CH622285A5

CH622285A5 -

Info

Publication number: CH622285A5
Application number: CH887176A
Authority: CH
Inventors: Bo Thuresson Af Ekenstam; Leif Erik Aurell; Karl Goeran Claeson; Birgitta Gunilla Karlsson; Stig Ingemar Gustavsson; Gun Anita Olausson
Original assignee: Kabi Ab
Priority date: 1975-07-11
Filing date: 1976-07-09
Publication date: 1981-03-31
Also published as: CA1081212A; DK312776A; DK146937C; FR2317278B1; NL187693B; JPS5615238B2; AU1530476A; NL7607433A; FI56524B; AU497546B2; JPS5224581A; ES449738A1; IT1062604B; NO762406L; DE2629067A1; DE2629067C2; AT349648B; ZA763585B; CS199631B2; BE843969A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Enzymen des Typs der Serin-Proteasen, bei dem das Material, in welchem die Serin-Protease bestimmt werden soll, mit einem neuen chromogenen Substrat zusammengebracht wird, aus dem durch die Serin-Protease durch enzymatische Hydrolyse ein die chromophore Gruppierung tragendes Hydrolyseprodukt abgespaltet wird, das sich bezüglich seines Absorptions-spektrums von dem Substrat unterscheidet.

Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten neuen Substrate sind zur quantitativen Bestimmung von Enzymen des Typs der Serin-Proteasen geeignet, welche die Peptidkette des Proteines an der Carboxylseitenkette des Arginines oder Lysines spalten. Des weiteren können die neuen Substrate verwendet werden, um Reaktionen zu studieren, bei denen diese fraglichen Enzyme gebildet, ge- ' hemmt oder verbraucht werden, und die Substrate können ferner zur Bestimmung von Faktoren herangezogen werden, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an derartigen Reaktionen teilnehmen.

Synthetische Substrate die bei Verfahren zur Enzymbestimmung eingesetzt werden, haben grosse Vorteile im 6() Vergleich zu natürlichen Substraten, vorausgesetzt, dass die synthetischen Substrate bestimmte Anforderungen erfüllen. So müssen die Substrate eine grosse Empfindlichkeit für das fragliche Enzym und eine Spezifität gegenüber dem fraglichen Enzym aufweisen, und ferner eine gute Löslichkeit in Wasser oder der biologischen Testflüssigkeit besitzen. Des weiteren müssen einige der bei der Substratspaltung entstehenden Produkte leicht feststellbar sein.

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Substrate, die hervorragend gute Eigenschaften bei der Verwendung in Verfahren zur Bestimmung von Enzymen, wie z. B. Plasmin, Thrombin, Trypsin, Kallikrein und Uro-kinas besitzen, sind unter anderem in der schwedischen Patentschrift Nr. 380.258 beschrieben, und die dort verwendeten Substrate sind im Prinzip chromogene Tripeptid-Deri-vate. Zu den am besten geeigneten Substraten dieses Typs gehören diejenigen, die eine benzoylierte Stickstoffendgruppe aufweisen und eine chromophore Gruppierung besitzen, die an die ICohlenstoff-Endgruppe gekuppelt ist. Ein typisches Beispiel für derartige Substrate weist die folgende Formel III

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Benzoyl-Ai-A2-A3-p-Nitroanilid (III)

auf, wobei in dieser Formel Ai, A2 und A3 Aminosäuren bedeuten.

Durch die Auswahl einer spezifischen Aminosäure-Sequenz ist es möglich, unter diesen Substraten solche zu erhalten, die eine spezielle Empfindlichkeit gegenüber einem bestimmten Enzym oder bestimmten Enzymen aufweisen. Wenn man die fraglichen Substrate bei einem Verfahren zur Bestimmung von Enzymen einsetzt, dann erfolgt eine enzymatische Hydrolyse der Substrate, wobei sich als chromophores Produkt das p-Nitroanilin bildet, welches leicht spektrophotometrisch bestimmt werden kann. Bei der Verwendung dieser Substrate besteht jedoch eine Einschränkung aufgrund der relativ niedrigen Löslichkeit der Substrate, die im allgemeinen < 1 mg/ml ist. Diese geringe Löslichkeit macht es nötig, dass man sehr nahe an der Sättigungsgrenze für das Substrat arbeiten muss, um eine befriedigende Substratkonzentration zu erreichen. Bei Enzymbestimmungen in unterschiedlichen biologischen Systemen kann es dementsprechend vorkommen, dass entweder das Substrat selbst oder eine Kombination aus Protein und Substrat ausgefällt wird. Diese Ausfällungen führen zu falschen Werten bei der spektrophotometrischen Bestimmung, und dementsprechend auch zu falschen Werten bei der Enzymbestimmung.

