Die Erfindung betrifft das neue wasserunlösliche Antibiotikum Papulacandin, das in Form seiner Hauptkomponenten A und B sowie mehrerer Nebenkomponenten, oder von Mischungen von 2 oder mehreren dieser Komponenten vorliegt (solche Mischungen werden der Einfachheit halber im folgenden als Papulacandin [Antibiotikum A 32283] bezeichnet), und Derivate des Antibiotikums sowie Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe.
Das Antibiotikum Papulacandin entsteht bei der Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der in unseren Laboratorien unter der Bezeichnung A32283 aufbewahrt wird. Der Stamm A 32283 ist der Art Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, früher als Arthrinium phaesospermum (Corda) Ellis bezeichnet, Ordnung Moniliales, zuzuordnen. Die Art ist von Ellis in Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes 1971, p. 569 unter Arthrinium phaeospermum eingehend beschrieben. Der Stamm A 32283 wurde beim Northern Regional Research Lab. US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois unter der NR. NRRL 8086 deponiert. Er wurde 1969 am Sustenpass (Schweiz) als Saprophyt auf abgefallenen Blättern einer nicht bestimmten Pflanzenart gefunden. Die Isolierung erfolgte auf einem Hefe - Nähragar folgender Zusammensetzung: Hefeextrakt 4 g/l.
Malzextrakt 10 g/l, Glucose 4 g/l, Agar Agar 20 g/l, pH nach Sterilisation: 7.0
Das Antibiotikum Papulacandin wird bei der Züchtung der Art Papularia sphaerosperma, insbesondere des Stammes NRRL 8086 gebildet. Zur Herstellung von Papulacandin wird Papularia sphaerosperma oder eine Papulacandin bildende Mutante in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob gezüchte, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Papulacandin hierauf isoliert. Das Antibiotikum Papulacandin bildende Mutanten können z. B. unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, Glycerin, ferner Inosit. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400C, vorzugsweise ca. 230C. Eine wesentliche antifungische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1'/2 bis 5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z. B. im Verhältnis
1:20, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispiels weise, indem man ein durch ca. 14tägiges Wachstum auf einem festen Nährboden erhaltenes versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft und 48 Stunden wachsen lässt.
Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichti gung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigen schaften des Antibiotikums.
So kann das Antibiotikum beispielsweise aus der unfiltrierten Kulturbrühe mit einem mit Wasser wenig mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Essigester, extrahiert werden.
Dieses sogenannte whole-broth -Verfahren wird vorzugsweise angewendet, weil sich das Antibiotikum sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat befindet. Das Antibiotikum sammelt sich in der wasserhaltigen organischen Phase, z. B. im Essigester an und diese Phase wird von der extrahierten Kulturflüssigkeit und dem Schlamm (extrahiertes Mycel und Nährlösungsfestbestandteile) abgetrennt. Der bei der Extraktion erhaltene Rückstand kann einer oder mehreren erneuten Extraktionen mit dem gleichen oder einem anderen Lösungsmittel unterworfen werden.
Man kann auch das z. B. mit Filterhilfsmitteln abfiltrierte Mycel oder das Kulturfiltrat allein extrahieren. Das mit Wasser gewaschene Mycel (mitsamt dem Filterhilfsmittel) wird vor zugsweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem Niederalkanol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, ferner Dimethylsulfoxid, Formamid, Dimethylformamid, Methylacetamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton, oder mit Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser, insbesondere mit wasserhaltigem Methanol, extrahiert. Das Kulturfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel z. B. mit Essigester, mit Wasser nicht mischbaren Alkohol wie n-Butanol, höheren aliphatischen Ketonen z. B. Methylisopropylketon, extrahiert.
Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich z. B. der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen oder der Absorption, vor allem Chromatographie bedienen. So können aus dem Rohprodukt, z. B.
