <SEP> CH2 <tb> R-CH-COS <SEP> er-Asn-LeuS <SEP> er-Thr-Cys-VaiLeuS <SEP> er-Ala- <SEP> <tb> 'lyr-'ITy-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Ar cly-Met-Gly-PheGly-Pro-Glu-Thr-PrNHz, worin R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe bedeutet, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, und/oder die Thiogruppe des Methioninrestes zur Sulfinylgruppe oxydiert ist, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende, zu ihrem Aufbau nötige Säuren bzw.

deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindungen und unter oxidativer Bildung der Disulfidbrücke zwischen Cysl und Cys7 in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die nach erfolgter Kondensation abgespalten werden, und zu Beginn oder in einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die N-terminale Arninogruppe in eine Acylaminogruppe überführt und die terminale Carboxylgruppe in die Amidgruppe überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Carboxylschutzgruppe die tert. -Butyl- estergruppe verwendet.

2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hydroxylschutzgruppe die tert.-Butyl äthergruppe verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aminoschutzgruppe die tert.-Butyloxycarbonylgruppe verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man in erhaltenen Verbindungen mit einem Methioninrest in 25 Stellung die Thiogruppe dieses Restes zur Sulfinylgruppe oxydiert.

5. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel I herstellt, worin R für die Acetylaminogruppe steht.

PATENTANSPRUCH II Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen Peptidamiden zur Herstellung von Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptidamide durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Stoffen mit saurem Charakter, welche durch Komplexbildung die Wirkung basischer Peptide verlängern, in solche Komplexe überführt.