Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums 460
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen antibiotisch wirksamen Produktes. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur fermentativen Herstellung eines antibiotisch wirksamen Produktes, bei welchem eine bisher unbeschriebene Variante des Mikroorganismus Micromonospora chalcea der Ordnung Actinomycetales verwandt wird, die Isolierung eines Antibiotikumgemisches aus diesem Produkt, die Auftrennung dieses Gemisches in die enthaltenen Antibiotika.
Ein erfindungsgemässes Verfahren zur Herstellung eines antibiotisch wirksamen Produktes besteht darin, dass man die vorerwähnte Variante von Micromonospora chalcea oder einen äquivalenten Mikroorganismus bebrütet, bis ein Produkt mit guter antibiotischer Wirksamkeit gebildet ist.
Aus diesem Produkt kann man ein Antibiotikumgemisch isolieren, das im folgenden kurz Antibiotikum 460 genannt wird. Dieses Antibiotikum 460 ist eine Mischung von drei nahe verwandten antibiotischen Substanzen, in welche es aufgetrennt werden kann und die im folgenden Antibiotikum460-Komponenten A, B und C genannt werden. Im folgenden wird die Herstellung dieser Antibiotika beschrieben.
Der Mikroorganismus
Der im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Mikroorganismus ist eine Variante von Micromonospora chalcea var. flavida genannt wird. Ein für die Verwendung im erfindungsgemässen Verfahren besonders geeigneter Stamm des Mikroorganismus wurde aus einer von einer bestimmten Stelle im Staate New York (USA) entnommenen Bodenprobe isoliert.
Eine Kultur der erfindungsgemäss vorzugsweise verwendeten Mikroorganismen wurde in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Departement of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihrer NRRL-Nummer 3222 erhältlich ist.
Man erreicht die Isolierung des Mikroorganismus dadurch, dass man etwas von einer getrockneten Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser schüttelt und dann die Suspension nach Verdünnung auf ein geeignetes gesiebtes Agarmedium aufstreicht. Die getrocknete Bodenprobe stammt von der erwähnten Stelle im Staat New York, falls der vorerwähnte Stamm M. chalcea var. flavida im erfindungsgemässen Verfahren verwendet wird.
Die mikroskopische Untersuchung von 21 Tage alten Kulturen von M. chalcea van flavida auf einem Medium, das aus 3 /0 NZ Amin Typ A (ein bei der enzymatischen Verdauung von Casein entstehendes Pepton, das als Stickstoffquelle dient und bei Sheffield Chemical Company, Norwich, New York, erhältlich ist), 1% Dextrose und 1,5 /o Agar besteht, ergibt, dass sich der Mikroorganismus durch ein langes, wenig verzweigtes Mycel mit einem ungefähren Durchmesser von 0,5 lt auszeichnet. Die Sporen sind nicht reichlich und sind Einzelsporen. Sie sind oval bis kugelförmig, haben einen Durchmesser von 1,8 - 1,0 lt und treten gerne bräunlich in Erscheinung.
Diese Kultur zeigt bei makroskopischer Betrachtung gutes Wachstum und kein Luftmycel und hat ein gefaltetes Aussehen.
Kolonien von M. chalcea van flavida kann man ferner durch ihr Aussehen und ihr Wachstum auf verschiedenen Nährmedien charakterisieren. Die folgende Tabelle : enthält die Wachstums- und Farbmerkmale von M. van flavida auf einigen häufig verwendeten Nährböden. Die Beobachtungen wurden an Kolonien gemacht, die durch 21tägige Bebrütung bei 24 bis 26 "C der vorerwähnten Mikroorganismen auf den bezeichneten Medien erhalten wurden. Bei der Beschreibung der Farbmerkmale wurde das folgende System und die folgende Bezeichnungsweise verwandt: Die Farbbezeichnung besteht aus zwei Angaben.
Die jeweils erste Angabe ist der Farbname gemäss Descriptive Color Name Dictionary von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950 (USA), in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer; diese Nummer ist dem Color Harmony Manual , vierte Auflage, 1958, herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen. Die zweite Angabe besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer entsprechend dem Synonym oder ungefähren Synonym des Circular 553 vom 1. November 1955 des National Bureau of Standards (U.S.A.).
