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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Klassifikationsgruppe E.C. 3.4.4. in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die Körperflüssigkeit ein Substrat einwirken lässt, welches die folgende Struktur aufweist:
: R' -Pro-X-Arg-NH-R2 I worin Rl eine Acyl- oder Sulfonylgruppe, R2 einen gegebenenfalls Substituenten tragenden aromatischen Kohlenwasserstoffrest und X eine Phenylalanyl-, ss-Cyclohexylalanyl; Phenylglycyl- oder Tyrosylgruppe bezeichnen, wobei -NH-R2 eine chromophore Gruppe darstellt, und welches die Eigenschaft besitzt, unter der hydrolytischen Einwirkung der genannten Enzyme ein Spaltprodukt der Formel
NH2-R2 abzugeben, und dass man die Menge des durch das Enzym abgespaltenen Produktes NH2-R2 mittels photometrischer, spektrophotometrischer oder fluoreszenzphotometrischer Methoden misst.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat verwendet, dessen durch Rl bezeichnete Acylgruppe die folgende Teilformel aufweist: R3 - CO - II, worin R3 a) einen gegebenenfalls in co-Stellung eine Aminogruppe tragenden aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen, b) einen araliphatischen Kohlenwasserstoffrest, dessen aliphatischer Teil 1 bis 17 Kohlenstoffatome enthält und dessen Arylrest gegebenenfalls eine Aminogruppe trägt, c) einen gegebenenfalls eine Amino- oder Aminomethyl- gruppe tragenden cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffrest, d) einen gegebenenfalls eine Alkyl-, Amino- oder Aminoalkylgruppe tragenden aromatischen Kohlenwasserstoffrest oder e) eine Benzyloxygruppe bezeichnet.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat verwendet, dessen durch R' bezeichnete Sulfonylgruppe eine Benzolsulfonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat verwendet, in welchem R2 eine p-Nitrophenyl-, p-Naphthyl- oder 4-Methoxy-p-naphthylgruppe ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Körperflüssigkeit Blutplasma verwendet.
6. Verfahren zur Bestimmung von Plasmakallikrein gemäss den Ansprüchen 1 und 5.
7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Spaltprodukt NH2R2 vor der photometrischen Messung diazotiert und mit einer Kupplungskomponente kuppelt.
8. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Substrat in protonisierter Form verwendet.
9. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Substrat in Form des Hydrochlorids verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Klassifikationsgruppe E.C. 3.4.4. in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere, insbesondere zur Bestimmung von Präkallikrein, Präkallikreinaktivatoren, Kallikrein und Kallikreininhibi toren in Blutplasma.
Es stehen zurzeit verschiedene synthetische Produkte als Substrate für proteolytische Enzyme der Peptid-Peptidohydrolase-Gruppe, insbesondere jener Enzyme, welche die Peptidketten auf der Carboxylseite von Arginin und Lysin spalten, z. B. Trypsin, Thrombin, Plasmin und Kallikrein sowie andere Enzyme der Klasse E.C. 3.4.4 (Enzymnomenklatur) zur Verfügung. E.C. ist die Abkürzung für Enzyme Committee der International Union of Biochemistry .
Entsprechend der Art der katalytischen Reaktion, welche die proteolytischen Enzyme auslösen, d. h. der esterolytischen oder der amidolytischen Reaktion, können die genannten synthetischen Substrate in zwei Hauptgruppen unterteilt werden, nämlich in die Gruppe der Estersubstrate und die Gruppe der Amidsubstrate.
Die Estersubstrate wurden bisher weit häufiger als die Amidsubstrate für Untersuchungen von Reaktionen, an welchen die genannten Enzyme teilnehmen, verwendet, und zwar deshalb, weil die Estersubstrate schneller gespalten werden als die zur Zeit verfügbaren Amidsubstrate.
Es wurden Arbeiten veröffentlicht (siehe z. B. W.H. SEE GERS, Blood Clotting Enzymology , Academic Press, 1967, S. 36 und 42-44), aus welchen hervorgeht, dass das Verhältnis der Reaktionsgeschwindigkeiten der esterolytischen und der amidolytischen Katalyse der genannten Enzyme starken Schwankungen unterworfen ist. So weist beispielsweise acetyliertes Thrombin eine erhöhte esterolytische Wirksamkeit auf, währenddessen amidolytische Wirksamkeit nahezu aufgehoben ist In biologischen Flüssigkeiten ist die mittels Estersubstraten von niedrigem Molekulargewicht bestimmte esterolytische Wirksamkeit der genannten Enzyme nicht immer im gleichen Ausmass gehemmt wie die mittels natürlichen Substraten oder Amidsubstraten bestimmte amidolytische Wirksamkeit.
Mittels eines synthetischen chromogenen Amidsubstrates mit einer von der Struktur der natürlichen Substrate abgeleiteten Struktur wäre es leichter, die Erhöhung bzw. Verminderung der enzymatischen Wirksamkeit in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen.
Natürliche Substrate, wie Kininogen und Fibrinogen, die meist hohe Molekulargewichte aufweisen, lassen sich in reiner nativer Form nur sehr schwer aus natürlichen Quellen isolieren.
Bei der enzymatischen Hydrolyse dieser natürlichen Substrate entstehen Produkte, die sich mit üblichen Methoden, z. B. durch spektrophotometrische Messungen, nur schwer bestimmen und verfolgen lassen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein synthetisches Amidsubstrat zu entwikkeln, das durch Plasmakallikrein leicht und rasch hydrolytisch spaltbar sein und Spaltprodukte liefern sollte, die sich durch photospektrometrische Methoden leicht bestimmen lassen sollten.
Zur Lösung dieser Aufgabe wurde davon ausgegangen, dass Kallikrein bei Schockzuständen beim Menschen durch hydrolytische Wirkung aus dem natürlich vorkommenden Substrat Kininogen (Molekulargewicht etwa 50 000) das biologisch hochwirksame, schmerzerzeugende Bradykinin (Molekulargewicht etwa 1000) in Freiheit setzt und dass man durch Verwendung eines C-terminalen Strukturelementes des Bradykinins und Verknüpfung dieses Elementes mit einer chromogenen bzw. fluoreszierenden Gruppe ein synthetisches Amidsubstrat erhalten könnte, welches die gleiche oder annähernd gleiche Suszeptibilität gegenüber Plasmakallikrein wie das natürliche Substrat aufweisen und durch Amidolyse ein chromogenes bzw.
fluoreszierendes Spaltprodukt mit einem bei hohen Wellenlängen messbaren hohen molaren Extinktionskoeffizienten bilden würde, so dass der Einfluss von biologischen Flüssigkeiten auf die Messung stark vermindert wäre.
Es wurde nun ein synthetisches chromogenes bzw. fluores
zierendes Substrat entwickelt, das den oben definierten Anforderungen entspricht und zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Klassifikationsgruppe E.C. 3.4.4. in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere, durch photometrische, spektrophotometrische oder fluoreszenzphotometrische Methoden geeignet ist. Dieses Substrat weist die allgemeine Formel R' -Pro-X-Arg-NH-R2 I auf, worin R' eine Acyl- oder Sulfonylgruppe, R2 einen gegebe nenfalls Substituenten tragenden aromatischen Kohlenwasser stoffrest, X eine Phenylalanyl-"ss-Cyclohexylalanyl; Phenylgly cyl- oder Tyrosylgruppe bezeichnen, wobei -NH-R2 eine chro mophore Gruppe darstellt, und besitzt die Eigenschaft, unter der hydrolytischen Einwirkung der Enzyme ein Spaltprodukt der Formel NH2-R2 abzugeben, dessen Menge durch die genannten photometrischen Methoden messbar ist.
Die in der Formel I durch R' bezeichnete Acylgruppe kann durch die folgende Gruppenformel gekennzeichnet werden:
R3-CO worin R3 (a) einen gegebenenfalls in co-Stellung eine Amino gruppe tragenden aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen, (b) einen araliphatischen Kohlen wasserstoffrest, dessen aliphatischer Teil 1 bis 17 Kohlenstoffa tome enthält und dessen Arylrest gegebenenfalls eine Amino gruppe trägt, (c) einen gegebenenfalls eine Amino- oder Ami nomethyl-Gruppe tragenden cycloaliphatischen Kohlenwas serstoffrest, (d) einen gegebenenfalls eine Alkyl-, Amino- oder
Aminoalkyl-Gruppe tragenden aromatischen Kohlenwasser stoffrest oder (e) eine Benzyloxygruppe bezeichnet.
