CH619734A5

CH619734A5 -

Info

Publication number: CH619734A5
Application number: CH979476A
Authority: CH
Inventors: Takashi Nara; Ryo Okachi; Mitsuyoshi Yamamoto; Yasuki Mori; Moriyuki Sato; Masahiro Sugimoto; Yoshiaki Shimizu
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1975-08-01
Filing date: 1976-07-30
Publication date: 1980-10-15
Also published as: GR61127B; SE7608589L; NO142919B; US4048015A; MX3770E; SE435068B; ATA565776A; IN144515B; DK140152C; CA1079212A; NL7608430A; ES450339A1; JPS5218888A; NO762573L; DE2633508A1; DK140152B; AR210360A1; BE844756A; DK344776A; FR2319377A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Fortimicin C der Formel

CH_

I 3

I

ch2-nh-co-nh2

serlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden. Die Reinigung von Fortimicin C kann insbesondere durch eine geeignete Kombination von Adsorption und Desorption an Kationen-harzaustauschern, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an Sephadex LH-20 und Chromatographie an Kieselgel erfolgen.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise fol-gendermassen ausgeführt werden: Das zellfrèie Kulturfiltrat wird zunächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 n wässriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft und hierauf auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form gegeben. Die beim Eluieren mit Wasser erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das in Wasser gelöst und mit 2 n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Das Fortimicin C wird an der Aktivkohle adsorbiert. Verunreinigungen werden durch Waschen der Säule mit Wasser abgetrennt. Sodann wird die Säule mit 0,2 n Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Neutralisation auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form gegeben. Die ablaufende Flüssigkeit wird gefriergetrocknet. Es wird die freie Base in Form eines Komplexes der aktiven Komponenten erhalten.

Das erhaltene rohe Pulver wird sodann an Kieselgel Chromatographien. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemmisches von Chloroform, Isopropanol und wässriger Ammoniaklösung (2:1:1) verwendet. Das rohe Pulver wird in dem Lösungsmittel suspendiert und auf die Säule gegeben. Die Entwicklung wird mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 30 ml/h durchgeführt. Zu Beginn wird eine aktive Fraktion eluiert, die Fortimicin B enthält. Nach dem Eluieren mehrerer in Spuren vorliegender Komponenten wird in grossen aktiven Fraktionen eine Fraktion eluiert, die Fortimicin A enthält. Danach wird die Eluierung fortgesetzt und in den nächsten grossen aktiven Fraktionen das Fortimicin C eluiert.

Die Fortimicin C enthaltenden aktiven Fraktionen können vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und das Konzentrat kann gefriergetrocknet werden. Man erhält ein weisses Pulver, das die freie Base von Fortimicin C darstellt. Das erhaltene Präparat von Fortimicin C ist verhältnismässig rein. Bisweilen ist das Präparat verunreinigt. In diesem Fall kann das Präparat an Cellulose chromatographiert werden. Als Entwicklungslösungsmittel ist z. B. ein Gemisch von n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser (6:4:2:4) geeignet. Die beim Eluieren erhaltenen aktiven Fraktionen können vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft werden. Man erhält ein gereinigtes Präparat von Fortimicin C.

Sofern die Verunreinigung eine Substanz ist, die eine positive Ninhydrin-Reaktion ergibt, kann die Reinigung auch an Carboxymethylcellulose erfolgen. In diesem Fall wird eine Lösung des rohen Pulvers auf eine mit Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Verbindungen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert. Sodann wird die Säule zur Abtrennung des grössten Teils der Pigmente und der anorganischen Salze gründlich mit Wasser gewaschen. Hierauf wird die Säule mit 0,2 n wässriger Ammoniumbicarbonatlösung eluiert. Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen können vereinigt und gefriergetrocknet werden. Es wird ein gereinigtes Fortimicin-C-Präparat erhalten.

Während der vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren können die Fraktionen durch aufsteigende Papierchroma619734

tographie an Filterpapier Whatman Nr. 1 untersucht werden. Als Laufmittel wird die untere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wässriger Ammoniaklösung (1:1 :1) verwendet. Die Entwicklung wird 6 bis 15 Stunden bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der RpWert für Fortimicin im Papierchromatogramm beträgt etwa 0,18.