Die benzoylierten Erizymsubstrate des oben erwähnten Typs III werden wesentlich besser löslich, wenn die an das endständige Stickstoffatom gebundene Benzoylgruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird. Die in diesem Fall freie protonisierte Aminogruppe der Aminosäure Ai erhöht die Löslichkeit, sie führt jedoch auch dazu, dass die Geschwindigkeit, mit der das Enzym das Substrat spaltet, vermindert wird. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Tabelle II verwiesen. Ausserdem kann in diesem Fall das Substrat in einer biologischen Testlösung in einer unerwünschten Weise ausgehend von dem endständigen Stickstoffatom durch Aminopeptidasen zersetzt werden.

Bei der Durchführung von Arbeiten auf diesem Gebiet wurde in völlig unerwarteter Weise gefunden, dass dann gute Ergebnisse erzielt werden, wenn in einem Substrat der Formel III, welches vom Standpunkt seiner Aktivität gegenüber bestimmten Enzymen befriedigend ist, die Benzoylgruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird, und ausserdem gleichzeitig die bisher für derartige Substrate verwendete L-Form der Aminosäure Ai durch die D-Form dieser Aminosäure Ai in den Substraten ersetzt wird.

In der Folge wird die L-Form der Aminosäure Ai als «L-Ai» abgekürzt und die D-Form der Aminosäure Ai als «D-Ai bezeichnet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Serin-Proteasen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Material, in dem die Serin-Proteasen bestimmt werden sollen, mit einem Sub-

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strat, das die folgende Formel II

H-D-Ai-A2-AS-NH-R (II)

aufweist, oder ein Salz der Verbindung der Formel II ist, zusammenbringt, wobei in dieser Formel II Ai und A2 eine Aminosäure aus der Gruppe von Aminosäuren ist, die Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro und Aze umfasst,

As ausserdem Phe sein kann,

Aa die Aminosäuren Arg, Lys oder Orn bedeutet 10

D anzeigt, dass die Aminosäure Ai in ihrer D-Form vorliegt und

R eine chromophore Gruppierung darstellt,

und durch die Serin-Proteasen aus dem Substrat durch enzymatische Hydrolyse eine Verbindung der Formel I 15

H2N-R (I)

abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel II unterscheidet, 20 und wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesenden Serin-Proteasen ist.

In den beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Substraten der Formel II ist die chromophore Grup- 25 pierung R vorzugsweise ein Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitro-naphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolyl-rest. Von diesen Resten ist wieder der Nitrophenylrest speziell bevorzugt.

Die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Ver- 30 fahrens eingesetzten Substrate sind aufgrund des an die Aminosäure Ai gebundenen Wasserstoffatomes leicht löslich, insbesondere in wässrigen Systemen, aber gleichzeitig wurde erreicht, dass die Aktivität des Substrates bezüglich des Enzymes nicht vermindert ist, indem man die Ai-Aminosäure 35 in der L-Form und nicht in der D-Form einsetzt. Es hat sich sogar herausgestellt, dass in völlig unerwarteter Weise die Aktivität des Substrates bezüglich des Enzymes durch die Verwendung der D-Aminosäure statt der L-Aminosäure auf ein Mehrfaches erhöht ist, und zwar im Vergleich zu 40 entsprechenden Substraten, die ausschliesslich aus L-Aminosäure aufgebaut sind. Oft ist die Aktivität des beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Substrates gegenüber dem Enzym sogar wesentlich besser als diejenige von entsprechenden gut geeigneten benzoylierten Substraten der 45 oben angegebenen Formel III. Die D-Aminosäure mit endständiger freier Stickstoffgruppierung führt auch dazu, dass die neuen Substrate nicht in unerwünschter Weise von Aminopeptidasen angegriffen werden, weil die Aminopepti-dasen spezifisch gegenüber L-Aminosäure sind. jq

Bezüglich der verwendeten Abkürzungen sei auf die weiter hinten angegebene Zusammenstellung von Abkürzungen verwiesen.

Zur Herstellung der beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten neuen chromogenen Substrate für die Enzyme H können übliche Schutzgruppen und Kupplungsverfahren angewandt werden, die für den Fachmann auf dem Gebiet der Peptid-Chemie gut bekannt sind.

Als a-Amino-Schutzgruppe wird mit Vorteil die Carbo-benzoxy-Gruppe oder der t-Butyloxy-carbonyl-Rest ver- M wendet oder einige Gruppierungen, die ähnlich aufgebaut sind, wie die oben erwähnten Gruppierungen, wie z. B. die p-Metoxy-, oder die p-Nitro- oder die p-Metoxy-phenylazo-carbobenzoxy-Gruppe.

Es ist vorteilhaft, eine Protonisierung, die NCVGruppe 6J oder die p-Toluolsulfonyl-Gruppe als Schutzgruppe zur Schützung der <5-Guanido-Gruppierungen des Arginyl-Restes heranzuziehen.

