CH617012A5

CH617012A5 - Process for the preparation of substrates with a bimolecular coating and the use thereof.

Info

Publication number: CH617012A5
Application number: CH1185474A
Authority: CH
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: Gen Electric
Priority date: 1973-08-30
Filing date: 1974-08-30
Publication date: 1980-04-30
Also published as: JPS5070517A; SE7410971L; SE457118B; DK151240B; MX3121E; FR2257259A1; DE2440367C2; FR2257259B1; DK151240C; GB1486826A; BR7407193D0; NL177628C; AU7251474A; ATA704774A; NL177628B; NL7411596A; JPS5916669B2; DK457174A; DE2440367A1; IT1020283B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mittels komplex gebundener Proteine bimolekular beschichteten Substraten und die Verwendung derselben zum Nachweis von weiteren immunologisch reaktiven Substanzen.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bekanntes erstes Protein sich mit einem zweiten, gegenüber dem Antigen spezifischen Protein verbindet, das als Antikörper bekannt ist und so ein immunologisch komplexiertes Protein bildet. Immunologische Reaktionen, die in einem biologischen System, wie einem Tier oder einem Menschen, stattfinden, sind lebenswichtig für die Bekämpfung von Krankheiten. In einem biologischen System veranlasst der Eintritt eines Fremdproteins, d. h. des Antigens, das biologische System, die spezifischen Antikörperproteine zu dem Antigen in einem Verfahren zu erzeugen, das derzeit noch nicht völlig verstanden ist. Die Antikörper-Proteinmoleküle haben verfügbare chemische Kombinations- oder Bindestellen, welche die auf dem Antigenmolekül ergänzen, so dass sich das Antigen und der Antikörper chemisch miteinander unter Bildung des immunologisch komplexierten Proteins verbinden können.

Da Antikörper durch biologische Systeme in Reaktion auf das Eindringen von Fremdproteinen in solche Systeme erzeugt werden, ist der Nachweis von Antikörpern, die in einem biologischen System vorhanden sind, von medizinisch diagnostischem Wert für die Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnosti-shen Nachweises von Antigenen schliessen den Nachweis der HCG-Proteinmoleküle im Urin als Nachweis für die Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle (HAA) im Blut in Aussicht genommener Blutspender ein. Um solche diagnostische Untersuchungen durchzuführen, muss das geeignete Protein mindestens eines immunologisch reagierenden Paares erhalten werden.

Die einzige bekannte Quelle für ein Antikörperprotein ist ein lebendes biologisches System. Weiter ist es derzeit nur von Wirbeltieren bekannt, dass sie auf die Einführung eines Fremdproteins immunologische Reaktionen zeigen. So werden z. B. in dem Blutserum von Tieren und Menschen, die diesem entsprechenden Antigen ausgesetzt wurden, viele Antikörper gefunden. Viele Antigene können jedoch in Laboratoriumskulturen kontrollierbar hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. die mit der Hepatitis verbundenen Antigene sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höherem lebenden biologischen Systemen erhältlich.

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als wesentlichen Bestandteil, während alle Antikörper Proteine sind. Da Proteine grosse Moleküle mit hohem Molekulargewicht sind, d. h. Polymere, die aus Ketten variabler Zahlen von Aminosäuren bestehen, können das Antigen- und Antikörperprotein jedes einige Bindestellen aufweisen. Die fünf Hauptklassen von Antikörpern (Immunoglobuline IgG, IgM, IgA, IgE und IgD) sind jede augenscheinlich durch mindestens zwei schwere (lange) Peptid-ketten aus Aminosäuren und mindestens zwei leichte (kurze) Peptidketten der Säuren charakterisiert, wobei die Bindung zwischen den Aminosäureeinheiten als Peptidbindung bekannt ist. Diese schweren und leichten Peptidketten sind in der allgemeinen Gestalt des Buchstabens «Y» orientiert und die aktiven oder Kombinationsstellen sind die äussersten Enden der beiden Arme des Y-förmigen Antikörpers für den IgG-Antikörper.

Immunologische Reaktionen können mittels verschiedener Techniken nachgewiesen werden, einschliesslich dem Gebrauch eines geeigneten Substrates, wie eines metallisierten

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Glas- oder eines Metallplättchens. Setzt man das Substrat einer Lösung des Antigens aus, so wird das Antigen physikalisch in einer dichten monomolekularen Schicht auf der Oberfläche des Substrates adsorbiert. Setzt man danach das Antigen-beschichtete Substrat einem Serum aus, das Antikörper für das Antigen enthält, so führt dies zu einer immunologischen Reaktion, bei der sich die Antikörper selektiv an die Antigene anlagern mittels der Bindestellen auf dem Antikörpermolekül, die jene auf dem Antigenmolekül ergänzen und dabei mindestens eine bimolekulare Teilschicht aus immunologisch komplexiertem Protein auf der Substratoberfläche bilden.

Das Problem zeigt sich, wenn man das beschichtete Substrat, das das Antigen-Antikörper-Komplexprotein aufweist, nachfolgend einer Lösung aussetzt, die das gleiche Antigen enthält oder von der man erwartet, dass sie dieses enthält. Dieses nachfolgende Aussetzen wird im allgemeinen nicht zu einem weiteren Binden von Antigen an dem Antikörper führen, da alle aktiven Stellen der Antikörper schon an die erste Antigenschicht gebunden sind, da die aktiven Antigenmoleküle sich in sehr geringem Abstand voneinander befinden. So gibt es bei der Oberflächenimmunologie das Problem, dass sich die Antikörper an eine (Antigen-) Oberfläche binden und ihre Aktivität verlieren (d. h. ihre Fähigkeit, sich weiter mit einem Antigen, einer Zelle oder einem Virus zu verbinden).

Das weitere Problem, das sich häufig ergibt, ist die Unfähigkeit, zwischen den monomolekularen und bimolekularen Schichten aus Protein auf dem Substrat zu unterscheiden, insbesondere wenn die adsorbierte (Antigen-) Schicht relativ dick ist, wie im Falle der HAA-Schicht, da das mit der Hepatitis verbundene Antigenmolekül mindestens zehnmal so gross ist wie der Antikörper zum HAA.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung bimolekularer Schichtbeläge auf Substraten, wobei die Schicht-beläge immunologisch komplex gebundene Proteine enthalten, sowie die Verwendung dieser bimolekular beschichteten Substrate zum Nachweis weiterer immunologisch reaktiver Stoffe sind in den vorstehenden Patentansprüchen 1 und 13 definiert.

Gemäss einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein immunologisch inertes Protein zu einer Lösung hinzugegeben, die ein immunologisch reaktives Antigen enthält. Ein Substrat wird dann in die Lösung eingetaucht und die Oberfläche des Substrates wird durch Adsorption mit einer monomolekularen Schicht aus Antigenmolekülen und inerten Proteinmolekülen beschichtet. Die Menge der inerten Proteinmoleküle ist vorzugsweise ausreichend, dass die Adsorptionsschicht aus reaktiven Antigenmolekülen besteht, die durch die inerten Proteinmoleküle um durchschnittlich einige hundert Â voneinander getrennt sind. Das darauffolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in eine Lösung, die ein immunologisch reaktives Antikörperprotein spezifisch zu dem Antigenprotein enthält, führt zu einem chemischen Verbinden der Antikörpermoleküle mit den Antigenmolekülen, wobei jedoch die verbleibenden Antikörperstellen aktiv bleiben. Als Ergebnis führt das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in eine Lösung, von der man annimmt, dass sie das Antigen enthält, zu einem weiteren Binden des Antigens an die aktiven Stellen der Antikörper, die an der ersten Antigenschicht gebunden sind. Die vorliegende Erfindung kann daher bei der Analyse einer Lösung zum Nachweis der Anwesenheit eines speziellen Antigens benutzt werden. Ein nachfolgendes Eintauchen des beschichteten Substrates in Lösungen, die alternativ den gleichen Antikörper und das gleiche Antien enthalten, kann relativ lange Ketten von Antigen-Antikörper-Komplexen von der Oberfläche des Substrates aufbauen. Das Verfahren kann dazu benutzt werden, Zellen oder Viren immunologisch zu identifizieren, da die Wahrscheinlichkeit für einige der Antikörpermoleküle, an den Enden der Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe eine Antigenstelle auf bestimmten Zellen oder Viren zu finden, relativ hoch ist, ungeachtet der Irregularität der Oberfläche der Zelle oder des Virus.

