La présente invention concerne un procédé de préparation de dérivés de l'acide adénosine-3 5 -monophosphorique cyclique et d'un de ses isomères et l'utilisation des composés ainsi obtenus.
L'acide adénosine- 3,5 -monophosphorique cyclique répond à la formule
EMI1.1
le qualificatif cyclique indiquant que les atomes de la partie
phosphorique forment un cycle avec ceux de la partie ribo
sique. Ce composé est produit dans les cellules de l'organisme animal à partir de l'acide adénosine-5 -triphosphorique par
I'action d'un enzyme l'adényl cyclase. On considère qu'un grand nombre d'hormones utilisent l'acide adénosine-3 5 -
phosphorique (en abrégé AMP cyclique ) comme messager
chimique pour l'exercice de leur action, en l'espèce comme
deuxième messager selon la terminologie de Sutherland et
ses collaborateurs.
L'activité biologique de l'AMP cyclique
peut commodément être mise en évidence in vitro par diverses
épreuves, notamment celle de la dilatation des mélanophores
dans la peau du lézard Anolis carolinensis, celle de la dispersion des mélanophores dans la peau de la grenouille (Rana pipiens) et celle de l'augmentation de la quantité d'hormone thyréotrope libérée par l'hypophyse de rat. L'AMP cyclique
augmente la production des corticostéroides [Haynes, Koritz,
Peron, J. biol. Chem., 234, 1421, (1959)]. Les dérivés dibutyryles de l'AMP cyclique ont le même effet et peuvent remplacer l'ACTH, et chez les animaux intacts augmentent le niveau plasmatique de corticostérone (Imura et Coll., Endocrinology 76, 933, 1965).
Un composé doué de propriétés similaires est l'isomères
dans lequel le noyau de ribose, au lieu d'être lié par son atome
de carbone 1 à l'atome d'azote 9 de la purine, l'est, par le
même atome, à l'atome d'azote 3, les doubles liaisons du
noyau purique étant déplacées en conséquence. On est
convenu de nommer ce composé iso-AMP cyclique.
L'objet de la présente invention est un procédé permettant de préparer de nouveaux dérivés de l'AMP cyclique et l'iso
AMP cyclique qui déploient des activités biologiques similaires mais plus intensément et/ou plus sélectivement.
Les nouveaux dérivés répondent à la formule
EMI2.1
dans laquelle chacun des symboles X et Y désigne un atome d'hydrogène ou un groupe alcoyle, R1 représente un atome d'hydrogène ou de brome ou un groupe sulfhydrile, hydroxyle, méthylthio ou amino et R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe amino, et de leurs sels avec des bases minérales ou organiques.
Le procédé permet de préparer, en particulier, les dérivés qui, dans la position 6, portent un radical NHCH3, N(CH3)2, NH-n-C4Hs ou NH-t-C4H9, ainsi que ceux pour lesquels R2 =
H et Ri = Br, SH, S-CH3, OH ou NH et celui pour lequel
R2 = NH2 et R = H, X et Y désignant H.
Le nouveau procédé de préparation de nucléotides cyclique; à partir de 5'-nucléotides selon l'invention s'apparente à celui de Smith. Drummond et Khorana, J. Amer. Chem. Soc. 83, 698 (1961). Le procédé consiste en ce que l'on soumet ul acide adénosine-5'-monophosphorique répondant à la formul
EMI2.2
dans laquelle X, Y, Ri et R2 ont les significations précitées, ou un sel de cet acide à une cyclisation intramoléculaire par chauffage en présence de dicyclohexyl carbodiimide et de pyridine anhydre.
En pratique et de préférence, on chauffe à l'ébullition, à reflux, un sel d'un 5'-nucléotide avec de la dicyclohexyl-carbodiimide (DCHC) ou di-(cyclohexylimino) méthane, en présence de pyridine anhydre.
Selon une variante préférée du procédé, on ajoute de la diméthyl formamide, ce qui a un double effet: d'une part, les 5/-nucléotides se dissolvent plus facilement dans le mélange, d'autre part, la diméthyl formamide semble favoriser la réac tion. On ajoute la diméthyl formamide en quantité suffisante pour que le 5 -nucléotide soit dissous complètement. On peut utiliser, par exemple, un mélange de pyridine et de diméthylformamide à volumes égaux.
Le procédé est plus simple que le mode de cyclisation des esters p-nitro phénoliques décrit dans la demande de brevet allemand publiée Nr. P20 49 638.2.
Il donne des rendements moins élevés dans le cas de l'AMP portant en 2 un groupe amino, en raison de la formation d'un produit accessoire, labile en milieu acide ou en milieu alcalin et qui semble représenter un acide adénosine-2N, 5 -phosphorique contenant une liaison phosphamidique qui explique sa labilité. Après traitement au moyen de soude caustique, ce composé régénère le nucléotide de départ qu'on peut isoler et soumettre à la même suite d'opérations, ce qui augmente le rendement global.
On peut ainsi, à partir de l'acide guanosine-5 -phosphorique (GMP) préparer directement du GMP cyclique dont des découvertes récentes ont montré la présence dans la nature et l'action biologique, qualitativement analogue à celle de l'AMP cyclique; dans certaines épreuves biologiques, ce GMP cyclique a même une action quantitative supérieure à celle de l'AMP cyclique.