Fortimicin C ist als freie Base ein weisses, basisch reagierendes Pulver, das 44,84% Kohlenstoff, 8,19% Wasserstoff, 17,36% Stickstoff und 29,61% Sauerstoff enthält. Die Verbindung hat die Summenformel CisHssNöO?. Das Molekulargewicht, berechnet durch.Massenspektroskopie in hoher Auflösung, beträgt 448. Somit beträgt der theoretische Gehalt an Kohlenstoff 44,62%, an Wasserstoff 8,32%, an Stickstoff 17,34% und an Sauerstoff 29,72%. Fortimicin C schmilzt bei 160 °C unter Zersetzung.

Das UV-Absorptionsspektrum einer wässrigen Lösung von Fortimicin C zeigt keine charakteristischen Maxima im Spektralbereich von 220 bis 360 m(i und lediglich eine Endadsorption.

Die freie Base des Fortimicin C hat folgenden optischen Drehwert: [a]o5 = +84° (c = 0,1, h2o).

In Fig. 1 ist das Ultrarot-Absorptionsspektrum von Fortimicin C als Kaliumbromid-Pressling wiedergegeben. Fortimicin C zeigt Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (cm-1): 3400,2900,1625,1570,1450,1350,1100 und 1030.

Fig. 2 zeigt das PMR-Spektrum von Fortimicin C-hydro-chlorid (DîO-Lôsung), wobei die chemischen Verschiebungen in ppm ( 8) feldabwärts von Tetramethylsilan als äusserem Standard angegeben sind.

Fig. 3 zeigt das CMR-Spektrum von Fortimicin C-hydro-chlorid (DîO-Lôsung), wobei die chemischen Verschiebungen in ppm feldabwärts von Tetramethylsilan angegeben sind, jedoch gemessen wurden vom internen Standard Dioxan 67,4 ppm.

Aufgrund der Analysen hat Fortimicin C die vorstehend angegebene Formel.

Fortimicin C ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Kaliumpermanganat-Reaktion sowie eine negative Elson-Mor-gan- und Biuret-Reaktion.

Die freie Base des Fortimicin C ist in Wasser gut löslich, in Methanol löslich, in Äthanol und Aceton mässig löslich und in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthyl-acetat, Butylacetat, Diäthyläther, Butanol, Petroläther und n-Hexan unlöslich.

Die RpWerte von Fortimicin C bei der Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln sind in den Tabelle I, II und III zusammengefasst. Diese Werte wurden mit den Rf-Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in ähnlicher Weise entwickelt wurden.

Tabelle I

Rf- Werte von Fortimicin C im aufsteigenden Papierchromatogramm bei 28 °C

Entwicklungslösungsmittel RpWert Entwicklungs dauer, Std.

20 Gew.-% Ammoniumchlorid- 0,96 3 lösung wassergesättigtes n-Butanol 0,00 15

n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1) 0,06 15

wassergesättigtes Äthylacetat 0,00 4

wassergesättigtes n-Butanol mit 0,04 15 2 Gewichtsprozent p-Toluolsulfon-säure und 2 Volumprozent Piperidin

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Tabelle II

Rf-Werte von Fortimicin C, Gentamicinkomplex, Gentamicin Cu und Sisomicin bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel; entwickelt bei Raumtemperatur während 3 Stunden

Entwickler*

Antibiotikum

RrWert

I

Fortimicin C

0,74

I

Gentamicin Komplex

0,71

I

Gentamicin C)a

0,71

I

Sisomicin

0,71

II

Fortimicin C

0,40

II

Gentamicin Komplex

0,06-0,16

II

Gentamicin Qa

0,16

II

Sisomicin

0,18

* Entwickler I: Die obere Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wässriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1:1)

Entwickler II: lOprozentige Ammoniumacetatlösung und Methanol (Volumverhältnis 1:1).

Tabelle III

RrWerte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papierchromatographie unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wässriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2 :1 :1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden.

