CH616402A5 - Process for the preparation of analogues of somatostatin - Google Patents
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Description
La présente invention est relative à un procédé de préparation de dérivés du tétradécapeptide dénommé somatostatine. Elle se rapporte aussi à la préparation des produits de départ utilisés dans ledit procédé.
Le terme somatostatine a été proposé pour le facteur trouvé dans des extraits hypothalamiques, empêchant la sécrétion de 50 l'hormone de croissance (somatotropine). La structure de ce facteur a été mise en évidence par P. Brazeau et consorts, «Science», 179,77 (1973) et on lui a attribué la structure suivante de tétradécapeptide:
H—Ala—Gly — Cys—Lys—Asn — Phe—Phe—Trp—Lys—Thr — Phe—Thr—Ser — Cys—OH
Les abréviations utilisées pour les divers aminoacides sont: Ala, alanine; Asn, asparagine; Cys, cystéine; Gly, glycine; Lys, lysine; Phe, phénylalanine; Ser, sérine; Thr, thréonine, et Trp, tryptophane.
La constitution du tétradécapeptide somatostatine a été confirmée par synthèse; voir, par exemple, D. Sarantakis et W.A. McKinley, «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 54 234 (1973), J. Rivier et consorts, «Compt. Rend. Ser. D», 276,2737 (1973) et H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974).
L'activité physiologique importante de ce tétradécapeptide l'a fait considérer comme un composé intéressant en pharmacologie clinique en rapport avec le traitement de l'acromégalie et du diabète;
voir, par exemple, K.Lundbaek et consorts, «Lancet», 2,131 (1970) et R. Guillemin dans «Chemistry and Biology of Peptides», J. Maienhofer, éd., 3rd American Peptide Symposium, Boston 60 1972, Ann Arbor Science Publications, Ann Arbor, Mich., 1972.
La forme linéaire de la somatostatine, comportant deux groupes sulhydryles au lieu d'un pont de disulfure, a été préparée par J.E.F. Rivier, «J. Amer. Chem. Soc.», 96,2986 (1974). Rivier a signalé que la forme linéaire est d'une puissance égale à celle de la 65 somatostatine, en ce qui concerne la capacité de ces deux types de composés à paralyser le taux de sécrétion de l'hormone de croissance par des cellules pituitaires de rat dans des cultures de tissus en couche monomoléculaire.
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Ce n'est que récemment que l'on a signalé que des polypeptides, autres que l'hormone naturelle et sa forme linéaire, ont une activité semblable à celle de la somatostatine. D. Sarantakis et consorts, «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 55, 538 (1973) ont décrit récemment la synthèse de l'analogue de somatostatine, [Ala3'14]-somatostatine, par des méthodes en phase solide. Cet analogue a montré une très faible somme d'activité, environ 0,01% de la puissance de la somatostatine. P. Brazeau et consorts, «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 60,1202 (1974) ont décrit récemment la synthèse d'un certain nombre de dérivés de Des—[Ala1 —Gly2]-somatostatine acylés par des méthodes en phase solide.
La présente invention se rapporte à un procédé de préparation de dérivés de somatostatine, qui montrent un degré d'activité supérieur ou du même ordre que l'hormone naturelle, ainsi qu'une durée d'activité qui est supérieure à celle de la somatostatine. On prépare ces dérivés facilement par un procédé approprié supposant 5 les avantages suivants : le procédé part de matières aisément disponibles, il évite des réactifs nocifs, il se développe facilement et il utilise des groupes protecteurs faciles à séparer.
Les qualités et les avantages précédents rendent les peptides préparés selon l'invention intéressants pour le traitement du diabète et de l'acromégalie.
Les peptides préparés selon l'invention sont représentés par la formule I:
SCH2CH(R1)CO—Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—NHCH(R2)CH2 S
Dans cette formule:
a) R1 représente H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH,H—Gly— Gly - Gly-Ala-Gly-NH- ou H—Leu—Gly—Gly—Ala— Gly—NH et R2 représente H ou COOH, ou b) R1 représente H ou NHR3, où R3 est le radical acyle ali-phatique inférieur de 1 à 6 atomes de carbone ou benzoyle, et R2 représente H, ou c) R1 représente H—Ala—Gly—NH et R2 représente COOAlk, où Alk est un alcoyle à chaîne droite ou ramifiée comportant de 1 à 14 atomes de carbone.
Les sels acceptables en thérapeutique des composés de formule I sont également englobés dans le cadre de l'invention.
Suivant l'invention, on prépare les peptides par un procédé comprenant l'oxydation d'un peptide linéaire de formule II:
.Trt - SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - Trp -Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu') — NHCH(R2)CH2S—Trt (II)
dans laquelle:
a) R2 représente H ou COOH et R4 représente Boc—Gly— Gly - Ala - Gly—NH,Boc - Gly—Gly - Gly - Ala - Gly - NH ou Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, ou b) R2 représente H et R4 représente H ou NHR3, où R3 a la définition précédente, ou c) R2 représente COOAlk et R4 représente Boc—Ala—Gly— NH, avec de l'iode ou du thiocyanogène pour obtenir le dérivé disulfure cyclique correspondant de la formule III:
SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys(Boc) -
Thr(Bul) - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -NHCH(R2)CH2S (III) dans laquelle R2 et R4 ont la définition donnée précédemment, avec ensuite la scission hydrolytique de tous les groupes protecteurs restants sous des conditions modérément acides pour obtenir le peptide correspondant de formule I.
On peut préparer aisément le peptide de départ linéaire de formule II par un procédé qui comprend la réaction, suivant la méthode de couplage à l'azide (expliquée ci-dessous), d'un peptide de la formule IV :
Trt - SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - NHNH2
(IV)
avec un peptide de formule V :
H - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -NHCH(R2)CH2S—Trt (V)
formules dans lesquelles R2 et R4 ont la définition donnée précédemment, en vue d'obtenir le peptide linéaire correspondant de formule II, dans laquelle R2 et R4 ont également la définition déjà donnée.
(I)
D'une manière générale, les abréviations utilisées dans la pré-20 sente description pour désigner les aminoacides et les groupes protecteurs sont fondées sur les recommandations de la IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [voir «Biochemistry», II, 1726-1732 (1972)]. Par exemple, Cys, Lys, Asn, Phe, Trp, Thr, et Ser représentant les restes de L-cystéine, L-lysine, 25 L-asparagine, L-phénylalanine, L-tryptophane, L-thréonine et L-sérine. Par le terme reste, on désigne un radical dérivant du L-aminoacide correspondant par élimination de la portion OH du groupe carboxyle et de la portion H du groupe amino. Tous les aminoacides ont la configuration naturelle L.
30 On connaît à ce jour un certain nombre de procédés ou de techniques pour la préparation des peptides. A titre d'exemple, les groupes fonctionnels qui ne sont pas impliqués dans la réaction de formation d'une liaison de peptide sont facultativement protégés par un ou des groupes protecteurs avant la réaction de condensation. 35 A titre d'exemple, les groupes protecteurs que l'on peut choisir pour une fonction amino d'un peptide ou d'un aminoacide, qui n'est pas impliquée dans la formation de la liaison de peptide, sont : les alcoxy-carbonyles, qui englobent le benzyloxycarbonyle (représenté par Z), le t-butoxycarbonyle (représenté par Boc), l'a,a-diméthyl-3,5-40 diméthoxybenzyloxycarbonyle (représenté par Ddz), le 2-(p-biphényl)isopropyloxycarbonyle (représenté par Bpoc), le p-chlorobenzyloxycarbonyle, le p-méthoxybenzyloxycarbonyle, l'isopropyloxycarbonyle ou l'éthoxycarbonyle; les groupes protecteurs du type acyle, qui englobent le formyle, le trifluoro-45 acétyle, le phtalyle, l'acétyle (Ac), ou le toluènesulfonyle; les groupes protecteurs du type alcoyle, qui englobent le triphénylméthyle ou trityle (représenté par Trt), ou le benzyle; les groupes protecteurs préférés pour le procédé de l'invention sont le benzyloxycarbonyle, le t-butoxycarbonyle, le triphénylméthyle et l'a,a-diméthyl-3,5-50 diméthoxybenzyloxycarbonyle. Les groupes protecteurs pour le radical hydroxyle de la sérine et de la tyrosine sont constitués par l'acétyle, le tosyle, le benzoyle, le butyle tertiaire (représenté par Bu'), le trityle et le benzyle ; le groupe protecteur préféré est le butyle tertiaire. Le groupe protecteur sur l'atome de soufre de la cystéine 55 ou de la cystéine modifiée est le trityle (représenté par Trt). La fonction acide carboxylique d'un peptide ou d'un aminoacide peut être considérée comme étant protégée par un ester d'alcoyle inférieur ou d'aralcoyle inférieur, notamment un ester de méthyle (représenté par OMe), d'éthyle (représenté par OEt) ou de benzyle (représenté 60 par OBzl), et également par des hydrazides substitués englobant l'hydrazide de t-butoxycarbonyle (représenté par NHNH Boc), l'hydrazide de benzyloxycarbonyle (représenté par NHNH Z) ou l'hydrazide d'a,cx-diméthyl-3,5-diméthoxybenzyloxycarbonyle (représenté par NHNH Ddz). L'avréviation Acm représente 65 l'acétamidométhyle.
Pour favoriser une condensation aisée du groupe carboxyle d'un peptide avec un groupe amino libre d'un autre peptide en vue de former une nouvelle liaison peptidique, le groupe carboxyle
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terminal doit être activé. Des descriptions de ces groupes d'acti-vation du radical carboxyle se retrouvent d'une manière générale dans les manuels sur la chimie des peptides; voir, par exemple K.D. Kopple, «Peptides and Amino Acids», W.A. Benjamin, Inc., New York, 1966, pp. 45-51 ; E. Schröder et K. Liibke, «The Peptides», vol. I, Academic Press, New York, 1965, pp. 77-128. Des exemples de la forme activée du carboxyle terminal sont le chlorure d'acide, l'anhydride, l'azide, l'ester activé ou l'o-acylurée d'un dialcoylcarbodiimide. Les esters activés suivants se sont montrés tout particulièrement appropriés; le 2,4,5-trichlorophényle (représenté par OTcp), le pentachlorophényle (représenté par OPcp), le p-nitrophényle (représenté par ONp) ou le 1-benzo-triazolyle ; le groupe succinimido est également intéressant pour une telle activation.
L'expression méthode à l'azide, que l'on utilise dans le cas présent, désigne la méthode de couplage de deux fragments de peptide, qui comprend la réaction d'un hydrazide de peptide avec un réactif fournissant de l'acide nitreux in situ. Des réactifs appropriés à cet effet sont les nitrites organiques (par exemple le nitrite de butyle tertiaire, le nitrite d'isoamyle) ou les nitrites de métaux alcalins (par exemple le nitrite de sodium, le nitrite de potassium) en présence d'un acide fort, tel que de l'acide chlorhydrique ou bien de l'acide sulfurique ou phosphorique. L'azide de peptide correspondant ainsi obtenu est ensuite mis en réaction avec un peptide comportant un groupe amino libre en vue d'obtenir le peptide désiré. Les conditions préférées pour la méthode de couplage à l'azide comprennent la réaction de l'hydrazide de peptide avec de l'acide nitreux, formé in situ au départ d'un nitrite organique en présence d'un acide fort, de préférence de l'acide chlorhydrique (pH habituellement de l'ordre de 0,1 à 2), dans un solvant organique inerte anhydre, par exemple du diméthylformamide, du sulfoxyde de diméthyle, de l'acétate d'éthyle, du dichlorure de méthylène, du tétrahydrofuranne, du dioxanne, etc., à une température de — 30 à 20° C, de préférence d'environ — 15°C, pendant 10 à 30 mn, en vue d'obtenir l'azide correspondant. L'azide de peptide peut être isolé et cristallisé, et on le laisse de préférence dans le mélange de réaction. Ensuite, l'azide du mélange précédent est mis en réaction avec l'unité peptide comportant le groupe amino libre à des températures allant de — 30° C à 20° C pendant environ 1 à 2 h, et ensuite à une température de 0 à 30° C pendant 10 à 30 h. Dans le mélange de réaction, il y a un accepteur d'acide, de préférence une base organique, par exemple de la N-éthyldiisopropylamine, de la N-éthylmorpholine ou de la triéthylamine, pour rendre le milieu de réaction légèrement alcalin, avec un pH de préférence de l'ordre de 7 à 7,5. Voir également les manuels cités précédemment de Kopple ou de Schröder et Liibke pour des descriptions supplémentaires de cette méthode.
Les termes peptide, tripeptide, hexapeptide, etc., que l'on utilise dans le cas présent, ne doivent pas être considérés comme se limitant aux peptides proprement dits, ces termes étant également utilisés pour les peptides modifiés présentant des groupes fonctionnalisés ou protecteurs. Le terme peptide s'utilise en considérant un peptide comportant de 2 à 17 restes d'aminoacide. Le reste SCH2CH(R1)CO désigne un reste modifié de cystéine, lorsque R1 désigne de l'hydrogène, ou un reste de cystéine lorsque R1 désigne NHR3, où R3 a la définition donnée précédemment, ou représente H—Gly—Gly— Ala - Gly - NH, H - Gly - Gly - Gly - Ala - Gly - NH, H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH ou H — Ala—Gly—NH. En outre, le reste NHCH(R2)CH2S désigne le reste de cystéine lorsque R2 représente COOH ou COOAlk ou un reste modifié de cystéine, lorsque R2 représente H.
L'abréviation Me désigne un groupe méthyle et NHNH2 désigne un groupe d'hydrazide.
L'expression alcoyle inférieur désigne ici des radicaux hydrocarbures comportant 1 à 3 atomes de carbone et elle englobe le méthyle, l'éthyle et le propyle. Le symbole Alk désigne un groupe alcoyle à chaîne droite ou modifiée, comportant 1 à 14 atomes de carbone.
Le terme acyle désigne, dans le cas présent, un acyle aliphatique inférieur de 1 à 6 atomes de carbone et englobe, sous cette définition, des acyles à chaîne droite ou ramifiée, notamment le formyle, l'acétyle, le propionyle, le butyryle, l'isobutyryle, le pivaloyle, le n-hexanoyle, etc.
L'expression acide minéral désigne, dans le cas présent, les acides minéraux forts et englobe les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique ou phosphorique. Lorsqu'on utilise cette expression en liaison avec un système anhydre, l'acide chlorhydrique anhydre constitue l'acide minéral préféré.
L'expression conditions faiblement acides désigne, dans le cas présent, des conditions dans lesquelles une solution aqueuse diluée d'un acide organique, par exemple une solution aqueuse à 30-80% d'acide formique, acétique ou propionique, de préférence une solution aqueuse à 70-80%, ou encore un mélange de solutions de ce genre, constitue un composant principal du milieu de réaction.
L'expression conditions modérément acides désigne, dans le cas présent, des conditions dans lesquelles des acides organiques concentrés ou des solutions des acides minéraux s'emploient comme composant principal du milieu de réaction à des températures allant de — 30 à 30° C. Des exemples de conditions préférées dans ce cas sont l'emploi d'acide trifluoroacétique à 50-100% à une température de 0 à 30°C ou d'acide chlorhydrique 0,1-12N en solution aqueuse ou en solution dans un solvant organique, ou encore du HCl en solution dans des solvants organiques anhydres à une température de —20 à 10° C.
L'expression nitrite organique englobe les nitrites d'alcoyle disponibles sur le marché, par exemple le nitrite de butyle tertiaire, le nitrite d'isoamyle, etc.
L'expression base organique englobe, dans le cas présent, la triéthylamine, la N-éthylmorpholine, la N-éthyldiisopropylamine, etc.
L'expression base forte désigne, dans le cas présent, à la fois des bases organiques telles que décrites précédemment et des bases minérales fortes, notamment les hydroxydes et les carbonates de sodium et de potassium.