Quant aux dérivés mono-alcoylés et di-alcoylés de l'acide adénosine-5 -monophosphorique qui sont nouveaux, on peut les obtenir en faisant réagir une 6-halogéno, en particulier la 6-chloro, 9-(ribo-B-furanosyl-2 ,3 -isopropylidène)-purine avec la mono ou la di-alcoylamine appropriée et en soumettant le dérivé d'adénosine ainsi obtenu à une phosphorylation, de préférence par l'action d'oxy-chlorure de phosphore dans du phosphate de méthyle.
A partir des composés obtenus selon le procédé, on peut si désiré préparer les dérivés butyryle corrspondants. On peut, d'autre part, utiliser les composés obtenus non substitués en position 8 pour préparer les dérivés 8-hydroxy, 8-mercapto ou 8-méthylthio correspondants. A cette fin, on fait réagir lesdits composés avec du brome en solution aqueuse et traite les acides 8-bromo-adénosine-3 ,5 -monophosphoriques ainsi formés par de l'acétate, du sulfhydrate ou du méthylmercaptate de sodium.
Pour ce qui est de l'acide 2 -O-butylyl-iso-AMP cyclique, on peut le préparer par acylation directe de l'acide, de préférence sous la forme de son sel de tri-éthyl ammonium. On peut, en particulier, opérer avec un excès d'anhydride butyrique, en présence, de pyridine, à la température ambiante.
Les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique peuvent être utilisés dans l'industrie aux mêmes fins que l'AMP cyclique, notamment pour les recherches biochimiques, biologiques et pharmaceutiques.
Essais biologiques.
On a recherché tout d'abord comment les dérivés de l'AMP cyclique portant des substituants alcoyliques en 6-N et le 2-O- butyryl-iso-AMP-cyclique se comportaient en présence d'hyophyses de rats mises en incubation selon une technique connue (M. Saffran et A. V. Schally, J. Biochem. of Physiol., Canada, 33, 408, 1955).
Après une heure d'incubation à 38 dans du milieu de
Krebs-Ringer additionné de bicarbonate de sodium et de glucose, les hypophyses de rats qui ont été en présence des nouveaux dérivés ont produit plus d'hormone thyréotrope que les hypophyses servant de témoins, la teneur des produits d'incubation en hormone thyréotrope après dilution a été déterminée par la méthode de McKenzie (J.M.McKenzie,
Endocrinology, 63, 372,1958).
Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après où les abréviations en tête de colonne signifient respectivement:
Réponse selon McKenzie
pourcentage d'augmentation de la radio-activité du sang en coups au compteur par minute et par ml de sang, après 2 heures
Réponse covar réponse calculée par covariance après transformation en logarithmes décimaux
Dunnet
Signif. Stat. signification statistique:
non significatif,
X significatif (p = 0,05),
X X très significatif (p = 0,01)
TSH mU milli-unités d'hormone thyréotrope mg. hyp. par mg d'hypophyse
Tableau I
Traitement Dose Réponse Répon- Dunnet Signif. TSHmU TSHmU
milli- selon se stat. total mg!hyp.
moles McKenzie Covar
Témoin - 140% 2,31 - - 30,0 2,94
AMPc 5 316% 2,59 4,53 xx 76,5 5,71 di-méthyl-AMPc 3 298% 2,62 4,94 xx 70,5 5,73 mono-méthyl-AMPc 3 250% 2,54 3,66 xx 54,0 4,20
Témoin - 137% 2,25 - - 20,0 1,90
AMPc 3 347% 2,66 5,36 xx 60,0 4,65
Traitement Dose Réponse Répond Dunnet Signif. lSHrnU TSHnìU
milli- selon se stat. total mg! p.
moles nioles NlcKenzie Covar
t-butyl-AMPc 1 186% 2,39 1,81 n.s. 26,0 2,05
n-butyl-AMPc 1 302% 2,60 4,57 xx 46,0 3,98
mono-méthyl-AMPc 1 270% 2,51 3,41 x 40,0 2,95
O-butyryl-iso-AMPc 1 275% 2,56 4,13 xx 42,0 2,94
Témoin - 135% 2,00 - - 20,0 1,69
n-butyl-AMPc 1 223% 2,23 3,77 xx 31,0 2,77
t-butyl-AMPc 1 164% 2,08 1,28 n.s. 23,0 1,92
AMPc 3 243 % 2,26 4,24 xx 37,0 3,44
O-butyryl-iso-AMPc 1,5 170% 2,13 2,10 n.s. 24,0 2,00
Il ressort de ce tableau que les nouveaux dérivés de l'AMP cyclique, sauf le dérivé 6-N-tertio-butylique, ont donné lieu à des augmentations significatives de la libération d'hormone thyréotrope même à la dose d'une milli-molécule alors que l'AMP cyclique lui-mème n'a pas encore d'effet à cette dose.
La moindre activité du dérivé tertio-butylique, dans cette épreuve, par comparaison avec le dérivé n-butylique paraît attribuable à l'encombrement stérique, le radical n-butylique étant caténiforme alors que le radical t-butylique est compact.
En revanche dans l'épreuve de l'action sur les mélanophores du lézard Anolis, le dérivé tertio-butylique et le dérivé butylique normal se comportent à peu près de la même façon. Les concentrations minimales qui ont donné des réponses positives dans cette épreuves ont été les suivantes:
AMPc 1 milli-mole dérivé mono-méthylique 0,43 milli-mole dérivé diméthylique 0,56 milli-mole dérivé n-butylique 0,26 milli-mole dérivé t-butylique 0,28 milli-mole
Les dérivés de l'acide adénosine-3',5'-monophosphorique cyclique portant des substituants en positions 2 et/ou 8 ont été étudies en ce qui concerne la libération in vitro de l'hormone de croissance hypophysaire chez le rat. Le dosage de l'hormone de croissance hypophysaire (GH) et de la prolactine (PR) a été effectué par électrophorèse sur gel.