Tabelle I
Beobachtungen von Merkmalen von Kolonien auf verschiedenen Medien
Verwendetes Medium Beobachtungen Glucose-Asp aragin-Agar Wachstum: Mittelmässig
Farbe: Aprikosenfarbig-g4ga
Hellorange-52
Bennett's Agar Wachstum: Mittelmässig, faltig gefurcht
Farbe: Orange-g4La
Tieforange-50
Emerson's Agar Wachstum: Gut, gefaltet
Farbe: Pastellorange-g41c
Mittelorange-53 Tomafenmark- Wachstum: Gut, gefurcht
Hafermehl-Agar Farbe: Feuerrot-g5NC
Tiefrotorange-35 Glucose Wachstum: Gut, erhöht, faltig
Hefeextrakt-Agar Farbe: Backsteinrot-g5NG
Tiefbraun-55
Der Mikroorganismus zeigt gutes Wachstum auf Kohlen hydraten wie Glucose, Arabinose, Galactose, Lactose, Laevu lose, Mannose, Raffinose, Stärke, Saccharose, Xylose und
Melibiose.
Er wächst kümmerlich, wenn überhaupt, auf Me dien, die als einziges Kohlenhydrat Rhamnose, Inosit, Man nit, Sorbit, Ribose oder Glycerin enthalten.
Angaben über die Stickstoff-Nutzung von M. chalcea van flavida auf verschiedenen stickstoffhaltigen Medien ist in der folgenden Tabelle II zusammengefasst:
Tabelle II
Stickstoffquellen-Nutzung
Stickstoffquelle mit Beobachtungen einem Gehalt von 1 Gewichts prozent Glucose 0,5 /0 Difco Wachstum: Gut, faltig Hefeextract* Farbe: Dunkelgewürzbraun L-g4PL
Dunkelbraun-59
1% NZ Amin Wachstum: Mittelmässig, faltig Typ A Farbe: Rostbraun-g5LE
Tiefbraun-55
1% Asparagin Wachstum: Kümmerlich, ungewiss
1% Glutaminssäure Wachstum: Kümmerlich, ungewiss
1% Natriumnitrat Wachstum: Kümmerlich, ungewiss
1% Ammoniumnitrat Wachstum: Kümmerlich, ungewiss * Hefe-Extract Disco ist ein Produkt der Fa.
Disco Laboratories Inc., Detroit (U.S.A.) Weitere Kulturmerkmale von M. chalcea var. flavida, die auf einigen typischen Labormedien beobachtet wurden, sind die folgenden: Kartoffelscheibe - Wachstum: gut. Gelatine - Es erfolgt Verflüssigung. Milch - Verdaut. Czapek's Agar Wachstum: mittelmässig. Tyrosin-Agar - Wachstum: mittelmässig; sich auflösende Kristalle und ein rötlichbraunes diffundierendes Pigment. Pepton-Eisen-Agar - kein diffundierendes Pigment. (Mit Tyrosin-Agar und Pepton-Eisen-Agar wurden die Beobachtungen an 2, 7 und 14 Tagen nach Gordon und Smith, J.
Bact. 69, 147 gemacht.)
M. chalcea van flavida zeigt ein befriedigendes Wachstum im Temperaturbereich von ungefähr 20 bis 45 "C und bei einem pH-Bereich von ungefähr 6 bis 8, bestes Wachstum jedoch im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen 26 und 37 "C und bei einem pH- WµLW /0PH-Wert zwischen 6,5 und 7,8. Wenig oder kein Wachstum findet bei einer Temperatur von 50 "C statt. M. chalcea van flavida ist aerob und reduziert Nitrat zu Nitrit.