R3 kann insbesondere eine Alkylgï uppe, wie Methyi-, Athyl-,
Propyl-, Butyl-, Pentyl- usw. bis Heptadecyl, sein. Diese Alkyl gruppen können in co-Stellung eine Aminogruppe tragen. Somit kann R3 z. B. eine o-Aminopropyl-, c3-Aminopentyl- oder o-Ami nononyl-Gruppe sein. R3 kann ferner eine Benzyl-, 2-Phenylät hyl-, 3-Phenylpropyl- usw. bis 1 1-Phenylundecyl-Gruppe bezeichnen. Der Phenylrest der genannten Gruppen kann in p-Stellung eine Aminogruppe tragen. Somit kann R3 eine p-Aminobenzyl-, 2-(p-Aminophenyl > äthyl-, 3Xp-AminophenylS propyl usw. bis 1 lXp-Aminophenyl-undecyl-Gruppe sein.
R3 kann ferner eine Cyclohexyl-, 4-Aminocyclohexyl-, 4-Amino methylcyclohexyl-, 4-Aminoäthylcyclohexyl-, 4-Aminopropyl cyclohexyl- oder 4-Aminobutylcyclohexyl-Gruppe darstellen.
R3 kann noch eine Phenyl-, a-Naphthyl-, ss-Naphthyl- oder
Biphenyl-Gruppe darstellen. Diese Gruppen können ihrerseits eine Aminogruppe, eine Aminoalkylgruppe oder eine Alkyl gruppe tragen. Das Alkyl in den genannten Aminoalkyl- und
Alkylgruppen kann z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Isobutyl sein. Schliesslich kann R3 eine Benzyloxy-Gruppe darstellen.
Die in der Formel I mit R1 bezeichnete Sulfonylgruppe kann eine Benzolsulfonyl- oder p-Toluolsulfonyl-Gruppe sein.
Die Herstellung des Substrates kann nach verschiedenen, z. T. bekannten Methoden erfolgen:
1. Bei der ersten Methode werden die chromophoren Grup pen (R2 in Formel I) an der C-terminalen Aminosäuregruppe angehängt. Diese Gruppen üben gleichzeitig die Funktion von
C-terminalen Carboxylschutzgruppen während der stufenwei sen Anknüpfung von Aminosäuren bis zum gewünschten Pep tidgerüst aus. Die übrigen Schutzgruppen werden vom Schluss produkt selektiv abgespalten, ohne dass die chromophore
Gruppe beeinflusst wird. Diese Methode ist z. B. in Peptide
Synthesis von Miklos Bodanszky et al., Interscience Publis hers, 1966, Seiten 163-165, beschrieben.
2. Bei der zweiten Methode wird die chromophore Gruppe an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, und zwar dadurch, dass nach erfolgtem, stufenweisem Aufbau des gewünschten Peptidgerüstes die C-terminale Carboxylgruppe zuerst durch alkalische Hydrolyse des Esters freigesetzt wird, worauf die chromophore Gruppe an die Carboxylgruppe angehängt wird. Die übrigen Schutzgruppen werden zum Schluss selektiv abgespalten, und zwar unter Bedingungen, bei welchen die chromophore Gruppe intakt bleibt. Diese Methode ist in Peptide Synthesis , siehe oben, Seiten 43 und 44, beschrieben.
3. Bei der dritten Methode wird die chromophore Gruppe an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, nachdem zuvor die übrigen Schutzgruppen abgespalten worden sind.
Die C-terminale Carboxylgruppe wird in diesem Fall durch racemisierungsfreie enzymatische Esterspaltung freigesetzt.
Diese esterspaltenden Enzyme können entweder frei oder an eine Matrix gebunden sein.
Zum Schutz der Na-Aminogruppen während des stufenwei sen Aufbaus der Peptidketten können gewöhnliche, bekannte Aminoschutzgruppen, die selektiv abgespalten werden können, verwendet werden. Es handelt sich in erster Linie um Cbo,
MeOCbO, NO2Cbo, MCbo, BOC, TFA oder Formyl. Die a-Carboxylgruppe der Aminosäuren kann nach verschiedenen bekannten Methoden reaktionsfähig gemacht werden, z. B.
durch Herstellung der p-Nitrophenylesterderivate, Trichlor phenylesterderivate, Pentachlorphenylesterderivate, N-Hydroxy-succinimidesterderivate und Isolierung dieser Derivate oder durch Herstellung in situ der Säureazide oder Säureanhydride, die entweder symmetrisch oder asymmetrisch sein können.
Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann auch mittels eines Carbodiimids, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, erfolgen.
Die Carboxylgruppe, die in den Peptidderivaten C-terminal steht, wird entweder mittels der chromophoren Amidgruppe oder aber als Methyl-, Äthyl- oder Isopropylester während des stufenweisen Aufbaus des gewünschten Peptidgerüstes geschützt.
Die übrigen freien reaktionsfähigen Gruppen, die nicht am Aufbau des Peptidgerüstes beteiligt sind, können durch folgende spezielle Massnahmen blockiert werden: Die ô-Guanidi- nogruppe des Arginins wird durch NO2, Tos oder durch einfache Protonisierung geschützt.
Die Herstellung des erfindungsgemässen Substrates nach den oben genannten Methoden ist in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben.
Die Analyse der gemäss den Beispielen erhaltenen Eluate und Produkte wurde durch Dünnschichtchromatographie ausgeführt. Zu diesem Zweck wurden mit Siliciumdioxydgel F 254 (Merck) überzogene Glasplatten verwendet. Zur Entwicklung der Dünnschichtchromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:
A Chloroform/Methanol (9:1)
B n-Propanol/Essigsäureäthylester/Wasser (7:1:2)
C n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1)
Die Chromatogramme wurden zuerst im UV-Licht und dann durch Reaktion mit Chlor/Toluidin (siehe G. Pataki, Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptid Chemie , Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, S. 125) entwikkelt.
In der vorliegenden Beschreibung (einschliesslich Patentansprüchen) werden folgende Abkürzungen verwendet: Arg = Arginin Pro = Prolin Phe = Phenylalanin Tyr = Tyrosin Val = Valin Ph = C-Phenylglycin CHA = B-Cyclohexylalanin
Sofern nichts anderes vermerkt ist, weisen alle Aminosäuren in den Peptidketten, die in den Beispielen beschrieben sind, L-Konfiguration auf.
Ac = Acetyl AclO = Acetanhydrid AcOH = Essigsäure BOC = Tert-Butyloxycarbonyl Bz = Benzoyl Bzl = Benzyl BzzO = Benzoesäureanhydrid Cbo = Carbobenzoxy DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid DCHA = Dicyclohexylamin DCH = Dicyclohexylharnstoff DMF = Dimethylformamid DSC = Dünnschichtchromatogramm Et3N = Triäthylamin LMS A = Lösungsmittelsystem:
Chloroform/Methanol 9:1 LMS B = Lösungsmittelsystem: n-Propanol/Essigsäuremethylester/Wasser 7:1:2 LMS C = Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:1:1 HMPTA = N,N,N:N',N",N"-Hexamethylphosphorsäuretriam MCbo = p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy MeOH = Methanol NA = Naphthylamin OtBu = Tert-Butyloxy OEt = Äthyloxy OMe = Methyloxy OpNP = p-Nitrophenoxy OisoPr = iso-Propyloxy pNA = p-Nitroanilid TFA = Trifluoroacetyl THF = Tetrahydrofuron Tos = p-Toluolsulfonyl Beispiel 1 N -Bz-Pro-Phe-Arg-p NA.HCl Ia) N -Cb:Arg(NO2)-p NA
1.
In einem 500 ml Dreihalsrundkolben wurden 32,55 g (92,1 mMol) gut getrocknetes Cbo-Arg(NO2-OH in 200 ml von über P205 getrocknetem und frisch destilliertem N,N,N',N:N",N"- Hexamethylphosphoräsuretriamid unter Feuchtigkeitsausschluss bei 20 C gelöst. Zu dieser Lösung wurden zuerst 9,32 g (92,1 mMol) Et3N und nachfolgend 18,90 g (115,1 mMol) p-Nitrophenylisocyanat in 250/obigem Uberschuss portionenweise zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei Zimmertemperatur wurde die Reaktionslösung unter Rühren zu 1,5 Liter 2%iger NaHCO3-Lösung zugetropft. Das ausgefällte Produkt wurde abfiltriert und dreimal mit je 0,7 Liter 20/obiger NaHCO3-Lösung, dreimal mit je 0,7 Liter dest.