Essigesterextrakt der Kulturbrühe, erhebliche Anteile an Begleitstoffen durch aufeinanderfolgende einfache Reinigungsprozesse wie Extraktion des getrockneten oder gelösten Rohproduktes mit Lösungsmitteln, in denen das Antibiotikum unlöslich ist, z. B. Kohlenwasserstoffen wie Petroläther, Cyclohexan, oder wasserfreien halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, entfernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen, z. B.
in Methanol, und durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, z. B. vernetzte Dextrane wie Sephadex (der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Begleitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt durch wiederholte Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, zweckmässig mit geringen Zusätzen von Aktivkohle, gereinigt werden. Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrakohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des stärker polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird. Wenn man den durch Extraktion der Kulturbrühe gewonnenen Extrakt an einer Mischung von Kieselgel mit z. B. 5 Gew. Prozent Aktivkohle und z. B.
Chloroform/Methanol als Elutionsflüssigkeit chromatographiert, findet man nahezu die gesamte Menge des aus der Kulturbrühe extrahierten Antibiotikums auf die Eluate der Methanolkonzentrationen 5-20 % verteilt.
Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen kann auch als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen werden. Als Lösungsmittelsystem dient beispielsweise eine Mischung von Essigester, Cyclohexan, Methanol und Wasser.
Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und Isolierung z. B.
nach der Methode derpräparativen Dünnschichtchromatographie unter den für den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung mittels Säulenchromatographie, wobei als Adsorptionsmittel z. B. Kiesel gel mit einem Gehalt von 1-5 Prozent Aktivkohle benutzt und die Elution vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit einer Mischung von Chloroform und Methanol bewirkt wird.
Die Steigerung der Konzentration des polareren Lösungsmittels erfolgt zweckmässig in kleineren Prozentualen Abstufungen, z. B. 5-20 Methanol, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradientenelutionsmethode. Das Antibiotikum wird vorzugsweise bei einer Methanolkonzentration von 10% eluiert. Das Reinigungsverfahren kann gegebenenfalls wiederholt werden.
Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (z. B. mit Chloroform-Methanol oder mit Essigester-Aceton-Wasser als Elutionsmittel) und Bioautographie mit Candida albicans kann man mindestens wei antibiotisch aktive Komponenten, Papulacandin A und Papulacandin B isolieren, deren Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel in Tabelle I angegeben sind; System 1 bezeichnet Chloroform-Methanol (4:1), zweimaliges Durchlaufen; System 2 bezeichnet Essigester Aceton-Wasser (72:24:4), zweimaliges Durchlaufen.
Tabelle I
Substanz System 1 System 2
KomponenteA 0,35 0,41
Komponente B 0,27 0,32 Ca. 75 % des Antibiotikums besteht aus der Hauptkomponente B, ca. 10% aus der Komponente A.
Für die Komponenten A und B wurden im Reihenverdünnungstest mit Candida albicans als Testorganismus minimale Hemmkonzentrationen (MIC) zwischen 0,006 und 0,1 y/ml gefunden.
Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - eignet sich als Testorganismus besonders gut Candida albicans.
Das Antibiotikum besteht - der Elementaranalyse der Hauptkomponenten A incl. B gemäss - nur aus den Elemen tenC,HundO.
Das Antibiotikum Papulacandin B weist folgende chemische and physikalische Eigenschaften auf:
Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz.
Sie ist löslich in Alkoholen, z. B. Niederalkanolen wie Methanol, Aethanol, n-Propanol, sowie in Ketonen, z. B. Diniederalkylketonen wie Aceton, Methylisobutylketon, ferner in Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid; sie ist schwer löslich in Essigester und chlorierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff (10-100 mg/ Liter); in Wasser, Petroläther, Äther, Hexan ist die Verbindung praktisch unlöslich. F. 193-197 (Zers.).
Elementaranalyse für C47H64017:
C H berechnet 62,65% 7,16% gefunden 61,28% 7,18% [a]D = + 50,0 + 1" (c = 0,46 in Methanol).
UV-Spektrum in Äthanol: X max 232 nm (E = 42 000)
240 nm (E = 42 400)
268 nm (E = 44 800)
300 nm (E = 31 200)
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3
100 MHz- NMR-Spektrum, s. Fig. 1.
Aufgrund der dampfdruck-osmometrischen Molekulargewichtsbestimmung des Acetylderivats kann das Molekulargewicht zu etwa 900-950 geschätzt werden. Das Antibiotikum besitzt keine freien Carboxyl- und keine O-Methylgruppen. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekulion fehlt. Im l3C-NMR.-Spektrum sind die Signale von 45-48 C-Atomen feststellbar. Zusammen mit den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Abbauversuche von Papulacandin lässt sich folgende Bruttoformel berechnen C47H64017.
Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten mehrere Hydroxylgruppen, davon 2 phenolische, acetyliert-werden. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich spektroskopisch nur schwer abschätzen. Im 100 MHz-NMR-Spektrum sind bei ca.
2 ppm die Signale mehrerer Acetylgruppen sichtbar. Aufgrund der Abbauversuche dürften 9 Acetylgruppen vorhanden sein.
Das Molekulargewicht wurde osmometrisch zu 1267 bestimmt.
Für das Acetylderivat wurden folgende physikalisch-chemische Daten erhalten.
Elementaranalyse fürC6sHs2026:
C H berechnet 61,02% 6,46% gefunden 60,74% 6,50%
UV-Spektrum (in Äthanol) hmax 216 nm (E = 23 200)
242 nm (E = 25 600)
268 nm (E = 27 600)
295 nm (Schulter).
IR-Spektrum, s. Beispiel 5 [a]D = -6fl" (c= 0,765 in Chloroform).
Bei der Hydrierung von Papulacandin B wurden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen. Im lH-NMR.-Spektrum des Hydrierungsproduktes sind alle Signale von olefinischen Protonen verschwunden. Zwei aromatische Protonen bei 6,3 ppm sind noch sichtbar. Das IR-Spektrum in KBr ist in Beispiel 6 angegeben. Das Hydrierungsprodukt weist folgende physikalisch-chemische Daten auf:
Elementaranalyse für C47H78017:
C H O berechnet 61,69% 8,59% 29,72% gefunden 60,94% 8,56% 30,10% F.125-130 C
UV-Spektrum (in Äthanol) h max. 270 nm (E = 3100) [a]D = +7 +1" (c = 0,214 in Methanol).
Das Antibiotikum Papulacandin Komponente A weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: Es ist eine schwach saure, in kristalliner Form weisse Substanz, die die gleichen Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B aufweist.
F. 171-1730C (Zersetzung)
Elementaranalyse
C H gefunden 61,88% 7,34%
UV-Spektrum (in Äthanol): max 232 nm Schulter
242 nm (Emax = 425)
265 nm (Emax = 520)
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3 [a]i7, +30 rel" (c = 0,419 in Methanol).
Die Figur 2 zeigt das 100 MHz-NMR.-Spektrum. Papulacandin A besitzt keine freien Carboxyl- und O-Methylgruppen. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekülion fehlt. Folgende Bruttoformel ist wahrscheinlich für Papulacandin A C 5o-53H72-75O17-19.
Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten verschiedene Hydroxylgruppen acetyliert werden. Das IR-Spektrum des Acetylderivates in Methylenchlorid ist in Beispiel 7 angegeben. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich nur schwer abschätzen. Vermutlich sind 9-11 Acetylgruppen vorhanden.
Das Acetylderivat von Papulacandin A weist folgende physikalisch-chemische Eigenschaften auf: Elementaranalyse:
C H O gefunden 61,91% 7,22% 30,81% UV-Spektrum (in Äthanol) max 240 nm (Emax = 270)
262 nm (Emax = 330) [a]D = - 15 (c = 0,249 in Chloroform) Bei der Mikrohydrierung von Papulacandin A werden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen.
Strukturaufklärung von Papulacandin B
Bei der alkalischen Hydrolyse von Papulacandin B in 0,5 N.-methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung lassen sich 3 Bruchstücke isolieren.