Während der mit NRRL 3222 bezeichnete Stamm von M. chalcea van flavida in erster Linie wegen seiner leichten Erhältlichkeit ein besonders geeignetes Ausgangsmaterial für das Verfahren darstellt, versteht es sich, dass andere Stämme der Variante und andere äquivalente Mikroorganismen annehmbare Alternativlösungen sind. Weiterhin können Mutanten von M. chalcea var. flavida, die dadurch erhalten sind, dass der Mikroorganismus, z. B. vom Stamm NRRL 3222, der Einwirkung eines Mutationsmittels, wie Hochfrequenzstrahlung (einschliesslich Röntgenstrahlung und Ultraviolettstrahlung), Actinophagen und/oder Stickstofflost, unterworfen wird, auch als Ausgangsmaterial geeignet sein, die nach Bebrütung unter geeigneten Bedingungen ein Produkt liefern, das gute antibiotische Wirksamkeit hat, aus dem das Antibiotikum 460 isoliert werden kann.
Bebrütung des Mikroorganismus
M. chalcea var. flavida liefert bei kontrollierter Bebrütung ein Produkt mit guter antibiotischer Wirksamkeit, das aus einem komplizierten Gemisch antibiotischer Substanzen besteht, aus dem das Antibiotikum 460 isoliert werden kann.
Zur Herstellung dieses Gemisches kann man erfindungsgemäss M. chalcea var. flavida unter aeroben Bedingungen im Temperaturbereich von 20"-45 "C, vorzugsweise von 25 -40 C, wachsen lassen. Die Bebrütung wird vorzugsweise unter Schütteln oder Rühren unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von ungefähr 6,0 bis 8,0 durchgeführt, wobei ein pH-Bereich von 6,5 bis 7,8 häufig besonders vorteilhaft ist. Die Bebrütungszeit beträgt üblicherweise 2 bis 7 Tage, vorzugsweise 4 bis 7 Tage, obwohl kür-zer oder länger bebrütet werden kann.
Die normalerweise bei der Bebrütung verwandten Medien sind wässrig und enthalten von den Mikroorganismen assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen. Geeignete Kohlenstoffverbindungen sind z. B. Kohlenhydrate, wie Stärke, Dextrin und Zucker. Geeignete Stickstoffverbindungen sind sowohl organische als auch anorganische Stickstoffverbindungen, vorzugsweise die ersten, wie z. B. das Handelsprodukt NZ-Amin Typ A.
Zwei Beispiele einer Zusammensetzung eines für den Mikroorganismus geeigneten Bebrütungsmediums sind: Medium 1: Hefeextrakt 0,5%, Fischauszüge 0,1 /o, Cornsteep li- quor 0,1%, Lactose 3% und Calciumcarbonat 0,1 /o; Medium II: Rindfleischextrakt 0,3 /0, Tryptose 0,5 /0, Dextrose 0,1 /o und Hefeextrakt 0,5 /0.
Es ist zweckmässig, wenn die Bebrütungsmedien ein Ingredienz enthalten, das mitwirkt, die Alkalität und Acidität der Medien im Gleichgewicht zu halten. So enthalten Medium 1 und II Calciumcarbonat zu diesem Zweck.
Die so erhaltene Zusammensetzung besteht aus einem Mycel und einer Brühe und zeigt als ganzes eine gute antibiotische Wirksamkeit, die im allgemeinen hauptsächlich in der Brühe konzentriert ist.
Isolierung des Antibiotikums 460
Das Antibiotikum 460 kann aus der Brühe isoliert werden, indem man das ganze bebrütete Nährmedium mit einer starken Säure, wie Schwefelsäure, auf einen pH-Wert von ungefähr 2,0 ansäuert. Dann trennt man das Mycel ab, und zwar normalerweise durch Filtration, wobei man z. B. eine Diatomeenfilterhilfe verwendet. Aus der mycelfreien Brühe trennt man das antibiotische Gemisch nach einer von zahlreichen verschiedenen Methoden ab, z. B. durch Bildung eines unlöslichen Salzes, mittels einer Harzmethode oder mittels Lösungsmittelextraktion.
Eine charakteristische Anwendung der Harzmethode besteht darin, dass die Brühe zuerst mit einem starken Alkali neutralisiert wird, z. B. mit Natrium- oder Kaliumhydroxid.