Wasser, dreimal mit je 0,5 Liter 0,5-n HCL und schliesslich dreimal mit je 0,5 Liter dest. Wasser gewaschen. Das derart gewonnene Produkt wurde im Vakuum bei 40 "C getrocknet und hierauf zweimal mit je 200 ml siedendem Methanol extrahiert, wobei die Hauptmenge des als Nebenprodukt angefallenen N -Cbo-(o-nitroar- gininlactams, neben nur geringen Mengen an gewünschtem Produkt herausgelöst wurde. Das auf diese Weise gewonnene, vorgereinigte Rohprodukt wurde nach dem Trocknen zweimal mit je 50 ml auf 70 "C erhitztem DMF extrahiert, wobei das gewünschte Produkt vollständig herausgelöst wurde, während das Nebenprodukt, nämlich N,N'-bis-p-Nitrophenylharnstoff, ungelöst zurückblieb. Die DMF-Lösung wurde im Vakuum bei 40 "C eingeengt.
Nach Zusatz von MeOH kristallisierte eine Substanz aus, welche in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlich war und einen Smp. von 186-188,5 "C aufwies.
Ausbeute: 29,75 g (68,2 /o der Theorie). Durch Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C20H23N7C7 wurden folgende Werte ermittelt (die Werte für die Bruttoformel sind in Klammern gesetzt):
C = 50,42 /o (50,74 /0); H = 4,98% (4,9001o); N = 20,90% (20,710/o). [a]ss2 = 1,27 (c = 1,0; AcOH).
2. In einem 500 ml Dreihalsrundkolben wurden 17,7 g (50 mMol) getrocknetes Cbo-Arg(NO2)-OH in 350 ml THF:DMF (1:1) gelöst, worauf unter Feuchtigkeitsausschluss 5,05 g (50 mMol) Et3N zugesetzt wurden. Nach Abkühlung der Reaktionslösung auf - 10 "C wurden dann 6,85 g (50 mMol) Chlorameisensäureisobutylester, gelöst in 30 ml THF, innerhalb 15 Minuten zugetropft, wobei eine Temperatur von - 10 bis -5 "C eingehalten wurde. Nach etwa 10 Minuten wurden 8,2 g (50 mMol) p-Nitroanilin, gelöst in 15 ml DMF, zugetropft, wobei wiederum eine Temperatur von -10 "C bis -5 "C eingehalten wurde.
Nach 2 Stunden wurde die Kühlung unterbrochen und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehen gelassen. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand nacheinander je dreimal mit dest. Wasser, dreimal mit 50/obiger NaHCO3-Lösung und wiederum dreimal mit dest Wasser digeriert. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde das Rohprodukt in Methanol gelöst und über eine mit Methanol äquilibrierte Säule von Sephadex LH-20 (vernetztes Dextrangel) laufen gelassen. Aus einer Fraktion des Eluats erhielt man 7,67 g Substanz (32,40/o der Theorie) mit den gleichen physikalischen Eigenschaften wie das gemäss Absatz 1 erhaltene Endprodukt.
3. 17,7 g (50 mMol) Cbo-Arg(NO2)-OH wurden in 75 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf - 10 "C wurden der Lösung nacheinander 10,3 g (50 mMol) DCCI und 8,2 g (50 mMol) p-Nitroanilin zugesetzt. Nach 4 Stunden bei -10 "C und 20 Stunden bei 20 "C wurde der gebildete DCH abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt wurde in MeOH gelöst und über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von Sephadex LH-20 laufen gelassen. Neben viel Nebenprodukt, nämlich N-Cbo-Arg-(NO2)-N,N'-dicyclUhexylharnstoff, wurden aus einer Fraktion des Eluats 4,32 g Substanz (17,9% der Theorie) gewonnen, welche die gleichen physikalischen Eigenschaften wie das nach Absatz la hergestellte Endprodukt aufwies.
Ib) Na-Cbo-Phe-Arg(N02)p NA
Unter Feuchtigkeitsausschluss wurden 9,5 g (20 mMol) N - Cbo-Arg(NO2)-p NA (siehe Beispiel 1, Absatz la, in einem Kolben mit 80 ml 2-n HBr in Eisessig unter Rühren eine Stunde bei 20 "C behandelt, wobei diese Substanz sich unter CO2-Entwicklung löste. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 400 ml getrocknetem Äther langsam zugetropft, wobei HBr-H-Arg(NO2)-p-NA ausfiel. Die Ätherphase wurde mit einem Filtrierstab abgesaugt. Die verbleibende Fällung wurde noch viermal mit je 150 ml trockenem Äther behandelt, um das gebildete Benzylbromid und überschüssiges HBr sowie Essigsäure zu entfernen.
Nach dem Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene Hydrobromid-Derivat wurde in 50 ml DMF gelöst, auf -10 "C gekühlt und mit 4,16 ml (30 mMol) Et3N versetzt, um H-Arg(NO2)-p NA aus dem Hydrobromid freizusetzen. Das gebildete EtsNHBr-Salz wurde abgenutscht, mit wenig kaltem DMF nachgewaschen, und dem Filtrat wurden 7,8 g (21 mMol) Cbo-Phe-OpNP bei -10 "C zugesetzt. Nach einigen Stunden hatte die Reaktionslösung Zimmertemperatur angenommen. Sie wurde wieder auf -10 "C gekühlt und mit 1,4 ml (10 mMol) Et3N gepuffert. Nach etwa 5 Stunden wurden nochmals 1,4 ml Et3N zugesetzt.
Nach weiteren 24 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 40 "C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde dreimal mit je 100 ml dest. H20 digeriert und wiederum im Vakuum bei 40 "C über NaOH-Plättchen getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert, wobei 7,84 g Substanz, die in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatogra phisch einheitlich war, gewonnen wurden. Aus der Mutterlauge wurden durch Gelfiltration über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von Sephadex LH-20 noch 3,14 g Substanz gewonnen.
Total wurden somit 10,98 g (88,5% der Theorie) einheitlicher
Substanz mit einem Smp. von 203-205 C erhalten. Elementara nalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C29H32N808 erga ben die folgenden Werte (die Werte für die Bruttoformel sind in Klammern gesetzt): C = 55,88% (C = 56,12%); H = 5,050/0 (H = 5,20%); N = 18,31% (N = 18,060/o).
Ic) N -Cbo-Pro-Phe-Arg(NO2)-p NA
31,0 g (50 mMol) N -Cbo-Phe-Arg(NO2)-p NA (siehe Bei spiel 1, Absatz Ib) wurden mit 250 ml 2-n HBr in Eisessig (0,5
Mol) behandelt und wie im Beispiel lb) aufgearbeitet. Das über
NaOH-Plättchen im Vakuum getrocknete Hydrobromid des
Dipeptidderivates wurde in 150 ml DMF gelöst und nach Küh lung mit 7,6 g Et3N in 15 ml DMF (75 mMol) versetzt. Gebilde tes Et3N.HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Zum Filtrat wurden 18,5 g (50 mMol) Cbo-Pro
OpNP gegeben. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog wie im Beispiel 1, Absatz Ib.
Durch Gelfiltrierung an einer mit
MeOH äquilibrierten Sephadex LH-20 -Säule wurden nach
Eluierung mit MeOH 30,9 g (86,2% der Theorie) von in den
Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlicher Substanz mit einem Smp. von 184-186 C gewonnen. Die Elementaranalyse und die Berechnung aus der Bruttoformel C34H3sNsOs ergaben die folgenden Werte: C = 56,750/o (56,900/o); H = 5,500/o (5,48%); N = 17,700/c (17,560/o) (die Werte für die
Bruttoformeln sind in Klammern gesetzt).
Id) N -Bz-Pro-Phe-Arg(NO2}p NA
14,4 g (20 mMol) Na-Cbo-Pro-Phe-Arg(NO2}p NA (siehe Beispiel 1. Absatz Ic) wurden mit 120 ml 2-n HBr in Eisessig (0,24 Mol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde wie im Beispiel 1, Absatz Ib) aufgearbeitet.
Nach Lösen des getrockneten Tripeptidhydrobromidderivates in 60 ml DMF wurden der Lösung nach Abkühlung 4,16 ml Et3N (30 mMol) zugesetzt. Das gebildete Et3N-HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF gewaschen. Das erhaltene Filtrat wurde mit 6,8 g (30 mMol) Benzoesäureanhydrid versetzt. Anschliessend wurde gepuffert und wie im Beispiel 1, Absatz Ib) aufgearbeitet. Das erhaltene Rohprodukt wurde über einer mit MeOH äquilibrierten Sephadex LH-20 -Säule gereinigt. Man erhielt auf diese Weise 11,3 g (82,00/o der Theorie) von in den Lösungsmittelsystemen A und B chromatographisch einheitlicher, amorpher Substanz. Die Elementaranalyse und die Berechnung aus der Bruttoformel C33H37N908 ergaben die folgenden Werte: C = 57,51% (57,63%); H = 5,38% (5,42%); N= 18,47%(18,33%).