Le tableau suivant II indique les résultats obtenus. Les concentrations de nucléotides sont exprimées en mM et les quantités d'hormone de croissance hypophysaire libérées dans les milieux d'incubation sont exprimées en Fg/mg d'hypophyse et en pourcentage par rapport aux témoins.
Tableau Il
Expérience Dose GH GH % par rap
(mM) g ug;mg hyp. port au
(2 ml) témoin
A
Témoin - 32 1,07 8-amino-AMP c 2 74 2,72 254 8-bromo-AMP c 2 156 4,88 456
B
Témoin - 16 0,75
AMP c 5 32 1,40 186 8-thio-AMP c 2 92 4,53 604 8-hydroxy-AMP c 2 56 2,68 357 8-amino-AMP c 2 32 1,55 206
C
Témoin - 36 1,29
AMPc 4 66 2,65 205 8-thiométhyl-AMP c 2 84 3,31 256 8-thio-AMP c 2 82 3,37 261 8-amino-AMP c 2 54 2,21 171 8-bromo-AMP c 2 188 5,68 440 8-hydroxy-AMP c 2 72 2,98 231
D
Témoin - 23 0,81
AMP c 9 52 1,90 235
AMP c 3 30 0,99 122 2-amino-AMP c 2 41 1,47 181 8-thio-AMP c 2 97 3,56 439 8-bromo-AMP c 1 53 1,75 216
E
Témoin - 21 0,69 8-thio-AMP c 1,5 62 2,19 317 8-hydroxy-AMP c 4 66 2,34 339
Tableau Il (Suite et fin)
Expérience Dose <RTI
ID=6.2> GH GH % par rap
(mM) Fg Stg/mg hyp. port au témoin
(2 ml)
F
Témoin - 20 0,82 8-amino-AMP c 4 44 2,01 245 8-hydroxy-AMP c 4 60 2,34 285 2-amino-AMP c 4 37 1,58 193
DBC* 2 75 3,06 373
DBC* 1,5 56 2,53 309
G
Témoin - 28 1,16 2-amino-AMP c 3 52 2,88 248
H
Témoin - 16 0,72
AMP c 4 20 0,995 138 8-bromo-AMP c 2 72 3,54 490 N6,2'-O-dibutyryl-8-thio AMP c 2 84 4,50 625 * DBC = N6, 2 -dibutyryl-AMP cyclique.
Les nouveaux dérivés de l'AMP c décrits dans la présente demande ont tous montré une activité supérieure à l'AMP c dans l'épreuve biologique de la libération de l'hormone. Le 8thio-AMP c, le 8-bromo-AMP c et surtout le 6-N, 21-O-dibutyryl-8-thio-AMP c ont une activité supérieure au 6-N, 2ç-O- dibutyryl-AMP c (DBC).
Les nouveaux dérivés sont utilisables en recherche pour l'étude du mécanisme de l'action hormonale. Etant donné qu'ils jouent le rôle de second messager de l'action hormonale, ils pourraient remplacer l'action des hormones elles-mêmes dans l'organisme.
Les exemples suivants, où les températures sont en degrés centigrades, illustrent la préparation des nouveaux dérivés.
Préparation des produits de départ
a) Acides 6-N-alcoyl-adénosine-5'-phosphoriques (6-N-nbutyl-AMP).
La substance de départ est la 9-(ribo-ss-furanosyl-2í,3 - isopropylidène)-6-chloro-purine ; elle a été préparée d'après
Hampton et Maguire, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1961, p. 150 et d'après Zemlicka et Sorm, Czech. Pat. Nr. 110 944, 1964, 50 mg de ce produit sont chauffés 15 heures à 800, en solution dans 1 ml de n-butylamine anhydre. On évapore sous vide jusqu'à siccité; on reprend par du chloroforme, on évapore à siccité sous vide et on répète plusieurs fois cette opération. Le résidu est ensuite séché 1 heure sous un vide poussé et dissous dans 1 ml de méthanol absolu; on introduit 0,5 g de gel de silice Merck (0,05-0,20 mm) et on évapore à siccité. Le solide est introduit au sommet d'une colonne de gel de silice de 155 mm de longueur et de 8 mm de diamètre.
On élue par un mélange de chloroforme et de méthanol (90:10 en volume) en collectant des fractions de 1 ml. La 9-(ribo-ss-furanosyl-2',3/- isopropylidène)-6-n-butyl-amino-purine est contenue dans les fractions no 7 à 13. On obtient, après évaporation à siccité, 37 mg d'une substance amorphe chromatographiquement homogène (Rf. 0,75 sur couche mince de silice dans du nbutanol saturé d'eau).
467 mg du produit précédent, séché sous un vide poussé durant 2 heures à la température ordinaire, sont dissous dans 3,3 ml de phosphate de méthyle. La température étant maintenue à 0O, on introduit 0,47 ml d'oxychlorure de phosphore et on laisse reposer 5 à 6 heures. L'excès de réactif est détruit par addition de 20 g de glace pilée. Après une demi-heure d'agitation, on ajuste le pH à 1,5 au moyen d'ammoniaque concen trée. On chauffe ensuite 50-60 minutes à 80-90o, ce qui permet d'enlever par hydrolyse le groupe isopropylidène. Après avoir amené le pH à 7,0 au moyen d'ammoniaque concentrée, on agite 10 minutes en présence de 10 g de noir animal actif (obtenu suivant Hurst et Becking, Can. J. Biochem. Physiol.