On obtient les nouveaux peptides sous la forme de la base libre ou d'un sel d'addition d'acide, soit directement grâce au procédé de la présente invention, soit en faisant réagir le peptide avec un ou plusieurs équivalents de l'acide approprié. Des exemples de sels préférés sont les sels avec des acides organiques, acceptables en pharmacie, par exemple les acides acétique, lactique, succinique, benzoïque, salicylique, méthanesulfonique ou toluènesulfonique, ainsi que des sels avec des acides polymères, comme l'acide tannique ou la carboxyméthylcellulose, et des sels avec des acides inorganiques, comme les acides halogénhydriques, par exemple l'acide chlorhydrique, ou bien l'acide sulfurique ou encore l'acide phosphorique. Il y a lieu de noter que les peptides comportent deux azotes basiques donnant des sels d'addition avec un et peut-être jusqu'à deux équivalents d'acide. Si on le désire, on convertit un sel d'addition d'acide particulier en un autre sel d'addition d'acide, par exemple un sel avec un acide acceptable en pharmacie, non toxique, par traitement avec la résine appropriée, échangeuse d'ions, de la manière décrite par R.A. Boissonas et consorts, « Helv. Chim. Acta», 43,1349 (1960). Des résines échangeuses d'ions appropriées sont les résines échangeuses de cations à base de cellulose, par exemple la carboxyméthylcellulose, ou des échangeurs de cations à base de dextrane, réticulés, chimiquement modifiés, par exemple les échangeurs du type Sephadex C, et les résines échangeuses d'anions fortement basiques, par exemple celles énumérées par J.P. Greenstein et M. Winitz dans «Chemistry of the Amino Acids», John Wiley and Sons, Inc., New York et Londres, 1961, vol. 2, p. 1456.
Les analogues de somatostatine de formule I donnent des sels complexes avec les ions métalliques lourds. Un exemple d'un complexe métallique lourd acceptable en pharmacie est un complexe formé avec le zinc ou avec de la zinc protamine.
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Les peptides produits par le procédé de l'invention, ainsi que leurs sels acceptables en pharmacie correspondants, sont intéressants car ils présentent l'activité pharmacologique du tétradécapeptide formé par la somatostatine naturelle. Leur activité est facilement démontrée dans des essais pharmacologiques, par exemple suivant la variante [A.V. Schally et consorts, «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 52,1314 (1973); J. Rivier et consorts, «C.R. Acad. Sci. Paris, Sér. D», 276, 2737 (1973)] de la méthode in vitro de M. Saffran et A.V. Schally, «Can. J. Biochem. Physiol.», 33,405 (1955).
L'activité des peptides de la formule I préparés suivant l'invention a également été démontrée in vivo en utilisant une variante de la méthode d'augmentation, provoquée par le pentobarbital, du taux d'hormone de croissance dans le plasma chez le rat, cette méthode ayant été décrite par Brazeau et consorts, citation précédente. Dans cet essai, les peptides préparés suivant l'invention montrent un taux d'activité qui est supérieur à celui de la somatostatine ou du même ordre de grandeur.
Les peptides obtenus selon le procédé de l'invention sont intéressants pour le traitement de l'acromégalie et des états apparentés d'hypersécrétion d'endocrine, ainsi que pour le traitement du diabète chez les mammifères; voir, par exemple, P. Brazeau et consorts, citation précédente. Lorsqu'on utilise les peptides ou leurs sels pour un tel traitement, on les administre à l'organisme, de préférence par voie parentérale, en combinaison avec un véhicule liquide, acceptable en pharmacie. Les peptides de la formule I ont un faible ordre de toxicité. La proportion du peptide ou de son sel est déterminée par sa solubilité dans le véhicule donné, par le véhicule lui-même ou par la voie choisie pour l'administration. Lorsqu'on utilise le peptide ou un sel de celui-ci en solution aqueuse stérile, cette solution peut également contenir d'autres produits dissous, tels que des tampons ou des agents de conservation, ainsi qu'une quantité suffisante de sels acceptables en pharmacie ou de glucose pour rendre la solution isotonique. La dose variera avec la forme d'administration et avec le cas particulier à traiter, cette dose étant de préférence maintenue à un taux de 1 (ig à 300 jxg/kg de poids de corps. Toutefois, pour atteindre des résultats efficaces, on utilise de manière particulièrement avantageuse une dose de l'ordre de 1 ng à 50 (ig/kg de poids de corps.
On peut également administrer les peptides ou leurs sels sous l'une des formes à longue durée d'action, à libération lente ou dépôt, que l'on décrit par la suite, de préférence par une injection intramusculaire ou par implantation. De telles formes de doses sont conçues pour libérer 0,1 à 50 ng/kg de poids de corps/j.
Il est souvent désirable d'administrer l'agent thérapeutique de façon continue sur des périodes prolongées de temps sous les formes à longue durée d'action, à libération lente ou dépôt. Ces formes peuvent contenir un sel acceptable en pharmacie du peptide, ayant un faible degré de solubilité dans les fluides du corps, par exemple l'un des sels décrits précédemment, ou bien elles peuvent contenir le peptide sous la forme d'un sel soluble dans l'eau, en même temps qu'un véhicule protecteur qui empêche une libération rapide. Dans ce dernier cas, par exemple, le peptide peut être formulé avec une gélatine partiellement hydrolysée, non antigène, sous la forme d'un liquide visqueux, ou bien le peptide peut être absorbé sur un véhicule solide, acceptable en pharmacie, par exemple de l'hydroxyde de zinc, ou bien encore on peut l'administrer en suspension dans un véhicule liquide acceptable en pharmacie; le peptide peut être aussi formulé en gels ou en suspensions avec un hydrocolloîde non antigène, protecteur, par exemple de la sodiumcarboxyméthylcellulose, de la polyvinylpyrrolidone, de l'alginate de sodium, de la gélatine, des acides polygalacturo-niques, par exemple la pectine, ou certains mucopolysaccharides, en même temps que des agents tensio-actifs, des agents de conservation et des véhicules liquides acceptables en pharmacie, aqueux ou non aqueux. Des exemples de formulations de ce genre se trouvent dans des publications pharmaceutiques classiques, par exemple dans «Pharmaceutical Sciences» de Remington, 14e éd., Mack
Publishing Co., Easton, Pennsylvanie, 1970. Une préparation à longue durée d'action, à libération lente, du peptide produit suivant le procédé de l'invention, peut également s'obtenir par une mise en microcapsules dans un enrobage acceptable en pharmacie, par exemple de la gélatine, de l'alcool polyvinylique ou de l'éthyl-cellulose. D'autres exemples de matières d'enrobage et de procédés utilisés pour la mise en microcapsules sont décrits par J.A. Herbig dans «Encyclopedia of Chemical Technology», vol. 13,2e éd., Wiley, New York 1967, pp. 436-456. Des formulations de ce genre, ainsi que des suspensions de sels du peptide, qui ne sont que faiblement solubles dans les fluides du corps, par exemple des sels avec l'acide pamoïque ou l'acide tannique, sont conçues pour libérer environ 1,0 à environ 100 |xg du composé actif/kg de poids de corps/j, l'administration se faisant de préférence par injection intramusculaire. A titre de variante, certaines des formes de doses solides énumérées précédemment, par exemple certains sels faiblement solubles dans l'eau ou des dispersions de sels du peptide dans des véhicules solides ou encore des produits d'adsorption de ces sels sur des véhicules solides, par exemple des dispersions dans un hydrogel neutre d'un polymère de méthacrylate d'éthylèneglycol ou de monomères similaires réticulés, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3551556, peuvent également être présentées sous la forme de pastilles libérant à peu près les mêmes quantités que celles données précédemment et peuvent être implantées par voie sous-cutanée ou par voie intramusculaire.
Le procédé suivant la présente invention sera illustré par les formes de mise en œuvre suivantes, dans lesquelles on prépare des peptides spécifiques de formule I.
a) Composés de formule I dans laquelle R1 = H—Gly—Gly—
Ala—Gly—NH—, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH —
ou H — leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH— et R2 =H ou COOH
L'ester alcoylique inférieur protégé d'alanyl-glycine, de préférence le Boc—Ala—Gly—OMe [décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta.», 57, 730 (1974)] est dissous dans de l'acide tri-fluoroacétique, et on maintient la solution à 0-10° C pendant environ 1 h, en prévoyant ensuite l'évaporation de l'acide trifluoroacétique pour obtenir le H—Ala—Gly—OMe sous la forme de son sel d'addition d'acide trifluoroacétique, que l'on peut, si on le désire, convertir à la forme de la base libre et utiliser sous cette dernière forme.
D'autres réactifs de scission pour l'enlèvement du groupe protecteur Boc sont l'acide bromhydrique dans de l'acide acétique, des solutions alcooliques d'acide chlorhydrique, etc. Le composé obtenu, mentionné en dernier lieu, est dissous dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide, et on refroidit la solution résultante jusqu'à environ 0-10° C. On ajoute à la solution un excès, de préférence de 1,1 à 1,3 équivalent, d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine; la solution a alors un pH d'environ 8. On ajoute pratiquement un équivalent d'un ester activé protégé de glycine, de préférence Boc—Gly—OTcp [décrit par J. Pless et R.A. Boissonnas, «Helv. Chim. Acta», 46, 1609 ( 1963)] et on maintient le mélange de réaction à environ 0-20° C pendant environ 2 j. On évapore le solvant et on cristallise le reste pour obtenir l'ester alcoylique inférieur protégé de glycyl-alanyl-glycine, de préférence Boc—Gly—Ala—Gly—OMe, qui, par traitement avec de l'acide trifluoroacétique de la manière mentionnée précédemment, donne l'ester alcoylique inférieur du tri-peptide glycyl-alanyl-glycine, de préférence H—Gly—Ala—Gly— OMe, sous la forme du sel d'addition d'acide trifluoroacétique, que l'on peut, si on le désire, convertir à la forme de la base libre. On fait réagir ce dernier tripeptide avec du Boc—Gly—OTcp de la manière mentionnée précédemment pour obtenir l'ester alcoylique inférieur protégé de glycyl-glycyl-alanyl-glycine, de préférence Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe, qui par traitement avec de l'acide trifluoroacétique de la manière mentionnée précédemment, donne l'ester alcoylique inférieur de glycyl-glycyl-alanyl-glycine, de préférence H —Gly—Gly—Ala—Gly —OMe, sous la forme de son sel d'addition d'acide trifluoroacétique, et qui, si on le
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Le tétrapeptide débarrassé de sa protection, mentionné ci-dessus, H —Gly—Gly—Ala—Gly—OMe, de préférence sous la forme du sel d'addition d'acide trifluoroacétique, est mis en réaction avec un ester activé protégé de leucine, de préférence de l'ester 1-benzotriazolylique de t-butyloxycarbonyl-leucine, en combinant, à environ 0-15° C dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide, le tétrapeptide précédent, débarrassé de sa protection, environ 1,5 à 2 équivalents de Boc—Leu—OH,
environ 1,5 à 2 équivalents de 1-hydroxybenzotriazole, environ 1,5 à 2,5 équivalents de dicyclohexylcarbodiimide, et un excès d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine, pour amener le pH de la solution à environ 8. On maintient le mélange résultant à environ 0-15°C pendant 20 à 30 h. La séparation du précipité, l'évaporation du filtrat et une cristallisation donnent l'ester alcoylique inférieur protégé de leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine, de préférence Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe.
Le tétrapeptide mentionné précédemment, de formule Boc— Gly—Gly—Ala—Gly—OMe et les pentapeptides des formules Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe et Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—OMe seront désignés ci-après par R5—Gly— Gly—Ala—Gly—OMe, où R5 désigne Boc, Boc—Gly et Boc—Leu respectivement.
Ces derniers composés de formule R5—Gly—Gly—Ala— Gly—OMe, où R5 a la définition donnée, sont aisément transformés en les hydrazides correspondants par réaction avec un excès (20 à 50 équivalents molaires) d'hydrate d'hydrazine. Des conditions préférées sont un traitement de ces derniers esters dans un solvant organique inerte, par exemple du méthanol, du n-butanol ou du diméthylformamide, avec 40 à 50 équivalents molaires d'hydrate d'hydrazine à une température de 0-30° C, pendant environ 2 h à environ 1 j. La séparation du solvant et de l'excès d'hydrate d'hydrazine donne l'hydrazide de peptide protégé en amino correspondant de formule IX:
R5—Gly—Gly—Ala—Gly—NHNH2 (IX)
où R5=Boc, Boc—Gly ou Boc—Leu.
Le peptide mentionné précédemment de formule IX et un penta-peptide de formule H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe— OMe (décrit par H.U. Immer et consorts, citation précédente) sont combinés suivant la méthode de combinaison à l'azide pour donner le peptide de formule R5 —Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt) — Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe.
Un procédé commode et efficace pour cette phase opératoire comprend la dissolution du peptide de formule IX dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide ou un mélange de diméthylformamide et de sulfoxyde de diméthyle. Une solution d'environ 2 à 5 équivalents molaires, de préférence 3 équivalents molaires, d'un acide minéral fort dans un solvant organique, de préférence de l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle, est ajoutée à la dernière solution mentionnée à une température de —20 à —10° C, de préférence à environ — 15°C, et on ajoute à la solution agitée, un nitrite organique, de préférence du nitrite de t-butyle (1 à 1,5 équivalent molaire, de préférence 1,2 équivalent). Après environ 15 mn à une température de —20 à 0°C, on rend le mélange alcalin, de préférence jusqu'à un pH de 7-7,5, avec un excès d'une base organique, de préférence de la N-éthyldiisopropylamine, avec ensuite addition d'environ 1 équivalent du penta-peptide mentionné précédemment. Une addition complémentaire de la base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine, peut être faite pour rendre le mélange légèrement alcalin. On agite alors le mélange de réaction à une température de —10 à0°C pendant 1 à 2 h, et ensuite à 20-30° C pendant 20 à 30 h. L'évaporation du solvant,
la reprise du reste dans un solvant organique, de préférence du méthanol, l'addition à un solvant dans lequel une précipitation se développe, de préférence de l'eau ou de l'éther diéthylique, et la récolte du précipité donnent le peptide mentionné précédemment de la formule R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)— Asn—Phe—Phe—OMe.
En résumé, le fragment de pentapeptide requis s'obtient facilement en faisant réagir un ester activé de Boc—Phe—OH avec du H—Phe—OMe, pour obtenir du Boc—Phe—Phe—OMe, qui, après séparation du groupe protecteur terminal (Boc) sous des conditions modérément acides, donne le H—Phe—Phe—OMe. A son tour, on fait réagir ce dernier composé avec un ester activé de Boc—Asn—OH pour obtenir le Boc—Asn—Phe—Phe—OMe. La séparation ultérieure du groupe protecteur d'amino terminal du dernier composé mentionné sous des conditions modérément acides donne le tripeptide H—Asn—Phe—Phe—OMe.
On utilise ensuite ce dernier composé pour obtenir le fragment de pentapeptide désiré en faisant réagir ce tripeptide avec un ester activé de Z—Lys(Boc)—OH pour obtenir le Z—Lys(Boc)—Asn— Phe—Phe—OMe, en hydrogénant ce dernier composé en présence d'un catalyseur de métal noble pour obtenir le H—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—Orne, en condensant ce dernier composé avec un ester activé de Trt—Cys(Trt)—OH pour obtenir le Trt—Cys(Trt) — Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe, et en séparant le groupe N-protecteur terminal (Trt) du dernier composé mentionné sous des conditions faiblement acides pour obtenir le pentapeptide désiré H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe.
En revenant maintenant à la préparation des composés des formules I, l'ester de peptide mentionné ci-dessus, R5—Gly—Gly— Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe,
où R5 a la définition donnée, est transformé en l'hydrazide correspondant par réaction avec un excès d'hydrate d'hydrazine de la même manière que décrit précédemment pour obtenir l'hydrazide de peptide de formule IVa, R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys-(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH2, où R5 a la définition donnée, que l'on peut aussi écrire sous la forme du peptide de formule IV, dans lequelle R4 représente Boc—Gly—Gly—Ala— Gly-NH, Boc—Gly—Gly—Gly — Ala—Gly—NH ou Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH.
Dans la synthèse du produit de départ pour le procédé de l'invention, le dernier composé mentionné de formule IV et un peptide de formule V, H—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu1)—Phe—Thr(Bu')— Ser(Bu')—NHCH(R2)CH2S—Trt, où R2 représente H ou COOH, sont combinés suivant la méthode de combinaison à l'azide, pour donner le peptide linéaire de formule Ha, R5 —Gly—Gly—Ala— Gly—Cys(Trt)—Ly s(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Ly s(Boc)— Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH(R2)CH2S - Trt, où R5 a la définition donnée et R2 représente H ou COOH, que l'on peut encore écrire sous la forme du peptide linéaire de formule II, dans laquelle R2 représente H ou COOH et R4 représente Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, Boc-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly—NH ou Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH.