Ie) Na-Bz-Pro-Phe-Arg-p NA HCI
688 mg (1 mMol) N -Cbo-Pro-Phe-Arg(NO2}p NA (siehe Beispiel 1, Absatz Id) wurden im Reaktionsgefäss eines Sakakibara-Apparates eingewogen. 10 ml getrocknetes Fluorwasserstoffgas wurden im Reaktionsgefäss kondensiert. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 0 C wurde unter Rühren die Nitroschutzgruppe abgespalten. Das kondensierte Fluorwasserstoffgas wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in DMF gelöst. Um das Peptid-Derivat in das HCI-Salz überzuführen, wurden 0,5 ml konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne eingeengt. Nach zweimaligem Wiederholen dieses Vorgangs wurde der Rückstand in 50 ml 30%iger Essigsäure gelöst.
Zur Reinigung wurde die Essigsäurelösung auf eine mit 300/ciger Essigsäure äquilibrierte Sephadex G-15 -Säule aufgetragen und mit 30%iger Essigsäure eluiert. Nach dem Gefriertrocknen eines Teiles des Eluates erhielt man 572 mg (84,2% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im Lösungsmittelsystem C dünnschichtchromatographisch einheitlich war. Ele mentaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G3H39N806CI ergaben die folgenden Werte: C = 58,12% (58,36%); H = 5,70% (5,79%); N = 16,65% (16,50%) und Cl = 5,15% (5,22%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Amino säuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,98 - Phe: 1,0 - Pro: 0,97
Beispiel 2
II. N -Ac-Pro-Phe-Arg-pNA HCI
IIa) N"-Ac-Pro-Phe-Arg(NO2 > pNA
1,44 g (2 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblokkiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 420 l (3 mMol) Et3N ver setzt Nach Abkühlung wurde das Reaktionsgemisch mit 400 l (4 4 mMol) Ac2O versetzt und gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 1,05 g amorphe Substanz (83,9% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H35N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 53,68% (53,75O/O); H = 5,60% (5,64%); N = 20,20% (20,15%).
II. Na-Ac-Pro-Phe-Arg-pNA HCI
626 mg (1 mMol) der Verbindung IIa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung II umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30 /0 AcOH. Ausbeute: 521 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (84,4% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H37N8O6Cl ergaben die folgenden Werte: C = 54,25% (54,500/o); H = 6,01% (6,04%); N =
18,25% (18,16%); Cl = 5,71% (5,750/o).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,99 - Phe: 1,00 - Pro: 0,97.
Beispiel 3 III. Na-Capryloyl-Pro-Phe-Arg-pNA HCI Illa) Na-Capryloyl-Pro-Phe-Arg(NO2}pNA 718mg(1 mMol) der gemäss Beispiel 1,Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 ul (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurde das Reaktionsgemisch mit 400 mg ( 1,5 mMol) Caprylsäure-p-nitrophenylester versetzt und das Reaktionsprodukt gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 490 mg amorphe Substanz (68,8 /o der Theorie), einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H49N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 57,51 % (57,37%); H = 6,88% (6,94%); N = 17,80% (17,71%).
III. Na-Capryloyl-Pro-Phe-Arg-pNA HCI
356 mg (0,5 mMol) der Verbindung III wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung III umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 226 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (64,3% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H51N8O6Cl ergaben die folgenden Werte: C= 57,920/0 (58,07%); H = 7,18% (7,31%); N = 16,08% (15,93%); Cl = 4,98% (5,04%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,99 - Phe: 1,00 - Pro: 0,95 Beispiel 4 IV. Nα-Cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl IVa) Nα-Cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, erhaltenen Verbindung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblokkiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 l (1,5 mMol) Et3N versetzt Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 375 mg (1,5 mMol) Cyclohexancarbonsäure-p-nitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 593 mg amorphe Substanz (85,5% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H43N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 57,01% (57,13%); H = 6,18% (6,25%); N = 18,300/0(18,170/0).
V. Nα-Cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
347 mg (0,5 mMol) der Verbindung Va wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie zu der Verbindung V umgesetzt. Reinigung: Gelfiltration an Sephadex G-15 in 30 /O AcOH. Ausbeute: 295 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (86,10/oder Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H4sNsO6CI ergaben die folgenden Werte: C = 57,70% (57,84%); H = 6,66 /o (6,62%); N = 16,40% (16,35%); Cl = 5,110/0 (5,17%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,97 - Phe: 1,00 - Pro: 0,95.
Beispiel 5 V. Nα-4-Methyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl Va) Nα-4-Methyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 l (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 386 mg (1,5 mMol) p-Toluolsulfonsäure-p-nitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 591 mg amorphe Substanz (84,2% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H39N9O8 ergaben die folgenden Werte: C = 58,070/0(58,190/0); H = 5,530/0(5,600/0); N = 18,06% (17,97%).
V. Nα-4-Methyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
351 mg (0,5 mMol der Verbindung Va wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le zu der Verbindung V umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 300/0 AcOH. Ausbeute: 248 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (71,5% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H4lNsO6Cl ergaben die folgenden Werte: C = 59,01% (58,910/0); H = 5,86% (5,96%); N = 16,31 /o (16,17%); Cl = 5,07% (5,110/0).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,96 - Phe: 1,00- Pro: 0,96.
Beispiel 6 Vla) Nα-3-Phenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl Vla Nα-3-Phenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, erhaltenen Verbindung wurden gemäss Beispiel versetzt. Nach Abkühlung werden dem Reaktionsgemisch 407 mg 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210111 (1,5 mMol) Et3N (1,5 mMol) Dihydrozimtsäure-p-nitrophenylester zugesetzt Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 547 mg amorphe Substanz (76,4% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C35H41N0O8 ergaben die folgenden Werte: C = 58,58% (58,730/ > ); H = 5,69% (5,77%); N = 18,82% (17,61%).
VI. Nα-3-Phenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
358 mg (0,5 mMol) der Verbindung VIa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung VI umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 300/ > AcOH. Ausbeute: 303 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (85,7% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C35H43N8O6Cl ergaben die folgenden Werte: C = 59,24% (59,440/ > ); H = 6,11 % (6,13%); N = 15,98% (15,85%); Cl = 4,93% (5,01%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,98 - Phe: 1,00 - Pro: 1,01.
Beispiel 7 VIIa) Nα-(#-Aminocaproyl)-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HCI VIIa Na-(NW-Cbo-Aminocaproyl-Pro-Phe-Arg(N02)
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 u1 (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 490 mg (1,25 mMol) NCbo-o-Aminocapronsäufe-p- nitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 698 mg amorphe Substanz (84,0% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformei 40H50N10O10 ergaben die folgenden Werte: C = 57,68% (57,82%): H = 6,01 % (6,07%); N = 17,02% (16,86%).
VII. Na-(o-Aminocaproyl)-Pro-Phe-Arg-pNA-2 HCI
415 mg (0,5 mMol) der Verbindung Vlla wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung VII umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 247 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (68,2% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H47N906Ch ergaben die folgenden Werte: C = 52,85% (53,04 /O); H = 6,50% (6,54%); N = 17,53% (17,40%); Cl = 9,69% (9,79%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,98 - Phe: 1,00- Pro: 0,95.
Beispiel 8 VIIIa) Nα-4-Aminomethyl-cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe-Arg- pNA 2 HCl Viola Nα-4-Cbo-Aminomethyl-cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe- Arg(NO2 > pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 l (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 455 mg (1,1 mMol) 4-Cbo-Aminomethyl-cyclohexancarbonsäure-p-nitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 762 mg amorphe Substanz (88,9% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C42H52N10O10 ergaben die folgenden Werte: C = 58,62% (58,87%); H = 6,05% (6,12%); N = 16,54% (16,35%).
VIII. Na-4-Aminomethyl-cyclohexylcarbonyl-Pro-Phe-Arg pNA-2 HCI
428 mg (0,5 mMol) der Verbindung VIII wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung VIII umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 198 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (52,7% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H49N9O6Cl ergaben die folgenden Werte: C = 54,22% (54,40%}; H = 6,530/ > (6,58%); N = 16,74% (16,58%); Cl = 9,35% (9,45%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,99 - Phe: 1,00 - Pro: 1,01.