Als die Schutzgruppe für die ó-Amino-Gruppe des Ornithines und für die e-Amino-Gruppe des Lysines ist es von Vorteil, von all den Gruppierungen die Carbobenzoxy-, t-Butyloxycabonyl- oder p-Toluolsulfonyl-Gruppe zu verwenden.

Als abspaltbare a-Carboxy-Schutzgruppe ist es günstig, den Methyl-, Äthyl- oder Benzylester zu verwenden.

Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder zwischen einem Dipeptid und einer Aminosäure wird erreicht, indem man eine Aktivierung der a-Carboxygruppierung durchführt. Das aktivierte Derivat kann entweder isoliert werden oder in situ hergestellt werden, und als Aktivierungsgruppen sind beispielsweise p-Nitrophenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl-, N-Hydroxysuccinimid- oder N-Hydroxy-benzotriazolester geeignet, sowie ferner symmetrische Anhydride oder asymmetrische Anhydride oder auch Säure-azide.

Die Aktivierung der oben erwähnten Ester-Derivate wird mit Vorteil durch die Anwesenheit eines Carbodiimi-des, wie z. B. durch die Verwendung von N,N'-Dicyclo-hexylcarbodiimid, erreicht, wobei dieses Carbodiimid auch als aktivierendes Kupplungsmittel zur direkten Kupplung zwischen der Carboxy-Komponente und der Amin-Kompo-nente dienen kann.

Das Prinzip der Synthese der Substrate kann eine stufenweise Anreihung von a-Aminosäuren an die Kohlenstoff-Endgruppierung des Arginylrestes sein, wobei dieser Rest entweder vom Beginn an mit der angekuppelten chromo-phoren Gruppierung versehen ist, die dann als Schutzgruppe für die Carbonsäuregruppierung dient, oder indem man als Schutzgruppe für die Carbonsäuregruppierung eine abspaltbare Gruppe anwendet und dann anschliessend die chromophore Gruppierung an das geschützte Tripeptid-Derivat ankuppelt. Es ist jedoch auch ein anderes Herstellungsprinzip möglich, indem man das Dipeptidfragment mit endständiger Stickstoffgruppierung selbst herstellt, und dieses dann an die Arginylgruppierung ankuppelt, wobei diese entweder die chromophore Gruppierung bereits tragen kann, oder nicht, wie dies im Prinzip bereits oben diskutiert wurde.

Unabhängig von dem gewählten Herstellungsweg kann eine Reinigung von Zwischenprodukten oder des Endproduktes durch Gelfiltrationschromatographie durchgeführt werden. Dieses Reinigungsverfahren ist deshalb geeignet,

weil es ein rasches Syntheseverfahren ermöglicht, und zu maximalen Ausbeuten führt.

Die bereits weiter vorne und in der Folge verwendeten Abkürzungen bedeuten das Folgende:

Abkürzung Bedeutung

Aminosäure falls nicht ausdrücklich andere Angaben ge

macht werden, handelt es sich immer um die

L-Form der entsprechenden Aminosäure

Arg

Arginin

Aze

2-Azetidin-carbonsäure

Ala

Alanin

Gly

Glycin

Ile

Isoleucin

Leu

Leucin

Lys

Lysin

Phe

Phenylalanin

Pip

Pipecolinsäure

Pro

Prolin

Val

Valin

AcOH

Essigsäure

622 285

4

Bz

Benzoyl

Cbo-

Carbobenzoxy-

DCCI

Dicyclohexyl-carbodiimid

DMF

Dimethylformamid

EtsN

Triäthylamin

EtOAc

Äthylacetat = Essigsäureäthylester

GPC

Gelfiltrationschromatographie

HBT

N-Hydroxybenzotriazol

HMPTA

N,N,N',N',N",N"-Hexamethylphosphorsäure-

triamid

HONSu

N-Hydroxy-succinimid

MeOH

Methanol

-OpNP

p-Nitrophenoxy

-pNA

p-Nitroanilid tBoc t-Butyloxy-carbonyl

TFA

Trifluoressigsäure

TLC

Dünnschichtchromatographie io

15

20

30 .

35

Reaktionstypen, die zur Synthese angewandt werden Für die Synthese der in der Tabelle II zusammengestellten 25 Enzymsubstrate wurden verschiedene Reaktionsschritte angewandt, die im grossen und ganzen in ähnlicher Weise durchgeführt werden. Aus diesem Grund wird hier eine allgemeine Beschreibung der unterschiedlichen Reaktionstypen gegeben, und anschliessend werden in der Tabelle I die Zwischenprodukte und Endprodukte, die Aufarbeitungsverfahren, die für die einzelnen Reaktionstypen angewandt werden, und die einzelnen physikalischen Daten angeführt.