41, 1963, page 469) et traité par lavage à l'acide. Le noir animal recueilli par filtration et lavé au moyen de 100 ml d'eau est traité par 400 ml d'un mélange d'ammoniaque concentrée, d'eau et de méthanol (15:35:50 en volume) ce qui permet l'élution du nucléotide absorbé. On évapore à siccité, on reprend par de l'eau et on acidifie à pH 2,0 au moyen d'acide sulfurique 0,5 M. On concentre ensuite à environ 2 ml. Après addition d'alcool puis d'acétone et séjour à 0O, on obtient 310 mg de 6-N-n-butyl-AMP cristallisé. Le produit analytiquement pur fond à 155-158 et se montre homogène à la chromatographie.
b) d'autres dérivés 6-N-alcoylés de l'AMP ont été préparés de la même façon. Le tableau suivant indique quelques uns des caractères des divers dérivés.
Tableau III
Dérivés N6-alcoylés de l'AMP.
Substituants Point A max e max Rf dans divers systèmes en N6 de fusion (mu) de dissolvants*
A B C monoéthyl 184-185 268 16900 0,21 0,30 0,33 diméthyl 225-230 274 18400 0,30 0,37 0,61 n-butyl 155-158 266 14000 0,50 - 0,75 t-butyl - 270 15200 0,51 0,66 0,75
* Système de dissolvants.
A: alcool-acétate d'ammonium 0,5 M (5:2 en vol.);
B: isopropanol-ammoniaque concentrée - eau (6:3:1 en vol.);
C: isopropanol-sulfate d'ammonium à 1% (2:1 en vol.)
Exemple I
Acide 6-N-n-butyl-adénosine-3 ,5-phosphorique
cyclique (6-N-n-butyl-AMP cyclique)
175 mg d'acide 6-N-n-butyl-adénosine-5 -phosphorique (6
N-n-butyl-AMP) sont transformés en sel de triéthyl ammonium qu'on sèche soigneusement. On dissout dans 10 ml de diméthyl formamide anhydre. La solution est introduite goutte à goutte, en l'espace de 2 heures, dans 10 ml d'un mélange, porté à l'ébullition, de diméthyl formamide et de pyridine anhydre à volumes égaux, le mélange étant additionné de 180 mg de DCHC. On chauffe encore 1 heure à l'ébullition à reflux. On agite continuellement durant toute l'opération.
Après évaporation à siccité sous vide, on reprend par 50 ml d'eau. On filtre pour enlever la dicyclohexylurée qui a précipité et on soumet la solution à une extraction par deux fois, au moyen de 20 ml d'éther pur éliminer la DCHC. La solution aqueuse est ensuite versée sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAE-cellulose sous sa forme bicarbonatée. Après lavage de la colonne par 500 ml d'eau bidistillée, on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M; on emploie au total 2 litres du mélange. On recueille des fractions de 20 ml.
Le nucléotide cyclique est contenu dans les tubes No 60 à 81. Leur contenu est évapore à siccité sous vide; le résidu est additionné à deux reprises de méthanol anhydre qu'on chasse par évaporation sous vide. On reprend ensuite par 1,5 ml de méthanol absolu. Le sel de sodium du nucléotide cyclique est précipité par addition de 20 ml d'une solution 0,125 m de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre. Le solide (100 mg) est recueilli par centrifugation et lavé plusieurs fois à l'acétone anhydre.
Le sel répond à la formule brute Ct4H29NsO6p Na et l'accide correspondant (préparé comme il sera décrit plus loin) possède les propriétés indiquées ci-dessous pour le No-nbutyl-AMP cyclique.
Les dérivés 6-N-monométhylique, 6-N-diméthylique et 6
N-t-butylique de l'AMP cyclique ont été préparés de la même façon.
Le tableau IV indique quelques uns des caractères des divers dérivés.
Tableau IV
Dérivés N6-substitués de l'AMP cyclique
Substituants en N6 X max** E max** Rf dans divers systèmes de dissol
vants*
A B C monométhyl 270 17000 0,58 0,49 0,75 diméthyl 274 20000 0,88 0,78 0,76 n-butyl 269 18200 0,75 0,83 0,82 t-butyl 272 18200 0,70 0,80 0,83
* Les systèmes de dissolvants sont les mêmes que dans le
tableau I
** Mesures effectuées à pH 7,0
Exemple 2
Acide 2 - O-butyryl-iso-adénosine-3', 5' -phosphorique
(2;-0-butyryl-iso-AMP cyclique)
La préparation connue de l'acide iso-adénosine-3Z,5;-phos- phorique (iso-AMP cyclique) comporte un fractionnement sur colonne de DEAE-cellulose qui fournit le nucléotide cyclique sous la forme d'une solution de son sel de triéthylammonium.
Ce sel, soigneusement desséché (25 mg) est dissous dans 0,75 ml de pyridine anhydre. On ajoute 0,375 g d'anhydride butyrique et on laisse reposer 6 heures à la température ordinaire.
La majeure partie de la pyridine est chassée par évaporation sous vide; l'anhydride butyrique en excès est ensuite décomposé par addition de 0,35 ml d'eau à 00. On évapore à siccité sous un vide poussé. Le résidu est maintenu encore 12 heures sous un vide poussé à la température ordinaire. On reprend par 10 ml d'eau et on verse sur une colonne de DEAE-cellulose de 15,5 cm de longueur et de 0,8 cm de diamètre. On lave d'abord au moyen de 300 ml d'eau et on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl-ammonium 0,1 M (pH 7,5). On recueille des fractions de 20 ml. Le dérivé monobutyrylé est contenu dans les fractions No 56 à 78 qui sont réunies et lyophilisées.