Formelschema 1
Alkalische Hydrolyse von Papulacandin B
EMI3.1
<tb> <SEP> Papulacandin <SEP> B
<tb> <SEP> 0,5NKOH
<tb> <SEP> CH30H/H20 <SEP> 2Std./RT
<tb> ROOC <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> VH <SEP> HO <SEP> CH2 <SEP> CH2S
<tb> <SEP> > 0S <SEP> X0v0 <
<tb> <SEP> = <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> H3 <SEP> 3 <SEP> yÜ2Oi <SEP> 00/\W
<tb> <SEP> tI <SEP>
<tb> <SEP> la: <SEP> R <SEP> = <SEP> H: <SEP> C15H2503 <SEP> H
<tb> <SEP> lb: <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3 <SEP> M+306
<tb> <SEP> 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca- <SEP> 3 <SEP> C19H26013
<tb> <SEP> 1,3,7,9-tetra-en-carbonsäure
<tb> <SEP> v
<tb>
EMI3.2
2a: R=H: C1oH1403 2b:
R= CH3 7-Hydroxy-nona- 1,3 ,5-trien-cnrbonsäure
1) 6-Hydroxy-7, 1 3-dimethyl-pentadeca- 1,3 ,7,9-tetra-en- carbonsäure-methylester
Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reaktionslösung mit Essigester bei pH 7,5 und anschliessende Veresterung mit Diazomethan erhalten.
Die Struktur dieser 4fach ungesättigten C-16-Fettsäure wurde folgendermassen bewiesen (s. Formelschema 2):
EMI4.1
Acetylierung des Methylesters 1b ergab das Monoacetat 5 mit der Masse 348. Die 13-Stellung der Methylgruppe ergab sich aus der Interpretation des 13C-NMR.-Spektrums von 5. Das Hydrierungsprodukt 6 von 5 zeigte im MS ein Molekülion bei m/e 356. Hydrierung des Methylesters 1b anderseits ergab 7 Hydroxy-8, 14-dimethyl-palmitinsäure-methylester 7, dessen Molekülion im MS bei m/e 314 gefunden wurde. Dessen Monoacetat war wiederum identisch mit der oben beschriebenen Verbindung 6. Die postulierte Struktur des aliphatischen Restes wurde dann durch einen Ozan-Abbau des Methylesters lb bewiesen.
Dabei konnten aus dem Reaktionsgemisch gaschromatographisch Oxalsäuredimethylester 8 und 4 Methylcapronsäure-methylester 9 durch Vergleich mit authentischem Material nachgewiesen werden.
2) 7-Hydrox-nona- 1,3,5,-trien-carbonsäuremethylester
Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reaktionslö sung mit Essigester bei pH 2,5 und anschliessende Veresterung mit Diazomethan erhalten. Mit Hilfe von UV.-, IR-, und
Massenspektrum (MS, mit Hochauflösung) und NMR.-Spektroskopie (mit Doppelresonanzversuchen) des Methylesters konnte die oben postulierte Struktur aufgestellt werden.
Die Struktur dieser 3fach ungesättigten Fettsäure wurde durch Oxidation des Methylesters mit CrO3 (Jones-Reagens) zum entsprechenden Keton 4 bestätigt:
EMI5.1
Im MS des Ketons ist ein Molekülion bei m/e 194 vorhanden.
Im NMR-Spektrum ist das Proton in 7-Stellung verschwunden.
3) Zuckerteil Ct9H26Ol3
Dieses Bruchstück wurde aus der restlichen Reaktionslösung nach Neutralisation auf pH 7,5 durch Chromatographie an Sephadex - LH-20 erhalten.
Die Interpretation des MS, der 100 MHz- und 360 MHz NMR.-Spektren und des '3C-NMR-Spektrums mit off-Resonanz-Entkopplung des Acetats 10a (siehe Formelschema 3)
Formelschema 3: Abbau des Zuckerbruchstücks
EMI5.2
EMI6.1
<tb> <SEP> Eornc!sch-:ma <SEP> 3:
<tb> R3 <SEP> ? <SEP> Abbau <SEP> des <SEP> Zucke:-bmchs,ücks
<tb> <SEP> oc <SEP> CII <SEP> 2011
<tb> <SEP> t <SEP> ,OCs <SEP> /
<tb> <SEP> OR <SEP> ( < <SEP> 3
<tb> <SEP> OR <SEP> 3
<tb> <SEP> r= <SEP> U <SEP> JO
<tb> 13a: <SEP> R <SEP> = <SEP> H <SEP> : <SEP> a-D-Form <SEP> 3
<tb> 13b: <SEP> R <SEP> = <SEP> H:P-D-Form <SEP> 15:R= <SEP> H:M+:328 <SEP> yIo
<tb> 14a: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> a-D-Form <SEP> 16: <SEP> R= <SEP> -COCH3: <SEP> M+: <SEP> 496.