Weiter wird gemäss einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein immunologisch inertes Protein zu einer Lösung hinzugegeben, die ein relativ grosses immunologisch reaktives Antigenprotein enthält. Ein Substrat wird dann in die Lösung eingetaucht und die Oberfläche des Substrates wird durch Adsorption mit einer monomolekularen Schicht aus Antigen-Proteinmolekülen und inerten Proteinmolekülen beschichtet, in der jedes Antigenmolekül im allgemeinen durch inerte Proteinmoleküle umgeben ist. Das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in eine zweite Lösung, die relativ kleine immunologisch reaktive Antikörperproteine spezifisch zu dem Antigenprotein enthält, führt zu einer chemischen Bindung der Antikörpermoleküle an die Antigenmoleküle unter Bildung mindestens einer bimolekularen Teilschicht auf dem Substrat. Die Menge der inerten Proteinmoleküle in der ersten Schicht reicht aus, um es durch den Abstand zwischen den Antigenmolekülen zu gestatten, dass mehr Antikörpermoleküle an die Antigenmoleküle gebunden werden, als wenn die Antigenmoleküle dicht zusammengepackt sind und dabei entsteht eine sehr viel grössere Änderung im Kontrast zwischen einer einzelnen und einer Doppelschicht auf einem mit zwei Proteinen beschichteten Substrat. Die Erfindung schafft so eine einfache Prozedur zur Unterscheidung zwischen einer einzigen Schicht aus einem grossen Antigen, wie dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen und einer Doppelschicht, die eine zweite Schicht aus kleinen Antikörpern einschliesst, wie dem Hepatitis-Antikörper, und sie kann so bei der Analyse der zweiten Lösung benutzt werden, um die Anwesenheit des Antikörpers damit zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 eine Seitenansicht eines Substrates, nachdem es erst in eine Lösung eines Antigens nach einem bekannten Verfahren und dann in eine Lösung des gegenüber dem Antigen spezifischen Antikörpers eingetaucht ist;

Fig. 2 eine Seitenansicht eines erfindungsgemäss hergestellten Substrates, nachdem es zwei Eintauchstufen wie in Fig. 1 unterworfen wurde, wobei jedoch das erste Eintauchen gemäss der Erfindung ausgeführt wurde;

Fig. 3 eine Seitenansicht des erfindungsgemäss hergestellten Substrates der Fig. 2 nach einer darauffolgenden immunologischen Reaktion, bei der das beschichtete Substrat in eine das gleiche Antigen enthaltende Lösung eingetaucht wurde; N-

Fig. 4 eine Seitenansicht des erfindungsgemäss hergestellten Substrates der Fig. 3 nach einem weiteren Eintauchen des Substrates in eine Lösung, die den gleichen Antikörper enthielt und bei dem die Antikörpermoleküle an den Enden der Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe Antigenstellen auf einem Virus oder einer Zelle finden, um diese immunologisch zu identifizieren;

Fig. 5 eine Seitenansicht eines Substrates, nachdem es zuerst in eine Lösung eines grossen Antigens nach einem bekannten Verfahren und dann in eine Lösung eines gegenüber dem Antigen spezifischen kleineren Antikörpers eingetaucht worden ist;

Fig. 6 eine Seitenansicht eines erfindungsgemäss hergestellten Substrates, nachdem es zwei Eintauchstufen wie in Fig. 5 unterworfen wurde, wobei jedoch das erste Eintauchen gemäss der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde;

Fig. 7 eine Seitenansicht des erfindungsgemäss hergestellten Substrates der Fig. 6 nach einer darauffolgenden

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immunologischen Reaktion, bei der das beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht wurde, die einen Antikörper zum Antikörper in der zweiten Lösung enthielt, und

Fig. 8 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäss hergestelltes Substrat, das einen engen Bereich von aktiven iner- s ten Proteinen aufweist, der von inertem Protein umgeben ist.

In Fig. 1 ist eine stark vergrösserte Seitenansicht eines Teiles der diagnostischen Apparatur in Form einer dünnen Platte 10 aus einem geeigneten Substratmaterial, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, geschmolzenes Siliciumdi- io oxyd oder ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den grössten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, gezeigt. Vorzugsweise hat das Substrat die Form eines Metall- oder metallisierten Glas-plättchens. An dem Substrat 10, wenn es in eine Lösung aus 15, im allgemeinen Salzwasser, das ein erstes interessierendes Protein enthält, welches biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann, eingetaucht wird, haftet durch Adsorption eine monomolekulare Schicht 11. Für den Zweck der vorliegenden Beschreibung wird die auf der Oberfläche des Sub- 20 strates 10 adsorbierte Schicht 11 im nachfolgenden als Antigenschicht beschrieben. ledes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, doch findet eine weitere Adsorption nicht statt, d. h. das Protein haftet zwar an dem Substrat, nicht jedoch an sich selbst. So kann daher ^ die Antigen-Proteinschicht 11 nur monomolekular und nicht von grösserer Dicke sein. Die für das vollständige Beschichten des Substrates mit dem Antigenprotein erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung, des Grades des Rührens der Lösung und der 3o Lösungstemperatur. So bedeckt z. B. eine l%ige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in etwa 30 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Antigen-Proteinschicht.

Nachdem die monomolekulare Schicht des Antigenpro-teins 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 gebildet ist, wird das beschichtete Substrat aus 35 der Lösung des Antigenproteins herausgenommen und als nächstes in eine Lösung eingetaucht, die das gegenüber dem Antigenprotein spezifisch reagierende Antikörperprotein enthält oder von der man vermutet, dass sie dieses enthält.

Diese zweite Lösung kann zusätzlich zu dem spezifisch 40

reagierenden Antikörperprotein, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll, viele Bestandteile enthalten. Es wird jedoch kein anderes Protein als das spezifisch reagierende Antikörperprotein an der ersten Antigenproteinschicht auf dem Substrat haften. Daher wird nur dann, wenn das spe- 45 zifisch reagierende Antikörperprotein in der zweiten Lösung vorhanden ist, ein immunologisches Komplexieren zwischen dem Antigen und seinem spezifisch reagierenden Antikörper stattfinden, und das Substrat wird nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht aufweisen. 50 Die für die Adhäsion der zweiten (Antikörper-) molekularen Schicht 12 auf dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung, des Grades der Lösungsbewegung und der Lösungstemperatur. Für Antikörper in 55 Blutserum kann diese Zeit etwa bis zu einem Tag betragen. Die zweite Schicht kann in Abhängigkeit von den oben genannten drei Faktoren nur eine Teilschicht oder eine im wesentlichen vollständige Schicht sein.

Wie in Fig. 1 dargestellt, benutzen in dem Falle, in dem 60 die Antigenschicht 11 im wesentlichen vollständig das Substrat 10 bedeckt, d. h. wenn der Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen sehr gering ist, die Antikörpermoleküle im wesentlichen alle ihre Kombinationsstellen, um sich mit den Antigenmolekülen zu verbinden und verlieren 65 so ihre Aktivität, d. h. im wesentlichen alle aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen 12 verbinden sich mit entsprechenden aktiven Stellen auf den Antigenmolekülen 11. Dieses

Substratbeschichtungsverfahren ist in der CH-PS 579 777 beschrieben.