Un procédé commode et efficace pour cette phase opératoire suppose la dissolution de l'hydrazide de peptide de formule IVa dans du diméthylformamide. A cette dernière solution, on ajoute une solution d'environ 2 à 5 équivalents molaires, de préférence de 3 équivalents molaires, d'un acide minéral fort dans un solvant organique, de préférence du HCl dans de l'acétate d'éthyle, à une température de — 20 à — 10° C, de préférence à environ — 15° C, et on ajoute à la solution agitée du nitrite de t-butyle (1 à 1,5 équivalent molaire, de préférence 1,2 équivalent). Après environ 15 mn à une température de — 20 à 10° C, on ajoute une solution d'environ 1 équivalent du peptide de formule V et d'une base organique, de préférence 3 à 5 équivalents de N-éthyldiisopropylamine, dans du diméthylformamide refroidi à environ — 15°C.
On agite alors le mélange de réaction à une température de —20 à 0°C pendant 1 à 2 h, et ensuite à 20-30° C pendant 15 à 25 h. L'évaporation du solvant, la trituration du reste avec de l'eau,
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du méthanol ou un mélange de méthanol et d'acide citrique aqueux (2 à 5%) et la séparation de la matière solide donnent le peptide linéaire mentionné précédemment de formule lia que l'on peut utiliser sans autre purification pour la phase suivante, présentée ci-après.
En résumé, le peptide mentionné ci-dessus de formule V, H—Trp — Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')— NHCH(R2)CH2S—Trt, où R2 représente COOH, que l'on peut encore écrire sous la forme de l'heptapeptide de formule Va, H - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -Cys(Trt)-OH, décrit par H.U. Immer et consorts, citation précédente, ainsi que dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3917578 délivré le 4 novembre 1975, s'obtient facilement en faisant réagir de l'ester méthylique de O-t-butylsérine avec un ester activé de benzyloxycarbonyl-{0-t-butyl)thréonine pour obtenir le Z—Thr(Bu')—Ser(Bu') —OMe. Le groupe protecteur d'amino terminal (Z) de ce dernier composé est ensuite séparé par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble pour donner le H—Thr(Bu')—Ser(Bu')—Ser(Bu')—OMe.
On fait ensuite réagir l'ester méthylique susdit avec un ester activé de Z—Phe—OH pour obtenir le Z—Phe—Thr(Bu')— Ser(Bu')—OMe, duquel on sépare ensuite le groupe protecteur d'amino terminal (Z) par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble pour obtenir le H—Phe—Thr(Bu')— Ser(Bu')—OMe. On fait ensuite réagir ce dernier ester de tripeptide avec un ester activé de Z—Thr(Bu')—OH pour obtenir le Z—ThrfBu')—Phe—Thi^Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—OMe. A nouveau, le groupe protecteur d'amino terminal (Z) de ce dernier composé est séparé par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble pour donner le Z—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu') — Sei^Bu')—OMe. On fait réagir ce dernier composé avec un ester activé de Z—Lys(Boc)—OH pour obtenir le Z—Lys(Boc)— Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—OMe, avec ensuite séparation du groupe protecteur d'amino terminal (Z) de ce dernier composé par hydrogénation en présence d'un catalyseur de métal noble pour obtenir le H—Lys(Boc)—Thr(Bu') —Phe—Thr(Bu1)— Ser(Bu')—OMe. On fait alors réagir ce dernier composé avec un ester activé de Ddz—Trp—OH pour obtenir le Ddz—Trp— Lys(Boc)—Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - OMe que l'on fait réagir, à son tour, avec de l'hydrate d'hydrazine, de manière à isoler l'hydrazide d'hexapeptide correspondant, Ddz—Trp—Lys-(Boc) - Thr(Bu') - Phe - ThitBu') - Ser(Bul) - NHNH2. . On combine alors cet hexapeptide avec du H —Cys(Trt)—OH suivant la méthode de combinaison à l'azide pour obtenir l'heptapeptide correspondant, Ddz—Trp — Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe— Thr(Bu')—Ser(Bu')—Cys(Trt)—OH. Le traitement de ce dernier composé sous des conditions faiblement acides donne l'heptapeptide désiré de formule Va ou le peptide de formule V, dans laquelle R2 représente COOH.
En résumé, le peptide mentionné ci-dessus de formule V, dans laquelle R2 représente H, décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3917581 délivré le 4 novembre 1975, s'obtient facilement en combinant l'hydrazide d'hexapeptide décrit précédemment de formule Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe— Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHNH2 avec de la 2-tritylthioéthylamine suivant la méthode de combinaison à l'azide, décrite précédemment, pour obtenir l'hexapeptide correspondant de formule Ddz - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bul) - Ser(Bu') -NHCH2S—Trt. Ce dernier composé, lorsqu'on le fait réagir sous des conditions faiblement acides, donne le peptide de formule V, dans laquelle R2 représente H, sous la forme du sel d'addition d'acide formique que l'on convertit, si on le désire, à la forme de la base libre.
A titre de variante, le peptide linéaire décrit précédemment de formule lia se prépare aisément de la manière suivante.
L'ester alcoylique inférieur protégé du pentapeptide de formule Trt—Cys(Trt) — Lys(Boc) — Asn — Phe—Phe—OMe, décrit précédemment, est aisément transformé en l'hydrazide correspondant par réaction avec un excès d'hydrate d'hydrazine. Les conditions préférées sont le traitement de cet ester dans un solvant inerte, par exemple du méthanol, du butanol ou du diméthylformamide, avec 20 à 40 équivalents molaires .d'hydrate d'hydrazine à une température de 0 à 30° C pendant 1 à 2 j. La séparation du solvant et une cristallisation donnent l'hydrazide de pentapeptide correspondant de formule VI, Trt—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe—NHNH2.
On combine ce dernier composé et le peptide de formule V, dans laquelle R2 représente H ou COOH, suivant la méthode de combinaison à l'azide, de la manière décrite précédemment, pour obtenir le peptide correspondant de formule VII, Trt—Cys(Trt) — Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')— Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHCH(R2)CH2S—Trt, où R2 représente H ou COOH, avec ensuite séparation du groupe N-protecteur terminal (Trt) de ce dernier composé de formule VII en vue d'obtenir le peptide correspondant de formule VIII, H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc) — Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHCH(R2)CH2S—Trt, dans laquelle R2 représente H ou COOH. La séparation du groupe protecteur (Trt) se réalise aisément sous des conditions faiblement acides. Les conditions préférées sont la dissolution du peptide de formule VII dans un mélange de 5 à 15% d'acide formique dans 60 à 80% d'acide acétique, en laissant reposer la solution à 20-30° C pendant 3 à 10 h. Une concentration de la solution donne le peptide de formule VIII, dans laquelle R2 représente H ou COOH, sous la forme de son sel d'addition d'acide formique, que l'on convertit, si on le désire, à la forme de la base libre.
Ce dernier composé de formule VIII et un hydrazide de peptide de formule IX, dans laquelle R5 a la définition donnée, sont combinés suivant la méthode de combinaison à l'azide de la manière décrite précédemment, pour donner le peptide linéaire correspondant de formule Ha ou de formule II, où R2 représente H ou COOH et R4 représente Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH—, Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH— ou Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—NH —.
La conversion de ce dernier peptide linéaire de formule II, obtenue par l'un ou l'autre des procédés décrits précédemment, en le composé correspondant de formule I se réalise de façon commode et efficace en soumettant d'abord le peptide linéaire de formule II à l'action de l'iode, de préférence en présence d'un alcanol inférieur ou d'acide acétique, de sorte qu'il se développe une séparation des groupes protecteurs de sulfhydryle, c'est-à-dire Trt, et en même temps la formation du pont de disulfure, pour donner le dérivé de disulfure cyclique correspondant de formule III:
SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys(Boc) -
Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH(R2)CH2S (III)
où R2 = H ou COOH et R4=Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NH, Boc—Gly—Gly—Giy—Ala—Gly—NH ou Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—NH. Ce dernier composé de formule III, où R2=COOH et R4=Boc—Gly—Gly—Ala—Gly — NH,
Boc—Gly — Gly—Gly—Ala—Gly—NH ou Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—NH peut encore être écrit sous la formule Illa :
R5—Gly—Gly—Ala—Gly—C ys — Lys(Boc) — Asn—Phe—Phe—
I !
Trp—Lys(Boc)—Thr(Bul) — Phe—Thr(Bul)—Ser(Bul—Cys — OH (Illa)
où Rs a la définition déjà donnée.
Le traitement ultérieur du composé de formule III, dans laquelle R2 représente H ou COOH et R4 représente Boc—Gly—Gly— Ala-Gly-NH, Boc - Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-NH ou Boc—Leu —Gly—Gly—Ala—Gly—NH sous des conditions modérément acides sépare les groupes protecteurs restants (c'est-à-dire Boc et Bu1) pour donner le composé correspondant de for-
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mule I, dans laquelle R1 représente H —Gly—Gly—Ala—Gly— NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH ou H—Leu—Gly— Gly—Ala-Gly-NH et R2=H ou COOH.
Dans une forme de réalisation préférée de la transformation précédente, le peptide linéaire de formule II est dissous dans de l'acide acétique ou du méthanol, de l'éthanol ou un autre alcanol inférieur approprié, par exemple du propanol, de l'isopropanol ou du butanol, et on ajoute la solution à un excès d'iode (5 à 25 équivalents molaires, de préférence 10) dissous dans l'un des solvants mentionnés précédemment, de préférence 2 à 5% d'iode dans du méthanol. La durée et la température de cette réaction ne sont pas critiques; toutefois, il est désirable de maintenir la réaction entre 0 et 30° C en réglant l'addition de la solution d'iode ou en refroidissant le mélange de réaction, ou encore en prévoyant une combinaison de ces deux solutions. Sous ces conditions, l'addition prend habituellement 30 à 60 mn. Après l'addition, on agite le mélange à 20-30°C pendant 30 à 120 mn, de préférence pendant 60 mn. On refroidit ensuite le mélange à environ 0° C et on ajoute un excès d'un agent réducteur modéré, de préférence du thiosulfate de sodium en solution aqueuse. On concentre le mélange et on met en suspension le reste dans de l'eau. La récolte de la matière solide donne le dérivé de disulfure cyclique correspondant désiré de formule Illa, dans laquelle les groupes protecteurs Boc et Bu' sont encore présents.
A titre de variante, le peptide linéaire de formule Ha peut être converti en le dérivé de disulfure cyclique correspondant mentionné ci-dessus de formule Illa, par la méthode de R.G. Hiskey et R.J. Smith, «J. Amer. Chem. Soc.», 90,2677 (1968) en utilisant du thiocyanogène.
Finalement, le dérivé de disulfure cyclique ci-dessus de formule Illa est transformé en le peptide correspondant de formule I en soumettant ce composé de formule Illa à des conditions modérément acides, de sorte que les groupes protecteurs restants du dérivé de disulfure cyclique sont séparés. Généralement, cette phase est réalisée en dissolvant le dérivé de disulfure cyclique dans un milieu de réaction aqueux contenant un acide organique à 0-20° C pendant 10 à environ 60 mn. Des exemples de milieux de ce genre sont l'acide trifluoroacétique, l'acide sulfurique aqueux à 10-20%, l'acide phosphorique à 10%, l'acide bromhydrique à 10-30% et l'acide chlorhydrique à 10-36%. Un milieu extrêmement intéressant est constitué par de l'acide chlorhydrique concentré. Les conditions préférées pour cette phase sont la dissolution du disulfure cyclique dans un minimum d'acide chlorhydrique concentré refroidi à 0°C et l'agitation du mélange à 0°C pendant 5 à 10 mn sous une atmosphère d'azote. On ajoute ensuite de l'acide acétique glacial (10 volumes) et on refroidit la solution jusqu'à environ — 70° C, puis on lyophilise pour obtenir le peptide cyclique de formule I. On purifie ensuite ce dernier composé par une Chromatographie à échange d'ions, de préférence en utilisant un échangeur de cations à base de carboxyméthylcellulose et de l'acétate d'ammonium comme éluant. Dans ce cas, on obtient le produit sous la forme de son sel d'addition d'acide avec de l'acide acétique. A titre de variante, on purifie le produit par une Chromatographie de partage sur du dextrane réticulé, chimiquement modifié, par exemple du Sephadex LH-20 ou du Sephadex G-25, en utilisant respectivement du méthanol ou de l'acide acétique comme solvant d'élution. Dans le cas où on utilise du Sephadex LH-20 et du méthanol comme solvant d'élution, on obtient le produit sous la forme de son sel d'addition d'acide chlorhydrique. Dans le cas où on utilise du Sephadex G-25 et de l'acide acétique, le produit s'obtient sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique. Une lyophilisation répétée du produit sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique donne un peptide essentiellement pur de formule I, dans laquelle R1 représente H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH ou H—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—NH et R2 représente H ou COOH, sous la forme de la base libre.
b) Composés de formule I dans laquelle R1 représente H ou NHR3,
où R3 a la définition donnée précédemment, et R2 représente H
L'hydrazide de peptide requis de formule IV, Trt - SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe- Phe - NHNH2, dans laquelle R4 représente NHR3, où R3 a la définition donnée, que l'on peut encore écrire sous forme de la formule IVb, R3 - Cys(Trt) - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - NHNH2, dans laquelle R3 a la définition donnée précédemment, se prépare par acylation du pentapeptide de formule H—Cys(Trt)—Lys(Boc) — Asn—Phe—Phe—OMe, pour obtenir le pentapeptide de formule R3—Cys(Trt) —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe, que l'on soumet à hydrazinolyse pour obtenir le dérivé de pentapeptide de formule IV, dans laquelle R4 représente NHR3.
Dans une forme de mise en œuvre préférée de la préparation de l'hydrazide de pentapeptide IVb précédent, on traite un mélange de quantités pratiquement équimolaires d'une base organique, de préférence de la N-éthylmorpholine, et du pentapeptide de formule H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe,
préparé comme décrit par H.U. Immer et consorts, citation précédente, dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne, à environ 0-10° C, avec un excès, de préférence 1,2 à 2 équivalents molaires, de l'acylate ou benzoate de p-nitrophényle désiré, par exemple de l'acétate de p-nitrophényle, préparé comme décrit par F.D. Chattaway, «J. Chem. Soc.», 2495 (1931). On conserve le mélange à 0-10° C pendant environ 15 à 30 h et on le soumet à évaporation. On reprend le reste dans un solvant organique polaire, de préférence du méthanol, et on ajoute lentement à un solvant organique non polaire, de préférence de l'éther diéthylique. On récolte le reste et on cristallise pour obtenir le pentapeptide acylé ou benzoylé correspondant, par exemple le pentapeptide de formule R3 — Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe, dans laquelle R3 a la définition donnée précédemment. On dissout ce dernier composé dans un solvant organique inerte, par exemple du méthanol, de l'éthanol, du diméthylformamide, etc., de préférence du méthanol. On traite la solution avec un excès d'hydrate d'hydrazide, par exemple 15 à 30 équivalents molaires. On maintient le mélange de réaction à environ 0-10° C pendant environ 40 à 60 h. On récolte le précipité et on sèche pour obtenir l'hydrazide de pentapeptide de formule IV, dans laquelle R4 représente NHR3, où R3 a la définition donnée, ou de formule IVb, dans laquelle R3 a la définition donnée.
L'hydrazide de peptide requis, à savoir le tétrapeptide de formule IV, Trt - S - CH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe -Phe—NHNH2, dans laquelle R4 représente de l'hydrogène, se prépare en faisant réagir un ester activé d'acide 3-tritylthio-propionique avec un tétrapeptide de formule H —LysfBocJ-Asn—Phe—Phe—OMe, pour obtenir le tétrapeptide de formule Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe,
que l'on soumet à hydrazinolyse pour obtenir l'hydrazide de tétrapeptide précité de formule IV, dans laquelle R4 représente de l'hydrogène.