Beispiel 9 IX. Na-Tos-Pro-Phe-ArgpNA HCI IXa) Na-Tos-Pro-Phe-Arg(NO2SpNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 l (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 380 mg (2 mMol) Tosylchlorid zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt.
Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 225 mg amorphe Substanz (30,5% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G3H39NgOgS ergaben die folgenden Werte: C =53,590/ > (53,72%); H = 5,31% (5,33%); N = 17,29% (17,09%?; S = 4,15% (4,35%).
IX. Na-Tos-Pro-Phe-Arg-pNA HCI
185 mg (0,25 mMol) der Verbindung IXa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung IX umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 127 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (69,6% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C23H41N0OClS ergaben die folgenden Werte: C = 54,18% (54,35%); H = 5,63% (5,67%); N = 15,52% (15,37%); Cl = 4,80% (4,86%); S = 4,44% (4,40).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,95 - Phe: 1,00 - Pro: 0,97.
Beispiel 10 X. Nα-4-Aminophenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HCI Xa) Nα-4-Cbo-Aminophenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 l (1,5 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 508 mg (1,25 mMol) 4-Cbo-Aminophenyl-essigsäure-pnitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 595 mg amorphe Substanz (69,9% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C42H43N10O10 ergaben die folgenden Werte: C = 58,96% (59,29%); H = 5,38% (5,45%); N = 16,55% (16,460/ > ).
X. Nα-4-Aminophenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HCI
425 mg (0,5 mMol) der Verbindung Xa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung X umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 315 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (84,6% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H43N9O6Cl2 ergaben die folgenden Werte: C = 54,72% (54,84%); H = 5,80 /o (5,82%); N = 17,08% (16,93%); Cl = 9,43% (9,52%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,99- Phe: 1,00 - Pro: 0,96.
Beispiel 11 XI. Nα-4-Aminobenzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2HCl XIa) Nα-4-Cbo-Aminobenzoyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ic, hergestellten Verbindung wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert, in 10 ml DMF gelöst und mit 210 u1 mMol) Et3N versetzt. Nach Abkühlung wurden dem Reaktionsgemisch 490 mg (1,25 mMol) 4-Cbo-Aminobenzoesäure-p-nitrophenylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in Methanol. Ausbeute: 693 mg amorphe Substanz (82,8% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C41H44N10O10 ergaben die folgenden Werte: C= 58,92% (58,84%); H = 5,16% (5,30%); N = 16,93% (16,74%).
XI. Na-4-Aminobenzoyl-Pro-Ph e-Arg-pNA2 HCI
418 mg (0,5 mMol) der Verbindung Xla wurden gemäss Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung Xl umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 282 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (77,2% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H4lNOO6Cl2 ergaben die folgenden Werte: C = 54,09% (54,25%); H = 5,600/ > (5,66%); N = 17,480/0(17,250/0); Cl = 9,65% (9,71%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,95 - Phe: 1,00 - Pro: 0,97.
Beispiel 12 XII. Na-Cbo-Pro-Phe-Arg-pNA HCI XIIa) Cbo-Arg-pNA HCI
In einem Dreihalsrundkolben von 250 ml Inhalt wurden 16,0 g (47,0 mMol) über P2O5 im Vakuum getrocknetes Cbo-Arg OH.HCl in 90 ml absolutem HMPTA unter Feuchtigkeitsausschluss bei 20 C gelöst. Bei Zimmertemperatur wurden der erhaltenen Lösung zuerst eine Lösung von 4,74 g (47,0 mMol) Et3 N in 10 ml HMPTA und danach 16,4 g (100 mMol) p-Nitrophenylisocyanat (1 000/ > iger Überschuss) portionenweise zugesetzt Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei 20 C wurde das HMPTA im Vakuum grösstenteils abdestilliert. Der Rückstand wurde mehrmals mit 30%iger Essigsäure extrahiert. Der Rückstand wurde verworfen.
Die vereinigten Essigsäureextrakte wurden weiter durch Gelfiltrierung auf einer Sephadex G-15 Säule gereinigt, wie dies im Beispiel 1, Absatz Ie, beschrieben ist. Nach dem Gefriertrocknen eines Teiles des Eluates erhielt man 12,6 g eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war und durch Trypsin unter Freisetzung von pNA gespalten wurde. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C20H2sN6OsCI ergaben die folgenden Werte: C = 51,29% (51,67%); H = 5,48% (5,42%); N = 17,92% (18,08%); Cl = 7,50% (7,63%).
XIIb) N -Cob-Phe-ArgpNA-HCI
Unter Feuchtigkeitsausschluss wurden 7,0 g (15 mMol) der Verbindung XIIa gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert und aufgearbeitet. Das so erhaltene Produkt wurde in 75 ml DMF gelöst, nach Abkühlung mit einer Lösung von 1,52 g Et3N in 10 ml DMF versetzt, worauf das gebildete Et3N HBr abfiltriert wurde. Zum Filtrat wurden 8,4 g (20 nMol) Cbo-Phe-OpNP zugesetzt. Die Reaktion wurde im übrigen gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde im Vakuum bei 40 "C zur Trockne eingeengt, worauf der Rückstand in 250 ml MeOH gelöst und die Lösung mit 1,20 ml konz.
Salzsäure versetzt wurde. Durch Gelfiltrierung auf einer Sephadex LH-20 -Säule in MeOH wurde das Rohprodukt gereinigt. Aus einer Fraktion erhielt man durch Einengen im Vakuum 7,55 g (82,2% der Theorie) des gewünschten Produktes, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel GgH34N706CI ergaben die folgenden Werte: C = 57,09% (56,91%); H = 5,500/ > (5,60%); N = 16,25% (16,02%); Cl = 5,71% (5,79%).
XII. Na-Cbo-Pro-Phe-Arg-pNA HCI
673 mg (1,1 mMol der Verbindung Xllb wurden unter Feuchtigkeitsausschluss gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblokkiert und aufgearbeitet. Das getrocknete Hydrobromiddenvat wurde in 10 ml DMF gelöst und nach Kühlen (-10 "C) mit 155 111 (1,1 mMol) Et3N versetzt. Danach wurden 555 mg (1,5 mMol) Cbo-Pro-OpNP zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit wurde die Reaktionslösung im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Der Rückstand wurde in 30 ml MeOH gelöst und durch eine Säule von mit MeOH äquilibriertem Sephadex LH-20 filtriert. Zur weiteren Reinigung wurde das Eluat im Vakuum eingeengt und der Rückstand in 30% AcOH gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von Sephadex G-15 filtriert. Nach Gefriertrocknung eines Teiles des Eluats mit Zusatz von 90 ,u1 konz. HCI erhielt man 479 mg (61,4% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementar analyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H4lNsO7Cl ergaben die folgenden Werte: C = 57,11% (57,58%); H = 5,710/ > (5,83%); N = 16,15% (15,80%); Cl = 4,92% (5,00%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,95 - Phe: 1,00 - Pro:0,98.
Beispiel 13 XIII. Na-Bz-Pro-CHA-Arg-pNA HCI CIIIa) N -Cbo-CHA-Arg(NO2)-pNA
9,47 g (20 mMol) der gemäss Beispiel 1, Absatz Ia, hergestellten Verbindung wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Der getrocknete Rückstand wurde in 100 ml DMF gelöst Nach Abkühlung wurden der Lösung 3,04 g (30 mMol) Et3N zugesetzt. Das gebildete HBr-Et3N wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde bei -10 "C mit 9,37 g (22 mMol) Cbo-CHA-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH erhielt man 11,72 g (93,5% der Theorie) der kristallinen Verbindung XIVa, die bei 166-168 "C schmolz und im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C29H38N808 ergaben die folgenden Werte: C = 55,20% (55,58%); H = 5,98% (6,11%); N = 18,01% (17,88%).
XIIIb) Na-Cbo-Pro-CHA-Arg(NO2)-pNA
6,27 g (10 mMol) der Verbindung XIIIa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das trockene Hydrobromidderivat wurde in 75 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung wurden der Lösung 2,08 ml (15 mMol) Et3N zugesetzt. Das gebildete HBr-Et3N wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde bei -10 "C mit 4,07 g (11 mMol) Cbo-Pro-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde weiterbehandelt gemäss Beispiel 1, Absatz Ib.
Nach Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH erhielt man 6,18 g (85,4% der Theorie) der amorphen Verbindung XIII, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H45N909 ergaben die folgenden Werte: C = 56,22% (56,42%); H = 6,14% (6,27%); N= 17,35%(17,42%).