Da die monomolekulare Antigenschicht 11 über im wesentlichen die gesamte Oberfläche des Substrates 10 in Fig. 1 adsorbiert ist, verbindet sich die zweite Schicht 12 des spezifischen Antikörpers für dieses Antigen unter Bildung der bimolekularen Schicht damit und ein weiteres Kombinieren mit zusätzlichem Protein, sei es Antigen oder Antikörper, ist nicht möglich, da keine weiteren aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen in Schicht 12 vorhanden sind. In der vorliegenden Erfindung wurde nun ein Verfahren gefunden, durch das die Antikörpermoleküle in der zweiten Schicht 12 mit den Antigenmolekülen in der ersten Schicht 11 verbunden werden können und gleichzeitig verbleibende aktive Stellen für eine weitere Verbindung mit anderen Antigenmolekülen in einer weiteren immunologischen Reaktion aufweisen. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 2 dargestellt. Zur Illustration sind die darin abgebildeten Antikörper solche der IgG-Klasse, doch gibt es keine Gründe, aus denen Antikörper der anderen vier Hauptklassen, die oben genannt sind, in der vorliegenden Erfindung nicht benutzt werden können.

Nach Auswahl des Substrates 10, auf dem der multimolekulare immunologisch komplexierte Film gebildet werden soll, wird dieses Substrat im allgemeinen in eine Lösung aus Salzwasser eingetaucht, die das Antigen enthält, wie im Falle des im Zusammenhang mit Fig. 1 beschriebenen Verfahrens. Im Unterschied zu diesem bekannten Verfahren wurde jedoch ein immunologisch inertes Protein zu der ersten Lösung vor dem Eintauchen des Substrates in diese Lösung hinzugegeben, so dass die auf der Oberfläche des Substrates

10 gebildete Adsorptionsschicht aus reaktiven Antigen-Proteinmolekülen 11 besteht, die voneinander und entlang der Substratoberfläche umgeben sind durch inerte Proteinmoleküle 20, wie in Fig. 2 gezeigt. Die Menge des zu der Lösung hinzugegebenen immunologisch inerten Proteins reicht aus, dass der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen 11, die an dem Substrat 10 haften, im allgemeinen bei einigen hundert Â liegt.

Das (mit Antigen und Inertprotein) monomolekular beschichtete Substrat 10 wird dann aus der ersten Lösung entfernt und in eine zweite Lösung eingetaucht, die spezifischen Antikörper zum Antigen der ersten Lösung enthält. Da der Abstand zwischen den aktiven Stellen eines Antikörpermoleküls 12 (der IgG-Klasse) etwa 200 Â beträgt, wird ein grosser Anteil der Antikörpermoleküle 12 mit der zweiten Lösung, die sich mit den Antigenmolekülen 11 verbinden, aktive Bindestellen behalten (es kann mehr als eine verbleibende Bindestelle pro Molekül existieren je nach der speziellen Klasse des Antikörpermoleküls) für "eine weitere Kombination mit zusätzlichen Antigenmolekülen in einer nachfolgenden immunologischen Reaktion. Irgendein Antikörpermolekül kann sich natürlich nicht mit mehr als einer aktiven Stelle auf irgendeinem Antigenmolekül verbinden. Wie in Fig. 2 gezeigt, werden die Antikörpermoleküle 12 aufgrund des ausreichenden Abstandes zwischen den benachbarten Antigenmolekülen 11 durch die dazwischenliegenden immunologisch inerten Proteinmoleküle 20 an die Antigenmoleküle

11 gebunden, und im allgemeinen verbleibt jedem Antikörpermolekül 12 eine aktive Bindungsstelle 12a für eine nachfolgende immunologische Reaktion. Ist das aktive Antigen z. B. menschliches Serumalbumin, dann ist ein Beispiel für das immunologisch inerte Protein Eialbumin und die Antikörper werden aus Kaninchenserum erhalten. Im Falle einer l%igen Albuminlösung aus menschlichem Serum beträgt die Konzentration des inerten Eialbuminproteins darin

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Nachdem das Substrat 10 aus der Antikörperlösung herausgenommen worden ist (d. h. nach den in Fig. 2 gezeig