Die neutralisierte Brühe wird dann mit Ammoniumoxalat behandelt, wobei das im Medium vorhandene Calcium als schwerlösliches Oxalatsalz ausgefällt wird. Man trennt das Calciumoxalat durch Filtration und das Antibiotikum 460 vom Filtrat durch Absorption an einem lonenaustauscherharz, wie ein Harz vom lRC-50-Amberlit-Typ, ab. Beispiele geeigneter Harze vom lRC-50-Amberlit-Typ, sowohl Anionen- als auch Kationenaustauscher, kann man im Handbook of Chemistry and Physics , 42. Auflage, Chemical Rubber Publishing Company, Cleveland, Ohio (USA), finden. Das Antibiotikum wird dann durch Säurebehandlung vom Harz eluiert. Das saure Eluat kann dann beispielsweise mittels eines Anionenaustauscherharzes neutralisiert und die Antibiotikumlösung lyophilisiert werden, bevor sie mittels einer Standard-Agar-Diffusionsmethode geprüft wird.
Auftrennung des Antibiotikums 460 in seine Komponenten
Das Antibiotikum 460 ist, wie vorher erwähnt, ein Gemisch dreier verwandter Antibiotika, in welche es leicht aufgetrennt werden kann. Zahlreiche Methoden sind für diese Auftrennung geeignet. Die Aufteilung erfolgt zweckmässig nach einer Chromatographiemethode. Ein geeignetes Auftrennverfahren ist die Verteilungschromatographie. Dabei wird das Antibiotikumgemisch durch eine Säule geschickt, die Kieselsäure als inertes Trägermaterial enthält, und die Säule wird dann mit einer Lösungsmittelmischung eluiert, die im wesentlichen die folgende Zusammensetzung hat (in Volumenteilen): Äthanol 20, Essigsäure 8, Essigsäureäthylester 8, Wasser 8 und Pyridin 4.
Das von dieser Säule erhaltene Eluat enthält drei unterschiedliche Fraktionen, die in der Reihenfolge ansteigender Polarität, d. h. abnehmender Beweglichkeit unter den gewählten Bedingungen, Fraktionen 1, 2 und 3 genannt werden. Fraktion 1 hat einen bioautographischen RrWert von ungefähr 0,95; für sie benötigt man üblicherweise ungefähr 15 bis 20 /o des Gesamteluatvolumens zur Elution; Fraktion 1 besteht aus ungefähr 75 bis 80 Gewichtsprozent des gesamten erhaltenen wirksamen Materials. Fraktion 2 hat einen bioautographischen RrWert von ungefähr 0,25; man benötigt für sie ungefähr 40 bis 42 /o des gesamten Eluatvolumens zur Elution; Fraktionen 2 besteht aus ungefähr 10 bis 15 Gewichtsprozent des gesamten erhaltenen wirksamen Materials.
Fraktio 3 hat einen bioautographischen RrWert von ungefähr 0,20; man benötigt für sie ungefähr 40 bis 48 /o des gesamten Eluatvolumens zur Elution; Fraktion 3 besteht aus ungefähr 10 bis 15 Gewichtsprozent des gesamten erhaltenen wirksamen Materials.
Jede Fraktion wird dann durch Eindampfen im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der so erhaltene Rückstand ist das Antibiotikum 460 Komponente A, B oder C, je nachdem von welcher Eluatfraktion er stammt. Der Rückstand wird dann in Wasser gelöst, die Lösung filtrieruunddas Filtrat lyophilisiert.
Das Antibiotikum 460 und seine Komponenten A, B und C können beispielsweise durch Waschen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel und/oder durch Umkristallisation aus solch einem Lösungsmittel gereinigt werden. Sie können auch in Derivate umgewandelt werden, wie z. B. in Säureadditionssalze, in N- und O-Acylverbindungen, in Bisulfit-Additionsprodukte und in Sulfonamide. Das folgende Beispiel dient zur weiteren Veranschaulichung gewisser Züge dieser Erfindung, insbesondere der Bebrütung von M. chalcea van flavida, der Abtrennung der Brühe vom erhaltenen bebrüteten Nährmedium, die Isolierung des Antibiotikums 460 davon und die Auftrennung dieses Antibiotikumgemisches in seine Komponenten.