Le résidu est repris par 0,2 ml de méthanol anhydre; on ajoute 1 ml d'une solution 0,5 M de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre et on complète par addition de 5 ml d'acétone anhydre la précipitation du sel de sodium de l'acide 2'- O-butyryl-iso-AMP cyclique qui est recueillie par centrifugation et lavé à l'acétone anhydre. On en obtient 13 mg; Bmax=278 m; emax=12 800; Rf 0,80 dans le système éthanol-acétate d'ammonium 0,5 M (5:2 en vol.) sur papier Whatman 1. Le maximum observé dans le spectre UV est pratiquement identique à celui du spectre de l'iso-AMP cyclique de départ, ce qui exclut la présence en N6 du reste butyryle; ce dernier ne peut alors se trouver qu'en 2'.
On obtient le même produit si la durée de réaction de l'iso-AMP avec l'anhydride butyrique en présence de pyridine est prolongée jusqu'à 8 jours, ce qui montre la faible réactivité du groupe amino N6.
Exemple 3
Acide guanosine-3", 5' -phosphori que (GMP cyclique)
150 mg de GMP sous forme d'acide libre sont dissous dans 25 ml de diméthyl formamide. En l'espace de 2 heures on introduit la solution goutte à goutte dans un mélange bouillant de 50 ml de pyridine, 50 ml de diméthyl formamide anhydre et 170 mg de DCHC. On chauffe encore 2 heures à l'ébullition à reflux. On agite continuellement durant toute l'opération.
Après évaporation à siccité sous vide, on reprend par 25 ml d'eau, on filtre et on extrait 3 fois au moyen de 15 ml d'éther.
La solution aqueuse est évaporée à siccité sous vide.
A côté de GMP cyclique, le résidu contient une substance qui est vraisemblablement de l'acide quanosine-N2, 5'-phosphorique. Pour hydrolyser la liaison phosphamidique, on reprend par 10 ml de soude caustique 0,2 N et on chauffe 45 minutes à 600.
Après neutralisation à l'acide acétique, on verse sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAEcellulose; on lave la colonne avec 300 ml d'eau et on élue par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M; on emploie au total 3 litres de mélange. On recueille des fractions de 20 ml.
Les fractions No 40 à 64 qui contiennent le GMP cyclique sont évaporées à siccité sous vide. On ajoute à trois reprises du méthanol anhydre et on évapore à siccité. On reprend ensuite par 1 ml de méthanol anhydre et on précipite le GMP cyclique sous forme de sel de sodium (38 mg) par addition de 12,5 ml d'une solution 0,1 M de perchlorate de sodium dans de l'acétone anhydre. Le produit est recueilli par centrifugation et lavé à l'acétone anhydre. n répond à la formule brute CloHltN5O7P
Na, H20; par ses divers caractères (spectres UV, IR et Rf dans divers dissolvants), il se montre identique à du GMP cyclique authentique.
Le GMP inaltéré ou régénéré est récupéré par lavage de la colonne au moyen de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,15 M. Son sel de triéthyl ammonium peut ensuite être soumis à la suite d'opérations indiquées pour sa transformation en GMP cyclique, ce qui permet d'augmenter le rendement global.
Exemple 4
Acide 8-thio-adénosine-3',5'-phosphorique
I. Acide 8-bromo-adénosine-3',5"-phosphorique (8-bromo
AMP cyclique)
a) à partir de l'AMP cyclique.
500 mg d'AMP cyclique sont dissous dans 0,75 ml de soude caustique 1 N. Après addition de 15 ml d'eau de brome saturée, on laisse 6 heures à la température ordinaire. On agite ensuite avec 10 g de charbon actif, en l'espèce de la norite lavée d'abord avec un mélange ammoniaque: éthanol: eau (15:60:25 en volume) puis à l'acide chlorhydrique et à l'eau, on filtre et on lave le charbon à l'eau jusqu'à disparition complète des ions Br-. On élue ensuite par agitation avec le mélange d'ammoniaque d'éthanol et d'eau (15:60:25). La solution est
évaporée à siccité sous vide et le résidu est repris par de l'eau.
Cette solution est versée sur une colonne (40 cm de hauteur et 2,8 cm de diamètre) de DEAE-cellulose sous sa forme bicarbonatée. La colonne est lavée d'abord avec 500 ml d'eau.
On élue ensuite par gradient de concentration au moyen d'eau additionnée graduellement de bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M. On emploie au total 3 litres de mélange. On recueille des fractions de 20 ml.
Les fractions No 35 à 60 sont combinées et évaporées à siccité sous vide. Le résidu est repris à trois reprises par du méthanol puis on évapore sous vide. Pour finir on reprend par 5 ml d'eau et on acidifie à pH 2,5 ce qui provoque la cristallisation du produit. On ajoute encore 2 volumes d'alcool et on abandonne à 00 pendant 24 heures. Le solide est ensuite recueilli par centrifugation et lavé deux fois avec 5 ml d'alcool absolu, et enfin séché. On en obtient 410 mg (rendement 67 4E). Le sel de sodium répond à la formule brute CloHloNsOoPBrNa.
b) à partir du 8-bromo-AMP (pour contrôle et identification).
Le 8-bromo-AMP a été préparé d'après la méthode de
Ikehara, Uesugi et Kaneko, CHem. Commun. 1, 17 (1967) La cyclisation a été effectuée d'après la méthode de Smith, Drummond et Khorana, J. Amer. Chem. Soc. 83, 698 (1961).