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ten Stufen) kann das bimolekular beschichtete Substrat weiterverwendet werden, indem es als nächstes in eine Lösung eingetaucht wird, die das gleiche Antigen wie die erste Lösung enthält oder in der man solches Antigen vermutet und diese Antigenmoleküle 30 werden selektiv an die verbleibenden aktiven Stellen 12a der Antikörpermoleküle 12 in einer weiteren immunologischen Reaktion gebunden. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. Diese Verwendung kann so dazu benutzt werden, bei der Analyse einer Lösung leicht die Anwesenheit eines speziellen Antigens nachzuweisen. Andererseits kann diese Verwendung auch dazu benutzt werden, verschiedene Ketten abwechselnder Antigen-Antikörper-Moleküle aufzubauen, in denen jede Kette ihren Ursprung an der Oberfläche des Substrates 10 hat, und einen multimolekularen immunologisch komplexierten Film verschiedener Ketten alternierender Antigen-Antikörper-Moleküle darauf zu bilden. Der multimolekular komplexierte Film wird leicht nachgewiesen durch Betrachten des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie einem Eilipsometer. Andererseits kann der multimolekular komplexierte Film auch elektrisch durch Messen der Kapazität eines Kondensators mit leitenden Platten, die durch das Metall oder metallbeschichtete Substrat und einen Quecksilbertropfen oder eine andere geeignete Elektrode gebildet werden, untersucht werden, wobei die Proteinschichten das Kondensator-Dielektrikum sind, wie in der CH-PS 579 777 im einzelnen beschrieben ist. Weiter ist in dieser CH-Patentschrift das Verfahren zum optischen Untersuchen durch einfache visuelle Beobachtung durch Bestimmen der Zeit beschrieben, bevor ein sichtbares Amalgam zwischen einem Quecksilbertropfen und dem das Substrat beschichtenden Metallfilm durch die dazwischenliegenden Proteinschichten hindurch gebildet wird. Schliesslich, und dies hat die grösste Bedeutung, kann der multimolekular komplexierte Film auch optisch im reflektierten oder durchgehenden Licht untersucht werden, wie ebenfalls in der genannten CH-PS 579 777 beschrieben ist. Bei dieser letztgenannten optischen Untersuchung durch reflektiertes oder durchgehendes Licht ist das folgende eine erste Technik mit durchgehendem Licht, die erfolgreich angewendet worden ist: Das Substrat 10, das ein lichtdurchlässiges Substrat sein muss, wie Glas, Kunststoff, geschmolzenes Siliciumdioxyd, Glimmer, Quarz oder ähnliches und das vorzugsweise Glas ist, wobei Objektträger eine bequem erhältliche Ausführungsform sind, wird zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen durch Aufdampfen eines Metalles, z. B. Indium, auf das Substrat bedeckt. Das Indium wird z. B. langsam aus einem Tantaltiegel auf das Glassubstrat in einem gewöhnlichen Vakuum von etwa 5 X 10 ~s mm Hg verdampft. Da die Indiumatome eine hohe Beweglichkeit auf der Oberfläche des Substrates haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Irgendein Metall mit ähnlichen Eigenschaften, so dass es bei seiner Verdampfung auf das Substrat ebenfalls Kügelchen bildet, kann verwendet werden. Ausser Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich angewendet worden. Das Aufdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat leicht braun gefärbt erscheint. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Grössenordnung von 1000 Â. Die genaue Grösse der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben gleich einem grossen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes. Die nächste Stufe ist das Eintauchen des Kügelchen-beschichte-ten Substrates 10 in eine erste Lösung eines ersten immunologisch reaktiven Proteins, wie des Antigens 11 und des Inertproteins 20. Das erste reaktive Protein und das Inertprotein haften wieder in einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Wenn sich eine monomolekulare Schicht gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der ersten Lösung herausgenommen und in eine zweite Lösung eingetaucht, die das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein 12 enthält und das Ergebnis ist das Haften einer bimolekularen Proteinschicht ähnlich der in Fig. 2 gezeigten auf dem Substrat und den Metallkügelchen. Dann nimmt man das beschichtete Substrat aus der zweiten Lösung und taucht es in eine dritte Lösung, welche das reaktive Protein der ersten Lösung enthält oder vermutlich enthält. Ist dieses Protein vorhanden, dann wird eine dritte Schicht oder Teilschicht auf dem Substrat gebildet. Das beschichtete Substrat wird dann im durchfallenden Licht betrachtet und vom Aussehen des beschichteten Substrates wird die Dicke der daran haftenden Proteinschicht bestimmt und demgemäss, ob das erwartete Protein in der Lösung vorhanden war oder nicht. Der Nachweis der Proteinschichten entspricht den Variationen des Brauntones, der in dem beschichteten Substrat beobachtet wird. Diese Variationen sind recht deutlich und der Nachweis der Proteinschichten ist daher eine einfache Prozedur. Die Kügelchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Braunton, die mit einer monomolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelchen erscheinen als dunklerer Braunton und die mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelschen erscheinen als noch dunklerer Braunton und schliesslich sind die mit einer trimolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelchen noch brauner. Diese Nachweismethode beruht auf der Tatsache, dass elektromagnetische Strahlung zu einem starken Grade durch leitende Kugeln mit Durchmessern gleich einem grossen Anteil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und dass im Falle der Streuung durch solche Kügelchen die Streuung stark durch eine dünne dielektrische Schicht auf den Kügelchen beeinflusst wird. Eine zweite Technik für die optische Untersuchung mit reflektiertem Licht, die erfolgreich angewendet worden ist, ist die folgende: Ein Goldsubstrat, das aus Wirtschaftlichkeitsgründen vorzugsweise aus einer dünnen Goldschicht auf einem anderen Metall besteht, hat daran adsorbiert eine monomolekulare Schicht des ersten reaktiven Proteins 11 und des inerten Proteins 20 nach dem Eintauchen in die oben näher bezeichnete erste Lösung. Gold hat ein Absorptionsband innerhalb des sichtbaren Spektrums und diese Tatsache ist bestimmend für die charakteristische Goldfarbe und gestattet die Ausführung dieser speziellen optischen Untersuchungstechnik. Das Goldsubstrat kann bequemerweise ein Glas-Objektträger sein, der mit einer dünnen Indiumschicht bedeckt ist und darüber eine Goldschicht aufweist, wobei die Indiumschicht sowohl die Adhäsion zwischen dem Glas und dem Gold verbessert als auch die optischen Eigenschaften des Objektträgers. Das relative Reflexionsvermögen des Goldsubstrates als Funktion der Wellenlänge führt dazu, dass das Substrat die charakteristische hellgelbe Farbe des Goldmetalles hat, wenn nicht irgendeine Proteinschicht darauf haftet. Bei Anwesenheit einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat hat der Objektträger (Substrat) ein dunkelgelbes Aussehen. Nachdem man den Objektträger einer Lösung ausgesetzt hat, der das gegenüber dem Protein 11 immunologisch reagierende Protein 12 enthält und der Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht aufweist, ergeben die Reflexionseigenschaften ein grünliches Aussehen. Eine dritte Proteinschicht führt zu einem noch grünlicheren Aussehen. In Tests, die bisher durchgeführt worden sind, scheinen die optischen Untersuchungen des beschichteten Substrates durch reflektiertes oder durchgehendes Licht, bei denen ein Metallkügelchen aufweisendes Substrat oder ein Goldsubstrat verwendet werden, die im allgemeinen brauchbarsten Methoden zu sein. Weiter wurde festgestellt, dass diese beiden Techniken verschiedene Empfindlichkeiten als Funktionen der Dicke der interessierenden Proteinfilme aufweisen. Im Einzelfalle liegt die

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grösste Empfindlichkeit bei der Technik mit einem Substrat, das Metallkügelchen aufweist, bei Filmdicken unterhalb etwa 200 Â. Die grösste Empfindlichkeit des Goldsubstrates liegt bei Filmdicken, die grösser sind als 30 Â. Die im Einzelfalle angewendete Nachweismethode bestimmt so die Art des angewendeten Substrates 10 in jeder Analyse, d. h. ob das Substrat ein Metall oder ein metallisierter Glasobjektträger ist, das eine flache Metallbeschichtung (aus Gold als einem Beispiel) oder Metallkügelchen (aus Indium als einem Beispiel) auf der Oberfläche aufweist, wie auch oben erläutert. Der Einfachheit halber ist das Substrat 10 als eine flache Oberfläche aufweisend illustriert, obwohl die Oberfläche, an der die erste Antigenschicht adsorbiert ist, auch die vorgenannten Metallkügelchen enthalten könnte.

Die Verwendung zur Bildung multimolekularer Schichten immunologisch komplexierter Proteine, wie es in Fig. 3 abgebildet ist, ist besonders von Bedeutung beim Untersuchen einer Lösung auf gewisse Proteine, z. B. ein Hormon, da Hormone und Antiserum für Hormone im allgemeinen erhältlich sind. Wenn daher die dritte Schicht das interessierenden Hormon ist, ist es leicht nachweisbar.

Schliesslich ist das Bilden multimolekularer, immunologisch komplexierter Schichtbeläge auch von Bedeutung beim immunologischen Identifizieren von Zellen oder Viren. Wie in Fig. 4 illustriert, ist es durch die erfindungsgemässe Verwendung möglich, eine Vielzahl von Ketten aus Antigen-Antikörper-Komplexen von den Oberflächen des Substrates 10 aufzubauen, so dass die Wahrscheinlichkeit für die verschiedenen Antikörpermoleküle an den Enden der verschiedenen Ketten relativ hoch ist, eine Antigenstelle auf einer Zelle oder einem Virus 40 zu finden. Und diese Wahrscheinlichkeit bleibt hoch, unabhängig von der Irregularität der Oberfläche der Zelle oder des Virus. Wie bekannt, weist die Zellmembran, die jede Zelle einschliesst, sich nach aussen erstreckende Moleküle auf, die als «Transplantations»-Anti-gene bezeichnet werden. Diese Antigene sind die, die dazu benutzt werden, die erste Schicht 11 in einem Zweischichtensystem für die immunologische Identifizierung von Zellen zu bilden, wobei die interessierenden Zellen die dritte Schicht darstellen würden. Im Falle eines Vierschichtensystems aus Antigen-Antikörper-Ketten, wie es in Fig. 4 abgebüdet ist, würden die erste und die dritte Schicht (11 und 30) aus den Transplantations-Antigenen bestehen. Es ist ebenfalls bekannt, dass ein Virus eine Proteinschicht aus Proteinmolekülen aufweist, die aufgespalten und getrennt werden können und solche Moleküle werden zur Bildung der ersten bzw. ersten und dritten Schicht in Zwei- bzw. Vierschichtensystemen von Antigen-Antikörper-Ketten verwendet, die man zum immunologischen Identifizieren eines Virus 40 benutzt. Die Antikörper 12 in der zweiten Schicht und 41 in der vierten Schicht würden natürlich spezifisch zu der speziellen Zelle oder dem speziellen Virus sein, das untersucht wird.