Antibiotikum

RrWert

Streptomycin A

0,02

Streptomycin B

0,00

Bluensomycin

0,01

Ribostamycin

0,00

Lividomycin A

0,00

Lividomycin B

0,03

Lividomycin D

0,02

Spectinomycin

0,45

Kasugamycin

0,01

Butirosin A

0,00

Butirosin B

0,01

Hygromycin B

0,02

Gentamicin A

0,00

Gentamicin B

0,00

Gentamicin C]a

0,18

Gentamicin Ci

0,59

Gentamicin c2

0,38

Sisomicin

0,18

Neomycin A

0,00

Neomycin B

0,03

Antibiotikum Nr. 460

0,01

Neomycin C

0,00

Kanamycin A

0,02

Kanamycin B

0,01

Kanamycin C

0,02

Paromomycin

0,00

Mebramycin Komplex

0,01

Tobramycin

0,02

Apramycin

0,02

Mebramycin Faktor 4

0,01

Mebramycin Faktor 5

0,00

Myomycin

0,00

XK-62-2

0,49

Fortimicin B

0,65

Fortimicin A

0,37

Fortimicin C

0,18

Das antibakterielle Spektrum von Fortimicin C gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wird in üblicher Weise nach der Agar-Verdünnungsmethode beim pH-Wert 8 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefasst.

Tabelle IV

Mikroorganismus minimale Hemmkon

zentration, y/ml

Bacillus subtilis Nr. 10707

0,16

Staphylococcus aureus ATCC 6538P

0,33

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

0,66

Escherichia coli ATCC 26

1,3

Escherichia coli KY 8327

1,3

(resistent gegenüber Kanamycin,

Gentamicin und Tobramycin)

Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1

5

Pseudomonas aeruginosa KY 8510

5

(resistent gegenüber Kanamycin,

Kanamycin B, Tobramycin, Genta

micin CIa und Ribostamycin)

Shigella sonnei ATCC 9290

2,6

Salmonella typhosa ATCC 9992

0,66

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, dass Fortimicin C eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten grampositiven und gram-negativen Keimen sowie auch gegenüber bestimmten Stämmen von Escherichia coli besitzt, die gegenüber Kanamycin, Gentamicin und Tobramycin resistent sind.

Fortimicin C ist ein neues Antibiotikum. Als wasserlösliche basische Antibiotika, die durch Mikroorganismen der Gattung Micromonospora erzeugt werden, und die ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum besitzen, sind beispielsweise folgende Verbindungen bekannt:

Gentamicin-Komplex, M.J. Weinstein u. Mitarb., Antimicro-bial Agents and Chemotherapy, 1963,1 ; DJ. Cooper u. Mitarb, J. Infect. Dis, Bd. 119 (1969), S. 342 und J.A. Waitz u. Mitarb, Antimicrob. Ag. Chemoth, Bd. 2 (1972), S. 464. Antibiotikum Nr. 460, JP-AS16 153/71, Sisomicin, M.J. Weinstein u. Mitarb, J. Antibiotics, Bd. 23 (1970), S. 551,555 und 559. Fortimicin B, US-PS 3 931400 und DE-OS 2418 349. Fortimicin A, DE-OS 2435 160.

Aus Tabelle III ist ersichtlich, dass die Komponenten des Gentamicin-Komplexes Gentamicin A, Gentamicin B, C2 und Ci RrWerte bei der Papierchromatographie von 0,00,0,00,0,38 bzw. 0,59 zeigen. Im gleichen Papierchromatogramm beträgt der RrWert für Fortimicin C 0,18. Fortimicin C zeigt den gleichen RrWert wie Gentamicin Qa, jedoch ist der RrWert bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (vgl. Tabelle II) mit dem Entwickler II verschieden vom RrWert des Gentamicin Cia. Fortimicin C unterscheidet sich vom Antibiotikum Nr. 460, XK-62-2 und Fortimicin B hinsichtlich seines RrWer-tes. Sisomicin hat bei der Papierchromatographie ebenfalls einen RrWert von 0,18, bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II jedoch einen deutlich verschiedenen RrWert.