Beispiel A. Keimung
100 ml steriles Medium II (siehe oben) werden in einem 300-ml-Erlenmeyerkolben mit M. chalcea var. flavida von einer Agarschrägplatte bebrütet. Man setzt den Kolben auf eine rotierende Schüttelmaschine (250-275 Umdrehungen pro Minute) und lässt die Kultur 3 Tage bei 35 "C wachsen.
Diese Kultur ist ausreichend zum Beimpfen von vier 2-Liter Bebrütungen.
B. Bebrütung
Man gibt 25 ml des oben hergestellten Inokulums aseptisch in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben, der 500 ml steriles Medium I enthält. Der Kolben wird auf eine rotierende Schüttelmaschine gesetzt und die Kultur 5 bis 6 Tage bei 28 "C bebrütet, wobei der pH-Wert durch mehrmalige Zugabe von Calciumcarbonat auf ungefähr 7 gehalten wird.
Der Ansatz wird während der 5 bis 6 Tage in gleichen Zeitabständen geprüft, um die maximale Wirksamkeit gegen S.
aureus, S. lutea, B. subtilis und K. pneumoniae zu bestimmen.
C. Abtrennung
Die erhaltene Reaktionsmischung, d. h. das bebrütete
Nährmedium, wird auf einen pH-Wert von 2,0 mit 6N
Schwefelsäure angesäuert und nach Zusatz von Diatomeen erde als Filterhilfe filtriert, um die Brühe abzutrennen. Das
Filtrat wird mit 6N Natriumhydroxid neutralisiert und Am moniumoxalat hinzugefügt, um das im Medium enthaltene
Calcium als sein schwerlösliches Oxalatsalz niederzuschla gen. Die Suspension wird filtriert und das niedergeschlagene
Calciumoxalat verworfen.
D. Isolierung
5 bis 6 g IRC-50-Kationenharz (Natriumsalzform) werden im Filtrat suspendiert und die Suspension eine halbe Stunde gerührt. Die Suspension wird dann filtriert und die Adsorp tionsstufe mit 5 bis 6 g frischem Harz wiederholt. Die Sus pension wird filtriert und das Filtrat verworfen. Das ver einigte Harz wird von Brüheresten frei gewaschen und dann in 50 ml Wasser suspendiert. Zur Suspension fügt man unter
Rühren genügend 3N Schwefelsäure hinzu, um die Suspen sion auf einen pH-Wert von 2,0 zu bringen, auf dem sie 30
Minuten lang gehalten wird. Sie wird dann filtriert, das Harz verworfen, das Filtrat neutralisiert und das Antibiotikumge misch an 20 g neutraler sulfationenfreier Aktivkohle (Sieb nummer 20 bis 40) adsorbiert.
Danach wird die Aktivkohle mit demineralisiertem Wasser gewaschen, bis das Waschwas ser sulfatfrei ist, was mit Bariumchlorid-Lösung geprüft wird.
Das Antibiotikumgemisch wird aus der Aktivkohle extra hiert, indem man sie 1 Stunde in 120 ml einer 1:1 Mischung von 1N Schwefelsäure und Methanol heftig schüttelt oder rührt. Die Aktivkohle wird dann durch Filtration abgetrennt, das Filtrat auf 25 ml durch Erhitzen im Vakuum eingeengt, das Konzentrat lyophilisiert und so ungefähr 50 mg Antibio tikum 460 erhalten.
E. Auftrennung
420 mg des Rohantibiotikums 460 (erhalten durch Verei nigen mehrerer Ansätze) werden in 20 ml Wasser gelöst und zum Absorbieren der Lösung 5,0 g Kieselsäure hinzugefügt.
Die Kieselsäure wird im Vakuum getrocknet und für die wei tere Verarbeitung aufgehoben. Eine Chromatographiersäule (Länge 80 cm, Durchmesser 3,5 cm) wird mit Kieselsäure bis zu einer Länge von 72 cm beschickt und die Antibiotikum Kieselsäure-Mischung von oben in den oberen Teil der Säule gefüllt.