Aufgrund der vorliegenden Beschreibung ist es klar, dass die vorliegende neue Methode wichtig für das Binden von Antikörpern an eine Oberfläche ist, so dass sie aktiv bleiben und multimolekulare immunologisch komplexierte Filme auf einem Substrat bilden können. Das Eintauchen eines geeigneten Substrates in die erste Lösung bildet durch Adsorption auf den Oberfläche des Substrates eine monomolekulare Schicht aus reaktiven Antigen-Proteinmolekülen, die durch die inerten Moleküle voneinander getrennt sind. Die Bildung einer solchen speziellen monomolekularen Schicht gestattet dann das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in eine zweite Lösung, die den zum ersten Antigen spezifischen Antikörper enthält, so dass die Antikörpermoleküle an die Antigenmoleküle gebunden werden und gleichzeitig weitere aktive Stellen frei haben, um in nachfolgenden immunologischen Reaktionen verwendet zu werden. Das beschichtete Substrat kann auch nachfolgend in eine Lösung eingetaucht werden, die das gleiche Antigen wie die erste Lösung enthält oder in der man dieses Antigen vermutet, und diese Prozedur kann wiederholt werden, um einen Aufbau verschiedener Ketten abwechselnder Antigen-5 Antikörpermoleküle zu verursachen.

In Fig. 5 ist eine stark vergrösserte Seitenansicht eines Teiles der diagnostischen Apparatur in Form einer dünnen Platte 10 aus einem geeigneten Substratmaterial gezeigt, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, geschmolzenes Silicium-dioxyd, Quarz oder ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den grössten Unterschied im Brechungsindex zum Protein aufweist, und vorzugsweise liegt das Substrat in Form eines Metall- oder metallisierten Glasplätt-chens vor. Wird das- Substrat 10 in eine erste Lösung allge-15 mein aus Salzwasser eingetaucht, die das erste interessierende Protein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann, wird dieses auf dem Substrat in einer monomolekularen Schicht 11 adsorbiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erläuterung wird die an der Oberfläche des 20 Substrates 10 adsorbierte Schicht 11 nachfolgend als Antigenschicht beschrieben. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbieren, doch findet eine weitere Adsorption nicht statt, d. h. das Protein haftet an dem Substrat, jedoch nicht an sich selbst. Die Antigen-Protein-25 schicht 11 kann daher nur monomolekular sein und keine grössere Dicke aufweisen. Die für das vollständige Beschichten des Substrates mit dem Antigenprotein erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung, des Grades des Rührens der Lösung und der Lö-30 sungstemperatur. So beschichtet z. B. eine Konzentration von 1 mg/cm3 des mit der Hepatitis verbundenen Antigens einen Objektträger in etwa 10 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Antigen-Proteinschicht.

Nachdem sich die monomolekulare Schicht des Antigen-35 proteins 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des Antigenproteins entfernt und als nächstes in eine zweite Lösung eingetaucht, die das mit dem Antigenprotein spezifisch reagierende Antikörperprotein ent-40 hält oder vermutlich enthält. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass das an der Oberfläche des Substrates 10 adsorbierte Protein 11 immer grösser ist als das damit immunologisch reaktive Protein, das eine zweite Schicht auf dem Substrat bildet. Die zweite Lösung 45 kann zusätzlich zu dem spezifisch reagierenden kleineren Antikörperprotein, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll, viele Bestandteile enthalten. Es wird jedoch kein anderes Protein als das spezifisch reagierende Antikörperprotein an der ersten Antigen-Proteinschicht auf dem Sub-50 strat haften. Es wird daher nur dann ein immunologisches Komplexieren zwischen dem Antigen und seinem spezifisch reagierenden Antikörper stattfinden, und das Substrat wird nach einer gewissen Zeit nur dann eine bimolekulare Proteinschicht tragen, wenn das spezifisch reagierende Antikörper-5S protein in der zweiten Lösung vorhanden ist. Die für die Adhäsion der zweiten (Antikörper-) molekularen Schicht 12 auf dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wiederum eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung, des Grades der Lösungsbewe-60 gung und der Lösungstemperatur. Für Antikörper im Blutserum kann diese Zeit bis zu einem Tag betragen. Die zweite Schicht kann je nach den drei oben genannten Faktoren entweder nur eine Teilschicht oder eine im wesentlichen vollständige sein.

6S In dem Falle, wie er in Fig. 5 dargestellt worden ist, in dem die Antigenschicht 11 im wesentlichen vollständig das Substrat 10 bedeckt, d. h. wenn der Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen sehr gering ist, ist die Zahl der

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Antikörpermoleküle 10, die an irgendeinem bestimmten Antigenmolekül gebunden werden kann, wegen der begrenzten Oberfläche des Antigenmoleküls, die für solche immunologische Reaktionen verfügbar ist, begrenzt. Dieses Substrat-beschichtungsverfahren ist in der oben genannten CH-PS 5 Nr. 579 777 beschrieben.

Da die monomolekulare Antigenschicht 11 über im wesentlichen die gesamte Oberfläche des Substrates 10 in Figur 5 adsorbiert ist, verbindet sich die zweite Schicht 12 aus dem kleineren spezifischen Antikörper für dieses Antigen in io einer dünnen Schicht unter Bildung einer bimolekularen Schicht damit. Da jedoch die Proteine der zweiten Schicht 12 eine geringere Grösse haben als die Proteine der ersten Schicht 11 und weil demgemäss die zweite Schicht weniger dicht ist als die erste (Antigen-) Schicht, ist es klar, dass es jj beträchtliche Schwierigkeiten bei dem Unterscheiden zwischen dieser einzelnen und der Doppelproteinschicht auf dem Substrat 10 geben kann. Ein gutes Beispiel für diese Situation ist der Fall, dass die erste Schicht 11 aus dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen besteht und die zweite Schicht 29 12 aus dem spezifischen Antikörper zum HHA. Die Untersuchung des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie dem Eilipsometer, gestattet einem nicht leicht zwischen der einzelnen (Antigen-) und einer Teil- oder verdünnten Doppel-(Antigen-Antikörper-Komplex) Schicht 25 auf dem Substrat zu unterscheiden, und so kann nicht leicht bestimmt werden, ob die zweite Lösung tatsächlich irgendeinen der Antikörper zum HAA enthielt und so ist ein solches diagnostisches Verfahren von geringem Wert. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren gefunden, mit ^ dem eine sehr viel grössere Zahl von Antikörpermolekülen in der zweiten Schicht 12 an die Antigenmoleküle der ersten Schicht 11 gebunden werden kann, so dass eine sehr viel grössere Änderung im Kontrast zwischen der einzelnen und der Doppelschicht verursacht wird. Das erfindungsgemäss hergestellte Substrat ist auch in Fig. 6 dargestellt. 35

Nach dem Auswählen des Substrates 10, auf dem der bimolekulare immunologische Komplexfilm gebildet werden soll, wird dieses Substrat in eine erste Lösung eingetaucht, die allgemein aus Salzwasser besteht, das das Antigen enthält, wie dies im Falle des Verfahrens im Zusam- 40 menhang mit Fig. 5 beschrieben wurde. Im Gegensatz zu diesem vorherigen Verfahren wurde jedoch hier vor dem Eintauchen des Substrates in die Lösung ein immunologisch inertes Protein zu der ersten Lösung hinzugegeben, so dass die auf der Oberschicht des Substrates 10 gebildete 45 Adsorptionsschicht aus relativ grossen reaktiven Antigen-proteinmolekülen 11 besteht, die entlang der Substratoberfläche voneinander getrennt und umgeben sind von inerten Proteinmolekülen 20, wie in Fig. 6 gezeigt. Die inerten Proteinmoleküle 20 haben eine Grösse, die mindestens etwas 30 geringer ist und vorzugsweise beträchtlich geringer als die der Antigenmoleküle 11, um die grösstmögliche Oberfläche und damit mehr Bindestellen der Antigenmoleküle 11 für das nachfolgende Verbinden mit den Antikörpermolekülen erreichbar zu machen. Die Menge des immunologisch inerten 35 Proteins 20, die zu der Lösung hinzugegeben wird, ist ausreichend, um im allgemeinen mit dem inerten Protein 20 i/2 bis 9/io der Fläche der vollständigen Adsorptionsschicht zu bedecken, d. h. das Antigen bedeckt dementsprechend Va bis V10 der Fläche, obwohl dies keine Begrenzung der vorlie- m genden Erfindung darstellt, da der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen auch durch die Zahl der aktiven Stellen auf dem jeweiligen Antigenmolekül und der Art, in der solche Moleküle an dem Substrat haften, bestimmt ist, d. h. der Zahl der aktiven Antigenstellen, 65 die freiliegen. In dem Falle, in dem das Antikörpermolekül 12 sehr viel kleiner ist als das Antigen, ist ein grösserer Abstand der Antigenmoleküle erwünscht, während bei einem nur leicht kleineren Antikörpermolekül gegenüber dem Antigen ein geringerer Abstand zwischen den Antigenmolekülen toleriert werden kann, um den maximalen Vorteil der vorliegenden Erfindimg zu erhalten. Als ein Ergebnis des grossen Antigenproteins relativ zum inerten Proteinmolekül wird ein Hauptanteil der Oberfläche des Antigenmoleküls frei bleiben und seine entsprechenden Bindestellen sind für eine Kombination mit Antikörpermolekülen in einer nachfolgenden immunologischen Reaktion zugänglich.