<SEP> 9 <SEP> oOl
<tb> 14b: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> ss-D-Form
<tb> <SEP> OL
<tb> <SEP> NOCH3
<tb> <SEP> 17: <SEP> mm <SEP> 194
<tb> spricht für die vorgeschlagene Struktur. Im MS des Acetats 10a wird ein Molekülion bei m/e 840 gefunden. Acetylierung mit Deutero-Essigsäureanhydrid ergab 10b, dessen Molekülion im MS bei m/e 867 gefunden wurde. Damit ist die Anwesenheit von 9 Acetylgruppen bewiesen.
Die Methanolyse von 3 ergab keine befriedigenden Ergebnisse. Vor allem konnte das aromatische Bruchstück nicht isoliert werden. Daher wurde 3 mit Diazomethan in das Dimethylderivat 11 übergeführt, das nach Acetylierung ein Heptaacetat 12 mit M+ bei m/e 784 lieferte. Methanolyse von 11 lieferte dann 3 Bruchstücke, nämlich Methyl-ct-D-galacto- pyranosid 13a, wenig Methyl-B-D-galacto-pyranosid 13b, deren Tetraacetate 14a und 14b mit authentischem Material identisch waren, und Verbindung 15, die im MSein Molekülion bei m/e 328 (Hochauflösung: ClsH200s) lieferte. Acetylierung von
15 lieferte das Tetraacetat 16 mit M+ bei m/e 496. Perjodatspaltung schliesslich von 15 mit Perjodsäure ergab Verbindung
17, die im MS ein Molekülion bei m/e 194 zeigte.
Aufgrund der Interpretation des 360-MHz-NMR.-Spektrums von 10a ist der Galactoserest ssglycosidisch mit dem restlichen Teil des Moleküls verknüpft.
Addiert man die Bruttoformeln der 3 gefundenen Bruchstücke unter der Annahme, dass die beiden Fettsäuren esterartig mit dem Zuckerbruchstück verknüpft sind, kommt man zu folgender Bruttoformel für Papulacandin B: C47H64017 MG 900. Sie stimmt mit den Ergebnissen der Elementaranalyse überein.
Aufgrund weiterer analytischer Untersuchungen, insbesondere des 360 MHz NIMR- und 13C-NMR-Spektrums und der Resultate der Massenspektroskopie konnte folgende Formel für Papulacandin B ermittelt werden:
EMI6.2
Struktur von Papulacandin A
Nach spektroskopischen Vergleichen von Papulacandin A und Papulacandin B und präliminären Hydrolyseversuchen enthält Komponente A ebenfalls 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca-1,3,7,9-tetraen-carbonsäure und das gleiche Zukkerbruchstück und unterscheidet sich vermutlich in der zweiten Fettsäure durch 1 zusätzliche Methyl- und 3-4 zusätzliche Methylengruppen.
Aufgrund ähnlicher analytischer Untersuchungen wie die oben für Papulacandin B erwähnten liess sich für Papulacandin A folgende Formel ermitteln:
EMI6.3
Unter Derivaten des Antibiotikums sind im vorangehenden wie im folgenden einerseits Ester des Antibiotikums, andererseits Hydrierungsprodukte und deren Ester zu verstehen. Ester sind beispielsweise solche, in denen die alkoholischen Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder Thiocarbonsäuren mit 120 Kohlenstoffatomen verestert sind. Solche Säuren sind vor allem gegebenenfalls substituierte Niederalkansäuren mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, ferner gegebenenfalls substituierte monooder bicyclische aromatische oder araliphatische Säuren wie Benzoesäure, Thiobenzoesäure, Naphthalinsäure, Phenylniederalkansäuren wie Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure.