170,4 mg de 8-bromo-AMP (0,4 mmole) sont dissous dans 10 ml de pyridine additionnée de 2 ml d'eau. On ajoute 117,6 mg de 4-morphoiine-N,N -dicyclohexylcarboxamidine (0,8 mmole). La solution est évaporée à siccité sous vide; on reprend le résidu par 20 ml de pyridine anhydre et on évapore de nouveau a siccité. Cette opération est répétée deux fois pour chasser complètement l'eau. On dissout finalement, dans 20 ml de pyridine anhydre et on introduit goutte à goutte en l'espace d'une heure et demie dans une solution de 165 mg de dicyclohexyl-carbodiimide dans 40 ml de pyridine anhydre chauffé à l'ébullition. On maintient pendant 2 heures encore à l'ébullition à reflux. La solution est ensuite évaporée à siccité sous vide.
On reprend le résidu par 20 ml d'eau; après filtration, on extrait trois fois au moyen de 20 ml d'éther. On opère le fractionnement comme indiqué dans l'exemple précédent après avoir versé la solution sur une colonne (20 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre) de DEAE-cellulose. Le 8-bromo
AMP cyclique obtenu (121 mg) possède les mêmes propriétés que le produit préparé selon a. Le rendement est susceptible d'amélioration si la cyclisation est effectuée en présence de diméthyl formamide (cf. exemple 1).
II. Acide 8-thio-adénosine-3 ,5-phosphorique
(8-thio-AMP cyclique)
On a employé la méthode utilisée dans d'autres cas par
Holme et Robins (J. Amer. Chem. Soc. 86, 1243 (1964)).
On fait barboter à basse température de l'hydrogène sulfuré dans 20 mi d'une solution alcoolique 1 M d'éthylate de sodium afin d'obtenir du sulfhydrate de sodium. L'excès d'hydrogène sulfuré est ensuite chassé par chauffage à l'ébullition. On introduit alors 100 mg de 8-bromo-AMP cyclique et on chauffe 5 heures à ébullition à reflux. Après neutralisation à l'acide acétique, on évapore à siccité sous vide, on reprend par 10 ml d'eau et on fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne (30 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre) de
DEAE-cellulose. Le produit n'est élué que par du bicarbonate de triéthyl ammonium 0,1 M; il se trouve dans les fractions No 80 à 110. Après le traitement habituel, on obtient le produit à l'état cristallisé en abaissant le pH à 2,5; on recristallise dans l'alcool éthylique. On obtient 52 mg (rendement 58%).
La substance répond à la formule brute C10Hi2N5O6P S.
Exemple S
Acide 8-thio-méthyl-adénosine 3,5-phosphorique
(8-thio-méthyl-AMP cyclique.)
On met 100 mg de 8-bromo-AMP cyclique (voir exemple 4,
I.a.) en suspension dans une solution 1 M de méthyl-mercaptate de sodium dans l'alcool absolu et on chauffe 6 heures à l'ébullition à reflux. On neutralise ensuite par de l'acide acétique et on évapore à siccité dans le vide. Le résidu est repris par 50 ml d'eau; on ajuste à pH 3 et on obsorbe le nucléotide par agitation avec 3 g de charbon actif. On lave à l'eau et on élue par traitement avec un mélange d'éthanol, d'ammoniaque concentrée et d'eau (60:15:25 en volume). La solution est
évaporée à siccité sous vide et le résidu est repris par 10 ml
d'eau.
On fractionne ensuite dans les conditions habituelles sur
une colonne (50 cm de hauteur et 1,2 cm de diamètre) de
DEAE-cellulose. Le produit attendu se trouve dans les frac
tions No 45 à 60 (il est nécessaire d'observer le spectre UV
tube par tube pour effectuer une séparation d'avec deux autres produits non identifiés). Le sel de triéthylamine contenu dans
ces fractions est transformé en sel de sodium de la manière
décrite précédemment. On en obtient 36 mg (rendement
40%).
La substance répond à la formule brute. CllHs2NsO6P S Na.
Exemple 6
Acide 8-hydroxy-adénosine-3 ,5 -phosphorique (8-hydroxy-AMP cyclique).
225 mg d'acétate de sodium anhydre fraîchement fondu sont dissous dans 7,5 ml d'acide acétique glacial; on ajoute 150 mg de 8-bromo-AMP cyclique sous forme d'acide libre anhydre.
On plonge dans un bain chauffé à 135 et on chauffe 2 heures à l'ébullition à reflux (au bout de 15 minutes le nucléotide est complètement dissous). La solution est ensuite évaporée à siccité et le résidu est repris par 10 ml d'eau. Le fractionnement sur une colonne de DEAE-cellulose est effectué dans les conditions habituelles. Le produit attendu se trouve dans les fractions No 50 à 70; on les réunit et on évapore à siccité sous vide. Le sel de triéthyl ammonium présent est transformé en sel de sodium dans les donditions déjà décrites. On en obtient 85 mg (rendement 66%). Le produit répond à la formule brute CloHaoNsO7P Na.