Das (mit Antigen- und Inertprotein) monomolekular beschichtete Substrat 10 wird dann aus der ersten Lösung entfernt und in eine zweite Lösung eingetaucht, die die für das Antigen der ersten Lösung spezifischen Antikörper enthält. Als Resultat der grösseren Oberfläche und der zahlreicheren Antigenstellen, die auf den Antigenen freiliegen, da die Antigene durch die kleineren Inertproteine in Fig. 6 umgeben sind, verglichen mit Fig. 5 können die Antigenmoleküle in Fig. 6 leichter immunologisch mit einer grösseren Anzahl von Antikörpern als in Fig. 5 kombinieren.

Wie in Fig. 6 gezeigt, wird daher eine grössere Zahl von Antikörpermolekülen 12 im allgemeinen mit jedem Antigenmolekül kombinieren als im Falle der Fig. 5, und es ist aus dem Vergleich der Fig. 5 und 6 offensichtlich, dass wegen der grösseren Zahl von Antikörpermolekülen, die in der zweiten Schicht vorhanden ist, eine sehr viel grössere Änderung im Kontrast zwischen der einzelnen und der Doppelschicht in der Ausführungsform der Erfindung der Fig. 6 erhalten wird. So hat z. B. die erste Lösung eine solche Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens (HAA) und des Rinderserumalbumins (BSA), welches das inerte Protein ist, dass das HAA V4 der Oberfläche in der monomolekularen Schicht und das inerte BSA-Protein die verbleibenden 3A der Oberfläche bedeckt und die zweite Lösung ist eine verdünnte Lösung des HAA-Antikörpers. Das oben beschriebene Verfahren kann daher bei der Analyse dazu benutzt werden, leicht die Anwesenheit eines spezifischen Antikörpers zu einem besonderen, relativ grossen Antigen nachzuweisen.

Das mit einer Doppelschicht bedeckte Substrat der Figur 6 kann danach verwendet werden, um in eine dritte Lösung oder ein Serum eingetaucht zu werden, das Antikörper 30 zu den Antikörpern 12 der zweiten Schicht enthält, um eine dritte Schicht aufzubauen, wie dies in Fig. 7 dargestellt ist. Da jedes Antikörpermolekül 12 verschiedene Antigen-determinanten hat, kann es im allgemeinen mit verschiedenen Molekülen 30, die Antikörper zu den Antikörpern 12 sind, kombinieren und dabei eine relativ dicke dritte Schicht aus solchen zweiten Antikörpermolekülen 30 bilden. Die Anwesenheit der dichten dritten Schicht 30 zeigt die Anwesenheit der zweiten Schicht 12 und schafft so einen noch grösseren Kontrast zwischen der monomolekularen und der bimolekularen Schicht aus Antigen und erstem Antikörper. Im letzteren Falle helfen die inerten Proteinmoleküle 20 zwischen den grossen Antigenmolekülen 11 in der ersten Schicht auch mit, ein Haften nichtspezifischen Proteinmaterials in dem Serum, das die Antikörper zu dem Antikörper eines solchen Antigens enthält, an dem Substrat zu verhindern. So wird ein zweifacher Gewinn erzielt, indem mehr spezifisch gebundene Antikörper für jedes Antigenmolekül erhalten werden und weniger nicht-spezifisch gebundenes Protein auf dem Substrat vorhanden ist, und all dies resultiert aus dem Gebrauch des Inertproteins, um die grossen Antigenmoleküle im Abstand voneinander zu halten und die Oberfläche des Substrates, die jedes Antigenmolekül umgibt, mit solchem inerte Protein zu bedecken. Die zur Bildung der dritten Schicht in Fig. 7 angewendete Prozedur ist daher brauchbar bei der Analyse der zweiten Lösung, von der man annimmt, dass sie Antikörper 12 enthält, da das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in die

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dritte Lösung einen beträchtlich verstärkten Kontrast schafft zwischen der monomolekularen Schicht und der bimolekularen, die tatsächlich nun eine trimolekulare Schicht ist, wenn eine bimolekulare Schicht aufgrund der Tatsache vorhanden war, dass die zweite Lösung tatsächlich den Antikörper 12 enthielt.

Die Anwesenheit der zweiten (Antikörper 12) Proteinschicht in der Ausführungsform der Fig. 6, die auch durch die dritte (Antikörper 30) Proteinschicht in Fg. 7 angedeutet ist, kann leicht nachgewiesen werden durch Betrachten des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie einem Eilipsometer. Die Proteinschichten können andererseits auch elektrisch untersucht werden, wie dies im einzelnen in der oben genannten CH-PS 579 777 beschrieben ist, indem man die elektrische Kapazität eines Kondensators misst, der leitende Platten aufweist, die aus dem Metall- oder metallbeschichteten Substrat und einem Quecksilbertropfen oder einer anderen geeigneten Elektrode gebildet sind und bei dem das Kondensator-Dielektrikum durch die Proteinschicht gebildet wird. Weiter können die Proteinschichten, wie oben bezüglich des multimolekularen komplexierten Filmes beschrieben, auch optisch untersucht werden, indem man sie visuell beobachtet und dabei die Länge der Zeit bestimmt, bevor ein sichtbares Amalgam zwischen einem Quecksilbertropfen und dem Metallfilm auf dem Substrat gebildet wird, wobei sich die Proteinschichten dazwischen befinden. Schliesslich, und diese Art der Untersuchung ist die bedeutendste, können die Proteinschichten auch optisch mit reflektiertem oder durchgehendem Licht untersucht werden, wie oben mit Bezug auf den multimolekularen komplexierten Film beschrieben. Im Falle der Proteinschichten wird das beschichtete Substrat dann aus der zweiten Lösung herausgenommen und in eine dritte Lösung eingetaucht, die ein reaktives Protein bezüglich des reaktiven Proteins in der zweiten Lösung enthält (wie einen Antikörper zu dem Antikörper), um eine dritte Schicht (oder eine Teilschicht) auf dem Substrat zu bilden, wenn die zweite Schicht vorhanden ist. Das beschichtete Substrat wird dann mit durchgehendem Licht beobachtet und von dem Aussehen des beschichteten Substrates wird eine Bestimmung der Dicke der am Substrat haftenden Proteinschicht gemacht und dementsprechend eine Bestimmung hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit des zweiten Proteins 12.

Der Kontrast zwischen einfachen und Doppelprotein-schichten kann zu einem noch grösseren Ausmass verstärkt werden, indem man das Antigen und inerte Protein auf das Substrat 10 als einen einzelnen Lösungstropfen aufbringt und danach das tropfbeschichtete Substrat in eine Lösung eintaucht, die nur das inerte Protein 20 enthält, um eine monomolekulare Schicht zu bilden, in der der kleine Anti-gen-Inertprotein-Bereich vollständig von dem Inertprotein umgeben ist, wie in Fig. 8 dargestellt. Diese Ausführungsform löst das Problem der nicht-spezifischen Adsorption für den Fall, dass Antikörper in einem Serum vorhanden sind, da das Inertprotein auf der Oberfläche des Substrates die nicht-spezifischen Proteine in dem Serum an einem Haften an dem Substrat hindert und so den Kontrast verbessert.