Das Eluierlösungsmittel bestehend aus 20 Teilen Äthanol, 8 Teilen Essigsäure, 8 Teilen Essigsäureäthylester, 8 Teilen Wasser und 4 Teilen Pyridin (jeweils Volumenteile) lässt man mit einer Geschwindigkeit von 1,0 ml pro Stunde durch die Säule laufen und man sammelt das Eluat in 2,0-ml-Fraktionen. Die Säule wird auf antibiotische Wirksamkeit untersucht, indem man Papierscheiben mit von jeder einzelnen 2-ml-Fraktion entnommenen Flüssigkeit befeuchtet, die Scheiben in einem Strom trockener Luft trocknet und dann gegen S. aureus und E. coli in der üblichen Art prüft. Eine Probe von jeder 2-ml-Fraktion wird absteigend papierchromatographiert, wobei man 18 Stunden mit einem Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser-System (15:10:3:12) arbeitet.
Dann werden die Papiere getrocknet und auf verschiedenen Platten gegen in einem Agar-Medium suspendierte Kulturen von S. aureus und E. coli bioautographiert.
Fraktionen mit übereinstimmenden Bioautographie-Mustern werden vereinigt und die drei so erhaltenen vereinigten Fraktionen jeweils im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der von jeder der drei Fraktionen erhaltene Rückstand wird in Wasser gelöst, die Lösung filtriert, das Filtrat lyophilisiert und so die entsprechende Komponente des Antibiotikums 460 erhalten (A, B oder C, je nachdem von welcher Fraktion der Rückstand stammt).
Angaben über gewisse Merkmale der Komponenten A, B und C des beispielsweise nach dem Verfahren des voranstehenden Beispiels erhaltenen Antibiotikums 460 finden sich nachfolgend.
Physikalische und chemische Eigenschaften 1. Elementaranalysen
Tabelle III
Prozent Element Komponente A Komponente B Komponente C Kohlenstoff 49,15 37,98 42,75 Wasserstoff 7,65 6,82 6,93 Stickstoff 3,28 - 7,27 Sauerstoff 39,92 - 43,05 2. Ultraviolettabsorption Die Antibiotikum460-Komponente A absorbiert ultraviolettes Licht und hat ein X x bei 270 m mit c I/o in Methanol gleich ungefähr 18. Die Antibiotikum460-Komponente B und C sind für ultraviolettes Licht zwischen 220 und 400 mlt durchlässig.
3. Infrarotspektren
Die Infrarotspektren der Antibiotikum460-Komponenten A, B und C sind in Fig. 1 bis 3 der anhängenden Zeichnungen wiedergegeben, woris-k die Wellenlänge in lt bedeutet, v bedeutet die Frequenz in cm ' und A bedeutet die Absorption. Die Absorptionsmaxima und Bandencharakteristika sind in Tabelle IV unten zusammengefasst, wobei die dort verwandten Abkürzungen die folgende Bedeutung haben: S = stark, M = mittel, M-S = mittel bis stark, W = schwach, M-W = mittel bis schwach, VW = sehr schwach und SH = Schulter.
Tabelle IV
Komponente A Komponente B Komponente C Absorp- Absorp- Absorb- Absorb- Absorb- Absorb tions- tions- tions- tions- tions- tions maxima stärke maxima stärke maxima stärke in lt in lt in lt 3,12 M-S 3,12 M (breit) 3,06 M-S 3,41S 3,4-3,5 M-W 3,44 M (sehr breit) 3,50 Sh 5,82 Sh 6,01 Sh 5,77 M 6,00 Sh 6,25 S 6,01 M 6,33 S 6,97 Sh 6,72 Sh 7,09 M 7,10 M 6,82 M-S 7,48 W 8,92 W 7,07 M 8,98 W 9,25 W (sehr breit) 7,24 M-S 9,75 M 9,75 S (breit) 7,32 W 10,50 M-W 10,50 M-W 7,65 VW 10,80 W 13,00 W (breit) 8,13 W 14,25 W (breit) 8,73 W 9,70 S (breit)
10,27 M-W 10,45 W 10,71 W 11,40 M-S
12,15 M 12,92 W 13,95 W
Die Eigenschaften 1 bis 3 dienen zusammen mit den weiter unten beschriebenen antibakteriellen Spektren zur Charakterisierung der Komponenten A,
B und C des Antibiotikums 460.
4. Schmelzpunkte
Antibiotikum460-Komponenten A, B und C haben bis 300 "C keinen erkennbaren bestimmten Schmelzpunkt.