XIIIc) N -Bz-Pro-CHA-Arg(NO2)pNA
1,45 g (2 mMol) der Verbindung Xlllb wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene trockene Hydrobromidderivat wurde in 15 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung (-10 "C) wurde die Lösung mit 0,30 g(3 mMol) Et3N und dann mit 680 mg (3 mMol) Benzoesäureanhydrid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Das erhaltene Rohprodukt wurde in MeOH gelöst und durch Filtrieren durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH gereinigt. Man erhielt 1,03 g (74,2% der Theorie) der amorphen Verbindung XIIIc, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G3H43Ns08 ergaben die folgenden Werte: C = 57,29% (57,13%); H = 6,30% (6,25%); N = 18,09% (18,17%).
XIII. Na-Bz-Pro-CHA-Arg-pNA HCI
694 mg (1 mMol) der Verbindung Xlllc wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung XIII umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 571 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (83,3% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C23H45N8O0Cl ergaben die folgenden Werte: C = 57,15% (57,84%); H = 6,49% (6,62%); N = 16,70% (16,35%); Cl = 5,09% (5,17%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 1,04 - CHA: 1,02 - Pro: 1,00.
Beispiel 14 XIV. Na-Bz-Pro-Tyr-ArgpNA HCI XIVa) N -Cbo-Tyr(OBzl}Arg(NO2)-pNA
2,37 g (5 mMol) der Verbindung Ia (siehe Beispiel 1) wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene getrocknete Hydrobromidderivat wurde in 30 ml DMF gelöst.
Nach Abkühlung wurden der Lösung zuerst 1,05 ml (7,5 mMol) Et3N und dann 2,82 g (5,5 mMol) Cbo-Tyr(OBzl > OpNP zugesetzt Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 1,78 g (49,0% der Theorie) der amorphen Verbindung XIV) erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C36H3sNsOs ergaben die folgenden Werte: C = 59,08% (59,50%); H = 5,11% (5,27%); N = 15,80% (15,42%).
XIVb) Na-Cbo-Pro-Tyr(OBzl}Arg(NO2}pNA
1,25 g (2 mMol) der Verbindung XlVa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Hydrobromidderivat wurde in 15 ml DMF gelöst. Nach Abkühlen wurde die Lösung mit 0,30 g (3 mMol) Et3N und anschliessend mit 815 mg (2,2 mMol) Cbo-Pro-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 928 mg (56,3% der Theorie) der amorphen Verbindung XIVb erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel c41H45N0Oio ergaben die folgenden Werte: C = 56,72% (56,42%); H = 6,09% (6,27%); N = 17,60% (17,42%).
XIVc) Na-Bz-Pro-Tyr(OBzl}Arg(NO2}pNA
824 mg (1 mMol) der Verbindung XIVb wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in 10 ml DMF gelöst und mit 210u1 (1,5 mMol) Et3N versetzt.
Nach Abkühlung wurden der Lösung 340 mg (1,5 mMol) Benzoesäureanhydrid zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH. Ausbeute: 422 mg amorphe Substanz (53,2% der Theorie); im DSC in den LMS A und B einheitlich.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C,0H43N0O0 ergaben die folgenden Werte: C = 60,92% (60,52%); H = 5,38% (5,46%); N = 16,19 /o (15,88%).
XIV. Na-Bz-Pro-Tyr-Arg-pNA HCI
412 mg (0,5 mMol) der Verbindung XIVc wurden gemäss
Beispiel 1, Absatz le, zu der Verbindung XIV umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 208 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (59,8% der Theorie); im DSC im LMS C einheitlich.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C33H30N8O7Cl ergaben die folgenden Werte: C = 57,43% (57,01%); H = 5,78% (5,65%); N = 16,35% (16,12%); Cl = 4,98% (5,10%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Amino säuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95 - Tyr: 1,00 - Pro: 0,98.
Beispiel 15
XV. Na-Bz-Pro-Ph-Gly-Arg-pNA-HCI
XVa) Na-Cbo-PhGly-Arg(NO2)-pNA
2,37 g (5 mMol) der Verbindung la (siehe Beispiel 1) wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Hydro bromidderivat wurde in 30 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10 C wurden der Lösung zuerst 1,05 ml (7,5 mMol) Et3N und dann 2,32 g (5,71 mMol) Cbo-PhGly-OpNP zugesetzt. Das
Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiter behandelt. Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sepha dex LH-20 in MeOH wurden 2,62 g (86,4% der Theorie) der amorphen Verbindung XVIa erhalten, die im DSC in den
LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C28H30NsOs ergaben die folgenden Werte: C = 55,10% (55,44%);
H = 5,08% (4,99%); N = 18,81% (18,47%).
XVb) Na-Cbo-Pro-Ph Gly-Arg(NO2)-pNA
1,22 g (2 mMol) der Verbindung XVa wurden gemäss Bei spiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Hydrobromidderi vat wurde in 15 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung wurde die
Lösung mit 300 mg (3 mMol) Et3N und dann mit 815 mg (2,2 mMol) Cbo-Pro-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrie rung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wur den 1,17 g (83,1% der Theorie) der amorphen Verbindung XVb erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G3H37NsOs ergaben die folgenden Werte: C = 56,08% (56,32%);
H = 5,21% (530%); N = 18,02% (17,91%).
XVc) Na-Bz-Pro-Ph Gly-Arg(NO2}pNA
704 mg (1 mMol) der Verbindung XVb wurden gemäss Bei spiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in
10 ml DMF gelöst und mit 210u1 (1,5 mMol) Et3N versetzt.
Nach Abkühlung wurden 340 mg (1,5 mMol) BzzO zugesetzt.
Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH. Ausbeute: 518 mg amorphe Substanz (76,9% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C22H35N0O8 ergaben die folgenden Werte: C = 56,85% (57,05%); H = 5,19% (5,24%); N = 18,96% (18,71%).
XV. Na-Bz-Pro-Ph Gly-Arg-pNA HCI
337 mg (0,5 mMol) der Verbindung XVc wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung XV umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 207 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (62,2% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H37NsO6CI ergaben die folgenden Werte: C = 57,520/0 (57,78%); H = 5,73% (5,6 1%); N = 16,98% (16,85%); Cl = 5,25% (5,33%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,97- Ph-Gly: 1,05- Pro: 1,00.
Beispiel 16 XVI. Na-Bz-Pro-Phe-Arg-2-NA HCI XVIa) Na-Cbo-Arg(NO2)-2-NA
3,53 g (10 mMol) gut getrocknetes Cbo-Arg(NO2)-OH wurden in 150 ml THF:DMF (3:1) unter Feuchtigkeitsausschluss gelöst. Nach Abkühlung auf -10 C wurden der Lösung 1,39 ml (10 mMol) Et3N zugesetzt und dann eine Lösung von 1,35 g (10 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester in 20 ml THF innerhalb von 15 Minuten zugetropft, wobei die Temperatur zwischen -10" und -5 C gehalten wurde. Der erhaltenen Lösung wurde dann eine Lösung von 1,72 g(12 mMol) ss-Naphthylamin in 15 ml THF zugetropft, wobei die oben genannte Temperatur eingehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ia-2, weiterbehandelt.
Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 3,75 g der kristallinen Verbindung XVIa (78,4% der Theorie) mit Smp. 173-174,5 C erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C24H26N6O5 ergaben die folgenden Werte: C = 60,82% (60,24%); H = 5,63% (5,48%); N = 17,48%(16,72%).
XVIb) Na-Cbo-Phe-Arg(NO2 > 2-NA
2,87 g (6 mMol) der Verbindung XVIa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Hydrobromidderivat wurde in 50 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10 C wurde die Lösung mit 1,25 ml (9 mMol) Et3N versetzt. Das gebildete Et3N-HBr wurde abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen. Die so erhaltene DMF-Lösung wurde mit 2,78 g (6,6 mMol) CbO-Phe-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt.
Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 3,23 g (86% der Theorie) der amorphen Verbindung XVlb XVIc) erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C32H35N7O6 ergaben die folgenden Werte: C = 63,10% (63,35%); H = 5,54% (5,64%); N = 15,80% (15,67%).
XVIc. Na-Cbo-Pro-Phe-Arg(N02 > 2-NA
1,88 g (3 mMol) der Verbindung XVlb wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit 0,63 ml (4,6 mMol) Et3N und dann mit 1,22 g (3,3 mMol) Cbo-Pro-OpNP versetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 1,72 g (79,3% der Theorie) der amorphen Verbindung XVIc erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G8H42N807 ergaben die folgenden Werte: C = 62,93% (63,14%); H = 5,82% (5,86%); N = 15,75% (15,50%).
