CH623848A5

CH623848A5 -

Info

Publication number: CH623848A5
Application number: CH212475A
Authority: CH
Inventors: Hans Dr Betzing; Dac Dr Lekim
Original assignee: Nattermann A & Cie
Priority date: 1974-02-21
Filing date: 1975-02-20
Publication date: 1981-06-30
Also published as: ATA136075A; FR2262045A1; GB1454983A; JPS50123872A; DK136728C; PH11983A; ES434840A1; FR2262045B1; SE7501873L; DK68275A; DK136728B; CA1047422A; AT338415B; NL7501945A; JPS5328514B2; US3925158A; SE424086B

Description

fahren vorliegender Erfindung

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Willstätter-Einheiten/g ergeben.

Bei der Bestimmung der Lipase nach E. A. Lazo-Wasem (J. of Pharm. Sciences 50 [1961] 999) wird Olivenöl bei 37 °C und 65 einem pH-Wert von 7,8 unter Zufügen von Rindergalle 30 Minuten mit dem Enzympräparat behandelt. Nach dem Ansäuern werden die abgespaltenen Fettsäuren mit Benzol extrahiert und mit Phenolphthalein als Indikator titriert.

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Es zeigt sich, dass nach beiden Bestimmungsmethoden die neuen Pankreatinpräparate dieser Anmeldung nicht nur an

Lipaseaktivitäten der erfindungsgemässen Enzympräparate lipolytischen Enzymen stark angereichert sind, sondern - wenn weit über den Werten der im Handel befindlichen Pankreatin- auch im geringerem Masse - eine Zunahme an Protease- und Produkte liegen. Stabilitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass Amylase-Aktivität gegenüber den üblichen Pankreationen des die hohen Lipaseaktivitäten, die den neuen Enzympräparaten 5 Handels aufweisen. In der nachfolgenden Tabelle 3 sind die dieser Erfindung zugrunde liegen, bei einer Lagerung bei Zim- Protease-, Amylase- und Esterase-Aktivitäten der erfindungsge-

mertemperatur über mehrere Monate praktisch keine Ände- mässen Pankreatine noch einmal gegenübergestellt einem han-

rung zeigen. delsüblichen 5/6-NF-Produkt.

Von besonderer Bedeutung ist auch die Tatsache, dass die

Tabelle 3

Produkt

Protease

Amylase

Esterase

nach N. Hennrich, F.I.B.

nach E.A. Lazo-Wasem

J. Mond. Pharm. 1968,3,

(Hydrolyse lösl. Stärke und J. Melcer et al.

S. 337-354

bei pH 6,8)

US-Patent 3168448

J. Mond. Pharm. 1968,3,

(Substrat T riacetin)

S. 337-354

5/6-NF-Produkt des Handels

IE*

11 FIB-E/mg

1500 Wilson-E/g erfindungsgemässes Präparat

1,57-2,16 E

12-13 FIB-E/mg

4800-6000 Wilson-E/g

* willkürliche Festlegung: entspricht 5,04 uMol Äquivalente freigesetztes Tyrosin durch 80 y Pankreatin beim pH 7,5

Es ist ersichtlich, dass durch das erfindungsgemässe Verfahren speziell die Lipaseaktivität stark angereichert worden ist.

G

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates durch Zerkleinern von Pankreasgewebe, Autolysieren, Entfetten und wässriges Extrahieren des Gewebes sowie Ausfällung des Enzyms aus dem wässrigen Extrakt durch Aceton und Trocknen der Fällung, dadurch gekennzeichnet, dass man das zerkleinerte Pankreasgewebe zunächst mit einer Mischung aus 9 Volumenteilen Chloroform mit 1 Volumenteil Butanol behandelt, dann das so partiell entfettete Gewebematerial bei 0 bis 4 °C 24 bis 96 Stunden lang stehen lässt, anschliessend mit Aceton entfettet und entwässert, worauf man mit 5%iger wäss-riger Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt das trok-kene Enzympräparat gewinnt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das partiell entfettete Gewebe 48 Stunden lang stehen lässt.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem alkoholhaltigen Extrakt das trockene Enzympräparat durch Fällung mit Aceton oder unmittelbar durch Gefriertrocknung des Extraktes gewinnt.