Dans une forme de mise en œuvre préférée de la préparation de l'hydrazide de tétrapeptide précité, on prépare l'ester activé d'acide 3-triltylthiopropionique, de préférence l'ester penta-chlorophénylique, en combinant des quantités pratiquement équimolaires d'acide 3-tritylthiopropionique, de pentachlorophénol et de dicyclohexylcarbodiimide, dans un solvant organique inerte, de préférence du tétrahydrofuranne, à environ 0-10° C. On agite le mélange à environ 0-10°C pendant environ 1 h et ensuite à environ 20-30° C pendant environ 1 h. On refroidit alors le mélange jusqu'à environ 0° C, ón filtre, et on évapore le filtrat. On cristallise le reste pour obtenir de l'ester pentachlorophénylique d'acide 3-tritylthiopropionique. Une solution de ce dernier composé et d'une quantité pratiquement équimolaire du tétrapeptide de formule H—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe acétate, décrit ci-dessus sous a), dans un solvant organique inerte, de préférence du diméthylformamide ou du tétrahydrofuranne, est traitée avec une quantité
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pratiquement équimolaire d'une base organique, de préférence de la triéthylamine, à environ 20-30° C. On agite le mélange pendant 2 à 3 j à environ 20-30° C et on évapore le solvant sous pression réduite. On triture le reste avec de l'acide citrique aqueux dilué froid et de l'eau, on sèche et on cristallise pour obtenir le tétrapeptide de formule Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc) — Asn—Phe—Phe—OMe. On dissout ce dernier composé dans un solvant organique inerte, par exemple du méthanol, de l'éthanol ou, de préférence, du diméthylformamide. On traite la solution avec un excès d'hydrate d'hydrazine, par exemple 15 à 30 équivalents molaires. On conserve le mélange de réaction à environ 20-30° C pendant environ 20 à 30 h et on évapore sous pression réduite. On triture le reste à l'eau froide et on sèche pour obtenir l'hydrazide de tétrapeptide de formule IV, dans laquelle R4 représente H.
Dans la synthèse des produits de départ pour le procédé de l'invention, le premier hydrazide de peptide ci-dessus, de formule IV dans laquelle R4 représente H ou NHR3, et le second peptide de formule V, H—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')— Ser(Bu')—NHCH2CH(R2)S—Trt, dans laquelle R2 représente H, décrit ci-dessus sous a), sont combinés suivant la méthode de combinaison à l'azide, décrite précédemment, pour obtenir le peptide linéaire correspondant de formule II, dans laquelle R2 représente H et R4 représente H ou NHR3.
La conversion de ce dernier peptide linéaire mentionné de formule II en le composé correspondant de formule I se réalise de façon commode et efficace en soumettant d'abord ce peptide linéaire de formule II à l'action de l'iode, de préférence en présence de méthanol [comme décrit précédemment pour la préparation du dérivé de disulfure cyclique de formule III, sous a)], de sorte qu'il se produit la séparation du groupe protecteur sulfhydryle, c'est-à-dire Trt, et la formation du pont de disulfure, ce qui donne le dérivé de disulfure cyclique correspondant de formule III, dans laquelle R2 représente H et R4 représente H ou NHR3, où R3 a la définition donnée précédemment. Ce dernier composé de formule III, où R4 représente NHR3, peut encore s'écrire sous la forme du composé Illb, à savoir R3—C ys—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—Trp—Thr—(Bu1)—
Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') ~ NH - CH(R2)CH2 S (IHb),
où R2 représente H et R3 a la définition donnée.
Un traitement ultérieur de ce dernier composé de formule III, dans laquelle R2 représente H et R4 représente H ou NHR3, sous des conditions modérément acides, c'est-à-dire en utilisant de préférence de l'acide chlorhydrique concentré refroidi jusqu'à environ 0°C [comme décrit précédemment pour la préparation du peptide cyclique de formule I sous a)], sépare les groupes protecteurs restants (c'est-à-dire Boc et Bu') pour donner le peptide correspondant de formule I, dans laquelle R1 représente H ou NHR3, où R3 a la définition donnée et R2 représente H, sous la forme de la base libre ou du sel d'addition d'acide.
c) Composés de formule I dans laquelle R1 représente
Boc—Ala—Gly—NH et R2 = COOAlk
Le premier hydrazide de peptide requis de formule IV, dans laquelle R4 représente Boc—Ala—Gly—NH, que l'on peut encore écrire sous forme d'un heptapeptide de formule IVc, Boc—Ala— Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH2, a été décrit par H.U. Immer et consorts, citation précédente.
Le second peptide requis de formule V, dans laquelle R2 représente COOAlk, que l'on peut encore écrire sous la forme d'un ester d'heptapeptide de formule Vb, H—Trp—Lys(Boc) —
Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - Cys(Trt) - COOAlk, se prépare aisément de la manière suivante.
L'heptapeptide de formule Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu') —Ser(Bu')—Cys(Trt)—OH [décrit précédemment sous a)] en solution dans un solvant inerte est mis en réaction avec un diazoalcane de la formule (Alk moins H)N2 en solution dans un solvant inerte à des températures de 0 à 20° C sur des périodes de
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temps de 1 à 48 h, avec ensuite évaporation des solvants et de l'excès de diazoalcane, séparation du groupe protecteur Ddz, et purification pour obtenir l'ester d'heptapeptide correspondant de formule Vb.
Des diazoalcanes intéressants à cet effet sont, par exemple, le diazométhane, le diazoéthane [von Pechmann, «Ber. Deutsch. Chem. Ges.», 31, 2640 (1898)], le 1-diazopropane [Niedlinger et consorts, «Am. Chem. J.», 43, 378 (1910)], le 2-diazopropane [Staudinger et consorts, «Ber. Deutsch. Chem. Ges.», 49,1905 (1916)], le 1-diazobutane [Niedlinger et consorts, citation précédente, p. 380], le 1-diazo-isobutane [Adamson et consorts, «J. Chem. Soc.», 1935, 286], le 4-diazo-2-méthylbutane [Werner, «J. Chem. Soc.», 115,1101 (1919)], le 1-diazopentane, le 1-diazo-hexane, le 1-diazoheptane ou le 1-diazooctane, les quatre derniers diazoalcanes étant préparés comme décrit par Adamson et consorts, citation précédente. Les solvants inertes préférés sont les alcanols, tels que le méthanol, et les éthers, comme l'éther diéthylique.
A titre de variante, et en particulier lorsqu'on désire obtenir le peptide de formule I, où R1 représente H —Ala—Gly—NH et R2 =COOAlk, où le groupe alcoyle (Alk) contient de 9 à 14 atomes de carbone, on fait réagir de la cystéine avec un excès molaire de l'alcanol approprié, AlkOH, où Alk a la définition précédente, en présence de HCl à 25-120° C, de préférence à 100-120° C, pendant 1 à 5 h, pour obtenir le chlorhydrate d'ester alcoylique de cystéine correspondant. On traite ensuite ce dernier composé avec environ 1 équivalent molaire de triphénylcarbinol en présence de 0,1-1 équivalent molaire d'éthérate de trifluorure de bore à 10-30°C pendant 0,5-3 h, de préférence avec 0,1 équivalent molaire à 25° C pendant 1 h, en vue d'obtenir l'ester alcoylique correspondant, H—Cys(Trt)—OAlk.
Ce dernier ester alcoylique d'une cystéine protégée est alors combiné, grâce à la méthode à l'azide, avec l'hydrazide d'hexapeptide protégé de formule Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu') —Ser(Bu')—NHNH2, décrit précédemment sous a), pour obtenir, après séparation du groupe protecteur Ddz sous des conditions faiblement acides, le second ester d'heptapeptide désiré de formule Vb. Des conditions préférées pour la séquence susdite de réactions englobent l'utilisation de proportions pratiquement équimolaires de cet hydrazide d'hexapeptide protégé et de nitrite de t-butyle en présence d'un acide minéral, de préférence de 2 à 3 équivalents molaires de HCl, dans un solvant anhydre inerte, de préférence du diméthylformamide, avec ensuite l'addition de l'ester alcoylique approprié de la formule H—Cys(Trt) —OAlk, avec 2 à 3 équivalents molaires d'une base organique, de préférence de la N-éthyldiisopropylamine, dans un solvant anhydre inerte, de préférence du diméthylformamide, à une température de —20 à 25° C pendant 6 à 12 h, cette opération étant suivie par une purification de l'ester alcoylique d'heptapeptide protégé résultant de formule Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu') — Ser(Bu') — Cys(Trt)—OAlk.
On soumet alors ce dernier composé à des conditions faiblement acides, de préférence par agitation dans un mélange d'acide acétique, d'acide formique et d'eau (7/1/2) pendant 12 à 18 h à 20-25° C, pour obtenir l'ester alcoylique d'heptapeptide correspondant de formule Vb.
Dans la synthèse des produits de départ du procédé suivant l'invention, le premier hydrazide de peptide ci-dessus de formule IVc et le second ester d'heptapeptide de formule Vb sont combinés suivant la méthode à l'azide, décrite précédemment, pour obtenir le peptide linéaire correspondant de formule II, dans laquelle R4=Boc—Ala—Gly—NH et R2=COOAlk, que l'on peut également écrire sous la forme du tétradécapeptide linéaire de formule Ile Boc—Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn — Phe— Phe - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -Cys(Trt)—OAlk.
La conversion du tétrapeptide linéaire précédent de formule Ile en le composé correspondant de formule I, dans laquelle R1 = H—Ala—Gly—NH et R2 = COOAlk, se fait de façon commode et efficace en soumettant d'abord le dernier tétradéca-
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peptide linéaire mentionné à l'action de l'iode, de préférence en présence de méthanol [comme décrit précédemment pour la préparation du dérivé de disulfure cyclique de formule III sous a)], de sorte qu'il se produit une séparation du groupe protecteur de sulfhydryle, c'est-à-dire Trt, et la formation du pont de disulfure, pour former le dérivé de disulfure cyclique correspondant de formule III, dans laquelle R2 = COOAlk et R4=Boc—Ala—Gly— NH, que l'on peut encore écrire sous la forme du dérivé de disulfure cyclique de formule IIIc:
Boc—Ala—Gly—C ys—Ly s(Boc)—Asn — Phe—Phe—Trp—
Lys(Boc)—Thr(Bu') -phe—ThrfBu') - Ser(Bul)—Cys - OAlk.
Le traitement ultérieur de ce dernier composé sous des conditions modérément acides, de préférence avec de l'acide chlorhydrique concentré refroidi jusqu'à environ 0°C [comme décrit précédemment pour la préparation du peptide cyclique de formule I sous a)] sépare les groupes protecteurs restants (c'est-à-dire Boc et Bu'), et une purification complémentaire, telle que décrite sous a), donne le peptide de formule I, dans laquelle
R1 =H—Ala—Gly—NH et R2=COOAlk, que l'on peut écrire également sous forme de la formule:
H - Ala - Gly - Cys- Lys—Asn - Phe—Phe -
5 I !
Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—Cys—OAlk,
et ce sous la forme de la base libre ou d'un sel d'addition d'acide de celle-ci.
Dans le procédé précédent décrit sous c), le groupe protecteur 10 Bu' pour le radical hydroxyle de la sérine et de la thréonine peut être omis sans effets néfastes, c'est-à-dire que Ser(Bu') et Thr(Bu') sont remplacés par Ser et Thr respectivement. En ce qui concerne encore le procédé suivant c), le groupe protecteur Trt des restes d'aminoacide de cystéine peut être remplacé par le groupe pro-15 tecteurAcm.
Les procédés décrits ci-dessus sous a) à c) sont représentés par les schémas suivants de réactions:
a) R1 =H—Gly—Gly—Ala—Gly—NH, H—Gly—Gly—Gly— 20 Ala—Gly—NH et H—leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH et R2=H ou COOH
R5—Gly—Gly—Ala—Gly—Cy s—Lys—Asn—Phe—Phe Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—NHCH(R2)CH2S—Trt
IVa
Ila-» Illa-» I
b) R1 =H ou NHR3 et R2=H
Trt-SCH2CH2CH(R4)CO-Lys-Asn-Phe-Phe Trp - Lys - Thr - Phe - Thr - Ser - NHCH(R2)CH2S - Trt IV
1
II->III-
c) R1 =H—Ala—Gly—NH et R2 = COOAlk
Boc—Ala—Gly—Cys — Lys—Asn—Phe—Phe Trp—Lys—Thr — Phe—Thr—Ser—Cys—OAlk
IVc
T
Vb
IIc->IIIc-»I
Finalement, il sera évident, pour les spécialistes en ce domaine, que des groupes protecteurs d'amino, hydroxy ou thiol équivalents, des procédés équivalents de combinaison de fragments de peptides et des procédés équivalents de séparation des groupes protecteurs d'amino, hydroxy ou thiol, autres que ceux décrits précédemment, peuvent s'utiliser dans les formes de mise en œuvre de la présente invention sans sortir pour autant du cadre de celle-ci.
Le schéma suivant les exemples illustrent encore plus complètement l'invention.
Peptide linéaire II /
Oxydation
Dérivé de disulfure Oxydation cyclique (III) ' )
| Réduction
Suppression de protection
Peptide (I)
Préparation 1 :
Trifluoroacétate d'ester méthylique d'alanyl-glycine {H-Ala- Gly - OMe ■ CF3 COOH)
1) Ag+ou Hg+ +
2) H2S
Dérivé disulfhydryle
45 On dissout du Boc—Ala—Gly—OMe [10 g, 45 mmoles, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974)] dans de l'acide trifluoroacétique froid (bain de glace) (100 ml). On agite la solution pendant 1 h à 0° C et on évapore le solvant. On dissout le reste dans du méthanol, on l'ajoute à de l'éther diéthylique so et on récolte le précipité pour obtenir le composé cité en rubrique. Préparation 2 :
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-glycyl-alanyl-qlycine (Boc -Gly-Ala- Gly - OMe)
J5 A une solution froide (bain de glace) de H—Ala—Gly— 0Me-CH3C02H (45 mmoles, décrit dans la préparation 1 dans 50 ml de diméthylformamide, on ajoute de la N-éthylmorpholine (pH d'environ 8), puis une solution froide de Boc—Gly—OTcp ( 18 g, 45 mmoles) dans 50 ml de diméthylformamide. On conserve la 60 solution dans un bain de glace pendant 2 j. On évapore le solvant et on purifie le produit par une Chromatographie en colonne sur gel de silice en employant de l'acétate d'éthyle/méthanol/pyridine (98/1/1). On cristallise le produit dans de l'acétate d'éthyle/éther de pétrole pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F. : 98-100° C; 65 RMN (DMSO-dg): 1,25 5 (3H); 1,4 5 (9H); 3,68 5 (3H).
Préparation 3 :
Trifluoroacétate d'ester méthylique de glycyl-alanyl-glycine (H—Gly—Ala—Gly—OMe- CF 3COOH)
11
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On dissout, dans de l'acide trifluoroacétique froid (bain de glace) ( 120 ml), du Boc—Gly—Ala—Gly—OMe (6,4 g, 20,1 mmoles, décrit dans la préparation 2, et on agite la solution à 0°C pendant 1 h. On évapore le solvant, on dissout le reste dans du méthanol et on précipite le produit par l'addition d'éther diéthylique. On récolte le précipité pour obtenir le composé cité en rubrique.
Préparation 4 :
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine (Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe)
A une solution agitée froide (bain de glace) de H —Gly—Ala— Gly—0Me CH3C02H (6,4 g, 20,03 mmoles, décrit dans la préparation 3 dans du diméthylformamide (30 ml), on ajoute 2,8 ml de N-éthylmorpholine, puis une solution de Boc—Gly—OTcp (8,5 g, 24 mmoles) dans 20 ml de diméthylformamide. On conserve la solution dans un bain de glace pendant 2 j. On évapore le solvant, on dissout le reste dans du méthanol et on précipite le produit avec de l'éther diéthylique. Une cristallisation dans de l'acétate d'éthyle donne le composé cité en rubrique; P.F.: 103-105° et 141°C (dimorphique); RMN: 1,25 8 (3H), 1,38 S (9H), 3,65 5 (3H).
Préparation 5 :
Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine ; IX, R5 = Boc (Boc - Gly -Gly-Ala- Gly -NH- NH2)
A une solution agitée, refroidie (bain de glace) de Boc—Gly— Gly—Ala—Gly—OMe (2,5 g, 6,7 mmoles, décrit dans la préparation 4 dans du méthanol (50 ml), on ajoute 2,5 ml d'hydrate d'hydrazine. On agite la solution à 0°C pendant 3 h et à la température ambiante pendant la nuit. On sépare le précipité par filtration, on lave au méthanol et on sèche pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides; Gly 3, Ala 0,99.
Préparation 6:
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine (Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— Cys( Trt)-Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe)
A une solution de Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—NH—NH2 (1,57 g, 4,2 mmoles, décrit dans la préparation 5) dans du sulfoxyde de diméthyle (25 ml) et du diméthylformamide (25 ml), on ajoute une solution 2,04N de HCl dans de l'acétate d'éthyle (5,15 ml) à —10° C. On refroidit la solution à — 12°C et on ajoute du nitrite de t-butyle (0,61 ml, 5,2 mmoles). On conserve la solution à — 10°C pendant 15 mn, on refroidit à — 15°C et on ajoute de la N-éthyldiisopropyl-amine (1,8 ml, pH de 8), puis une solution de H—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn-Phe-Phe—OMe [4,5 g, 4,18 mmoles, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta.», 57,730 (1974)] et de N-éthyldiisopropylamine (0,72 ml) dans du diméthylformamide (25 ml). On agite le mélange pendant 1 h à —10° C et pendant la nuit à la température ambiante. Après évaporation, on dissout le reste dans du méthanol, on précipite le produit avec de l'eau et on cristallise dans du méthanol pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides; Lys, 1,07; Asp, 0,97; Gly, 3,27; Ala, 1; Phe, 2,08; acide cystéique, 1,35.