Substituenten der Säuren sind beispielsweise Halogen wie Fluor, Chlor, Brom, Jod, Trifluormethyl, Nitro, freie, ver esterte oder verätherte Hydroxylgruppen, z. B. Niederalkanoyloxy wie Acetoxy, Niederalkoxy wie Methoxy, Niederalkylmercapto wie Methylmercapto, freie oder funktionell abgewandelte Carboxylgruppen, z. B. Niederalkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Carbamoyl, Cyan, gegebenenfalls substituierte Aminogruppen, z. B. mono- oder di-nieder-alkylierte oder N-acylierte Aminogruppen, z. B. Methylamino, Dimethylamino, Niederalkanoylamino, z. B. Acetylamino.
Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate weisen neben ihrer antifungischen Wirkung auf Fadenpilze (Hyphomyceten) wie z. B. Trichoderma mentagrophytes, vorallem eine sehr gute spezifische Wirkung gegenüber verschiedenen Arten hefeartiger Pilze wie Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata, und Hansenula anomala auf. So beträgt z. B. bei der in vitro-Prüfung im Gradienten-Platten Strichtest (W. Szibalski, Science 116, 46 [1 925j) gegenüber ca.
20 verschiedenen klinisch vorkommenden Stämmen von Candida albicans die minimale Hemmkonzentration 0,006 bis 0,1 ml. Papulacandin zeichnet sich durch sehr geringe Toxizität im Vergleich zu bekannten antifungisch wirkenden Antibiotika aus. Das neue Antibiotikum und seine Derivate können daher zur Bekämpfung von Infektionen, die durch die genannten Pilze, insbesondere Candida albicans, hervorgerufen werden oder als Desinfektionsmittel verwendet werden.
Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate können, wie erwähnt als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die topische, enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Oele, Benzylalkohole, oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Die Figuren stellen dar: Fig. 1: lH-NMR-Spektrum in CD30D, von Papulacandin B Fig. 2: 'NMR-Spektrum in CD3OD von Papulacandin A.
Beispiel I
Ein gut bewachsenes Schrägagarröhrchen des Papularia sphaerosperma A 32283 wird mit 5 ml 0,2-m. Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane: Einbuchtung, mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl und 20 g Mannit enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n. Natronlauge auf 8,5 eingestellt wurde, werden mit je 1 ml der Papularia-Suspension beimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 upm bei 23 inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 23"C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.
1,5 Liter der Kultur aus den 2 Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 48 Stunden bei 23 inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einem Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6-blätterigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche). Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 1 atü, Rührgeschwindigkeit 450 upm, Temperatur 23 C, Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 200 mM O2/ 1/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums A 32283 erfolgt nach ca. 60 Stunden Inkubation. Die Kulturlösung weist dann einen pH von 6,7 auf.
Sie hat eine Aktivität von 10-12 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans unter Verwendung von Whatmann A discs 6 mm.
Beispiel 2
600 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel Decalite (Diatomeenerde) filtriert 560 Liter Kulturfiltrat werden mit Natronlauge auf pH 8,6 gestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Essigester im Verhältnis 2:1 extrahiert.
Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen. 600 Liter Essigesterphase werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein Konzentrat von 45 Litern.
91 kg Mycel aus obiger Filtration werden 1 x mit 200 Liter und 1 X mit 100 Litern Methanol verrührt und jeweils filtriert. Das inaktive Mycel wird verworfen. 300 Liter Methanolextrakt werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein wässeriger Mycel-Extrakt von 33 Litern, der mit NaOH auf pH 8,4 gestellt und 2 x mit je 66 Litern Essigester extrahiert wird. Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen.
120 Liter Mycel-Essigester-Extrakt werden mit obigen 45 Litern Kulturfiltrat-Essigester-Extrakt vereinigt und im Vakuum konzentriert. Es resultieren 1,85 Liter Essigesterextrakt-Konzentrat, die mit 2 Liter 85 %igem Methanol versetzt und 3 X mit je 2 Liter Petroläther extrahiert werden. Die inaktiven Petrolätherphasen werden verworfen und die Methanolphase wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es resultieren 51 g dunkelbrauner, zähflüssiger Rückstand, der in 200 ml 85%igem Methanol gelöst und 2 X mit je 300 ml Heptan extrahiert wird. Die inaktiven Heptanphasen werden verworfen. Die Methanolphase wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren 41,8 g Extrakt-Rückstand.