Es ist seit langem bekannt, lipasehaltige Pankreaspräparate zur fermentativen Spaltung von Fetten zu verwenden. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die Anreicherung der Lipase in derartigen Enzympräparaten. Diese finden Verwendung unter anderem bei der Behandlung von Verdauungsstörungen und ihren Folgeerscheinungen, deren Ursachen in erster Linie in nicht ausreichender Sekretion der Bauchspeicheldrüse oder in ungenügender Produktion der betreffenden Enzyme begründet sind.

Die bis jetzt im Handel befindlichen Enzympräparate zeigen in der Regel Lipaseaktivitäten von 40 bis 60 Willstätter-Ein-heiten (WE)/g. Dabei ist eine WE diejenige Enzymmenge, die unter festgelegten Bedingungen in einer Stunde von 2,5 g Olivenöl 24% des Öls spaltet. Die Aktivitätswerte dieser Präparate sind jedoch nach ärztlicher Erfahrung für den therapeutischen Einsatz beim Menschen sehr oft unbefriedigend, da mit den üblichen Dosierungen dieser Präparate der Mangel an Lipase nicht ausgeglichen werden kann.

Aus der britischen Patentschrift 1 328 202 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Pankreatinpräparates mit einer Aktivität grösser als 3 x NF bekannt, wobei unter NF die nach der National Formulary, Xllth Edition, von der Amerikanischen Pharmazeutischen Gesellschaft, Washington, D.C., USA, veröffentlichte minimale Pankreatinaktivität solcher Präparate gegenüber Stärke und Kasein gemeint ist. Bei diesem Verfahren werden in einem wässrig alkalischem Milieu die zerkleinerten Pankreasdrüsen bei einer Temperatur von 20 bis 30 °C vor dem Entwässern und Entfetten mit Propyl- bzw. Butyl-alkohol zunächst einer Autolyse unterworfen. Das aus dem nach dem Entfetten des autolysierten Gewebematerials erhaltene Enzympräparat zeigte jedoch immer noch eine relativ geringe Lipaseaktivität.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man bei einer Durchführung der Autolyse bei tiefen Temperaturen nach teilweiser Entfettung und Entwässerung des zerkleinerten Pankreasdrüsenmaterials und anschliessender Extraktion des Materials eine starke Aktivitätsanreicherung auch besonders der Lipase in dem Extraktmaterial erreicht. Dies war nicht zu erwarten, da bei dem Verfahren der britischen Patentschrift durch die Autolysestufe zwar die Amylaseaktivität, nicht jedoch die Lipaseaktivität wesentlich gesteigert werden konnte.

Erfindungsgemäss besteht das Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates nun darin, dass man zerkleinertes Pankreasgewebe mit einer Mischung aus 9 Volumenteilen Chloroform und einem Teil Butanol.behandelt, dann das partiell entfettete Gewebe bei 0 bis 4 °C 24 bis 96 Stunden lang stehen lässt, anschliessend durch Behandlung mit Aceton entfettet und entwässert und dann mit einer 5%igen wässrigen Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt das trockene Enzympräparat gewinnt. Die Isolierung und Trocknung erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Aceton.

Im allgemeinen geht man bei der Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens so vor, dass man tiefgekühlte Pankreasgewebe unmittelbar nach dem Auftauen zunächst mit einer 9:1-Mischung von Chloroform und Butanol in einem Fleischwolf oder Mixer zerkleinert, nach Abziehen des organischen Lösungsmittels das Gewebe erneut mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch unter Rühren behandelt und das Lösungsmittel wieder dekantiert, worauf man den noch feuchten Rückstand zur Durchführung der Autolyse wenigstens 24 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden, bei 0 bis 4 °C im Eisschrank stehen lässt.

Nach der Autolyse wird das schon weitgehend entfettete Gewebematerial noch zweimal mit Aceton durchgerührt und das Lösungsmittel dann jeweils abgetrennt. Zur Isolierung des lipasereichen Enzymmaterials wird dann das trockene Gewebepulver wiederholt mit einer Wasser-Äthanol-Mischung (Volumenverhältnis 95:5) gerührt, die vom Gewebe abgetrennten Lösungen vereinigt und durch Zugabe von Aceton und anschliessendem Zentrifugieren der entstandenen Suspension die Fällung abgetrennt, die dann mit Aceton behandelt und anschliessend im Vakuum getrocknet wird. Das erhaltene Präparat ist ein feines grauweisses Pulver mit ungewöhnlich hoher Lipaseaktivität.