5. Optische Drehung
Die Antibiotikum-460-Komponente A hat eine spezifische optische Drehung von Iclll,r =+3,5 (0,62 % in Wasser).
6. Qualitative Gruppenanalysen
Unterwirft man die Komponenten A, B und C des Antibiotikums 460 den folgenden qualitativen Gruppenanalysen, so erhält man Ergebnisse, die in Tabelle V zusammengefasst sind:
Tabelle V
Analyse Komponente
A B C
Ninhydrin + + +
Stärke-Kaliumjodid --- - + +
Sakaguchi
In der Tabelle bedeutet (+) ein positives und (-) ein negatives Ergebnis.
7. Derivate
Chemisch sind Antibiotikum 460 und seine Komponen ten A, B und C Stickstoffbasen und sie können in die ver schiedenen Arten von Derivaten überführt werden, die mit solchen Basen erhältlich sind. Zum Beispiel können die freien Basen sowohl mit organischen als auch mit anorgani schen Säuren in ihre Säureadditionssalze überführt werden.
Die Derivate, z. B. die Säureadditionssalze, haben die antibio tischen Eigenschaften der Basen mit nur graduellen Unter schieden, sind jedoch manchmal besser löslich und eignen sich manchmal besser als die freien Basen für Zubereitun gen. Beispiele für Säureadditionssalze sind jene, die man mit
Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Toluolsulfonsäure,
Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalin-l-carbon säure, Laurylschwefelsäure, Acetylsalicylsäure und Chol säure erhält. Sie können durch Titrieren einer wässrigen Lö sung der freien Base mit der gewünschten Säure und an schliessende Gefriertrocknung der erhaltenen Lösung herge stellt werden.
Papierchromatographische Eigenschaften
Die Papierchromatogramme können in verschiedenen
Lösungsmittelsystemen gemacht werden und die RrWerte werden nach einer Standard-Bioautographiemethode be stimmt, die darin besteht, dass die Papierchromatogramme entwickelt und getrocknet werden, bevor sie auf eine Staphy lococcus-aureus-Agarplatte gelegt werden; nach einer Kon taktzeit von 15 Minuten wird das Papier von der Platte ent fernt, die dann bei 37 "C 16 bis 20 Stunden bebrütet wird.
Durch Beobachtung der Lage der Hemmzonen kann man die R1rWerte bestimmen. In der folgenden Tabelle Vl sind die mit zwei verschiedenen Lösungsmittelsystemen erhalte nen Rl-Werte der drei Komponenten des Antibiotikums 460 angegeben: 1. Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12), PPEW-System genannt, und 2. Propanol-Essig säure-Wasser (50:40:5), PEW System genannt.
Tabelle Vl
Komponente Lösungsmittelsystem
PPEW PEW A 0,95 0,93
B 0,25 0,20 C 0,20 0,13
Biologische Eigenschaften In-Vitro-Spektren
Die In-Vitro-Wirksamkeit der Antibiotikum-460-Komponenten gegen eine Reihe von Mikroorganismen wird in der folgenden Tabelle VII dargelegt. Die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotika wurde nach der Standard-Rohr-Verdünnungsmethode bestimmt und das in jedem Fall verwandte Wachstumsmedium bestand aus 0,8 /o Nährbrühe, 0,3 /0 Hefeextrakt und 0,1% Glucose. Die Ergebnisse werden in minimalen Hemmungskonzentrationen ausgedrückt, Dimension llg/ml.
Tabelle VII Mikroorganismus Minimale Hemmungs konzentration (llg/ml)
Komponente
A B C Bacillus subtilis ATCC 6633 2,5 2,5 < 5,0 Diplococcus pneumoniae 15,0 2,5 7,5 Mikroorganismus Minimale Hemmungs konzentration (,ug/ml)
Komponente
A B C Staphylococcus aureus ATCC 6638-P 7,5 2,5 < 5,0 Staphylococcus aureus DA 2040' 2,5 2,5 < 5,0 Streptococcus pyogenes DA 21' > 40,0 > 40,0 7,5 Escherichia coli ATCC 10536 30,0 > 40,0 7,5 Klebsiella pneumoniae DA 20' 15,0 2,5 7,5 Proteus vulgaris DA 121' > 40,0 7,5 7,5 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689 30,0 7,5 7,5 Salmonella schottmuelleri DA 10' 30,0 7,5 7,5
DA bezieht sich auf die Kulturensammlung der Schering Corporation, Bloomfield, New Jersey, USA.