Beispiel 3
Von dem nach Beispiel 2 erhaltenen Extrakt-Rückstand werden 18 g auf einer Säule ( 5,4 cm, h = 140 cm), welche aus einer (95:5 Gew.: Gew .)-Mischung von 1000 g Silicagel (Merck Korngrösse 0,05 - 0,2 mm) und 50 g Aktivkohle NoritOR besteht, chromatographiert. Die Mischung von Silicagel-Aktivkohle wurde vorher 3 mal mit Methanol und anschliessend 3mal mit Chloroform aufgeschlämmt und filtriert.
Die 12,3 g Extrakt-Rückstand werden in 50 ml Methanol gelöst, mit 50 g Silicagel vermischt und das Gemisch wird zur Trockne eingedampft. Der getrocknete pulverige Rückstand wird auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Fraktionen zu je 1 Liter mit Chloroform-Methanolmischungen unter stufenweiser Steigerung der Konzentration von Methanol. Man beginnt mit einem Methanolgehalt von 4% und hört auf mit 50% Methanol. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 ml/ Std. Die Fraktionen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Fraktionen werden dann aufgrund dünnschichtchromatographischer und bioautographischer Prüfung vereinigt. Die Fraktionen 1-16 (eluiert mit 1-4% Methanol) sind nur schwach aktiv und werden verworfen.
Die Fraktionen 17-23 (eluiert mit 4 bis 7% Methanol) enthalten Papulacandin D und E (weitere Reinigung siehe Beispiel 5). Die Fraktionen 24-27 (eluiert mit 7% Methanol) enthalten Papulacandin A. Die Fraktion 28 (eluiert mit 10% Methanol) enthält ein Gemisch von Papulacandin A und B. Die Fraktionen 29-31 (eluiert mit 10% Methanol) enthalten Papulacandin B. Die Fraktionen 32 und 36 (eluiert mit 1020% Methanol) enthalten neben Papulacandin B auch Papulacandin C mit kleinerem Rf-Wert. Die restlichen Fraktionen (eluiert mit 2050% Methanol) enthalten noch weitere aktive Substanzen in kleinen Mengen.
Zur Isolierung von Papulacandin B wird der Rückstand der Fraktionen 29-31 (1,86 g) aus Aceton/Äther gefällt. Es resultieren 1,5 g reines Papulacandin B als farbloses Pulver vom F.
193-197 C (Zersetzung).Zur Isolierung von reinem Papulacandin A wird der Rückstand der Fraktionen 24-27 (1,5 g) aus Aceton/Äther kristallisiert. Es resultieren 1,2 g reines Papulacandin A als farbloses Pulver vom F. 171-1730C.
Papulacandin B
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C: 60,45 % H = 6,99% 0 = 32,62%. Das Antibiotikum zeigt im IR-Spek trum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2975, 2925, 2875,
1690, 1640 (Schulter), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260,
1180, 1150, 1070, 1035, 1005, 970, 865 und 845 cm-l. Im UV-Spektrum in Aethanol sind folgende Maxima vorhanden: ymax232 nm (E = 42 000), 240 nm (± = 42 400), 268 nm (E = 44 800), 300 nm (E = 31 200). Die optische Drehung beträgt [a]20 = + 50 + 1 (c = 0,458 in Methanol). Die Bruttofor mel lautet C47 Htt 017.
Das lH-NMR-Spektrum in CD30D ist in Fig. 1 gegeben.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselfertigplatten F254 der Fa. Merck) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert = 0,4 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 7 Aequivalente Wasserstoffe verbraucht.
Papulacandin A
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 62,98% H = 7,45% 0 = 29,09%. Das Antibiotikum zeigt im IR. Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2950, 2870,
1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155,
1075, 1035, 1010, 975, 860 und 845 cm-l. Im UV-Spektrum in Äthanol sind die folgenden Maxima vorhanden: Xmax (E?): 232 nm (Schulter), 242 nm (E = 425) und 265 nm (E = 520).