Da in den erhaltenen Wasser-Alkohol-Extrakten das Enzym bereits in einem hohen Reinheitsgrad vorhanden ist, kann man nach einer Ausführung des Verfahrens diese 5%igen Alkoholextrakte auch zur Gewinnung des Lipasepräparates unmittelbar verwenden, indem man die vereinigten Extrakte der Gefriertrocknung unterwirft. Hierbei fällt das lipasereiche Enzympräparat als trockenes, grauweisses Pulver an. Der Vorteil dieser Verfahrensabänderung liegt darin begründet, dass die Ausfällung des Enzympräparates mit Aceton, sowie die Isolierung des erhaltenen Niederschlages durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfällt. Das beinhaltet ausser einer grossen Zeiteinsparung besonders auch die Einsparung grosser Mengen von Aceton, deren Rückgewinnung durch den Wassergehalt ohnehin erschwert ist. Die Aktivität des so erhaltenen Lipasepräparates entspricht der durch die Acetonfällung gewonnenen Enzyms.

Beispiel 1

5,0 kg tiefgekühltes Schweinepankreas werden nach dem Auftauen vom anhaftenden Fett befreit, grob zerkleinert und mit 51 einer Mischung von Chloroform-Butanol 9:1 in einem Mixgerät oder Fleischwolf homogenisiert. Der entstandene Organbrei wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, die chloroformhaltige flüssige Phase abdekantiert und dann der Rückstand noch zweimal mit je 51 Chloroform-Butanol 9:1 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und jedesmal das Lösungsmittel abdekantiert. Der noch feuchte Rückstand wird dann 48 Stunden bei 0 bis 4 °C sich selbst überlassen. Anschliessend wird das auf diese Weise weitgehend entfettete Organ noch zweimal mit je 2,51 Aceton 15 Minuten ausgerührt und jedesmal die überstehende Lösung abdekantiert.

Zur Extraktion der lipasereichen Fermente wird das völlig entfettete Material zweimal mit je 21 einer Mischung von Wasser-Äthanol 95:5 geweils 30 Minuten lang gerührt und anschliessend die Lösung abfiltriert Die einzelnen Wasser-Äthanol-Extrakte werden vereinigt und zur Ausfällung der Pan-

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kreasfermente mit 51 Aceton 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Nach dem Zentrifugieren wird der Niederschlag noch dreimal mit je 1,61 Aceton nachgewaschen, dann im Vakuum getrocknet und zerkleinert.

Ausbeute: 450 g (9% bezogen auf Nassorgan) eines gelblichen Pulvers mit einer Lipaseaktivität von 270 WE/g.

Beispiel 2

2 kg gefriergetrocknetes Schweinepankreas werden dreimal 30 Minuten mit je 51 Chloroform-Butanol 9:1 unter Rühren extrahiert und jedesmal vom Lösungsmittel abdekantiert. Der feuchte Rückstand wird dann 60 Stunden bei 0 bis 4 °C sich selbst überlassen. Zur Vervollständigung der Entfettung wird noch zweimal je 15 Minuten mit jeweils 2,51 Aceton gerührt und jedesmal vom Lösungsmittel abfiltriert.

Zur Extraktion der Pankreasfermente wird der entfettete Organrückstand zweimal mit je 21 einer Mischung von Wasser-Äthanol 95:5 30 Minuten unter Rühren behandelt, wobei jedesmal die Lösung vom Rückstand abfiltriert wird. Die vereinigten Wasser-Äthanol-Extrakte werden mit 51 Aceton 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, die ausgefallenen lipasereichen Fermente abzentrifugiert. Der Niederschlag wird noch dreimal mit je 1,61 Aceton gewaschen, im Vakuum getrocknet und anschliessend zerkleinert.

Beispiel 3

3 kg tiefgekühltes Schweinepankreas werden in einem Fleischwolf sehr fein zerkleinert und mit 3,01 einer Mischung von Chloroform-Butanol 9:1 v/v in einem Mischgerät homogenisiert. Der entsprechende Organbrei wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, die chloroformhaltige flüssige Phase abgelassen und der Rückstand noch zweimal mit je 3,01 Chloroform-Butanol 9:1 v/v 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und jedesmal das Lösungsmittel abgetrennt. Der noch feuchte Rückstand wird dann 48 Stunden bei 4 °C sich selbst überlassen und anschliessend das weitgehend entfettete Organ noch zweimal mit je 1,51 Aceton 15 Minuten ausgerührt und jedesmal die überstehende Lösung abdekantiert.