Fortimicin C als Breitspektrum-Antibiotikum unterscheidet sich von den anderen wasserlöslichen basischen Breitspektrum-Antibiotika, die durch Actinomyceten gebildet werden, wie Streptomycin, Ribostamycin, Lividomycin, Spectinomycin, Kasugamicin, Neomycin, Kanamycin, Nebramycin und Paromomycin.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC Nr. 21819; FERM-P Nr. 1560) wird als Einsatzstamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet, das 2 Gewichtsprozent Glucose, 0,5 Gewichtsprozent Pepton, 0,5 Gewichtsprozent Hefeextrakt und 0,1 Gewichtsprozent Calciumcarbonat enthält. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml des Vorkulturmediums in einem 50 ml fassenden grossen Reagensglas überimpft. Die Züchtung wird 5 Tage bei 30 °C unter Schütteln durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur in 30 ml eines zweiten Vorkulturmediums in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung wird 2 Tage bei 30 °C unter Schütteln durchgeführt.

Sodann werden 30 ml des zweiten Vorkulturmediums in 300 ml eines dritten Vorkulturmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben überimpft, der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des dritten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung wird im dritten Vorkulturmedium 2 Tage unter Schütteln bei 30 °C durchgeführt. Hierauf werden 1,5 Liter der dritten Vor-kulturbrühe - entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben - in 15 Liter eines vierten Vorkulturmediums in einem 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/min; Belüftung 15 Liter/min) bei 37 °C durchgeführt. Schliesslich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines Mediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl überimpft. Dieses Nährmedium enthält 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 2 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 1 Gewichtsprozent Maisquellwasser, 0,05 Gewichtsprozent K2HPO4,0,05 Gewichtsprozent MgSO«- 7HzO, 0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCCh. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei 37 °C durchgeführt. Die erhaltene Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Sodann werden etwa 7 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird mit 6 n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Austauscherbett abfliessende Flüssigkeit wird verworfen. Aktive Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasser werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,5 n wässriger Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität des Eluats wird durch ein Antibiogramm nach der Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtilis 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml eines Anionenharzaustauschers in der OH~-Form gefüllte Säule gegeben. Sodann wird das Austauscherbett mit etwa 2 Liter Wasser gewaschen, um Verunreinigungen abzutrennen. Di&aktiven Verbindungen werden mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit etwa 50 ml pulverisierte Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen wurden an der Aktivkohle adsorbiert. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, und das abfliessende Wasser und das Waschwasser werden verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen mit 0,2 n Schwefelsäure eluiert. Die Aktivität des Eluats wird nach der Testplättchenmethode an Bacillus subtilis bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der OH~-Form gefüllte Säule gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit Was-5 ser eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird gefriergetrocknet. Es wird ein pulveriges Rohprodukt erhalten, das den Fortimicin-Komplex enthält. Die Ausbeute beträgt 31 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aktivität von 570 Einhei-10 ten/mg (die Aktivität von 1 mg reiner Verbindung entspricht 1000 Einheiten).

Zur Isolierung und Reinigung von Fortimicin C werden etwa 500 ml Kieselgel in ein Glasrohr gefüllt. Über das Kieselgel werden in gleichmässiger Schicht 10 g des erhaltenen Röhls produktpulvers gefüllt. Die Kieselgelkolonne wird folgender-massen hergestellt:

Zunächst wird das Kieselgel in der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Isopropanol und 17prozentiger wässriger Ammoniaklösung (VolumVerhältnis 2:1 :1) suspenso diert. Die Suspension wird in die Kolonne in gleichmässiger Schicht eingefüllt und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen. Hierauf wird das Rohproduktpulver in den Kopf der Kolonne eingefüllt. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, das langsam in den Kolonnen-25 köpf eingespeist wird. Danach wird das Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Std. fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Fortimicin B, gefolgt von Fortimicin A, wird zuerst 30 eluiert. Die Eluierung wird fortgesetzt, und sodann wird Fortimicin C eluiert. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen, und die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und 35 gefriergetrocknet. Ausbeute 0,9 g eines gereinigten Präparats der freien Base von Fortimicin C. Das Produkt hat eine Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg.

Beispiel 2

40 Der in Beispiel 1 verwendete Stamm wird als Einsatzstamm verwendet und der ersten bis vierten Vorkultur gemäss Beispiel 1 unterworfen. Das Nährmedium im 300 Liter fassenden Fermenter aus Edelstahl enthält jedoch 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 3 Gewichtsprozent Trockenhefepulver, 0,05 45 Gewichtsprozent K2HPO4,0,05 Gewichtsprozent

MgS04- 7H20,0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCCh.