Das lH-NMR.-Spektrum in CD30D ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die Verbindung zeigt eine optische Drehung [a]20 = + 3 1 + lo (C = 0,451 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselgelfertigplatten F254 der Fa. Merck im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert = 0,50 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 6-7 Aequ. Wasserstoff verbraucht. Die ungefähre Bruttoformel lautet Csss3H72-7sOl7-ls.
Beispiel 4
Von den nach Beispiel 3 erhaltenen Fraktionen 67-70, die Papulacandin B enthalten, werden 2,1 g auf eine Säule ( = 4 cm, h = 50 cm), gefüllt mit SephadexQ-LH-20 (5,5 Liter) chromatographiert. Sephadex-LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran) wurde vorher 4 Stunden in Methanol gequollen. Die 2,1 g Papulacandin B werden in 5 ml Methanol gelöst und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt mit Methanol in Fraktionen von 22 ml. Die Geschwindigkeit beträgt 90 ml/Stunde.
Die Fraktionen werden im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Eluate der Fraktionen 1-15 (120 mg) sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 16-27 enthalten 1,9 g reines Papulacandin B, die aus Aceton/Äther gefällt wird.
Eigenschaften siehe Beispiel 3.
Beispiel 5
Papulacandin B wird wie folgt acetyliert: 250 mg Papulacandin B werden mit je 2 ml Pyridin und Essigsäureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 30 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 300 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Äther und Hexan gefällt wird. Im IR-Spektrum in Methylenchlorid des Acetylderivats sind folgende Banden vorhanden: 2970, 2870, 1755, 1645, 1620, 1425, 1375, 1225, 1195, 1125, 1080, 1050, 1015, 970 und 890 cm-1. Das UV-Spektrum in Aethanol weist Maxima bei 216 nm (e = 23200), 242 nm (E = 25 600), 268 nm (E = 27 600) und 295 nm (Schulter) auf. Die Elementaranalyse ergibt: C = 60,74% H = 6,51%. Osmometrisch wird ein Molekulargewicht von 1250 gefunden.
Beispiel 6
Papulacandin B wird wie folgt hydriert. Zu 50 mg Platinoxid, die in 15 ml Äthanol in einer Hydrierungsapparatur vorhydriert wurden, gibt man 250 mg Papulacandin B. Es werden 44 ml Wasserstoff aufgenommen, was 6,8 Aequivalenten entspricht. Nach Filtration und Eindampfen des Filtrates werden 243 mg farbloser Rückstand erhalten, der an 50 g Kieselgel mit Chloroform, welches 8% Methanol enthält, chromatographiert wird. Es werden 106 mg reines Hydrierungsprodukt erhalten.
Das IR.-Spektrum (in KBr) zeigt Banden bei: 3500, 2950, 2860, 1720, 1610, 1465, 1385, 1250, 1185, 1150, 1095, 1070, 1030, 1005, 980 cm-l. Im lH-NMR.-Spektrum sind die Signale der olefinischen Protonen der Komponente B verschwunden.
Weitere physikalisch-chemische Eigenschaften: siehe den allgemeinen Teil der Beschreibung.
Beispiel 7
Das Antibiotikum Papulacandin A wird wie folgt acetyliert: 100 mg Papulacandin A werden mit je 1 ml Pyridin und Essigsäureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 20 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 75 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Äther und Hexan gefällt wird. Im IR.-Spektrum (in Metyhlenchlorid) des Acetylderivates sind folgende Banden vorhanden: 2920, 2860, 1755, 1690, 1640, 1605, 1510, 1460, 1370, 1225, 1175, 1125, 1040, 965 cm-l. Das UV.-Spektrum in Äthanol weist Maxima bei 242 nm (El5 m = 240) und 262 (El tm = 370) auf. Die Anzahl der Acetylgruppen liess sich nicht eindeutig bestimmen.
Aufgrund des lH-NMR.-Spektrums sind 9-11 Acetylgruppen anzunehmen.