Zur Extraktion der lipasereichen Pankreasfermente wird das völlig entfettete Material zweimal mit je 1,51 einer Mischung von Wasser-Äthanol 95:5 v/v jeweils 30 Minuten lang gerührt und anschliessend die Lösung durch ein Metallsieb abfiltriert. Die vereinigten Wasser-Äthanol-Extrakte werden zur Entfernung des Lösungsmittels in einen Gefriertrocknungsapparat eingegeben. (Schichtdicke etwa 1 bis 2 cm, Anfangstemperatur -20 °C, Enddruck 10-4 Torr, Endtemperatur 20 °C.) Das trockene poröse Material wird zerkleinert und gesiebt. Ausbeute: 365 g (12% bezogen auf Nassorgan) eines hellgelben Pulvers mit einer Lipaseaktivität von etwa 250 Willstätter-Ein-heiten/g, entsprechend 110 000 FIP-Einheiten/g.

Wie ein Vergleich des nach den Beispielen des britischen Patents hergestellten Pankreatins mit einem Produkt, hergestellt nach dem Verfahren vorliegender Erfindung, zeigt, erhält man durch die erfindungsgemässe schonende Autolyse ohne Zusatz von Basen oder Säuren, nämlich durch einfaches Stehenlassen wenigstens 24 Stunden bei 0 bis 4 °C und mit der modifizierten Aufarbeitungsmethode, ein Pankreatinpräparat mit einer wesentlich höheren Lipaseaktivität.

Dass hierbei die Temperatur, bei der die Autolyse abläuft, eine entscheidende Rolle spielt, geht aus der nachstehend aufgeführten Tabelle deutlich hervor:

. Tabelle 1

Aktivität

Dauer der Autolyse

Autolyse bei

Autolyse bei in Stunden

Zimmertemperatur

0-4 °C

io 0

100%

100%

24

97%

110%

48

52%

150%

96

-

140%

15 Die folgende Tabelle 2 zeigt die nach der Methode von Willstätter und Lazo-Wasem in Willstätter bzw. Wilson-Einheiten bestimmten Lipaseaktivitäten von zwei Pankreatinpräpara-ten des Handels im Vergleich zu den entsprechenden Aktivitäten der lipasereichen Produkte, wie sie nach dem Verfahren der 20 vorliegenden Anmeldung erhalten werden.

Tabelle 2

Produkt

Lipase nach Willstätter

Lipase nach

Lazo-Wasem

(in

Wilson-Einheiten)

4-NF-Produkt des

Handels

45 E/g

2060 E/g

5/6-NF-Produkt des

Handels

56 E/g

2450 E/g erfindungsgemässes

Produkt

239,6 E/g

8000 E/g

Bei diesen Versuchen wurde die Lipaseaktivität nach Willstätter (Hoppe-Seylers 125 [1923] 193) modifiziert nach Vogel und Laeverenz (Hoppe-Seylers 234 [1935] 176) bestimmt,

indem 2 bis 3 mg des Pankreaspräparates in 5 ml Wasser und 40 2 ml NH3-NH4C1-Puffer vom pH 9,2 aufgeschäumt wurde, dann mit je 2 ml Eieralbuminlösung (2,4%ig), CaCh-Lösung (1,6%ig) und Natriumoleatlösung (l,6%ig) versetzt und zum Schluss 2,5 g Olivenöl zugefügt wurde. Der Ansatz wurde einige Sekunden kräftig geschüttelt und anschliessend 60 Minuten bei 30 °C 45 mit einem Magnetrührer gut durchgemischt. Hiernach wurde die Spaltung durch Zufügen von 100 ml Äthanol unterbrochen und nach Zusatz von 20 ml Äther und 12 Tropfen 1 %iger alkoholischer Thymolphthaleinlösung mit 0,5 n alkoholischer KOH bis zum blauen Farbton titriert. Von dem so ermittelten Lau-50 genverbrauch wird der Verbrauch des Leerversuches, der gleichzeitig mit dem Hauptversuch angesetzt wird, mit dem Unterschied, dass das Olivenöl erst nach Zugabe von Alkohol und Äther, also kurz vor der Titration zugegeben wird, abgezogen. Aus dem so erhaltenen Wert %-Spaltung gelangt man mit 53 Hilfe einer empirisch aufgestellten Eichkurve zu den entsprechenden Lipase-Einheiten, die durch Multiplikation mit dem Faktor

1000

mg Einwaage

Pankreatinpräparat

Lipaseaktivität in

WE/g hergestellt nach Beispiel 1

des brit. Patents 1 328 202

95

hergestellt nach dem Ver