Reaktions-Typ 1 Ankupplung der chromophoren Gruppierung R 20 mMole eines N®, NG -ges chützten Arginines oder eines Nß, Nv/-geschützten Ornithines oder Lysines oder ein in entsprechender Weise geeignet geschütztes Dipeptid-Derivat wurden im vermahlenen und gut getrocknetem Zustand in 50 ml an frisch destilliertem HMPTA gelöst, und dann gibt man 20 mMol Triäthylamin und 30 mMol des chromophoren Amines in Form seines Isocyanat-Derivates unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen und unter Rühren zu. Sobald eine Reaktionszeit von einem Tag abgelaufen ist,

giesst man die Lösung in 0,5 1 einer 2-%-igen Natrium-bicarbonatlösung unter Rühren ein. Der dabei gebildete Niederschlag wird abfiltriert und mit Bicarbonatlösung, mit Wasser, mit 0,5 normaler Chlorwasserstoffsäure und dann wieder mit Wasser gut gewaschen. Aus dem Niederschlag wird das erwünschte Produkt extrahiert, beispielsweise unter Verwendung von Methanol, wobei bestimmte Nebenprodukte nicht gelöst werden. Der Methanolextrakt wird dann eingedampft, und er kann aus einem geeigneten Medium zur Kristallisation gebracht werden, oder er kann auch durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt werden.

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Reaktionstyp 2 Abspaltung der Carbobenzoxy-Schutzgruppe (Cbo-Schütz-gruppe)

10 mMole des gut getrockneten Carbobenzoxy-Derivates (Cbo-Derivates) werden in 25 ml getrockneter Essigsäure aufgeschlämmt und dann werden 15 ml an 5,6 normaler Bromwasserstoffsäure in Essigsäure unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen bei Zimmertemperatur zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 45 — 60 Minuten wird die Lösung tropfenweise in 300 ml trockenen Äther unter heftigem

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Rühren eingebracht. Die Ätherphase wird von dem gebildeten Niederschlag abgesaugt und der Niederschlag wird mit 2 bis 3 Anteilen von 100 ml Äther gewaschen. Die so erhaltene Verbindung ist das Hydrobromid der Na-unge-schützten oder deblockierten Verbindung. Dieses Produkt wird über Natronlauge-Plätzchen in Vakuum bei 40 °C während 3 bis 16 Stunden getrocknet.

Reaktionstyp 3 Abspaltung der t-Butyloxy-carbonyl-Schutzgruppe (tBoc-Schutzgruppe).

10 mMole des gut getrockneten tBoc-Derivates (Nß-Derivates) werden in 200 ml an 25 °/oiger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen bei Zimmertemperatur gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten wird die Lösung tropfenweise in 500 ml trockenen Äther eingebracht. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und gut mit Äther gewaschen. Man erhält so das Trifluoracetat der entsprechenden Na-ungeschützten oder N®-entblockierten Verbindung. Dieses Produkt wird über Natronlauge-Plätzchen unter Vakuum 2 bis 3 Stunden lang bei 30 °C getrocknet.

Reaktionstyp 4 Kupplungsreaktionen.

Freisetzung der a-Aminogruppe.

Zur Acylierung der Derivate, die nach den Reaktionstypen 2 oder 3 erhalten werden,.muss die a-Aminogruppe in Form der freien Base vorliegen. Die Freisetzung kann nach vielen unterschiedlichen Arbeitsweisen durchgeführt werden. Unter anderem ist es möglich, ein Äqivalent eines trockenen Amines, wie z. B. von Triäthylamin oder N-Äthyl-morpholin, zu einer Dimethylformamid-Lösung des Bromwasserstoffsäure-Derivates oder des Trifluoressigsäure-Derivates zuzusetzen, wobei die Lösung auf — 10 °C abgekühlt ist. In denjenigen Fällen, wo man ein Bromwasserstoffsäure-Derivat und Triäthylamin verwendet, fällt dann das HBr-Salz des Triäthylamines aus, und wird durch Filtration entfernt. Andererseits ist es auch möglich, das Bromwasserstoffsäure-Derivat oder Trifluoressigsäure-Derivat in einer 5°/oigen Natriumbicarbonatlösung aufzulösen, aus welcher dann das freigesetzte Derivat extrahiert wird, beispielsweise indem man Essigsäureäthylester oder Butanol als Extraktionsmittel verwendet, worauf dann die organische Phase getrocknet und abgedampft wird.

a) Kupplungsreaktion mit Nffi-geschützten aktiven Ester-Derivaten.