Préparation 7:
Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-Ne-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanine; IV, R4=Boc—Gly—Ala—Gly— NH (Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)—Iys(Boc)— Asn - Phe - Phe -NH- NH2)
A une solution froide (bain de glace) de Boc—Gly—Gly— Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe (0,9 g, 0,66 mmole, décrit dans la préparation 6) dans du diméthylformamide (25 ml), on ajoute 1,5 ml d'hydrate d'hydrazine. On agite la solution à la température ambiante pendant 18 h. On évapore le solvant, on triture le reste au méthanol et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir le composé cité en rubrique: analyse des aminoacides: Lys, 1,10; Asp, 1 ; Gly, 3,33; Ala, 1 ; Phe, 2,14; acide cystéique, 1,35.
Exemple 1 :
t-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéïnyl-Nt-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanyltryptophyl-N'-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine ; II,R2 = COOH et R4—Boc—Gly — Gly— Ala-Gly - NH (Boc - Gly - Gly - Ala - Gly - Cys(Trt)-Iys(Boc)—Asn—Phe—Phe — Trp—Lys(Boc) — Thr(Bul)— Phe - 1hr{Bu') - Ser(Bu') - Cys( Trt) - OH)
A une solution agitée à — 20° C de Boc—Gly—Gly—Ala— Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH2 (800 mg, 0,59 mmole, décrit dans la préparation 7) dans du diméthylformamide (12 ml), on ajoute une solution 1,85N de HCl dans de l'acétate d'éthyle (0,795 ml, 1,475 mmole). On amène le mélange à — 17° C, on ajoute du nitrite de t-butyle (0,081 ml, 0,71 mmole), et on agite la solution pendant 14 mn. On refroidit à —15° C, une solution de H - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -Cys(Trt)—OH [816 mg, 0,59 mmole, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57,730 (1974)] et de N-éthyldiisopropylamine (0,354 ml, 2,06 mmole) dans du diméthylformamide (6 ml), et on l'ajoute au mélange de réaction précédent. On agite le mélange à — 15° C pendant 1 h, et à 25° C pendant 18 h. On évapore le solvant, on triture le reste avec de l'acide citrique refroidi à la glace, on filtre, on lave à l'eau puis au méthanol, et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique: analyse des aminoacides: Lys, 1,94; Asp, 0,96; Thr, 1,64; Ser, 0,49; Gly, 2,82, Ala, 1,00; Phe, 2,80.
Exemple 2:
Disulfure cyclique de glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysylthréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-cystéine; I, R' —H —Gly— Gly—Ala— Gly - NH et R2 = COOH (H—Gly—Gly—Ala—Gly— Cys—lys—Asn—Phe—Phe—
Trp—lys—Ihr—Phe —Thr—Ser —Cys—OH)
On dissout du Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')— Phe—Thi^Bu')—Ser(Bu')—Cys(Trt)—OH décrit dans l'exemple 1 (0,871 g, 0,32 mmole) dans de l'acide acétique (150 ml) et on l'ajoute goutte à goutte à la température ambiante à une solution d'iode dans du méthanol (0,5%, 150 ml, 30 mmoles) avec agitation sur 1 h. On agite le mélange pendant 45 mn supplémentaires, on refroidit dans un bain de glace et on ajoute une solution de thiosulfate de sodium dans de l'eau (IN, 6 ml) afin de détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant et on triture le reste avec de l'eau, on dessèche et on triture le produit sec avec de l'éther isopropylique pour obtenir le disulfure cyclique d'hexadécapeptide de formule III :
Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—C ys—Ly s(Boc)—Asn—Phe—
Phe - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bul) - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bul) -
I :
Cys-OH.
A ce dernier composé, on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré froid (23 ml) dans un bairi d'eau glacée, sous une atmosphère d'azote, avec une agitation énergique. On poursuit l'agitation pendant 10 mn, on ajoute 300 ml d'acide acétique glacial et on lyophilise la solution. On dissout le reste dans de l'eau et on lyophilise à nouveau. On dissout le reste dans une solution aqueuse 0,01N d'acétate d'ammonium et on l'applique à une colonne de carboxyméthylcellulose (Whatman CM-23, 2,5 x 30 cm). Le
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composé pur est élué avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,06N. La matière purifiée est lyophilisée à partir d'eau pour donner une matière solide blanche constituant le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique;
C 282 nm (e: 5260), 289 nm (e: 4730), analyse des aminoacides: Lys,2,28; Asp, l,05;Thr, 1,95;Ser,0,93;Cys,2,34;Gly,3; Ala, 1,05; Phe, 3,12. Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 2,10; Asp, 1,04; Thr, 1,80; Ser, 0,95; Cys, 2,17; Gly, 3; Ala, 1,07; Phe, 2,99.
De la même manière, mais en utilisant du thiocyanogène suivant le procédé de Hiskey et Smith, citation précédente, au lieu d'iode, on obtient également le composé cité en rubrique.
Préparation 8:
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine (Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe) Une solution de Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe (2 g, 5,35 mmoles, décrit dans la préparation 4) dans 25 ml d'acide trifluoroacétique est agitée à 0° C pendant 1 h. On évapore le solvant, on triture le reste à l'éther, on récolte la matière solide, et on dessèche pour obtenir le tétrapeptide de formule H—Gly—Gly—Ala— Gly—OMe, isolé sous la forme du sel d'addition d'acide trifluoroacétique.
Une solution de ce dernier tétrapeptide (5,35 mmoles), de Boc—Leu—OH (2,31 g, 10 mmoles), de 1-hydroxy benzotriazole (1,35 g, 10 mmoles), de dicyclohexylcarbodiimide (2,27 g, 11 mmoles), et de N-éthylmorpholine (0,68 ml) dans du diméthylformamide (25 ml) est soumise à agitation à 0°C pendant 24 h. On filtre le mélange pour séparer le précipité et on ajoute le filtrat à de l'éther diéthylique (200 ml). On récolte le précipité et on cristallise dans du méthanol/éther isopropylique pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F.: 190,5-193°C; [a]ë5 = -15,2° (c=l, diméthylformamide).
Préparation 9:
Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine ;IX,RS=Boc—Leu(Boc—Leu— Gly—Gly— Ala—Gly— NHNH2)
Une solution de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe (2 g, 4 mmoles, décrit dans la préparation 8 et d'hydrate d'hydrazine (4,12 ml, 80 mmoles) dans 50 ml de méthanol est agitée à 0°C pendant 4 h. On concentre cette solution jusqu'à 4 ml et on l'ajoute à de l'éther diéthylique (200 ml). On récolte le précipité, on dissout dans du méthanol (4 ml) et on ajoute à de l'éther diéthylique (200 ml). On récolte le précipité et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F.: 174-176,5°C; [a]f>4 = ~ 12° (c = 1, diméthylformamide).
Préparation 10:
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl Nc-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine (Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly — Cys( Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe — Phe—OMe) On ajoute du nitrite de t-butyle (0,15 ml, 1,27 mmole) à une solution de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—N2H3 (0,308 g, 0,635 mmole, décrit dans la préparation 9, dans du diméthylformamide (5 ml) à — 20° C, et de HCl 2,4N dans de l'acétate d'éthyle (0,66 ml, 1,59 mmole). Après agitation à — 20° C pendant 15 mn, on ajoute une solution de H —Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe—OMe [0,62 g, 0,58 mmole), décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974)] et de diisopropyléthylamine (0,372 ml) dans du diméthylformamide (6 ml). Après agitation à —20° C pendant 1 h et à 0° C pendant 24 h, on ajoute la solution à de l'éther diéthylique (200 ml). On récolte le précipité, on dissout dans du méthanol (5 ml) et on ajoute à de l'éther diéthylique (200 ml). On récolte le précipité et on sèche pour obtenir le composé cité en rubrique, point de fusion de 238-240,5° C.
Préparation 11 :
Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cistéinyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine ; IV, R4=Boc—leu—Gly—Gly— Ala—Gly—NH (Boc—leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt) — lys(Boc)—Asn—Phe—NHNH 2)
Une solution de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys-(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe (0,56 g, 0,38 mmole, décrit dans la préparation 10) et d'hydrate d'hydrazine (0,74 ml) dans du diméthylformamide (10 ml) est agitée à 0°C pendant 12 h et à 25° C pendant 24 h. On ajoute la solution à de l'éther diéthylique (100 ml). Le précipité est récolté, dissous dans du diméthylformamide (3 ml), et ajouté à de l'éther diéthylique (100 ml). On récolte le précipité et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique: P.F.: 239-242°C; analyse des aminoacides: Lys, 1,05; acide cystéique, 0,66; Asp, 0,99; Gly, 3; Ala, 1,1 ; 'ACys, 0,21 ; Leu, 0,96; Phe, 1,86.
Exemple 3:
t-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanylphénylalanyl-tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine ; II, R2 = COOH et R4=Boc—Ieu— Gly—Gly—Ala—Gly—NH (Boc—Leu—Gly—Gly—Ala— Gly—Cys( Trt)—lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— Trp—
Iys(Boc) - 1hr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - Cys(Trt) - OH)
On ajoute du nitrile de t-butyle (0,03 ml, 0,28 mmole) à une solution à —20°C de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys (Boc)—Asn—Phe—Phe—N2H3 (0,20 g, 0,14 mmole, décrit dans la préparation 11) dans 2 ml de sulfoxyde de diméthyle, de 4 ml de diméthylformamide et de HCl 2,21N dans de l'acétate d'éthyle (0,16 ml, 0,35 mmole). Après agitation à —20°C pendant 15 mn, on ajoute une solution de H—Trp —Lys(Boc)—Thr(Bu')— Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—Cy s(Trt)—OH • HC02H (0,20 g, 0,14 mmole), décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57,730 (1974) et de diisopropyléthylamine (0,08 ml, 0,49 mmole) dans du diméthylformamide (5 ml). On agite la solution à — 20° C pendant 1 h et à 0°C pendant 24 h. On concentre la solution jusqu'à 2 ml et on l'ajoute à de l'éther diéthylique (100 ml). On récolte le précipité, on lave à l'eau (2x5 ml), on lave au méthanol (2x5 ml) et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 1,92; acide cystéique, 0,93; Asp, 0,93; Thr, 1,38; Ser, 0,66; Gly, 3; Ala, 1,02; 'A Cys, 0,39; Leu, 0,93; Phe, 2,70.
Exemple 4:
Disulfure cyclique de leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phényl-alanyl-thréonyl-séryl-cystéine; I, R1 =H—leu— Gly—Gly—Ala—Gly—NH et R2 — COOH (H—leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—lys—
Asn—Phe—Phe— Trp—Lys—Ihr—Phe—Thr—Ser—Cys—OH)'
Une solution de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')— Phe—Thr(Bu')—Ser(Bul)—Cys(Trt)—OH (0,23 g, 0,081 mmole, décrit dans l'exemple 3) dans 90 ml d'acide acétique est ajoutée goutte à goutte sur une période de 1 h à une solution de 0,5% d'iode dans du méthanol (41,5 ml, 0,81 mmole). A la fin de l'addition, on agite la solution à la température ambiante pendant 1 h et on refroidit ensuite à 0°C. On ajoute du thiosulfate de sodium IN (1,62 ml) jusqu'à ce que la solution devienne incolore. On récolte le solvant, on dessèche, on triture avec de l'éther et on dessèche pour obtenir le disulfure cyclique d'heptadécapeptide de formule III; Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—C ys—Lys(Boc)—Asn—
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Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—
Ser(Bu')—Cys—OH.
On agite rapidement à 0°C pendant 8 mn, une solution du disulfure cyclique d'heptadécapeptide (0,155 g, 0,066 mmole) dans 6,87 ml d'acide chlorhydrique concentré sous une atmosphère d'azote. On ajoute 69 ml d'acide acétique et on lyophilise la solution. On lyophilise le reste à partir d'eau (50 ml). On Chromatographie le reste sur une colonne d'un dextrane réticulé, chimiquement modifié Sephadex G-25M [3 x 50 cm, équilibrage dans la phase inférieure et ensuite équilibrage dans la phase supérieure de n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5)], en utilisant la phase supérieure pour désorber le peptide. Les fractions contenant le peptide pur sont combinées, évaporées et lyophilisées à partir d'eau pour donner le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique; C 290 (e: 5000), 281 (s: 5540), 275 (e:5205), 269 (s:4980), 265 (e: 4625), 259 nm (s: 4085). Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la •forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 1,98; acide cystéique, 1,41; Asp, 1,26; Thr, 1,92; Ser, 0,96; Gly, 3; Ala, 1,02; Leu, 0,96; Phe, 2,76.
De la même manière, mais en utilisant du thiocyanogène suivant la méthode de Hiskey et de Smith, citation précédente, au lieu d'iode, on obtient également le composé cité en rubrique.
Préparation 12:
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine (Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe) Une solution de Boc—Gly—OTcp (3,7 g, 10,04 mmoles), de H - Gly - Gly - Ala - Gly - OMe • CF3C02H (3,12 g, 8,03 mmoles, décrit dans la préparation 8) et de N-éthylmorpholine (1,1 ml) dans du diméthylformamide (15 ml) est agitée à 0°C pendant 20 h. On récolte le précipité et on ajoute le filtrat à de l'éther diéthylique. Les deux précipités combinés sont cristallisés dans le méthanol pour donner le composé cité en rubrique ;P.F.: 198-201°C;[a]ê4= —3,9° (c= 1, diméthylformamide).
Préparation 13:
Hydrazide de t-butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycine ; IX, Rs — Boc—Gly (Boc—Gly — Gly—Gly— Ala-Gly-NHNH2)
Une solution de Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—OMe (1,0 g, 2,32 mmoles, décrit dans la préparation 12) et d'hydrate d'hydrazine (1 ml, 23,2 mmoles) dans 30 ml de méthanol est agitée à 0°C pendant 4 h. Après évaporation, on triture le reste avec de l'éther diéthylique et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique, d'un point de fusion de 221-223° C.
Préparation 14:
Hydrazide de N,S-ditrityl-cystéinyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanine; VI (Trt—Cys-(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH 2)
Une solution de Trt—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— OMe (1,25 g, 1 mmole, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974) et d'hydrate d'hydrazine (0,97 ml, 20 mmoles) dans 30 ml de méthanol est agitée à 0°C pendant 2 j. On évapore le solvant et on cristallise le reste dans de l'éthanol/ éther isopropylique pour obtenir le composé cité en rubrique; RMN (DMSO-ds): 5 1,38 (s, 9H), 7,19-7,30 (m, 40H).
Préparation 15:
N,S-Ditrityl-cystéinyl-Ne-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-
phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-NE-t-butyloxycarbonyl-
lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-
O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine; VII, R2 = COOH
(Trt— Cysf Trt) — Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—
Lys(Boc) — Thiißu')—Phe — Thr(Bu')—Ser(Bu') — Cj>s( Trt)—OH)
On ajoute du nitrile de t-butyle (0,09 ml, 0,74 mmole) à une solution à — 20° C de Trt—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— NHNH2 (0,62 g, 0,493 mmole, décrit dans la préparation 14) dans du diméthylformamide (10 ml) et de HCl 2,6N dans de l'acétate d'éthyle (0,475 ml, 1,23 mmole). Après agitation à — 20° C pendant 15 mn, on ajoute une solution de H—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu') — Cys(Trt) — OH • HCOOH [0,70 g, 0,493 mmole, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57,730 (1974)] et de diisopropyléthylamine (0,30 ml, 1,65 mmole) dans du diméthylformamide (10 ml). On agite la solution à - 20° C pendant 1 h et à 25° C pendant 24 h, puis on évapore. On triture le reste avec de l'eau, de l'éther diéthylique, de l'acide citrique IN froid, et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; RMN (CDCI3) 5 1,08 et 1,13 (s, 27H), 1,37 (s, 18H), 7,28 (m, 60H), analyse des aminoacides: Lys, 2,23; acide cystéique, 1,10; Asp, 1; Thr, 2,12; Ser, 1,02; ViCys, 0,64; Phe, 3,18.