Die Züchtung und Isolierung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Es werden etwa 63 g eines Rohpulvers des Fortimicin-5o Komplexes mit einer Aktivität von etwa 650 Einheiten/mg erhalten. 50 g des Rohpulvers werden gemäss Beispiel 1 gereinigt. Es werden 7 g Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 850 Einheiten/mg erhalten.

Zur weiteren Reinigung wird das Präparat an Cellulose 55 chromatographiert. Zu diesem Zweck werden etwa 500 ml Cel-lulosepulver in einem Gemisch von n-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser (6:2:4:4) suspendiert und in eine Glassäule gleichmässig eingefüllt. Hierauf wird die Kolonne mit dem gleichen Lösungsmittel gründlich gewaschen. Danach wird das bo Präparat in dünner Schicht auf die Kolonne gegeben und mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, das langsam in den Kolonnenkopf eingespeist wird. Danach wird das Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1 ml/min fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 10 ml gesam-b5 melt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchen-methode bestimmt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute

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3,5 g gereinigtes Fortimicin C mit einer Aktivität von 950 Einheiten/mg.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird ein Nährmedium für den Edelstahlfermenter verwendet, das 4 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 3 Gewichtsprozent Casaminosäure (ein Säure-hydrolysat von Casein), 0,05 Gewichtsprozent K2HPO4,0,05 Gewichtsprozent MgSOt* 7H20,0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCCh enthält. Die Züchtung und die Isolierung und Reinigung von Fortimicin werden gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Ausbeute 6,5 g gereinigtes Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg.

Beispiel 4

Die Züchtung und Isolierung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Ausbeute 3 g Fortimicin C enthaltendes Rohproduktpulver. Das Rohprodukt wird in 5 ml Wasser gelöst und auf eine mit etwa 200 mg Carboxymethylcellulose in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Danach wird die Säule mit etwa 1 Liter Wasser gewaschen. Die aktiven Verbindungen werden an der Carboxymethylcellulose adsorbiert, während der grösste Teil der Pigmente und anorganischen Salze eluiert werden. Hierauf wird mit einem 0,2 molaren Citronensäure-Phosphor-säure-Puffer (pH-Wert 3,0) in einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Stunde eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 10 ml aufgefangen. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen, und die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf einen Kationenaustauscher in der H+-Form gegeben. Die aktiven Verbindungen werden am Kationenharzaustauscher adsorbiert. Danach wird der Kationenharzaustauscher mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n Salzsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Neutralisation auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der OH'-Form gefüllte Säule gegeben. Die ablaufenden aktiven Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 350 mg Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 985 Einheiten/mg.

Beispiel 5

Als Einsatzstamm wird Micromonospora olivoasterospora Mm 744, KY 11067 (FERM-P 2193; ATCC Nr. 31009) verwend-det. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 2 Gewichtsprozent Glucose, 0,5 Gewichtsprozent Pepton, 0,3 Gewichtsprozent Hefeextrakt und 0,1 Gewichtsprozent Calciumcarbonat enthält. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die erste bis vierte Vorkultur wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vor-kulturbrühe in 150 Liter eines Nährmediums in einem 300 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 2 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 0,05 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, 2 Gewichtsprozent Glucose, 1 Gewichtsprozent Maisquellwasser, 1 Gewichtsprozent Hefeextrakt, 0,05 Gewichtsprozent K2HPO4,0,05 Gewichtsprozent MgSCU- 7H20,0,03 Gewichtsprozent KCl und 0,1 Gewichtsprozent CaCCb. Vor der Sterilisation wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 U/min; Belüftungsgeschwindigkeit 80 Liter/min) bei 30 °C durchgeführt. Nach been-» deter Züchtung wird die Gärmaische gemäss Beispiel 1 aufgearbeitet. Ausbeute 42 g roher Fortimicin-Komplex mit einer Aktivität von etwa 560 Einheiten/mg. Das Rohproduktpulver wird gemäss Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 2,4 g Fortimicin B mit einer Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg.