XVld. Na-Bz-Pro-Phe-Arg(NO2)-2-NA
1,08 g (1,5 mMol) der Verbindung XVIc wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in 12 ml DMF gelöst und mit 315 u1 (2,25 mMol) Et3N versetzt.
Nach Abkühlung wurden der Lösung 510 mg (2,25 mMol) Bz20 zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH. Ausbeute: 765 mg amorphe Substanz (73,6% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C37H40Ns06 ergaben die folgenden Werte: C = 63,88 /o (64,15%); H = 5,75% (5,82%); N = 16,49% (16,18%).
XVI. NBz-Pro-Phe-Arg-2-NA-HC1
693 mg (1 mMol) der Verbindung XVld wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung XVI umgesetzt Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 455 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (66,5% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C37Hd2N704C1 ergaben die folgenden Werte: C = 65,18% (64,95%); H = 6,13% (6,19%); N = 14,55% (14,330/ > ); Cl = 5,09% (5,18%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,98 - Phe: 1,00 - Pro: 0,94.
Beispiel 17 XVII. Na-Bz-Pro-Phe-Arg-4-MeO-2-NA HCI XVIIa) Na-Cbo-Arg(NO2)-4-MeO-2-NA
Zu 3,53 g (10 mMol) Cbo-Arg(NO2)-OH wurde gemäss Beispiel 16, Absatz XVIa, eine Lösung von 2,08 g (12 mMol) 4-Methoxy-2-naphthylamin in 15 ml THF zugetropft (statt 2-Naphthylamin). Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 3,91 g der amorphen Verbindung XVIIa (76,9% der Theorie) erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C25H2sNOO0 ergaben die folgenden Werte: C = 59,20% (59,05%); H = 5,41% (5,55%); N = 16,72% (16,53%).
XVIIb) Na-Cbo-Phe-Arg(NO2)-4-MeO-2-NA
2,55 g (5 mMol) der Verbindung XVIIa wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Hydrobromidderivat wurde in 50 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf - 10 "C wurde die Lösung mit 1,05 ml (7,5 mMol) EtN und dann mit 2,31 g (5,5 mMol) Cbo-Phe-OpNP versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt.
Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 2,55 g (77,8% der Theorie) der amorphen Verbindung XVIIb erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C34H37N707 ergaben die folgenden Werte: C = 61,95 /o (62,28%); H = 5,62% (5,69%); N = 15,11% (14,95%).
XVIIc Na-Cbo-Pro-Phe-Arg(NO2)4-MeO-2-NA
1,97 g (3 mMol) der Verbindung XVIIb) wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit 0,63 ml (4,6 mMol) Et3N und dann mit 1,22 g (3,3 mMol) Cbo-Pro-OpNP versetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, weiterbehandelt. Nach Gelfiltrierung durch eine Säule von Sephadex LH-20 in MeOH wurden 1,54 g (68,3% der Theorie) der amorphen Verbindung XVIIc erhalten, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C39H44N808 ergaben die folgenden Werte: C = 62,05% (62,22%); H = 5,91% (5,89%); N = 15,08% (14,89%).
XVIId. Na-Bz-Pro-Phe-Arg(NO2)4-MeO-2-NA
1,13 g (1,5 mMol) der Verbindung XVIIc wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ib, deblockiert. Das erhaltene Produkt wurde in 12 ml DMF gelöst und mit 315 u1 (2,25 mMol) Et3N versetzt.
Nach Abkühlung wurden der Lösung 510 mg (2,25 mMol) BzzO zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gemäss Beispiel 1, Absatz Id, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex LH-20 in MeOH. Ausbeute: 780 mg amorphe Substanz (71,9% der Theorie); einheitlich im DSC in den LMS A und B.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C3sH42N807 ergaben die folgenden Werte: C = 63,48% (63,14%); H = 5,75% (5,87%); N = 15,78% (15,50%).
XVII. Na-Bz-Pro-Phe-Arg4-MeO-2-NAHCI
723 mg (1 mMol) der XVIId XVlld. wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ie, zu der Verbindung XVII umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung an Sephadex G-15 in 30% AcOH. Ausbeute: 488 mg gefriergetrocknetes amorphes Pulver (68,3% der Theorie); einheitlich im DSC im LMS C.
Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G8H44N7OsCI ergaben die folgenden Werte: C = 63,58% (63,90%); H = 6,15% (6,21%); N = 14,03% (13,73%); Cl = 4,88% (4,96%).
Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Amino sauren im richtigen Verhältnis: Arg: 0,93- Phe: 1,00- Pro: 0,94.
Die Substrate, z. B. das gemäss Beispiel 1 erhaltene Substrat, nämlich Na-Bz-Pro-Phe-Arg-p NA HCI, wurden zur Bestimmung verschiedener Enzyme in Blutplasma verwendet.
Die Bestimmung erfolgte nach dem Prinzip, dass das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt (NHTR2) ein UV-Spektrum aufweist, das von demjenigen des Substrates verschieden und nach höheren Wellenlängen verschoben ist. So weist das Substrat gemäss Beispiel 1, d. h. Na-Bz Pro-Phe-Arg-p-NA HCI, ein Absorptionsmaximum bei 302 nm (Nanometer) und einem molaren Extinktionskoeffizienten von 12950 auf. Die Absorption des Substrates ist bei 405 nm praktisch Null. p-Nitroanilin (pNA), das bei der enzymatischen Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt (NH2R2), weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf. Bei 405 nm sinkt der Extinktionskoeffizient nur wenig, d. h. auf 9650.
Durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm lässt sich der Grad der enzymatischen Hydrolyse des Substrates, welcher der Menge an abgespaltenem p-Nitroanilin proportional ist, leicht bestimmen. Das im Uberschuss vorhandene Substrat stört somit die Messung bei 405 nm nicht. Die Verhältnisse sind für die anderen Substrate, die eine p-Nitroanilinogruppe als chromophore Gruppe enthalten, praktisch identisch. Die spektrophotometrische Messung wurde deshalb in allen diesen Fällen bei 405 nm durchgeführt.
Die enzymatische Hydrolysereaktion kann schematisch folgendermassen dargestellt werden:
EMI10.1
E = Enzym S = Substrat ES = Enzym-Substrat-Komplex P1 und P2 = Produkte kl, k2, k3 und k4 = Geschwindigkeitskonstanten Dissoziationskonstante für ES = k2/kl = Km (Michaelis-Konstante) Wenn (S) > (E) und k4 < k3, gilt:
EMI10.2
Die Geschwindigkeitskonstante, bei welcher P1 gebildet wird, ist: v = kr(ES)
EMI10.3
Wenn E vollständig an S gebunden ist, so gilt: (ES) = (E) und v = vmax = k3 < E) (3) Lineweaver-Burk-Gleichung:
EMI10.4
Aus der Gleichung (2) folgt, dass die Konstanten Km und k3 die Wirksamkeit des Substrats für ein gegebenes Enzym bestimmen.
Zur Bestimmung dieser Konstanten wendet man die folgende Methode an:
Man mischt das Enzym und das Substrat in einer Pufferlö sung und verfolgt die Hydrolysereaktion während 2 bis 30
Minuten. Die Konzentration des Substrates (S) wird variiert, während die Enzymkonzentration konstant gehalten wird.
Wenn die Extinktion (OD = optische Dichte) in einem Koordinatensystem als Funktion der Zeit aufgetragen wird, erhält man eine Kurve, deren Tangente im Nullpunkt dem idealen Verlauf der Hydrolyse entspricht. Mit Hilfe dieser Tangente kann man die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse ermitteln.
Wenn l/v als Funktion von 1/(S) aufgetragen wird, erhält man ein Lineweaver-Burk-Diagramm (siehe Kurzes Lehrbuch der Biochemie von P. Karlson, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, Seite 70), aus welchem sich vmax und Km graphisch ermitteln lassen.
Km und k3 = vmax/E wurden unter Verwendung von Na-Bz Pro-Phe-Arg-p-NA-HCI (Substrat gemäss Beispiel 1) für Plasmakallikrein, Trypsin, Plasmin und Thrombin bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I
Enzymaktivität gemessen an Na-Bz-Pro-Phe-Arg-pNAHC1 Enzym Km Mol/Liter vmax umoll Verhältnis
Substratein Minze5) heiten zu gebräuchlichen
Einheiten Plasmakalli- 2,82 10-4 950 10-2 1 E = 4,8 BAEE-E' krein Plasmin 1,4- 10 4 32- 10-3 I 1E=518CE4 Trypsin 1,7 2,22 - 10-3 1 E = 12 000 NF2 Thrombin 1,6 0,14-10-3 IE=117600NIH3 1.