Préparation 16:
Formiate de S-trityl-cystéinyl-Ne-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine;
VIII, R2=COOH (H—cys(Trt) — Lys(Boc) — Asn—Phe— Phe - Trp - Iys(Boc) - Thr(Bu') - Plie — Thr[Bu')—Ser(Bu') -Cys(Trt)-OH-HCOOH)
Une solution de Trt—Cys(Trt) —Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bul)—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')— Cys(Trt)—OH (0,50 g, 0,192 mmole, décrit dans la préparation 15) dans 6 ml d'acide acétique/acide formique/eau (7/1/2) est agitée à 25° C pendant 6 h. On évapore le solvant et on triture le reste avec de l'éther diéthylique pour obtenir le composé cité en rubrique ; analyse des aminoacides: Lys, 2,23; acide cystéique, 1,38; Asp, 1 ; Thr, 2,14; Ser, 0,86; Phe, 3,24.
Préparation 17:
t-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-N^-t-butyloxy-carbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine; II, R2 = COOH et Rs=Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH (Boc—Gly— Gly — Gly—Ala—Gly—Cys( Trt)—fys(Boc)—Asn—Phe — Phe — Trp—Lys(Boc) — Thr(Bi/)—Phe — Thr(Bu')—Ser(Bu')— Cys(Trt) — OH)
On ajoute du nitrite de t-butyle (0,04 ml, 0,34 mmole) à une solution à — 20°C de Boc-Gly-Gly-Ala-Gly-NHNH2 (0,076 g, 0,176 mmole, décrit dans la préparation 13) dans du sulfoxyde de diméthyle (1 ml), du diméthylformamide (2 ml) et du HCl 2,5N dans de l'acétate d'éthyle (0,176 ml, 0,44 mmole). Après agitation à — 20° C pendant 15 mn, on ajoute une solution de H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—Trp—Lys(Boc) — Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - Cys(Trt) - OH • HCOOH (0,385 g, 0,16 mmole, décrit dans la préparation 16) et de diisopropyléthylamine (0,12 ml) dans du diméthylformamide (5 ml). On agite la solution à — 20° C pendant 1 h, à 0° C pendant lhetà25°C pendant 20 h. On évapore le solvant et on ajoute le reste à de l'éther diéthylique (100 ml). On récolte le précipité, on lave à l'eau et au méthanol, et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique ; analyse des aminoacides: Lys, 2,30; acide cystéiqiie, 1,42; Asp, 1 ; Thr, 2,27; Ser, 1 ; Gly, 3,84; Ala, 1 ; Phe, 3,34.
Exemple 5:
Disulfure cyclique de glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysylthréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-cystéine; I, R' =H—Gly — Gly—Gly — Ala—Gly—NH et R2 = COOH (H - Gly -Gly-Gly-Ala- Gly - Cys - b's -
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14
Asn — Phe—Phe—Tpr—lys —Ihr—Phe —Thr—Ser—Cys—OH)
Une solution de Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp — Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - SerfBu') - Cys-(Trt) —OH (0,285 g, 0,103 mmole, décrit dans la préparation 17) dans 200 ml d'acide acétique est ajoutée à une solution de 0,5% d'iode dans du méthanol (52 ml, 1,03 mmole) sur 60 mn, et on agite pendant 60 mn à la température ambiante. On refroidit la solution à 0°C et on ajoute du thiosulfate de sodium IN (2,06 mmoles) afin d'obtenir une solution incolore. On évapore le solvant et on ajoute le reste huileux à de l'eau (100 ml). On récolte le précipité et on dessèche pour obtenir le disulfure cyclique d'heptadécapeptide de formule III :
Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—Lys(Boc)—Asn—
Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—
!
Ser(Bul)—Cys—OH.
On agite à 0°C pendant 10 mn sous azote, une solution du disulfure cyclique susdit d'heptadécapeptide (0,10 mmole) dans 10 ml d'acide chlorhydrique concentré. On ajoute 100 ml d'acide acétique et on lyophilise la solution. Après une autre lyophilisation à partir d'eau (100 ml), on soumet le reste à une Chromatographie de partage sur une colonne d'un dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25M, 3 x 50 cm, constitué dans la phase inférieure de n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et ensuite équilibré dans la phase supérieure) en utilisant la phase supérieure pour désorber l'heptadécapeptide pratiquement pur. On combine les fractions pures, on évapore et on lyophilise pour obtenir le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique;
283 (e: 6702), 289 nm (e: 6350). Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 2; acide cystéique, 1,42; Asp, 1,09; Thr, 1,89; Ser, 0,91; Gly, 3,64; Ala, 0,98; Phe, 2,95.
De la même manière, mais en utilisant du thiocyanogène suivant la méthode de Hiskey et de Smith, citation précédente, au lieu d'iode, on obtient également le composé cité en rubrique.
Préparation 18:
N.S-Ditrityl-cystéinyl-N^-t-butoxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-N*-t-butoxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-2-tritylthioéthylamide; VII, R2=H (Trt—Cys-( Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe—Phe — Trp—Iys(Boc)—Thr-(Bu')—Phe—1hi{Bu')-Ser(Bu'-NHCH2CH2S-Trt) L'hydrazide de pentapeptide Trt—Cys(Trt)—Lys(Boc)— Asn—Phe—Phe—NHNH2 (0,80 g, 0,637 mmole, décrit dans la préparation 14) est dissous dans du diméthylformamide sec (9 ml) et refroidi à — 20° C. On ajoute de l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle (2,4N, 0,691 ml), puis du nitrite de t-butyle (0,0872 ml, 0,764 mmole). On agite le mélange pendant 15 mn à —15° C. On refroidit une solution de H—Trp—Lys(Boc)— Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH2CH2S - Trt (0,852 g, 0,637 mmole, préparé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3917581 délivré le 4 novembre 1975) dans 8 ml de diméthylformamide contenant de la N-éthyldiiso-propylamine (0,272 ml, 1,59 mmole) jusqu'à —15° C et on l'ajoute goutte à goutte au mélange de réaction précédent. On poursuit l'agitation à — 15° C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On évapore le mélange de réaction sous pression réduite, on triture le reste avec de l'eau, on filtre, on lave à l'eau, et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On Chromatographie le reste sur une colonne de gel de silice (163 g) avec du chloroforme contenant du méthanol (3%) et de la pyridine (0,3 %) comme éluant,
et on cristallise le produit pur dans du méthanol/éther isopropylique pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F.: 163-180°C (déc.).
Analyse pour Ci49Hi8oNi60i9S2:
Calculé: C 69,85 H 7,04 N8,76%
Trouvé: C 69,24 H 7,09 N 8,90%.
Préparation 19:
Formiate de S-trityl-cystéinyl-Nz-t-butyloxycarbonyl-lysyl-aspa-
raginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-Nz-t-butyl-
oxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-
butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-2-tritylthioéthylamide;
VIII, R2=H (H—Cys(Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe—Phe—
Trp - lys(Boc) - 1hr[Bu') - Phe - Thr(But)-Set{Buf)-
NHCH2CH2S - Trt-HCOOH)
L'undécapeptide Trt—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—ThifBu')—Ser(Bu') — NHCH2CH2S—Trt (0,909 g, 0,355 mmole, décrit dans la préparation 18) est dissous dans un mélange d'acide acétique/acide formique/eau (7/1/2,10 ml) et on agite la solution pendant la nuit à la température ambiante. On évapore le solvant et on triture le reste avec de l'eau. On filtre le précipité obtenu, on lave à l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On triture la matière solide plusieurs fois avec de l'éther de pétrole/éther et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides; Lys, 2,03 ; Asp, 1 ; Ser, 0,87 ; Phe, 2,97 ; acide cystéique, 0,90; Thr, 1,85.
Préparation 20:
t-Butyloxycarbonyl-leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-W-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phënyl-alanyl-phénylalanyl-tryptophyl-Nc-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butylthréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-2-tritylthioéthylamide; II, R2=H et R4 =Boc—Leu — Gly—Gly—Ala—Gly—NH (Boc—Leu—Gly—Gly—Ala— Gly—Cys( Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—
lys(Boc) -Thr(Bu')-Phe- 1iir[Bu')-Ser{Bu')-NH CH 2 CH 2S—Trt)
L'hydrazide de pentapeptide Boc— Leu—Gly—Gly—Ala— Gly—NHNH2 (0,066 g, 0,136 mmole, décrit dans la préparation 9) est dissous dans du diméthylformamide sec (3 ml) et refroidi à — 20° C. On ajoute de l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle (2N, 0,175 ml), puis du nitrite de t-butyle (0,0186 ml, 0,163 mmole). On agite le mélange à — 15° C pendant 15 mn. On refroidit jusqu'à — 15°C une solution de H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys (Boc) - ThrfBu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH2CH2S -Trt(0,315g,0,133 mmole, décrit dans la préparation 19) dans du diméthylformamide (4 ml) contenant de la N-éthyldiisopropylamine (0,082 ml, 0,476 mmole) et on l'ajoute goutte à goutte au mélange de réaction précédent. On poursuit l'agitation à —15° C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On évapore le mélange de réaction sous pression réduite, on triture le reste avec de l'acide citrique refroidi à la glace (IN), on filtre et on lave à l'eau. On triture le reste solide avec du méthanol et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 1,88;
acide cystéique, 0,84; Asp, 1 ; Thr, 1,94; Ser, 0,97; Gly, 2,78 ; Ala, 0,89 ; Leu 0,89; Phe, 3,11.
Exemple 6:
Disulfure cyclique de leucyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-
phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-
phénylalanyl-thréonyl-sêryl-2-thioéthylamide; I, R1 =H—Ieu—
Gly-Gly-Ala-Gly-NH et R2=H
(H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—lys—Asn—Phe—
Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-NHCH2CH2S)
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Une solution de Boc—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe— Thr(Bu') — Ser(Bu')—NHCH2CH2S—Trt (0,230 g, 0,083 mmole, décrit dans la préparation 20) dans 100 ml d'acide acétique est ajoutée lentement à une solution énergiquement agitée d'iode (0,211 g, 0,83 mmole) dans du méthanol (42 ml) à la température ambiante. A la fin de l'addition, on agite la solution à la température ambiante pendant 60 mn. On refroidit la solution jusqu'à 0°C et on ajoute lentement une solution de thiosulfate de sodium dans de l'eau (IN) pour détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant presque jusqu'à siccité, on triture le reste avec de l'eau froide, on filtre, on lave à l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On lave la matière solide à l'éther et on la dessèche pour obtenir le disulfure cyclique de formule III, Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—Cys—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—
I j
Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bul)—Ser(Bu')—NHCH2CH2 S.
Cet hexadécapeptide cyclique est énergiquement agité à 0°C sous une atmosphère d'azote pendant 10 mn dans de l'acide chlorhydrique concentré (7 ml). On ajoute 90 ml d'acide acétique et on lyophilise la solution. On reprend le reste dans l'acide acétique à 2% dans de l'eau et on lyophilise. On soumet le reste à une Chromatographie de partage sur une colonne de dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25M, 3 x 50 cm, équilibre dans la phase inférieure de n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et équilibrage ensuite dans la phase supérieure) en utilisant la phase supérieure pour désorber l'hexadécapeptide essentiellement pur. On combine les fractions pures, on évapore et on lyophilise pour obtenir le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique; 290 (e: 4290), 282 (s: 4910), 273 nm (s: 4630). Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides; Lys, 2,01; Asp, 1,35;
Ser, 0,93; Ala, 0,99; Phe, 2,52; acide cystéique, 0,66; Thr, 1,98; Glyr3; Leu, 0,96.
Préparation 21 :
t-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-tritylcystéinyl-Nc-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-NE-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-2-tritylthioéthylamide ;II, R2=HetR4 =Boc— Gly— Gly -Ala-Gly- NH (Boc -Gly-Gly- Gly - Ala-Gly-Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe — Trp—Iys(Boc)— Thr(Buj-Ser(Bu')-NHCH2CH2S-Trt)
L'hydrazide de pentapeptide Boc—Gly—Gly—Gly—Ala— NHNH2 (0,0608 g, 0,141 mmole, décrit dans la préparation 13) est dissous dans du diméthylformamide sec (6 ml) et du sulfoxyde de diméthyle (2 ml), et on refroidit jusqu'à —20° C. On ajoute de l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle (2N, 0,176 ml, 0,352 mmole), puis du nitrite de t-butyle (0,0194 ml, 0,169 mmole). On agite le mélange à — 15°C pendant 15 mn. On refroidit jusqu'à — 15°C une solution de H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp— Lys(Boc)—Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH2CH2S -Trt (0,327 g, 0,138 mmole, décrit dans la préparation 19) dans du diméthylformamide (4 ml) contenant de la N-éthyldiisopropylamine (0,085 ml, 0,494 mmole), et on l'ajoute goutte à goutte au mélange de réaction précédent. On poursuit l'agitation à — 15°C pendant 1 h et à la température ambiante pendant la nuit. On évapore le mélange de réaction sous pression réduite, on triture le reste avec de l'acide citrique (IN) refroidi à la glace, on filtre et on lave à l'eau. On triture le reste solide avec du méthanol et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 2,31 ; acide cystéique, 0,84; Asp, 1; Thr, 2,26; Ser, 1,19; Gly, 4; Ala, 0,84; Phe, 3,2.
Exemple 7:
Disulfure cyclique de glycyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phényl-alanyl-thréonyl-séryl-2-thioéthylamide; I, R' — H—Gly—Gly— Gly-Ala-Gly-NH et R2 = H (H -Gly-Gly-Gly- Ala-Gly — Cys—lys—Asn—Phe—Phe — Trp—lys— Thr—Phe—
Thr - Ser - NHCH2CH2S)
Une solution de Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bu') -Phe—Thr(Bul)—Ser(Bu')—NHCH2CH2S—Trt (0,224 g, 0,083 mmole, décrit dans la préparation 21) dans de l'acide acétique (160 ml) est ajoutée lentement à une solution énergiquement agitée d'iode (0,211 g, 0,83 mmole) dans du méthanol (42 ml) à la température ambiante. A la fin de l'addition, on agite la solution à la température ambiante pendant 60 mn. On refroidit la solution jusqu'à 0°C et on ajoute lentement une solution de thiosulfate de sodium dans de l'eau ( IN) pour détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant presque jusqu'à siccité, on triture le reste à l'eau froide, on filtre, on lave à l'eau, et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On lave la matière solide à l'éther et on dessèche pour obtenir le disulfure cyclique de formule III :
Boc—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys — Lys(Boc) — Asn— Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu') — Ser(Bu')—NHCH2CH2 S.
On agite énergiquement cet hexadécapeptide cyclique à 0° C sous une atmosphère d'azote pendant 10 mn dans de l'acide chlorhydrique concentré (7 ml). On ajoute 90 ml d'acide acétique et on lyophilise la solution. On reprend le reste dans de l'acide acétique à 2% dans de l'eau et on lyophilise. On soumet le reste à une Chromatographie de partage sur une colonne de dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25M, 3 x 50 cm, équilibrage dans la phase aqueuse de n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et ensuite équilibrage dans la phase supérieure), en utilisant la phase supérieure pour désorber l'hexadécapeptide pratiquement pur. Les fractions pures sont combinées, évaporées et lyophilisées pour donner le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique; Xmâ?H: 288 (s: 4870), 280 (s: 5575), 274 (e: 5380), 268 (s: 5185), 265 nm (e: 4955). Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 1,72; Asp, 1; Ser, 0,73; Ala, 0,69; Phe, 2,78; acide cystéique, 0,57; Thr, 1,69; Gly, 3,59.
Exemple 8:
t-Butyloxycarbonyl-glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystémy]-Ne-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-Nc-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-2-tritylthioéthylamide; II, R2 = H et R4=Boc— Gly — Gly—Ala—Gly—NH(Boc—Gly—Gly—Ala—Gly— Cys(Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Iys(Boc) —
Thi{Bu') - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH2CH2 - Trt)
A une solution de Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys-(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH2 (800 mg, 0,59 mmole, préparé comme décrit dans la préparation 7) dans du diméthylformamide (12 ml) à — 20° C, on ajoute, avec agitation, une solution 1,85N de HCl dans de l'acétate d'éthyle (0,795 ml, 1,475 mmole). On amène ce mélange à —15° C, on ajoute du nitrite de butyle tertiaire (0,081 ml, 0,71 mmole) et on agite la solution pendant 15 mn. On refroidit à — 15° C une solution de H—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')— Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') - NHCH2CH2S - Trt (0,852 g, 0,637 mmole, préparé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amé-
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rique N° 3917581 délivré le 4 novembre 1975) et de N-éthyldiisopropylamine (0,354 mi, 2,06 mmoles) dans 6 ml de diméthylformamide et on l'ajoute au mélange de réaction précédent. On agite ce mélange à — 15°C pendant 1 h et à 25° C pendant 18 h. On évapore le solvant, on triture le reste avec de l'acide citrique refroidi à la glace, on filtre, on lave à l'eau, puis au méthanol, et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides; Lys, 2,01; Asp, 0,97; Thr, 1,60; Ser, 0,65; acide cystéique, 0,87; Gly, 2,92; Ala, 1; Phe, 2,97.