Beispiel 6

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MK-80, KY 11055 (ATCC Nr. 31010; FERM-P Nr. 2192) verwendet. Als Einsaatmedium für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 1 Gewichtsprozent Glucose, 1 Gewichtsprozent lösliche Stärke, 0,5 Gewichsprozent Hefeextrakt, 0,5 Gewichtsprozent Pepton und 0,1 Gewichtsprozent Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die vierte Kulturbrühe wird sodann in ein Hauptfermentationsmedium der in Beispiel 5 angegebenen Zuammensetzung überimpft. Aus der erhaltenen Gärbrühe wird gemäss Beispiel 1 der Fortimicin-Komplex als Rohpulver isoliert. Ausbeute 52 g mit einer Aktivität von etwa 515 Einheiten/mg. Das Rohprodukt wird gemäss Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 5 g gereinigtes Fortimicin C mit einer Aktivität von etwa 990 Einheiten/mg.

Beispiel 7

Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P Nr. 1560; ATCC Nr. 21819) verwendet. Der Stamm wird gemäss Beispiel 1 gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden 150 Liter der erhaltenen Gärflüssigkeit mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten gerührt. Danach wird die Kulturflüssigkeit mit 6 n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Hierauf werden 15 Liter eines Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform eingetragen, und das Gemisch wird 30 Minuten langsam gerührt. Danach wird der Kationenharzaustauscher auf einem groben Filtertuch abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und sodann in ein 170 cm langes Rohr mit einem Innendurchmesser von 15 cm eingefüllt. Hierauf wird der Kationenharzaustauscher mit 30 Liter 0,5 n wässriger Ammoniaklösung eluiert. Es werden 7 Liter eines den Fortimi-cin-Komplex enthaltenden Konzentrats erhalten. Das Konzentrat enthält neben Fortimicin C, Fortimicin A und B noch mehrere Komponenten in Spuren. Zur Fraktionierung des Konzentrats wird es unter vermindertem Druck auf 500 ml eingedampft. Schliesslich werden 49 g des rohen Fortimicin-Komple-xes durch Gefriertrocknung als Pulver erhalten. Das Pulver wird in 50 ml der unteren Schicht eines Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wässriger Ammoniaklösung (2:1 :1) suspendiert und auf eine mit Cellulosepulver gefüllte, 100 cm lange Kolonne mit einem Innendurchmesser von 5 cm gegeben. Die Entwicklung wird mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Testplättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Bioauto-graphie gegen Bacillus subtilis Nr. 10707 unterworfen, um die aktive Komponenten in den Fraktionen zu bestimmen. Bei der Chromatographie an Cellulose werden Fortimicin B, A und C in dieser Reihenfolge eluiert. Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Ausbeute 12,5 g eines amorphen weissen Pulvers, das Fortimicin C als Hauptbestandteil enthält. Das Rohprodukt wird in etwa 50 ml Wasser gelöst und die Lösung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Sodann wird die Lösung auf eine mit «Bio-Rex 70» in der Ammoniumform gefüllte, 80 cm lange Säule mit einem Innendurchmesser von 2 cm gegeben. Der Kationenaustauscher wird gründlich mit Wasser gewaschen. Der Fortimicin C als Hauptbestandteil enthaltende Fortimicin-Komplex wird an dem Kationenharzaustauscher adsorbiert, während die Verunreinigungen mit Wasser eluiert werden. Danach wird mit 0 bis 0,2 n wässriger Ammoniaklösung mit zunehmender Konzentration eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und jede Fraktion wird der Papierchromatographie unterworfen, um die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen zu bestimmen. Die Fortimicin C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter verminder6

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tem Druck eingedampft und schliesslich gefriergetrocknet. Ausbeute 10,2 g reines Fortimicin C als weisses amorphes Pulver mit einer Aktivität von 1000 Einheiten/mg.

10 g der erhaltenen freien Base des Fortimicins werden in

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einer geringen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und gefriergetrocknet. Ausbeute 13,3 g Fortimicin-C-Sulfat als weisses amorphes Pulver mit einer Aktivität von 600 Einheiten/mg.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

619734 2 PATENTANSPRÜCHE säure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure und Ascorbin-

1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums For- säure.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von

Fortimicin C und dessen Salzen mit Säuren ist im Patentan-5 spruch 1 definiert.