Schliesslich ist die oben beschriebene Prozedur von Bedeutung bei der immunologischen Identifizierung von Viren und Enzymen. Alle Antigene des Virustyps sind grösser als ihre spezifischen Antikörper, während die Antigene des Enzymtyps grösser oder kleiner sein können, je nach der spezifischen Enzymart. Eine Prozedur für die Identifizierung eines speziellen Virus oder eines grossen Enzyms, die als Inhibitionstest bekannt ist, wird in folgender Weise ausgeführt:

Ein spezielles Virus oder grosses Enzym wird in eine erste Lösung (allgemein Salzwasser) zusammen mit dem Inert-protein eingebracht und in diese Lösung wird das Substrat eingetaucht oder es wird ein Tropfen der Lösung auf dem Substrat angeordnet und das Substrat dann in eine Lösung von nur dem Inertprotein eingetaucht. Nachdem eine monomolekulare Schicht des Virus oder Enzyms (d. h. des Antigens) und des Inertproteins an dem Substrat adsorbiert wurde, entfernte man das beschichtete Substrat aus der ersten Lösung. Proben menschlichen Serums, die auf die Anwesenheit des speziellen Virus oder Enzyms getestet werden sollen, werden vorbereitet durch Einmischen einer Menge bekannter Antikörper zu dem spezifischen Virus oder Enzym, und zwar in einer ausreichenden Menge, um dieses immunologisch aus der Mischung zu entfernen, wenn das Virus oder Enzym in der Serumprobe vorhanden ist. Das monomolekular beschichtete Substrat wird dann in die vorher zubereitete Serumprobe eingetaucht oder ihr ausgesetzt und nach dem Entfernen davon gemäss irgendeiner der oben beschriebenen Prozeduren untersucht. Wenn die Betrachtung des Substrates das Vorhandensein nur einer monomolekularen Schicht darauf anzeigt, dann weiss man, dass das untersuchte menschliche Serum ursprünglich das spezielle Virus oder Enzym enthielt. Wird jedoch eine bimolekulare Schicht nachgewiesen, dann zeigt dies, dass das Serum ursprünglich solches Virus oder grosse Enzymantigen nicht enthielt, da die Antikörper sich nicht immunologisch mit ihrem spezifischen Antigen (Virus oder Enzym) in der Serumprobe verbanden und sie daher in der Lage waren, sich mit dem Antigen der auf dem Substrat adsorbierten ersten Schicht zu verbinden.

Aufgrund der vorstehenden Beschreibung ist klar, dass das erfindungsgemäss erhaltene Substrat zur Verbesserung des Kontrastes in immunologischen Oberflächentests zwischen einer Einzel- und einer Doppelschicht aus Protein beiträgt.

Neben den spezifischen Ausführungsformen und Beispielen, die beschrieben wurden, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung noch verschiedene Modifikationen und Variationen möglich. So könnte z. B. das inerte Protein in einer Lösung getrennt von dem Antigen verwendet werden, und das Substrat würde in diese separate Lösung als Vorstufe der Antigen- und der Antikörperlösung eingetaucht werden.

Die Erfindung kann auch dazu benutzt werden, Enzyme nachzuweisen, indem man eine verdünnte Lösung des Enzyms benutzt, um die Antigene in der ersten Schicht zu erhalten und Rinderserumalbumin als das Inertprotein zu der ersten Lösung hinzugibt und eine Lösung eines Antikörpers zu dem Enzym (von einem Kaninchen, dem zuvor das Enzym injiziert worden ist) in der zweiten Lösung benutzt und dann das bimolekular beschichtete Substrat in eine dritte Lösung eintaucht, von der man annimmt, dass sie das Enzym enthält und man dann anschliessend das Substrat auf die Anwesenheit einer dritten Schicht untersucht, die aus dem speziellen Enzym gebildet werden würde. Obwohl das auf der Substratoberfläche adsorbierte reaktive Protein als ein Antigen beschrieben worden ist, ist es jedoch klar, dass das reaktive Protein der ersten Schicht auch ein Antikörper sein könnte und das Protein der zweiten Schicht würde dann das Antigen sein, das spezifisch für diesen Antikörper ist und die dritte Proteinschicht würde dann wieder der Antikörper sein. Eine solche Anordnung aus einer ersten Antikörperschicht und einer zweiten Antigenschicht, die spezifisch zu dem Antikörper ist, wäre in solchen Fällen brauchbar, in denen ein Antikörpermolekül grösser ist als sein spezifisches Antigenmolekül, was z. B. hinsichtlich des Antikörpers zum Insulin der Fall is. i

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Bilden bimolekularer Schichtbeläge auf Substraten, wobei die Schichtbeläge immunologisch komplex gebundene Proteine enthalten, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

(a) Beschichten eines geeigneten Substrates mit einer monomolekularen Proteinschicht, die aus einem immunologisch reaktiven ersten Protein und einem inerten Protein besteht, so dass die Moleküle des ersten Proteins durch die Inertproteinmoleküle voneinander getrennt sind und

(b) Inkontaktbringen des beschichteten Substrates mit einer Lösung eines immunologisch reaktiven zweiten Proteins, spezifisch zu dem ersten Protein, um eine immunologische Reaktion damit zu bewirken, bei der sich die zweiten Proteinmoleküle mit den ersten Proteinmolekülen unter Bildung einer bimolekularen Schicht auf dem Substrat verbinden und die zweiten Proteinmoleküle nach Bildung der bimolekularen Schicht eine grössere Zahl aktiver Stellen für eine weitere immunologische Reaktion behalten, als wenn die monomolekulare Proteinschicht kein inertes Protein enthielte.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein metallisierter Objektträger ist.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch reaktive erste Protein ein Antigen ist und dass das immunologisch reaktive zweite Protein ein Antikörper spezifisch zu dem Antigen, vorzugsweise ein Antikörper der Immunoglobulin-Ig G-Klasse ist.
4. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Enzym ist, dass das inerte Protein Rinderserumalbumin ist und dass der Antikörper von Kaninchen stammt, denen vorher das Enzym injiziert worden war.
5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eben ist und dass der Verfahrensschritt (a) umfasst:

(1) Zubereiten einer ersten Lösung eines inerten Proteins,

(2) ausreichendes Eintauchen des Substrats in die erste Lösung, um das Substrat mit einer monomolekularen Teilschicht des inerten Proteins zu bedecken,

(3) Entfernen des teilweise beschichteten Substrats aus der ersten Lösung,

(4) Zubereiten einer zweiten Lösung, enthaltend immunologisch reaktives, erstes Protein,

(5) Eintauchen des teilbeschichteten Substrates in die zweite Lösung, um die verbleibende Oberfläche des Substrates mit einer monomolekularen Teilschicht des immunologisch reaktiven ersten Proteins zu bedecken, so dass die monomolekulare Schicht aus den Molekülen des immunologisch reaktiven ersten Proteins besteht, die voneinander durch die inerten Proteinmoleküle getrennt sind, und

(6) Entfernen des mit der monomolekularen Schicht bedeckten Subtrates aus der zweiten Lösung.
6. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt (a) umfasst:

(1) Zubereiten einer verdünnten ersten Lösung des immunologisch reaktiven ersten Proteins,

(2) Eintauchen des Substrates in die erste Lösung, ausreichend um das Substrat mit einer monomolekularen Teilschicht des immunologisch reaktiven ersten Proteins zu bedecken,