Exemple 9:
Disulfure cyclique de glycyl-glycyl-alanyl-glycyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-2-thioéthylamide; I, R' =H—Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH et R2=H (H—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys—lys—Asn—Phe—Phe—
Trp -lys-Ihr- Phe -Thr- Ser - NHCH2CH2 S)
On dissout du Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—Cys(Trt)— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHCH2CH2S—Trt décrit dans l'exemple 8 (0,860 g, 0,30 mmole) dans de l'acide acétique glacial (150 ml) et on l'ajoute goutte à goutte à la température ambiante à une solution d'iode dans du méthanol (0,5%, 150 ml, 30 mmoles) avec agitation sur une période de 1 h. On agit ensuite le mélange pendant 45 mn supplémentaires, on refroidit dans un bain de glace et on ajoute une solution de thiosulfate de sodium dans de l'eau (IN, 6 ml) pour détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant et on triture le reste avec de l'eau, on dessèche et on triture le produit sec avec de l'éther isopropylique pour obtenir le disulfure cyclique de pentadécapeptide de formule III, Boc—Gly—Gly—Ala—Gly—C ys — Lys(Boc)—Asn—Phe
Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bul)—
I
NHCH2CH2S
A ce dernier composé, on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré froid (23 ml) dans un bain d'eau glacée, sous une atmosphère d'azote avec agitation énergique. On poursuit l'agitation pendant 10 mn, on ajoute 300 ml d'acide acétique glacial et on lyophilise la solution. On dissout le reste dans de l'eau et on lyophilise à nouveau. On dissout le reste dans une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 0,01N et on l'applique à une colonne de carboxyméthylcellulose (Whatman CM-23,2,5 x 30 cm). On élue le composé pur avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,006N. On lyophilise la matière purifiée à partir d'eau pour obtenir une matière solide blanche constituant le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique; : 282 nm (s : 5120), 289 nm (e;4610).
Une lyophilisation répétée de ce dernier produit à partir d'eau donne le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 2,06; Asp, 1,02; Thr, 1,75; Ser, 0,91; acide cystéique, 0,73; Gly, 3; Ala, 1,10; Phe, 3,11.
De la même manière, mais en utilisant du thiocyanogène suivant la méthode de Hiskey et de Smith, citation précédente, au lieu d'iode, on obtient également le composé cité en rubrique.
Préparation 22:
Ester méthylique d'acétyl-{S-trityî)cystéinyl-(Nz-t-butoxy-carbonytjlysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine {Ac—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe)
On ajoute une solution d'acétate de p-nitrophényle (0,191 g, 1,05 mmole, préparé comme décrit par F.D. Chattaway, «J. Chem. Soc.», 2495 (1931)] dans du diméthylformamide (4 ml) à une solution à0°C de H—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—OMe-
HOAc (0,750 g, 0,698 mmole, préparé comme décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974) et de N-éthylmorpholine (0,1 ml). Après agitation à 0° C pendant 24 h, on évapore le solvant sous pression réduite. On dissout le reste dans 3 ml de méthanol et on l'ajoute lentement à 200 ml d'éther diéthylique. On récolte le précipité et on cristallise dans l'éthanol pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F.: 219,5-221°C; [a]os = —21,6° (c = 1, diméthylformamide).
De la même manière, en utilisant les esters p-nitrophényliques des acides formique, propionique, butyrique, isobutyrique, piva-lique, n-hexanoïque ou benzoïque, au lieu de l'acétate de p-nitrophényle, on obtient également les composés correspondants de la formule précédente, dans laquelle Ac est remplacé par le formyle, le propionyle, le n-butanoyle, l'isobutanoyle, le pivaloyle, le n-hexanoyle ou le benzoyle.
Préparation 23 :
Hydrazide d'acétyl-(S-trity[)cystéinyl-(Ne-t-butoxycarbonyl)-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine; IV, R4=NHCOCH3 {Ac—Cys(Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe— Phe-NHNH 2)
Une solution de Ac—Cys(Trt) —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— OMe (0,40 g, 0,379 mmole, décrit dans la préparation 22) et d'hydrate d'hydrazine (0,37 ml, 7,58 mmoles) dans 15 ml de méthanol est agitée à 0° C pendant 48 h. On récolte le précipité et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique; P.F.: 236-237°C; [a]p5= —28,6° (c=1, diméthylformamide).
De la même manière, en utilisant les autres matières de départ appropriées décrites dans la préparation 22, on obtient également les composés correspondants de formule IV, dans laquelle R4 représente NHR3, où R3 est le formyle, le propionyle, le n-butanoyle, l'isobutanoyle, le pivaloyle, le n-hexanoyle, ou le benzoyle.
Exemple 10:
Acétyl-(S-trityl)cystéinyI-(Ne-t-butoxycarbonyl)lysyl-asparagi-
nyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-(N'-t-butoxy-
carbonyl)lysyl-(0-t-butyl]-thréonyl-phénylalanyl-{0-t-butyl)-
thréonyl-(0-t-butyl)séryl-2-tritylthioéthylamide;
II,R2 =HetR4=NHCOCH3 (Ac - Cys(Trt) - Lys(Boc) - Asn -
Phe—Phe —Trp—Iys(Boc) — Thr(Bu')—Ser(Bu')—
NHCH2CH2S— Trt)
Une solution de Ac—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— NHNH2 (IV) (0,240 g, 0,227 mmole, décrit dans la préparation 23) dans du diméthylformamide sec (2 ml) et du sulfoxyde de diméthyle (1 ml) est refroidie à — 20° C. On ajoute de l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle (2,IN, 0,273 mmole), puis du nitrite de butyle tertiaire (0,0312 ml, 0,273 mmole). On agite le mélange pendant 15 mn à — 15°C. On ajoute goutte à goutte au mélange de réaction précédent une solution de H—Trp—Lys(Boc)—
Thr(Bu') - Phe—Thr(Bu') - Ser(Bu')NHCH2CH2S -Trt (V, 0,304 g, 0,227 mmole, préparé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3917581 délivré le 4 novembre 1975) dans 3 ml de diméthylformamide contenant la N-éthyldiisopropylamine (0,097 ml, 0,568 mmole), refroidi à — 15° C. On agite le mélange à — 15° C pendant lhetà25°C pendant 20 h. On évapore le solvant sous pression réduite. On triture le reste avec une solution d'acide citrique (IN) refroidie à la glace, on filtre, on lave à l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On triture le reste solide avec du méthanol, on filtre et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 1,82; Asp, 1 ; Ser, 0,76; acide cystéique, 0,93; Thr, 1,87; Phe, 3,10.
De la même manière, mais en utilisant les autres matières de départ appropriées de formule IV, dans laquelle R4 représente NHR3 comme décrit dans la préparation 23, on obtient également les composés correspondants de formule II, dans laquelle R3 représente H et R4 représente NHR3, où R3 est le formyle, le
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propionyle, le n-butanoyle, l'isobutanoyle, le pivaloyle, le n-hexanoyle, ou le benzoyle.
Exemple 11 :
Disulfure cyclique d'acétyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-2-thioéthylamide; I, R' =NHCOCHî et R2=H
(Ac—Cys—lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr—Phe— Ihr - Ser - NHCN2CH2S)
Une solution de Ac—Cys(Trt) —Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu') — NHCH2CH2S—Trt (0,260 g, 0,110 mmole, décrit dans l'exemple 10) dans 61 ml d'acide acétique est ajoutée lentement à une solution agitée d'iode (0,278 g, 1,1 mmole) dans 56 ml de méthanol à 25° C. A la fin de l'addition, on agite la solution à 25° C pendant 1 h. On refroidit la solution à 0°C et on ajoute lentement une solution de thiosulfate de sodium IN dans de l'eau pour détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant sous pression réduite et on triture le reste avec de l'eau. On récolte le précipité, on lave à l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore pour obtenir l'un-décapeptide protégé cyclique de la formule III, Ac—Cys—Lys(Boc)
Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—ThrfBu')—Phe—Thr(Bul)—
!
Ser(Bu')—NHCH2CH2 S.
Ce peptide cyclique est agité énergiquement à 0°C sous une atmosphère d'azote pendant 10 mn dans de l'acide chlorhydrique concentré (9,1 ml). On ajoute 119 ml d'acide acétique et on lyophilise immédiatement la solution. On dissout le reste dans de l'eau et on lyophilise. On dissout le reste dans la phase supérieure du système solvant: butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et on l'applique à une colonne de dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25 M), préparé dans la phase inférieure du système solvant. On utilise la phase supérieure du système solvant ci-dessus pour désorber l'undécapeptide. Les fractions contenant le produit pur sont combinées et évaporées sous pression réduite. On triture le reste avec de l'éther diéthylique, on dissout dans de l'acide acétique à 5% et on lyophilise pour obtenir le composé cité en rubrique sous la forme du sel d'addition d'acide acétique; U.V. (méthanol): X.max: 290 (s: 4990), 282 (s: 5455), 274 nm (s: 5095).
Ce dernier composé, sous la forme du sel d'addition d'acide acétique, est soumis à une lyophilisation répétée à partir d'eau pour donner le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides : Lys, 1,93 ; Asp, 1 ; Ser, 0,84; acide cystéique, 0,80; Thr, 1,84; Phe, 2,97.
De la même manière, en utilisant les autres matières de départ appropriées de formule II, dans laquelle R2 représente H et R4 représente NHR3, comme décrit dans l'exemple 10, on obtient également les composés correspondants des formules III et I, dans lesquelles R2 représente H, et R4 et R1 représentent NHR3, où R3 est le formyle, le propionyle, le n-butanoyle, l'isobutanoyle, le pivaloyle, le n-hexanoyle ou le benzoyle.
Préparation 24 :
Ester pentachlorophénylique d'acide 3-tritylthiopropionique (H-t-SCH2CH2COOPcp)
On dissout de l'acide 3-tritylthiopropionique [1 g, 2,87 mmoles, décrit par R.C. Hiskey et M.A. Harpold, «J. Org. Chem.», 33, 559 (1968)] dans du tétrahydrofuranne sec (25 ml) et on ajoute du pentachlorophénol (0,765 g, 2,87 mmoles). On refroidit le mélange à 0° C, on ajoute du dicyclohexylcarbodiimide (0,596 g, 2,87 mmoles) et on agite la réaction pendant 1 h à 0° C et pendant 1 h à 25° C. On refroidit ensuite le mélange de réaction à 0°C, on filtre, et on évapore le filtrat sous pression réduite. On cristallise le reste dans de l'acétate d'éthyle pour donner le composé cité en rubrique, d'un point de fusion de 154-156° C.
Préparation 25 :
Ester méthylique de 3-tritylthiopropionyl-(Nc-t-butoxycarbonyl)-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine (Trt—SCH2CH 2CO—Iys(Boc)—Asn — Phe—Phe—OMe) On agite à 25° C pendant 3 j une solution d'ester pentachlorophénylique d'acide 3-tritylthiopropionique (0,597 g, 1 mmole, décrit dans la préparation 24), de H—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— OMe-HOAc [1 mmole, préparé comme décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974)] et de triéthylamine (0,14 ml, 1 mmole). On évapore le solvant sous pression réduite. On triture le reste avec une solution d'acide citrique IN refroidie à la glace, on filtre, on lave à l'eau et on dessèche sur de l'hydroxyde de potassium. On cristallise la matière solide dans du méthanol pour obtenir le composé cité en rubrique, d'un point de fusion de 215-220° C.
Préparation 26:
Hydrazide de 3-tritylthiopropionyl-(Ns-t-butoxycarbonyl)-lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanine;
IV, R4=H (Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe-NHNH 2)
Une solution de Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc)—Asn—Phe— Phe—OMe (0,900 g, 0,9 mmole, décrit dans la préparation 25) et d'hydrate d'hydrazine (1 ml) dans du diméthylformamide (20 ml) est agitée à 25° C pendant 20 h. On évapore le solvant sous pression réduite. On triture le reste à l'eau froide, on filtre, on lave à l'eau et on dessèche pour obtenir le composé cité en rubrique, d'un point de fusion de 225-235° C.
Exemple 12:
3-Tritylthiopropionyl-{Nz-t-butyloxycarbonyî)lysyl-asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-(Nc-t-butoxycarbonyl)-lysyl-(0-t-butyl)thréonyl-phénylalanyl-{0-t-butyl)thréonyl-(0-t-butyl)-séryl-2-tritylthioéthylamide; II, R2 et R4~ H (Trt—SCH 2CH2CO—Iys(Boc) — Asn—Phe—Phe— Trp-Iys(Boc) - 1hr(Bu') - Phe-1hr(Bu') - Ser(Bu') -NHCH2CH2S-1i-t)
On refroidit à — 20° C une solution de Trt—SCH2CH2CO— Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—NHNH2 (0,500 g, 0,5 mmole, décrit dans la préparation 26) dans du sulfoxyde de diméthyle (5 ml) et du diméthylformamide (20 ml). On ajoute une solution d'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle (1,4N, 0,895 ml), puis du nitrite de butyle tertiaire (0,069 ml, 0,6 mmole). On agite le mélange à — 15°C pendant 15 mn et on ajoute une solution, refroidie à —15° C, de H—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')— Ser(Bu')—NHCH2CH2S—Trt (0,670 g, 0,5 mmole, préparé comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N°3917581, délivré le 4 novembre 1975) et de N-éthyldiisopropylamine (0,214 ml, 1,25 mmole) dans du diméthylformamide (10 ml). On agite le mélange de réaction à —15° C pendant 1 h et à 25° C pendant 20 h, et on évapore sous pression réduite. On triture le reste avec une solution d'acide citrique IN refroidie à la glace, on filtre, on lave à l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore. On triture la matière solide avec du méthanol froid et on sèche pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 1,99; Asp, 1,15; Thr, 1,73; Ser, 0,67; Phe, 3.
Exemple 13:
Disulfure cyclique de 3-thiopropionyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-2-thioéthylamide; I, R1 et R2=H (SCH2CH2CO -lys-Asn—Phe - Phe - Trp—lys—Thr—
Phe-1hr-Ser-NHCH2CH2S)
Une solution de Trt—SCH2CH2CO—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—
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Ser(Bu')—NHCH2CH2S—Trt (0,500 g, 0,216 mmole, décrit dans l'exemple 12) dans de l'acide acétique (100 ml) est ajoutée lentement à une solution agitée d'iode (0,547 g, 2,16 mmoles) dans du méthanol (110 ml) à 25° C. A la fin de l'addition, on agite la solution à 25° C pendant 1 h. On refroidit cette solution à 0°C et on ajoute lentement une solution de thiosulfate de sodium IN dans de l'eau pour détruire l'excès d'iode (solution incolore). On évapore le solvant sous pression réduite et on triture le reste avec de l'eau. On recueille le précipité, on lave plusieurs fois à l'eau et on sèche sur pentoxyde de phosphore pour obtenir le décapeptide protégé cyclique de formule III, SCH2CH2CO —Lys(Boc)—Asn—Phe—
Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—
I ~
NHCH2CH2S.
Ce dernier décapeptide cyclique est agité énergiquement à 0°C sous une atmosphère d'azote pendant 10 mn dans de l'acide chlorhydrique concentré (18 ml). On ajoute 200 ml d'acide acétique et on lyophilise immédiatement la solution. On dissout le reste dans de l'eau et on lyophilise. On dissout le reste dans la phase supérieure du système solvant: butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et on l'applique à une colonne de dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25 M), préparé dans la phase inférieure du système solvant. La phase supérieure de ce système solvant est utilisée pour la désoption du décapeptide. On combine les fractions contenant le produit pur et on les évapore sous pression réduite. On dissout le reste dans de l'acide acétique à 5% et on lyophilise pour obtenir le composé cité en rubrique sous la forme du sel d'addition d'acide acétique; ultraviolet (méthanol): X max: 290 (s: 4920), 282 nm (e: 5390).