Eine Plasmakallikrein-BAEE-Einheit ist diejenige Menge Enzym, die ein uMol Benzoyl-L-argininäthylester pro Minute unter Standardbedingungen hydrolysiert.
2. Eine Trypsin-NF-Einheit ist diejenige Menge Enzym, die eine Absorptionsänderung AOD = 0,003 pro Minute, gemessen an Benzoyl-L-argininäthylester, unter Standardbedingungen bewirkt (siehe The National Formulary XII , herausgegeben von The American Pharmaceutical Association , Washington, D. 1965, Seiten 417/418).
3. Die Thrombin-NIH-Einheit ist diejenige des US National Institute of Health .
4. Die Plasmin-CE-Einhcit ist die Casein-Einheit, die an Casein unter Standardbedingungen gemessen 5. Enzymeinheit 5) Enzymeinheit = diejenige Menge Enzym, die 1 uMol Substrat in einer Minute bei Substratsättigung hydrolysiert.
In der dritten Kolonne der Tabelle I sind die gegenüber dem Substrat gemäss Beispiel 1 ermittelten Enzymeinheiten verglichen.
In den beigefügten Zeichnungen haben die Figuren die folgende Bedeutung:
Fig. list eine graphische Darstellung, in welcher die Änderung der optischen Dichte A OD, welche durch die hydrolytische Wirkung von Plasmakallikrein auf das Substrat gemäss Beispiel 1 im Zeitlauf von 30 Minuten hervorgerufen wird, als Funktion der Plasmakallikreinmenge in einem Koordinatensystem aufgetragen ist.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, in welcher die Abnahme der optischen Dichte A OD als Funktion der Menge an Protease-Inhibitor in einem wässrigen gepufferten Medium bei konstanter Menge an Plasmakallikrein und an Substrat gemäss Beispiel 1 in einem Koordinatensystem aufgetragen ist.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, in welcher die Hemmkapazität bzw. die induzierte proteolytische Wirksamkeit von Rattenplasma nach Induzierung eines Schockzustandes als Funktion der Zeit bei konstanter Menge an Substrat gemäss Beispiel 1 in einem Kordinatensystem aufgetragen ist.
Die Dosis-Wirkungs-Kurve in Fig. 1 wurde für verschiedene Konzentrationen an Plasmakallikrein bei konstanter Konzentration an Substrat ermittelt. Die Messungen wurden bei 25 "C und pH 8,2 unter Verwendung eines Tris-Imidazol-Puffers mit einer lonenstärke von 0,15 ausgeführt.
Die Messungen, deren Resultate in Fig. 2 aufgezeichnet sind, wurden wie folgt durchgeführt: 0,25 ml Plasmakallikreinlö sung (0,0275 BAEE-Einheiten/ml) wurde zu 2,0 ml Tris-Imidazol-Puffer (pH 8,2, Ionenstärke = 0,15) gegeben. Dann wurde 0,25 ml Protease-Inhibitor-Lösung (Protease-Inhibitor aus Lunge) zugegeben und die Mischung genau 10 Minuten bei 25 "C inkubiert. Dann wurde 0,5 ml wässrige Substratlösung (0,679 mg des Substrates gemäss Beispiel 1 pro ml) zugegeben.
Die Mischung wurde 30 Minuten bei 25 C inkubiert. Die Reaktion wurde dann mit 1,0 ml 2-n Essigsäure unterbrochen, worauf die Absorption mittels eines Spektrophotometers bei 405 nm gemessen wurde.
Die Messungen, deren Resultate in Fig. 3 aufgezeichnet sind, wurden wie folgt durchgeführt: Zur Erzeugung eines Schockzustandes bei einer Ratte wurde deren rechtes Hinterbein durch Eintauchen in auf 80 "C erhitztes Wasser während 10 Sekunden verbrüht. Dann wurde der Ratte Blut entnommen.
0,25 ml Plasmakallikreinlösung (0,022 BAEE-Einheiten) wurde zu 2,0 ml Tris-Imidazol-Puffer (pH 8,2, Ionenstärke = 0,15) gegeben. Dann wurde 0,01 ml Rattenplasma zugegeben und die Mischung 5 Minuten bei 25 "C inkubiert. Anschliessend wurde 0,5 ml wässrige Substratlösung (0,679 mg Substrat gemäss Beispiel 1 pro ml) zugesetzt und die Mischung bei 25 "C während genau 30 Minuten inkubiert. Die Zunahme der Absorption wurde spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen. Die Messungen wurden ferner mit einer nur Plasmakallikrein enthaltenden Blindprobe durchgeführt.
Aus Tabelle list ersichtlich, dass das gemäss Beispiel 1 erhaltene Substrat gegenüber Plasmakallikrein eine viel höhere Spezifizität als gegenüber Plasmin, Trypsin und Thrombin aufweist. vmax ist für Plasmakallikrein wesentlich höher als für die anderen Enzyme, worin zum Ausdruck kommt, dass das Substrat durch Plasmakallikrein viel schneller hydrolysiert wird als durch die genannten anderen Enzyme. Dadurch ist es möglich, kleine Mengen Plasmakallkrein oder dessen Inhibitoren genau zu bestimmen, was in der Klinik, wo oft nur kleine Probemengen zur Verfügung stehen, von grosser Bedeutung ist.
Aus Tabelle list ferner ersichtlich, dass Thrombin die
Bestimmung von Plasmakallikrein oder dessen Inhibitoren nicht stört.
Das Substrat hat ferner den Vorteil, dass die enzymatische
Hydrolyse durch Plasmakallikrein dem Michaelis-Menten
Gesetz folgt und es dadurch möglich ist, die kinetischen Kon stanten Km und vmax zu bestimmen.
In Fig. 1 und 2 kommt zum Ausdruck, wie genau und empfindlich die Bestimmung von Plasmakallikrein oder dessen Inhibitoren sind. Dies stellt einen wesentlichen Vorteil dar, insofern, als es möglich wird, die Therapie von Schockzuständen beim Menschen mittels Protease-Inhibitoren laufend zu überwachen und deren Verabreichung genau zu dosieren.
Fig. 3 zeigt, wie mittels des neuen Substrats ein Schockzustand, bei welchem das Plasmakallikrein-System aktiviert wird, festgestellt werden kann. Die Aktivierung des Plasmakallikrein Systems, welche für solche Schockzustände charakteristisch ist, kann mittels des neuen Substrats genau ermittelt werden.
Das Spaltprodukt NH2-R2 kann vor der photometrischen Bestimmung zuerst diazotiert und mit einer Kupplungskomponente gekuppelt werden.
Tabelle II Plasma-Kallikrein- bzw. Human-Plasmin-Aktivität, gemessen mittels der neuen Substrate bei konstanter Substratkonzentration und Enzymkonzentration Substrat Menge des durch 1
BAEE-Einheit
Plasma-Kallikrein bzw.
1CE-Einheit Human-Plasmin in
1 Minute gebildete p-Nitroanilins (pNA) bzw.
ss-Naphthylamins (2-NA) bzw.
4-Methoxy-B-naphthylamins (4-Meo-2-NA) in Nanomol (nM)
Plasma-Kallikrein Human-Plasmin le 135,5 nM pNA 152,0 nM pNA II 42,3 nM pNA 49,1 nM pNA III 108,3nMpNA 100,0 nM pNA IV 154,7 nM pNA 158,0 nM pNA V 78,4 nM pNA 142,0 nM pNA Vl 256,0 nM pNA 144,0 nM pNA VII 59,7 nM pNA 256,0 nM pNA VIII 65,1 nM pNA 600,0 nM pNA IX 88,5 nM pNA 80,2 nM pNA X 72,1 nM pNA 230,0 nM pNA XI 49,2 nM pNA 196,0 nM pNA XII 109,9 nM pNA 176,1 nM pNA XIII 64,5 nM pNA 116,0 nM pNA X 71,0 nM pNA 73,8 nM pNA XV 9,1 nM pNA 16,2 nM pNA XVI 44,1 nM 2-NA 95,4 nM 2-NA XVII 39,8 nM 4-MeO-2-NA 79,7 nM 4-MeO-2-NA
Die neuen Substrate werden zweckmässigerweise nicht in der Amin-Form,
sondern in protonisierter Form, d. h. in Form eines Salzes mit einer Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, verwendet.