(3) Entfernen des teilweise bedeckten Substrates aus der ersten Lösung,

(4) Zubereiten einer zweiten Lösung, enthaltend inertes Protein,

(5) Eintauchen des teilbeschichteten Substrates in die zweite Lösung, um die verbleibende Oberfläche des Substrates mit einer monomolekularen Teilschicht aus inertem Protein zu bedecken, so dass die monomolekulare Schicht aus den Molekülen des immunologisch reaktiven ersten Proteins besteht, die voneinander durch die inerten Proteinmoleküle getrennt sind, und

(6) Entfernen des mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrates aus der zweiten Lösung.
7. Verfahren gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt (a) umfasst:

(1) Zubereiten einer ersten Lösung eines Antigens,

(2) Zugeben des inerten Proteins in ausreichender Menge zu der ersten Lösung,

(3) Eintauchen des Substrates in die erste Lösung, um das Substrat mit der monomolekularen Proteinschicht zu beschichten, wobei das inerte Protein in ausreichender Menge vorhanden ist, so dass die Antigenmoleküle in der monomolekularen Schicht durch die inerten Proteinmoleküle voneinander getrennt sind,

(4) Entfernen des mit der monomolekularen Schicht bedeckten Substrates aus der ersten Lösung und

(5) Beschichten des Substrates mit dem Antigen entsprechenden Antikörpern, wobei das Antigen aus den äusserten Teilen von spezifischen Zellen oder Viren stammt.
8. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

Beschichten eines metallisierten Objektträgers mit einer monomolekularen Proteinschicht aus einem immunologisch reaktiven ersten Protein und einem inerten Protein geringerer Grösse als das reaktive erste Protein, so dass die Moleküle des immunologisch reaktiven ersten Proteins voneinander durch die kleineren Moleküle des inerten Proteins getrennt und von diesen umgeben werden, und anschliessende Behandlung des beschichteten Objektträgers mit einer Lösung eines immunologisch reaktiven zweiten Proteins, das spezifisch zu dem ersten Protein ist und eine geringere Grösse hat als dieses, um eine immunologische Reaktion damit zu bewirken, in der eine relativ grosse Zahl immunologisch reaktiver zweiter Proteinmoleküle sich mit den immunologisch reaktiven ersten Proteinmolekülen unter Bildung einer bimolekularen Schicht auf dem Objektträger verbindet, und wobei das inerte Protein in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, so dass seine Moleküle 50 bis 90 % der Oberfläche des Objektträgers bedecken, wobei die relativ dichte zweite Schicht reaktiver Moleküle des immunologisch reaktiven zweiten Proteins geringerer Grösse bei Prüfung des Objektträgers einen signifikant verbesserten Kontrast ergibt, als wenn die monomolekulare Schicht kein inertes Protein enthielte.
9. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, bei dem das Substrat ein metallisierter Objektträger ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung eines immunologisch reaktiven ersten Proteins zubereitet wird, eine ausreichende Menge eines inerten Proteins einer geringeren Grösse als der des immunologisch reaktiven, ersten Proteins zu der Lösung zugegeben wird, der Objektträger mit der Lösung in Kontakt gebracht wird, um mindestens einen Teil des Objektträgers durch Adsorption mit einer monomolekularen Schicht aus dem immunologisch reaktiven, ersten Protein und dem kleineren inerten Protein zu bedecken, um so die Moleküle des immunologisch reaktiven ersten Proteins durch die kleineren inerten Proteinmoleküle voneinander zu trennen und um das reaktive Protein entlang der Oberfläche des Objektträgers mit den kleineren Molekülen des inerten Proteins zu umgeben,

so dass bei Prüfung des Objektträgers nach der weiteren immunologischen Reaktion zwischen dem ersten und dem zweiten immunologischen reaktiven Protein ein verbesserter Kontrast zwischen mono- und bimolekularen Schichten aus Proteinen erhalten wird.
10. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch: Beschichten des Substrates mit einer monomolekularen Proteinschicht aus einem Antigen und einem Inertprotein

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von geringerer Grösse als das Antigen, so dass die Antigen-moleküle voneinander getrennt und über die Substratoberfläche von den kleineren, inerten Proteinmolekülen umgeben sind, und anschliessende Behandlung des beschichteten Substrates mit einer Lösung eines für das Antigen spezifischen s Antikörpers, der eine geringere Grösse als dieses hat, um eine immunologische Reaktion zu bewirken, in der die Antikörpermoleküle sich mit den Antigenmolekülen unter Bildung einer bimolekularen Schicht auf dem Substrat verbinden, wobei eine relativ grosse Zahl der sich mit den Anti- io genmolekülen verbindenden Antikörpermoleküle aus der grossen Zahl aktiver Stellen resultiert, die auf den Antigenmolekülen freigelegt sind, da sie entlang der Substratoberfläche durch die kleineren inerten Proteinmoleküle umgeben sind, und die relativ dichte zweite Schicht der kleineren Anti- ^ körpermoleküle einen verbesserten Kontrast zwischen der Einzel- und der Doppelschicht des Proteins erzeugt, als wenn nur Antigenmoleküle dicht nebeneinander angeordnet wären.
11. Mit bimolekularen Schichten belegte Substrate, erhalten nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1. 20
12. Verwendung der mit bimolekularen Schichten belegten Substrate gemäss Patentanspruch 11 zum Nachweis weiterer immunologisch reaktiver Stoffe.
13. Verwendung gemäss Patentanspruch 12 der gemäss Patentanspruch 7 hergestellten Substrate, dadurch gekenn- 25 zeichnet, dass man dieselben mit einer dritten Lösung in Kontakt bringt, von der man vermutet, dass sie das gleiche Antigen enthält wie die erste Lösung, um eine immunologische Reaktion mit dem Antikörper zu bewirken, bei der die verbleibenden aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen 30 sich chemisch mit den gegebenenfalls in der dritten Lösung vorhandenen Antigenmolekülen verbindet.
14. Verwendung gemäss Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat anschliessend untersucht wird, um festzustellen, ob sich eine dritte Schicht auf dem 35 Substrat gebildet hat, und somit ob das Antigen in der dritten Lösung anwesend ist oder nicht.
15. Verwendung gemäss Patentanspruch 14 der gemäss Patentanspruch 7 erhaltenen Substrate, dadurch gekennzeichnet, dass man dieselben mit einer dritten Lösung in 40 Kontakt bringt, von der man annimmt, dass sie die spezifische Zelle oder das Virus enthält, aus denen das Antigen gewonnen wurde, so dass die Antikörpermoleküle Antigenstellen auf der Zelle oder dem Virus finden, um eine Bindung damit zu verursachen, dass man die Substrate anschliessend 45 untersucht, um festzustellen, ob sich darauf eine dritte Schicht befindet und um so die Anwesenheit der speziellen Zelle oder des Virus in der dritten Lösung festzustellen, dass man das beschichtete Substrat eventuell aus der dritten Lösung entfernt, dasselbe anschliessend mit einer vierten Lösung in 50 Kontakt bringt, die den gleichen Antikörper enthält wie die zweite Lösung, um eine immunologische Reaktion zu verursachen, in der aktive Stellen der Antigenmoleküle aus der vierten Lösung sich mit Antigenmolekülen aus der dritten Lösung verbinden, dass man das Substrat aus der vierten 55 Lösung entfernt, dasselbe mit den Ketten der Antigen-Anti-körper-Komplexe, die von der Oberfläche des Substrates her aufgebaut sind, eventuell mit einer fünften Lösung, von der man annimmt, dass sie spezifische Zellen oder Viren enthält, in Kontakt bringt, so dass die Antikörpermoleküle in den 60 Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe Antigenstellen auf den Zellen oder Viren finden und sich in diesen verbinden, und dass man schliesslich das Substrat aus der fünften Lösung entfernt und dasselbe untersucht, um zu bestimmen, ob die auf den Antikörpermolekülen verbliebenen aktiven Stellen sich mit Antigenstellen auf den Zellen oder dem Virus in der fünften Lösung verbunden haben.