Zu einer Lösung von 10 mMol eines Peptid-Derivates oder eines Aminosäure-Derivates, bei dem die Aminogruppe nach dem oben erwähnten Verfahren freigesetzt wurde, gibt man 20 bis 50 ml an frisch destilliertem Dimethylforma-mid, 11 mMol eines Nß-geschützten p-Nitrophenyl- oder n-Hydroxysuccinimidester-Derivates der Aminosäure, die gekuppelt werden soll, zu, wobei man eine Temperatur von — 10 °C einhält. Sobald eine Reaktionszeit von einer Stunde bei einer Temperatur von — 10 °C eingehalten wurde, puffert man die Lösung mit 5 mMolen eines tertiären Amines ab und lässt sie dann langsam sich auf Zimmertemperatur erwärmen. Nach diesem Reaktionsablauf ist es günstig, eine Analyse durch Dünnschichtchromatographie durchzuführen. Falls es benötigt wird, gibt man nach einer erneuten Kühlung 5 mMole einer Base zu. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, wird die Lösung auf einem Rotationsverdampfer eingedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhält, der mit mehreren Protionen Wasser gerührt wird. Der Rückstand wird dann durch eine Gelfil

5

622 285

trationschromatographie oder durch Umkristallisieren gereinigt. Wenn man zur Durchführung des Reinigungsverfahrens des Kupplungsproduktes eine Gelfiltrationschromatographie durchführt, und diese ein Eluationsvolumen hat,

welches vollständig oder teilweise mit demjenigen des ak- 5 tiven Ester-Derivates der angekuppelten Aminosäure zusammenfällt, dann kann eine Verunreinigung des Kupplungsproduktes vermieden werden, wenn nach der Beendigung der Reaktion, jedoch vor der Abdampfung, das unverbrauchte aktive Ester-Derivat durch einen Überschuss von beispiels- io weise 3 bis 5 mMolen eines primären Amines ersetzt wird, beispielsweise durch n-Butylamin, indem man hiezu eine Reaktionsdauer von 30 Minuten bei Zimmertemperatur anwendet. Nach diesem Arbeitsschritt wird die Aufarbeitung so durchgeführt, wie dies oben beschrieben ist. 15

b) Kupplung mit Na-geschützten Aminosäuren oder Peptiden und Herstellung des aktiven Esters in situ.

Zu einer Lösung von 10 mMolen des oben erwähnten freigesetzten Peptides oder Aminosäure-Derivates in 20 bis 50 ml an frisch destilliertem Dimethylformamid gibt man 20 11 mMole der Na-geschützten Aminosäure oder eines in entsprechender Weise geschützten Peptid-Derivates mit einer am endständigen Kohlenstoffatom stehenden freien Carboxylgruppe, sowie 11 mMole HBT oder HONSu und 11 mMole DCCI bei einer Temperatur von — 10°C zu. Dann 25 wird die Reaktionslösung bei — 10 °C während 1 — 3 Stunden belassen, und man lässt sie bis dann auf Zimmertemperatur erwärmen. Nach diesem Reaktionsablauf ist es günstig, eine Analyse unter Verwendung der Dünnschichtchromatographie durchzuführen. Sobald die Reaktion abge- 30 schlössen ist, giesst man unter Rühren in 100 bis 300 ml einer 5 °/o-igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung ein.

Der so erhaltene Niederschlag wird nach dem Filtrieren oder Dekantieren mit Wasser gewaschen. Der dabei anfallende Niederschlag kann durch Gelfiltrationschromatographie 35 oder durch Umkristallisieren gereinigt werden.

Reaktionstyp 5

Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen und Reinigung und Ionenaustausch.

0,2 bis 1,0 mMole des geschützten Peptid-Derivates mit der gewünschten chromophoren Gruppierung wird von den Schutzgruppen befreit, indem man es mit 5 — 20 ml an trockener Fluorwasserstoffsäure in Anwesenheit von 45 0,2 bis 1,0 ml Anisol reagieren lässt. Die Reaktion wird in einer Apparatur nach Sakakibara durchgeführt, die für die vorliegenden Zwecke bestimmt ist, und die Reaktionszeit beträgt bei 0 °C 60 Minuten. Sobald die Reaktion beendet ist, und die gesamte Menge an Fluorwasserstoffsäure abde- 50 stillisiert wurde, wird das Rohprodukt in 33 %-iger wäss-riger Essigsäure aufgelöst und durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung aus der verdünnten Essigsäure isoliert, und man unterwirft es dann einem Ionenaustausch auf einer Säule, die mit einem schwach basischen Ionenaustauscherharz gefüllt ist. Das Ionenaustauscherharz war Sephadex (R) QAE-25, in der Chloridform, das mit einer Mischung aus Methanol plus Wasser im Mengenverhältnis 95:5 .uellen gelassen wurde, und als Eluationsmedium wurde das gleiche Medium verwendet, das zur Lösung eingesetzt wurde. Das reine Produkt wird aus Wasser gefriergetrocknet.