In-Vivo-Wirksamkeit
Die In-Vivo-Wirksamkeit der Komponenten A und C des Antibiotikums 460 gegen eine letale Infektion von Staphylococcus aureus (Stamm Gray) und der Komponente C gegen Klebsiella pneumoniae wird in Tabelle VIII angeführt. Die Tests wurden an männlichen Mäusen, Stamm CF Nr. 1, Gewicht 18 bis 22 g, ausgeführt, indem man die Mäuse mit einem Inoculum der entsprechenden Bakterien infizierte und ihnen dann die Antibiotikum-460-Komponente subcutan injizierte. Die Ergebnisse werden in PD50-Werten angegeben (diejenige Konzentration von Antibiotikum, die 50 /O der infizierten Tiere schützt), deren Dimension Milligramm Antibiotikum-Komponente pro Kilogramm Testtier ist.
Tabelle Vlil Komponente S. aureus (Gray) K. pneumoniae A 37,5 C 7,5 12,5
Die voranstehenden biologischen Daten zeigen, dass die Komponenten des Antibiotikum-460-Gemisches eine wirksame Gruppe von antibiotischen Substanzen sind und einzeln oder als Gemisch zur Bekämpfung von Infektionen verwandt werden können, die von verschiedenen pathogenen Mikroorganismen herrühren, insbesondere von grampositiven Mikroorganismen wie Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae und Streptococcus pyogenes.
Diese Antibiotika sind ebenso zur Sterilisation von Laborglasgerät brauchbar, zur Bekämpfung und Ausrottung von gewissen Bakterien-lnfektionen bei Labortieren, zur Sterilisation von Operationsräumen und chirurgischen Instrumenten und in Kombination mit Seifen und Detergentien zur Reinigung von Räumen, die der Zubereitung von Speisen dienen, wie Krankenhausküchen und Speiseräumen in Schulen.
Die einzelnen Komponenten A, B und C des Antibiotikums 460 finden als Standard gegen gewisse Mikroorganismen Anwendung. Die Komponente A kann beispielsweise als Bezugssubstanz dienen, gegen die andere potentiell brauchbare antibiotische Substanzen gemessen werden, wobei Staphylococcus aureus als Testorganismus dient. Die erhaltenen Ergebnisse würden dann ein Mass des Verhältnisses der Aktivität des potentionellen Antibiotikums gegen über derjenigen der Komponente A sein. Ähnlich können die Komponenten B und C als Standard gegen Klebsiella pneumoniae bzw. Escherichia coli Verwendung finden. Sol che Standards stellen eine verhältnismässig einfache Methode zur Bestimmung der relativen Wirksamkeit von antibiotischen Verbindungen dar.
Therapeutische Formen der 460-Antibiotika
Für therapeutische Zwecke kann das Antibiotikum 460 oder jede seiner Komponenten A, B oder C oder ein Derivat des Gemisches oder einer Komponente gegebenenfalls zu einer annehmbaren Form weiter verarbeitet werden.
Zum Beispiel kann das Antibiotikum, beispielsweise durch Mischen, mit einem Träger zu einer therapeutischen Zubereitung vereinigt werden. Als Träger können eine oder mehrere flüssige oder feste, organische oder anorganische Substanzen dienen, die mit dem Antibiotikum verträglich und für die Verabreichungsweise des Antibiotikums geeignet sind. Beispiele für solche Substanzen sind Wasser, Gelatine, Lactose, eine Stärke, Magnesiumstearat, Talk, ein Pflanzenöl, Benzylalkohol, ein Gummi, ein Glycol und Vaseline.
Die Zubereitungen können auch noch ein anderes wirksames Ingrediens enthhalten, z. B. ein Analgetikum, ein anderes Antibiotikum oder ein proteolytisches Enzym.