Ce dernier composé, sous la forme du sel d'addition d'acide acétique, est soumis à une lyophilisation répétée à partir d'eau pour donner le composé cité en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 1,97; Asp, 1; Thr, 1,64; Ser, 0,65; Phe, 2,94.
Préparation 27:
Ester méthylique de cc,a.-diméthyl-3,5-diméthoxybenzyloxycarbo-nyl-tryptophyl-Nc-t-butyloxy-carbonyl-lysyl-0-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine (Ddz— Trp—Iys(Boc) — Thr(Bu')—Phe—Thr-(Bu') - SeiiBu') - Cys(Trt) - OMe)
On ajoute une solution de diazométhane dans de l'éther, à une solution de Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu1)—Phe—Thr(Bu1)— Ser(Bu')—Cys(Trt) — OH [12,6 g, 0,785 mmole, décrit par H.U. Immer et consorts, «Helv. Chim. Acta», 57, 730 (1974)] dans du méthanol (10 ml) à 0°C. On agite le mélange à 0°C pendant 1 h et on évapore. On soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant 3% de méthanol et 0,5% de pyridine dans du chloroforme pour l'élution. Une évaporation de l'éluat donne le composé cité en rubrique; RMN (CDCI3); 8 1,13 (s, 18H), 1,27 (s, 9H), 1,48 (s, 9H), 1,77 (s, 6H), 3,68 (s, 3H), 3,79 (s, 6H), 7,1-7,6 (m, 23H).
De manière similaire, en utilisant du diazoéthane, du 1-diazo-propane, du 2-diazopropane, du 1-diazobutane, du 1-diazo-isobutane, du 1-diazopentane, du 4-diazo-2-méthylbutane, du 1-di-azohexane, du 1-diazoheptane ou du 1-diazooctane, au lieu de diazométhane, on obtient les esters éthylique, propylique, iso-propylique, n-butylique, isobutylique, n-pentylique, 2-méthylbuty-lique, n-hexylique, n-heptylique et n-octylique du composé en rubrique.
Préparation 28:
Ester décylique de S-tritylcystéine (H— Cys(Trt)-OCH2-(CH2)sCH3)
On agite à la température ambiante pendant 1 h une solution de chlorhydrate d'ester décylique de cystéine [0,894 g, 3 mmoles, préparé comme décrit par Vouille et consorts, brevet français d'addition N° 75.157 (1961), «C.A.», 57, 15235c], de triphénylcarbinol (0,78 g, 3 mmoles) et d'éthérate de trifluorure de bore (0,42 ml) dans de l'acide acétique (5,2 ml). On sépare le solvant sous pression réduite et on soumet le reste à Chromatographie sur gel de silice en utilisant 40 g d'acétate d'éthyle dans de l'hexane, contenant 0,1 % de triéthylamine comme éluant. L'évaporation de l'éluat donne le composé cité en rubrique sous la forme d'une huile ; [ä]d5 = + 25,84° (c= 1, CHCI3); RMN (CDCI3) 8 0,89 (t, J=5 Hz, 3H), 1,3 (s, 16H), 1,55 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 3,25 (2d, J=5 Hz, 1H), 4,1 (t, J=6 Hz, 2H).
De la même manière, mais en remplaçant la matière de départ par une quantité équivalente de chlorhydrate d'ester tétradécylique de cystéine (préparé comme décrit par Vouille et consorts, citation précédente), on obtient l'ester tétradécylique de S-tritylcystéine; [oc]ë5 = +13,8° (c= 1, CHCI3); RMN (CDCI3) 5 0,89 (t, J=5 Hz, 3H), 1,3 (s, 24H), 1,56 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 3,25 (2d, J=5 Hz, 1H), 4,1 (t, J=6Hz, EH).
De la même manière également, on obtient les esters nonylique, undécylique, dodécylique et tridécylique correspondants de S-tritylcystéine.
La combinaison des esters précédents de S-tritylcystéine avec l'hydrazide d'hexapeptide de formule Ddz—Trp—Lys(Boc)— Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHNH2 grâce à la méthode à l'azide donne les esters nonylique, décylique, undécylique, dodécylique, tridécylique et tétradécylique correspondant au composé cité en rubrique de la préparation 27.
Préparation 29:
Formiate d'ester méthylique de tryptophyl-N^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-tritylcystéine; V, R2—COOCH3 (H — Trp—LysiBoc) — Thr(Bu')—Phe— 1hr(Bu')—Ser-(Bu') - Cys(Trt) - OMe ■ HC02H)
Une solution de Ddz—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe— Thr(Bu')—Ser(Bu')—Cys(Trt)—OMe (1,11 g, 0,685 mmole, décrit dans la préparation 27) dans 10 ml d'un mélange d'acide formique/ acide acétique/eau (1/7/2) est agitée à la température ambiante pendant la nuit. On évapore le mélange et on triture le reste avec de l'eau. On recueille la matière solide par filtration et on dessèche sous pression réduite pour obtenir le composé cité en rubrique; ÄH: 290 (s: 6335), 280 (e:8470), 273 (3720), 216 nm (s: 78400).
De la même manière, mais en utilisant les autres heptapeptides décrits dans les préparations 27 et 28 comme matières de départ, on obtient également les esters éthylique, propylique, isopropylique, n-butylique, isobutylique, n-pentylique, 2-méthylbutylique, n-hexylique, n-heptylique, n-octylique, n-nonylique, n-décylique, n-undécylique, n-dodécylique, n-tridécylique et n-tétradécylique correspondant au composé cité en rubrique.
Exemple 14:
Ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-alanyl-glycyl-S-trityl-cystéinyl-Ne-t-butyloxycarbonyl-lysyl-asparaginyl-phényl-aIanyl-phénylalanyl-tryptophyl-N*-t-butyloxycarbonyl-lysyl-0-t-butylthréonyl-phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-S-trityl-cystéine; II, R2=COOCH3 et R4—Boc—Ala— Gly—NH (Boc—Ala—Gly—Cys(Trt)—Iys(Boc)—Asn—Phe— Phe — Trp—lysfBoc) — Thr(Bu')—Ser(Bu')—Cys( Trt)—OMe) A une solution du premier hydrazide d'heptapeptide IV, Boc—Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— NHNH2, (0,775 g, 0,624 mmole, décrit par H.U. Immer et consorts, citation précédente) dans du diméthylformamide (9 ml) à — 20° C, on ajoute du HCl anhydre 2,IN dans de l'acétate d'éthyle (1,56 mmole), puis du nitrite de t-butyle (0,0863 ml, 0,749 mmole). On agite la solution à — 15° C pendant 15 mn. On refroidit à — 15° C une solution du second ester méthylique d'heptapeptide V,
H - Trp - Lys(Boc) - ThrfBu') - Phe - ThifBu1) - Ser(Bu') -Cys(Trt)—0Me HC02H (0,900 g, 0,624 mmole, décrit dans la préparation 29) et de N-éthyldiisopropylamine (0,373 ml,
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2,184 mmoles) dans du diméthylformamide (5 ml), et on l'ajoute à la solution précédente à —15° C. On agite le mélange résultant à — 15°C pendant 1 h et à la température ambiante pendant 3 j. On sépare le solvant sous pression réduite. On triture le reste avec de l'acide citrique IN, on filtre, on lave le précipité à l'eau et on dessèche sur pentoxyde de phosphore sous pression réduite. On triture le reste séché avec une petite quantité de méthanol, et le reste est recueilli et séché pour obtenir le composé cité en rubrique; analyse des aminoacides: Lys, 2,06; acide cystéique, 1,75; Asp, 0,94; Thr, 1,93; Ser, 0,97; Gly, 1; Ala, 0,88; Phe, 3,10.
De la même manière, en utilisant les autres esters alcoyliques d'heptapeptide de formule V, décrits dans la préparation 29, on obtient également les esters éthylique, propylique, isopropylique, n-butylique, isobutylique, n-pentylique, 2-méthylbutylique, n-hexylique, n-heptylique, n-octylique, n-nonylique, n-décylique, n-undécylique, n-dodécylique, n-tridécylique et n-tétradécylique correspondant au composé en rubrique.
Exemple 15:
Disulfure cyclique d'ester méthylique de t-butyloxycarbonyl-
alanyl-glycyl-cystéinyl-N^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-
asparaginyl-phénylalanyl-phénylalanyl-tryptophyl-
N^-t-butyloxycarbonyl-lysyl-O-t-butyl-thréonyl-
phénylalanyl-O-t-butyl-thréonyl-O-t-butyl-séryl-cystéine;
III, R2 = COOCHi et R4=Boc- Ala- Gly - NH (Boc -
Ala—Gly—Cys—LysiBoc)—Asn—Phe—Phe —Trp—Iys(Boc)—
Thr(Bu') - Ser(Bu') - Cys - OMe)
On dissout dans de l'acide acétique chaud (200 ml) l'ester méthylique de tétradécapeptide protégé linéaire de l'exemple 14, Boc—Ala—Gly—Cys(Trt)—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe— Trp—Lys(Boc)—Thr(Bul) — Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')— Cys(Trt)—OMe (0,898 g, 0,345 mmole). On refroidit la solution jusqu'à la température ambiante et on l'ajoute goutte à goutte à une solution de 5% d'iode dans du méthanol (175 ml, 3,45 mmoles) sur une période de 1 h. On agite le mélange pendant 1 h supplémentaire, on refroidit à 0° C et on ajoute une solution de thiosulfate de sodium IN dans de l'eau (15 ml) pour détruire l'excès d'iode. On évapore le solvant, on triture le reste avec de l'eau et on dessèche sur du pentoxyde de phosphore sous pression réduite pour obtenir le composé cité en rubrique.
De la même manière, en utilisant les autres esters de tétradécapeptide protégés linéaires de formule II, décrits dans l'exemple 14, on obtient également les esters éthylique, propylique, isopropylique, n-butylique, isobutylique, n-pentylique, 2-méthylbutylique, n-hexylique, n-heptylique, n-octylique, n-nonylique,
616 402
n-décylique, n-undécylique, n-dodécylique, n-tridécylique et n-tétradécylique correspondant au composé en rubrique.
Exemple 16:
Ester méthylique de somatostatine. Disulfure cyclique d'ester méthylique d'alanyl-glycyl-cystéinyl-lysyl-asparaginyl-phényl-alanyl-phénylalanyl-tryptophyl-lysyl-thréonyl-phénylalanyl-thréonyl-séryl-cystéine; I, R1 — H—Ala—Gly—NH et
R2 = COOCH3 (H-Ala- Gly - Cys - Lys-Asn - Phe - Phe -Trp—lys—Ihr—Phe— Thr—Ser—C$s—OMe)
On agite sous une atmosphère d'azote pendant 10 mn à 0°C, une solution du disulfure cyclique de l'exemple 15, Boc—Ala—Gly—Cys—Lys(Boc)—Asn — Phe—Phe —
Trp—Lys—(Boc)—Thr(Bu') — Phe—Thr(Bu') — Ser(Bu')—
Cys-OMe, (0,345 mmole) dans de l'acide chlorhydrique concentré (29 ml). On ajoute de l'acide acétique glacial (290 ml) et on lyophilise la solution. On dissout le reste dans de l'acide acétique à 5% et on lyophilise à nouveau. On dissout le reste dans de l'acétate d'ammonium 0,2M, on l'applique à une colonne de carboxyméthylcellulose (Whatman CM-23) et on élue avec un tampon d'acétate d'ammonium 0,2M. On lyophilise l'éluat. On soumet le reste à une Chromatographie de partage sur une colonne de dextrane réticulé, chimiquement modifié (Sephadex G-25M), équilibré dans la phase inférieure de n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5) et équilibré ensuite dans la phase supérieure, et en utilisant la phase supérieure pour la désorption de l'ester méthylique de somatostatine. On combine les fractions pures, on évapore et on lyophilise pour obtenir le composé cité en rubrique sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique290 (e: 4345), 287 (e: 4385), 268 (e: 4090), 265 (e: 3900), 215 nm (e: 38305); hydrolyse alcaline et Chromatographie gazeuse: calculé pour le méthanol: 1,75%; trouvé: 2% ; RMN (DMSO-d6) 5 3,63 (s, 3H, OCH3).
Une lyophilisation répétée de ce dernier sel d'addition d'acide à partir d'eau donne le composé en rubrique sous la forme de la base libre; analyse des aminoacides: Lys, 2; acide cystéique, 1,28; Asp, 0,95; Thr, 1,91 ; Ser, 0,97; Gly, 1 ; Ala, 0,94; Vi Cys, 0,30; Phe, 3,01.
De la même manière, en utilisant les autres disulfures cycliques de formule III, décrits dans l'exemple 15, on obtient également les esters éthylique, propylique, isopropylique, n-butylique, isobutylique, n-pentylique, 2-méthylbutylique, n-hexylique, n-hepty-lique, n-octylique, n-nonylique, n-décylique, n-undécylique, n-dodécylique, n-tridécylique et n-tétradécylique correspondant au composé en rubrique.
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Claims (2)
- 6164022REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un peptide de formule I:SCH2CH(R1)CO — Lys—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys—Thr—Phe—Thr—Ser—NHCH(R2)CH2 S(I)formule dans laquelle:a) R1 = H - Gly—Gly - Ala - Gly - NH, H-Gly-Gly-Gly—Ala—Gly—NH ou H—Leu—Gly—Gly—Ala—Gly—NH et R2=H ou COOH, ou b) R1 =H ou NHR3, où R3=un acyle aliphatique de 1 à 6 atomes de carbone ou benzoyle, et R2=H, ou c) R1 = H—Ala—Gly—NH et R2=COOAlk, où Alk est un io groupe alcoyle à chaîne droite ou ramifiée, comportant de 1 à 14 atomes de carbone, ainsi que de ses sels acceptables en thérapeutique,caractérisé en ce qu'on cyclise par oxydation avec de l'iode ou du thiocyanogène un peptide linéaire protégé de formuleTrt—S—CH2 — CH — C—Lys(Boc)—Asn—Phe—Phe—Trp—Lys(Boc)—Thr(Bu')—Phe—Thr(Bu')—Ser(Bu')—NHCH-CH2S - TrtR4 ° (n) R2dans laquelle:a) R2=H ou COOH et R4=Boc - Gly - Gly - Ala - Gly - NH, Boc— Gly—Gly—Gly—Ala—Gly—NH ou Boc—Leu—Gly— Gly—Ala—Gly—NH, ou b) R2=H et R4=H ou NHR3, où R3 a la définition précédente,ou c) R2=COOAlk et R4=Boc—Ala—Gly—NH, Alk ayant la définition précédente,pour obtenir le dérivé disulfure cyclique correspondant de formule III :SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys(Boc)SCH2 - CH(R2) - NH - Ser(Bu') - Thr(Bu') - Phe - Thr(Bu')(III)dans laquelle R2 et R4 ont la définition donnée précédemment, avec ensuite scission hydrolytique de tous les groupes protecteurs restants sous des conditions modérément acides pour obtenir le peptide correspondant de formule I.
- 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite une solution dans de l'acide acétique du peptide linéaire de formule II, avec de l'iode en solution dans un alcanol inférieur ou de l'acide acétique, on traite le disulfure cyclique résultant de formule III avec de l'acide chlorhydrique, et on isole le peptide correspondant de formule I.20 3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on soumet le peptide linéaire de formule II à un traitement de l'iode à une température de 0 à 30° C pendant 30 à 180 mn dans un alcanol inférieur ou de l'acide acétique pour obtenir comme produit intermédiaire le disulfure cyclique correspondant de formule III. 25 4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite le produit intermédiaire, soit le disulfure cyclique de formule III, avec de l'acide chlorhydrique concentré à environ 0°C pendant 5 à 10 mn pour obtenir le peptide correspondant de formule I.30 5. Application du procédé suivant la revendication 1 à un peptide linéaire de formule II préparé par la réaction suivant la méthode de couplage à l'azide, dans laquelle on fait réagir un peptide de formule IV:Trt - SCH2CH(R4)CO - Lys(Boc) - Asn - Phe - Phe - NHNH2(IV)avec de l'acide nitreux pour obtenir l'azide correspondant qui est alors couplé sous des conditions basiques avec un peptide de formule V :40 H - Trp - Lys(Boc) - Thr(Bul) - Phe - Thr(Bu') - Ser(Bu') -NHCH(R2)CH2S-Trt (V)formules dans lesquelles R2 et R4 ont la définition donnée dans la revendication 1.
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