Gelfiltrationschromatographie

Durch Gelfiltrationschromatographie des geschützten Peptides oder des Aminosäure-Derivates, der Rohprodukte oder der Eindampfungsrückstände, die aus den Mutterlaugen nach der Kristallisation erhalten werden, kann ein vereinfachtes Aufarbeitungsverfahren erreicht werden, und es werden auch optimale Ausbeuten erzielt. Die Substanzen wurden dann in Methanol gelöst und auf eine Säule einer geigneten Grösse aufgetragen, deren Volumen 0,5 — 7,5 1 beträgt und die eine Länge von 100 cm aufweist. Die Säule ist mit SephadexfR) LH-20, das in Methanol quellen gelassen wurde, gefüllt, und man eluiert mit dem gleichen Lösungsmittel. Es werden geeignete Teilvolumen des Elua-tes fraktioniert aufgefangen und in diesen Eluatfraktionen wird die Lichtabsorption im ultravioletten Bereich bei 254 mm ständig bestimmt. Produktenthaltende Teilfraktionen werden auf ihre Reinheit durch Dünschichtchromatographie geprüft, und die reinen Fraktionen werden miteinander vereinigt und eingedampft.

Zur Reinigung der Peptid-Derivate nach der Abspaltung der Schutzgruppen mit Fluorwasserstoffsäure nach dem oben beschriebenen Reaktions-Typ 5 wird eine 30 %-ige wässrige Essigsäurelösung des Rohrproduktes auf eine Säule einer geeigneten Grösse aufgebracht, wobei die Säule beispielsweise ein Volumen im Bereich von 0,5 bis 2,01 und eine Länge von 60 cm aufweisen kann. Die Säule ist mit Sephadex(R) G-15, das in 30%iger wässriger Essigsäure quellen gelassen wurde, gefüllt, und man eluiert mit dem gleichen Lösungsmittel. Man entwickelt die Säule nach dem oben beschriebenen Verfahren und fängt Fraktionen auf, wobei die produktenthaltenden reinen Teilfraktionen '.. gefriergetrocknet werden, gegebenenfalls nachdem eine teilweise Eindampfung unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei einer Temperatur von 25 °C stattgefunden hatte.

Durchführung der Dünnschichtchromatographie Zur Durchführung der Analysen nach dem Verfahren der Dünnschichtchromatographie werden Glasplatten eingesetzt, die unter Verwendung von «Kieselgel F254» (Merck) als Absorptionsmittel hergestellt wurden. Zur Entwicklung der Dünnschichtchromatographie wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme eingesetzt, wobei sich die angegebene Mengenverhältnisse jeweils auf das Volumen beziehen.

Lösungsmittel-System A n-Butanol:Essigsäure:Wasser=3:2:1

Lösungsmittel-System Pi Chloroform :Methanol=9:1

Lösungsmittel-System P 1/2 Chloroform : Methanol=19:1

Nach der Beendigung der Chromatographie werden die Platten in Ultraviolettlicht (Wellenlänge von 254 nm) betrachtet, und man entwickelt dann unter Verwendung von Cl/o-Toluidin Reagens nach üblichen Arbeitsverfahren. Die angegebene Rf-Werte sind die Ergebnisse von getrennten Chromatographien.

Bestimmung von Serinproteasen unter Verwendung der chromogenen Substrate Die nach den folgenden Beispielen hergestellten Substrate werden verwendet, um verschiedene Enzyme nach dem in der Folge erläuterten Arbeitsverfahren zu bestimmen.

Im Prinzip beruht das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren oder Nachweisverfahren darauf, dass die bei,der enzymatischen Hydrolyse gebildeten Verbindungen der Formel I, wie bereits erwähnt wurde, sich bezüglich ihres Absorptions-spektrums, insbesondere des Ultraviolettspektrums, von dem Substrat der Formel II unterscheiden. Wenn man ein Substrat der Formel II verwendet, in

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welchem der chromogene Rest R ein p-Nitrophenylrest ist, dann ist das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Material der Formel I das p-Nitroanilin. Es zeigte sich,

dass alle zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendbaren neuen p-Nitroanilid-substrate der Formel II Absorptionsmaxima aufweisen, die im Bereich von 310 nm liegen, wobei der molare Extinktionskoeffizient etwa 12.000 beträgt. Bei einer Wellenlänge von 405 nm hat die Absorption dieser Substrate praktisch vollständig aufgehört. Während der enzymatischen Hydrolyse nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird von den Substraten das p-Nitroanilin abgespalten, das ein Absorptionsmaximum bei 380 nm aufweist, und einen moralen Extinktionskoeffizienten von 13.200 besitzt, wobei der morale Extinktionskoeffizient des p-Nitroanilines bei einer Wellenlänge von 405 nm nur auf 9.620 abgefallen ist. Wenn man daher eine spektrophotometrische Untersuchung bei 405 nm vornimmt, ist es leicht, die Menge an p-Nitroanilin zu bestimmen, die gebildet wurde, wobei diese Menge proportional zu dem Ausmass der enzymatischen Hydrolyse ist. Das Ausmass der enzymatischen Hydrolyse ist selbst wieder durch die aktive Menge an Enzym bestimmt.