Exemple 7
Acides 8-amino-adénosine-5 -phosphorique (8-amino-AMP) et 8-amino-adénosine-3 ,5 -phosphorique (8
amino-AMP cyclique).
a) Préparation du produit de départ
426 mg de 8-bromo-AMP sont dissous dans 2,5 ml de for mamide; on ajoute 10 ml de méthanol saturé d'ammoniac. On chauffe en tube scellé à 87-92 durant 48 heures. On évapore le méthanol, on ajoute 10 ml d'eau et on fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne de DEAE-cellulose. Le produit attendu est contenu dans les fractions No 50 à 70; on les réunit et on évapore à siccité sous vide. Le 8-amino-AMP est accompagné dans le mélange brut de deux composés donnant des pics mineurs et dont l'un est difficile à séparer du produit principal. Ce dernier est néanmoins utilisable pour la suite, bien qu'il n'ait pas donné des chiffres corrects à l'analyse.
Le rendement obtenu est de 70%, d'après la quantité de phosphore récupérée.
b) 176 mg de sel de triéthyl ammonium, bien sec du 8amino-AMP sont dissous dans un mélange de 25 ml de pyridine et de 5 ml d'eau. On ajoute 146 mg de 4-morpholine
NN'-dicyclohexylcarboxamidinium dans le but de transformer le nucléotide en un sel soluble. On évapore à siccité sous vide, on reprend par 25 ml de pyridine et on évapore de nouveau à siccité; cette opération est répétée deux fois. Finalement, le résidu est dissous dans 50 ml de pyridine. La cyclisation en présence de 202 mg de dicyclohexyl-carbodiimide dissous dans 50 ml de pyridine est effectuée comme il est décrit dans l'exemple 1. Le produit de réaction est fractionné sur une colonne de DEAE-cellulose dans les conditions habituelles.
Le produit attendu se trouve dans les fractions No 50 à 65 que l'on réunit et évapore à siccité sous vide. On transforme ensuite en sel de sodium dans les conditions déjà décrites.
On en obtient 56 mg (rendement 32%). Ce rendement peut être amélioré par emploi de diméthyl formamide lors de la cyclisation (exemple 1). Le produit répond à la formule brute
C10H12N606P Na.
Exemple 8
Acide 2-amino-adénosine-3 ,5'-phosphorique
(2 -amino-AMP cyclique)
Le principe de sa synthèse est le suivant:
On part de la 2-amino-6-chloro-9 (2',3',5'-triacétyl-ss-D- ribofuranosyl)-purine qui se prépare à partir de la guanosine.
Les groupes acétyles sont enlevés par ammonolyse. La 2 amino-6-chloro-9 (B-D-ribofuranoysl) -purine est traitée dans des conditions plus énergiques par de l'ammoniaque ce qui fournit de la 2-amino-adénosine. Le produit est transformé en dérivé 2, 3 -isopropylidénique qui par phosphorylation au moyen d'oxychlorure de phosphore en présence de pyridine et d'acide formique (cf. Asahi Chemical Industry Co., Ltd. brevet français no 531 156) donne du 2-amino-AMP. Ce dernier, par cyclisation en présence de DCHC et de diméthyl formamide (cf. exemple 1) fournit finalement le 2-amino-AMP cyclique.
Le trois derniers produits sont nouveaux.
a) Préparation du produit de départ
La 2-amino-6-chloro-9 (2',3',5'-triacétyl-B-D-ribofura- nosyl)-purine est préparée, à partir de la guanosine, d'après les indications de Gerster, Lewis, et Robbins, Methods in Nucleic
Acids Chemistry 1, 242. On traite le produit durant 14 heures, à la température ordinaire par une solution saturée d'ammoniac dans du méthanol pour le désacétyler. On évapore sous vide et on recristallise dans le méthanol.
La substitution du chlore par un groupe amino exige des conditions assez énergiques. 200 mg du produit précédent sont chauffé 48 heures à l'autoclave a 1200 avec 50 ml d'ammoniaque concentrée. Les cristaux du 2,6-diamino-nucléoside déposés après refroidissment (rendement 55 à 65 %) sont recueillis, lavés à l'alcool et à l'eau et séchés. Le produit avait déjà été préparé par une méthode différente mais le procédé objet de l'invention est plus pratique.
1,3 g du composé précédent sont mis en suspension dans 220 ml d'acétone; on ajoute 52 ml de diméthoxy propane et
9,2 d'acide p-toluène-sulfonique monohydraté; on agite à la température ordinaire. Après dissolution du nucléoside, le ptoluène-sulfonate du dérivé isopropylidénique précipité. Au bout d'une heure, le sel est recueilli par centrifugation et lavé à l'acétone; on le décompose en le traitant par 40 mi de bicarbonate de sodium à 10%. Après dissolution complète suivie de l'évaporation à siccité sous vide, le résidu est séché par addition à trois reprises de 50 ml de benzène puis évaporation. On extrait par 150 ml, au total, de chloroforme et on évapore à siccité. On sèche de nouveau par introduction, à deux reprises, de 50 ml de benzène suivie d'évaporation.
Le résidu est dissous dans la quantité minimum de chloroforme; on précipite par addition de benzène en excès. On obtient 1,2 g de produit amorphe, homogène à la chromatographie.
Pour la phosphorylation la substance précédente (1,1 g) est introduite dans un mélange de 3,5 ml d'acétonitrile, 1,74 ml d'oxychlorure de phosphore, 0,46 ml d'acide formique anhydre et 1,5 ml de pyridine anhydre. On agite jusqu'à dissolution, à la chambre froide, et on abandonne à une température de 3 à 4 durant 2 heures. On introduit alors lentement, à 00, 35 ml d'eau, on agite 2 heures à 00 et ajuste le pH à 1,5 au moyen d'hydroxyde de sodium. On chauffe à 70O pendant 1 heure pour enlever les groupes isopropylidènes et on agite ensuite avec 16 g de charbon actif. Ce dernier est lavé à l'eau.