Im erfindungsgemässen Verfahren kann jeder Stamm der Gattung Micromonospora eingesetzt werden, der Fortimicin C bildet. Beispiele für bevorzugt verwendete Stämme sind Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P Nr. 1560; (I) io ATCC21819); Micromonospora olivoasturospora MK.-80

(FERM-P Nr. 2192; ATCC 31010) und Micromonospora olivoasterospora Mm 744 (FERM-P Nr. 2193; ATCC 31009). Diese Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, und beim Fermentation Research ' m mh 15 Instìtute> Agency of Industriai Science and Technology, Tokyo,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, chemischen Verbindungen mutiert werden. Alle Stämme und dass man einen Stamm der Art Micromonospora olivoastero- Mutanten, die die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin C besit-spora oder eine aus diesem Stamm durch ein Mutationsverfah- zen, können für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet ren erhaltene Mutante einsetzt. 30 werden.

2 Japan, hinterlegt. Die Hinterlegung bei der American Type Cul ture Collection erfolgte für den erstgenannten Stamm am 21. August 1972 und für die beiden letztgenannten Stämme am oder von Salzen davon mit Säuren, dadurch gekennzeichnet, 4. März 1974 ohne Beschränkungen. Die Stämme sind somit der dass man einen Fortimicin C bildenden Stamm der Gattung 20 Öffentlichkeit unbeschränkt zugänglich. Die morphologischen Micromonospora oder eine aus diesem Stamm durch ein Muta- Eigenschaften dieser Stämme sind in der US-PS 3 931 400 und tionsverfahren erhaltene Mutante in einem Nährmedium, das den DE-OS 2 418 349 und 2 435160 beschrieben.

assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter Ebenso wie andere Stämme von Actinomyceten können die aeroben Bedingungen züchtet und anschliessend das entstan- für das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzten Mikroorga-dene neue Antibiotikum aus der Gärflüssigkeit abtrennt und 25 nismen durch mutagene Mittel, wie UV-Licht, Bestrahlung mit gegebenenfalls in ein Salz überführt. Co6, Röntgenstrahlen und den verschiedensten mutagenen

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, Im allgemeinen können im erfindungsgemässen Verfahren dass man Micro monospora olivoasterospora ATCC 21819, die üblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten ver-Micromonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micro- wendet werden. Für das Nährmedium können die verschieden-monospora olivoasterospora ATCC 31010 oder eine aus diesen sten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffquel-Stämmen durch ein Mutationsverfahren erhaltene Mutante 35 len sind beispielsweise Glucose, Stärke, Mannose, Fructose, einsetzt. Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, z. B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren ver-dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Tem- wendet werden, je nach der Verwertungsfähigkeit des einge-peratur von 25-40 °C während 2 bis 15 Tagen bei etwa neutra- setzten Mikroorganismus. Anorganische und organische Stick-

40 stoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casamino-säure und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein 45 oder im Gemisch verwendet werden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate, dem Nährmedium zugesetzt werden. Schliesslich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden, welche das Wachs-50 tum des Mikroorganismus und die Bildung von Fortimicin C fördern.

Im erfindungsgemässen Verfahren wird vorzugsweise ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submers-verfahren und unter Rühren durchgeführt. Vorzugsweise wird 55 die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 40 °C und bei annähernd neutralem pH-Wert durchgeführt. Nach etwa 2- bis 15tägiger Züchtung hat sich in der Gärbrühe eine ausreichende Menge des Antibiotikums gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin C in der Gärbrühe ein Maximum erreicht hat, wird 60 die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Filtrat isoliert und gereinigt. Die Isolierung und Reinigung von Fortimicin C und dessen Salzen mit Säuren. Die Salze können sich von anor- aus dem Filtrat kann nach üblichen Methoden zur Isolierung ganischen oder organischen Säuren ableiten. Spezielle Bei- und Reinigung von mikrobiellen Stoffwechselprodukten aus spiele für die zur Salzbildung verwendeten Säuren sind Salz- 65 Gärflüssigkeiten durchgeführt werden. Da Fortimicin C eine säure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Schwefel- Base darstellt und in Wasser löslich, jedoch in üblichen organi-säure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, sehen Lösungsmitteln schlecht löslich ist, kann das Antibioti-Zitronensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Wein- kum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter was-

timicin c der Formel I

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