Die Tabelle II zeigt einen Vergleich der relativen Reaktionsgeschwindigkeit zwischen bisher bekannten Substraten der Formel III, deren nicht benzoylierten Formen und beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzenden Substraten. Aus dieser Tabelle wird die Überlegenheit der beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Substrate klar ersichtlich.

Dementsprechend sind beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Substrate um ein Mehrfaches besser geeignet als entsprechend aufgebaute Substrate, die als endständige Aminosäure eine L-Aminosäure mit freier Amino-5. gruppe aufweisen, und sie sind ferner mindestens so gut geeignet, wie die besten bisher bekannten Substrate, die benzoylierte Substrate gemäss der weiter oben angegebenen Formel III sind. Ausserdem führt die höhere Löslichkeit der neuen beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzen-io den Substrate, die im allgemeinen etwa 20 — 300-mal grösser ist, zu sehr grossen Vorteilen bei der Enzymbestimmung, und zwar insbesondere dann, wenn die Bestimmung in biologischen Systemen durchgeführt werden muss. In derartigen biologischen Systemen hat die schlechte Löslichkeit der bisher bekannten Substrate zu schwierigen Problemen geführt, und zwar teilweise aufgrund der Tatsache, dass eine Sättigung mit dem Substrat nicht erreicht werden konnte und deshalb, weil das Risiko für unerwünschte Ausfällungen bestand.

Das Gel Sephadex(ß) G-15, das zur Durchführung der Gelfiltration verwendet wird, ist ein vernetztes Dextrangel.

Das Gel Sephadex(E) LH-20 ist ein hydroxypropyliertes vernetztes Dextrangel.

Der Ionenaustauscher Sephadex(R)QAE-25 ist ein vernetztes Dextrangel mit Diäthyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-äthyl als funktionelle Gruppe. Diese Gele werden von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden hergestellt.

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Tabelle I

Produkt Nr.

Cbo-Arg(N02)-pNA I

tBoc-Lys(Cbo)-pNA II

Cbo-Pro-Arg(N02)-pNA III

Cbo-D-Val-Pro-Arg(NC>2)-pNA IV

Cbo-Pip-Arg(NOz)-pNA V

Cbo-Val-Pip-Arg(N02)-pNA VI

Cbo-Leu-Arg(N02)-pNA VII

Boc-D-Ile-Leu-Arg(N02)-pNA VIII

Cbo-D-Val-Leu-Arg(N02)-pNA IX

tBoc-Leu-Lys(Cbo)-pNA X

tBoc-D-Ile-Leu-Lys(Cbo)-pNA XI

Cbo-D-Val-Leu-Lys(Cbo)-pNA XII

H-D-Val-Pro-Arg-pNA-2 HCl XIII

H-D-Val-Pip-Arg-pNA-2 HCl XIV

H-D-Ile-Leu-Arg-pNA-2 HCl XV

H-D-Val-Leu-Arg-pNA-2 HCl XVI

H-D-Ile-Leu-Lys-pNA-2 HCl XVII

H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2 HCl XVIII

Cbo-Ala-Arg(NC>2)-pNA XIX

Cbo-D-Ala-Ala-Arg(N02)-pNA XX

Ausgangs-Material

Cbo-Arg(N02)-C>H-p-NC>2-Phenylisocynat tBoc-Lys(Cbo)-pNA-p-N02-Phenylisocyanat

I, Cbo-Pro-OpNP III, Cbo-D-Val-OpNP I, Cbo-Pip-OpNP V, Cbo-D-Val-OpNP

I, Cbo-Leu-OpNP

VII, tBoc-D-Ile-OH VII, Cbo-D-Val-OpNP

II, tBoc-Leu-OpNP X, tBoc-D-Ile-OH

X, Cbo-D-Val-OpNP

IV (1.46 mmol)

VI (0.20 mmol)

VIII (0.38 mmol)

IX (0.28 mmol)

XI (0.18 mmol)

XII (0.27 mmol)

I, Cbo-Ala-OpNP

XIX, Cbo-D-Ala-OpNP

Synthese Aus- Auf- [a]24ï/ Cl~

Gem. Re- beute arb. D Wert Gehalt aktions- in °/o Verf. (Dünn- gefunden

Typ Nr. Schicht) (theor.)