On élue le nucléotide absorbé au moyen d'un mélange d'éthanol, d'ammoniaque concentrée et d'eau (60:15:25) en vol.). On fractionne ensuite sur une colonne de DEAE-cellulose par gradient de concentration au moyen d'eau additonnée graduellement de bicarbonate d'ammonium 0,35 M. Le 2-amino-AMP est contenu dans les fractions No 100 à 140. Son sel de triéthyl ammonium isolé dans les conditions habituelles est utilisé directement pour la suite (la quantité de phosphore présente correspond à 640 mg de sel).
b) La cyclisation a été effectuée à partir de 400 mg de sel de triéthyl ammonium de 2-amino-AMP dissous dans 5 ml d'eau.
Après addition de 360 mg de 4-morpholine-N,N-dicyclohexyl- carboxamidine, on procède comme décrit dans les exemples 1 et 2 en utilisant 510 mg de DCHC et 50 ml de diméthyl formamide. Par chromatographie sur papier, on décèle, à côté du produit attendu, un autre composé migrant plus rapidement, qui peut être (voir exemple 3) de l'acide 2-amino-adéno sine-2-N,5'-phosph:orique Après évaporation à siccité sous vide, on traite le mélange brut pendant 1 heure à 600 par 50 parties d'hydroxyde de sodium 0,1 N. On neutralise à l'acide acétique et fractionne dans les conditions habituelles sur une colonne de DEAE-cellulose. Le produit est transformé finalement en sel de sodium, de la manière indiquée. On en obtient 106 mg . Le produit répond à la formule brute C10H12N606P Na.
On peut précipiter les sels d'argent à partir de solutions aqueuses concentrées des sels de sodium des dérivés de nucléotides obtenus selon le procédé, par décomposition des sels d'argent au moyen d'hydrogène sulfuré, on obtient les acides libres et ensuite par neutralisation, au moyen de bases minérales et organiques, les sels correspondants. D'autre part, tous ces composés sont susceptibles d'acylation en N6 ou 2'-O et éventuellement en N8, 8-0,8-S et 2-N . Sie, en particulier, on traite au moyen d'anhydride butyrique en présence de pyridine on obtient les dérivés butyrylés en N6 et 2'-O et, éventuellement, en 8-O, 8-S, 8-N et 2-N. Ces composés présentent de l'intérêt car le dibutyryl-6-N, 2'-O-AMP cyclique manifeste dans beaucoup d'épreuves in vivo une action supérieure à celle du nucléotide de base.
Exemple 9
6-N, 2 -O-dibutyryl-8-thio-AMP cyclique
On met en suspension 75 mg de 8-thio-AMP cyciique dans un mélange de 2,5 ml de pyridine anhydre et de 1,25 ml d'anhydride butyrique. On agite durant 3 heures jusqu'à dissolution complète et on abandonne 20 heures à la température ambiante. On refroidit alors la solution à - 100 et on ajoute avec précaution 1,5 ml d'eau glacée. Après 3 heures de repos à la température ambiante, on évapore à siccité sous vide poussé et on maintient sous ce vide pendant 24 heures. On reprend par 5 ml d'eau et on fractionne sur une colonne de DEAEcellulose dans les conditions indiquées plus haut.
La fraction contenant le dérivé butyrylé est évaporée à siccité; on coévapore plusieurs fois avec du méthanol anhydre et on reprend par 2 ml d'éthanol. On ajoute la quantité théorique d'iodure de baryum dans 1 ml d'alcool (on se base sur la teneur en phosphore en solution : pour 1 atome P il faut 1/2 mole de BaI2). Le sel de baryum précipite au bout d'un certain temps et il est recueilli par centrifugation et lavé avec un peu d'alcool. On obtient 29 mg de produit; une quantité considérable de produit resté dans les eaux mères peut être récupérée sous forme moins pure par addition de 2 à 3 volumes d'éther anhydre. Le produit répond à la formule brute ClsH-1NlOsPS.Ba/2.
D'après sa composition et son spectre IR le produit ne contient que 2 groupes butyriles qui sont sans doute fixés en 6
N- et 2-O. Le groupe sulfhydryle en C-8 n'a pas réagi ce qui s'explique par le fait qu'il est complètement sous sa forme tautomère de thio-cétone.
Quelques propriétés des dérivés de l'AMP cyclique sont indiquées dans le tableau V suivant.
Tableau V
Substances 1 max.*t E max.** Rf dans deux systèmes
(mil) de dissolvants+
A B 8-bromo-AMP c*** 266 15.200 0,43 0,63 8-thio-AMP c 297**** 24.000**** 0,25 0,40 8-thiométhyl-AMP c 280 18.400 0,48 0,66 8-hydroxy-AMP c 270 11.500 0,38 0,48 8-amino-AMP c 273 16.000 0,23 0,32 2-amino-AMP c 258 10.200
282 10.200 0,20 0,25 8-amino-AMP 274 16.100 0,05 0,23 8-thio-AMP 236*** 25.200 0,06 0,25
297**** 24.100 dibutyryl-8-thio-AMP c 246 19.800 0,85 0,82
326 25.500
*) systèmes de dissolvants:
A = éthanol-acétate d'ammonium 0,5 M (5:2 en vol.)
B = isopropanol-sulfate d'ammonium à 1 % (2:1 en vol.)
**) mesures effectuées dans l'eau, sauf indication contraire à
pH7.
***) c = cyclique ****) mesures effectuées à pH 11,0.