1

63

GPC

+

20,5 (D)

Pi (0,34)

1

67

Krist. (EtOH)

—

8,5 (M)

Pi (0,72)

2,4a

96

GPC

—

33,0 (D)

Pi (0,28)

2,4a

75

GPC

+

26,2 (D)

Pi (0,38)

2, 4a

86

GPC

—

26,2 (D)

Pi (0,30)

2, 4a

23

GPC

—

24,0 (D)

Pi (0,40)

2, 4a

85

GPC

+

3,7 (D) 33,4 (M)

Pi (0,38)

2,4b

94

GPC

—

2,5 (M)

Pi (0,38)

2, 4a

64

Krist. (MeOH)

+

1,7 (D)

Pi (0,42)

3,4a

74

GPC

—

4,7 (D)

Pl/2 (0,62)

3,4b

77

GPC+ +Krist. (MeOH)

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85

GPC

—

81,5 (A)

A (0,40)

11,7 (12,2)

5

75

GPC

—

58,2 (A)

A (0,46)

12,4 (11,9)

5

75

GPC

—

63,7 (A)

A (0,46)

11,7 (12,1)

5

72

GPC

—

66,6 (À)

A (0,44)

13,0 (12,5)

5

87

GPC

—

67,3 (A)

A (0,42)

12,5 (12,9)

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76

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In der Tabelle I bedeutet in der 7. Spalte die Bezeichnung [a] 25+/dass die Bestimmung der optischen Drehung fJA

[a] q bei einer Konzentration von 0,5—1,0 in den in der Klammer angeführten Lösungsmitteln durchgeführt wurde.

Dabei bedeuten:

(D) = Dimethylformamid (M) = Methanol

(A) = 50%ige wässrige Essigsäure

Tabelle II

Substrat

Löslichkeit in mg/ml Puffer*

Relative Reaktionsgeschwindigkeiten T Try PI Kai UK

Bz-Val-Pro-Arg-pNA

0,3

6

60

15

H-Val-Pro-Arg-pNA

40

6

55

15

H-D-Val-Pro-Arg-pNA (XIII)

100

80

100

95

Bz-Val-Pip-Arg-pNA

4

45

30

H-Val-Pip-Arg-pNA

4

35

45

H-D-Val-Pip-Arg-pNA (XIV)

100

70

100

Bz-V al-Leu-Arg-pNA

0,2

100

H-V al-Leu-Arg-pNA

50

H-D-Val-Leu-Arg-pNA (XVI)

600

100

Bz-V al-Leu-Lys-pNA

0,5

100

H-V al-Leu-Lys-pNA

25

H-D-Val-Leu-Lys-pNA (XVIII)

>100

100

Bz-Ile-Leu-Arg-pNA

0,2

55

100

H-Ile-Leu-Arg-pNA

10

20

H-D-Ile-Leu-Arg-pNA (XV)

4

75

100

Bz-Ile-Leu-Lys-pNA

1

130

H-Ile-Leu-Lys-pNA

35

H-D-Ile-Leu-Lys-pNA (XVII)

20

100

* Als Puffer wurde Tris, pH 8,2,10,15 verwendet.

In der vorangegangenen Tabelle II werden die Reaktionsgeschwindigkeiten für die unterschiedlichen Substrate im Verhältnis zu einem Bezugs-Substrat für jedes Enzym angegeben. Die Abkürzungen für die Enzyme, die Bezugs-Substrate und die Empfindlichkeit der Enzyme gegenüber den Bezugs-Substraten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

50

55

60

Enzym (Abkürzung)

Bezugs-Substrat Nr.

Empfindlichkeit (angegebene Menge an Enzym ergibt die Aktivität 0,1 nkat)

AOD/min = 0,0254

Thrombin (T)

XIV

0,06 INH

Trypsin (Try)

XIII

0,03/ig (Novo)

Plasmin (PI)

XVIII

0,01 CU

Kallikrein (Kai)

XVI

0,2 BE

Urokinase (UK)

XIV

40 Ploug E

M

Claims

622 285

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Bestimmung von Serin-Proteasen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Material, in dem die Serin-Proteasen bestimmt werden sollen, mit einem Substrat, das die folgende Formel II

H-D-Ai-Aa-As-NH-R (II)

aufweist, oder ein Salz der Verbindung der Formel II ist, zusammenbringt, wobei in dieser Formel II io

Ai und A2 eine Aminosäure aus der Gruppe von Aminosäuren ist, die Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro und Aze umfasst,

A2 ausserdem Phe sein kann,

As die Aminosäure Arg, Lys oder Orn bedeutet 15

D anzeigt, dass die Aminosäure Ai in ihrer D-Form vorliegt und

R eine chromophore Gruppierung darstellt,

und durch die Serin-Proteasen aus dem Substrat durch enzymatische Hydrolyse eine Verbindung der Formel I 20

H2N-R (I)

abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel II unterscheidet, und 25 wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesenden Serin-Proteasen ist.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Substrat der Formel II die chromo- so phore Gruppierung R ein Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitro-naphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolyl-rest ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in dem verwendeten Substrat der Rest R ein Nitrophenylrest ist.

35