CH624660A5

CH624660A5 -

Info

Publication number: CH624660A5
Application number: CH549076A
Authority: CH
Inventors: Shumpei Sakakibara; Toshiharu Noda; Tadanori Morikawa; Eisuke Munekata; Terutoshi Kimura; Yasuo Nakagawa
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1975-05-01
Filing date: 1976-04-30
Publication date: 1981-08-14
Also published as: DK193876A; FR2309235B1; DE2616399A1; AT360670B; BE841376A; FR2309235A1; GB1516947A; DK149597B; SE437836B; JPS51128993A; HU176623B; DK149597C; AU508162B2; NL7604605A; JPS5341677B2; NL164551B; AU1356576A; ATA311476A; NL164551C; CA1065856A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide der allgemeinen Formel I

| "(CH2)5 1

LcO-Aj-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-AT-Leu-

Gly-AI0-Ai1-A12-Gln-A14-A15-Axä-Lys-A18-

A19-Thr-A21-Pro-A23-Thr-A25-A26-Gly-A28-

Gly-A30-Pro-NH2 (I)

worin Aj Ser oder Gly, A7 Val oder Met, Ai0 Lys oder Thr, Au Leu oder Tyr, A12 Ser oder Thr, A14 Glu oder Asp, Ais Leu oder Phe, A16 His oder Asn, Ai8 Leu oder Phe, A-19 Gin oder His, A2l Tyr oder Phe, A23 Arg oder Gin, A25 Asp, Asn oder Ala, A26 Val, Thr oder Ile, A28 Ala, Ser oder Val und A30 Thr, Val oder Ala bedeuten, sowie dessen pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzen.

Das Polypeptid der allgemeinen Formel I hat den Calcium-spiegel des Serums senkende Eigenschaften.

Calcitonin ist ein bekanntes Polypeptid mit den Calcium-spiegel des Serums bei Säugetieren senkenden Eigenschaften und wird aus Säugetier- oder Vögelschilddrüsen oder aus dem letzten Kiemenkörper von Fischen isoliert. Die Aminosäuresequenz des Calcitonins hängt von seiner natürlichen Herkunft ab, und kürzlich wurden synthetische Calcitonine bekannt, die dieselbe chemische Struktur wie diejenigen natürlichen Ursprungs aufweisen.

Die Calcitonine natürlichen Ursprungs, wie z.B. Aal-, Lachs- oder Humancalcitonin, sind Polypeptide, die aus 32 Aminosäuren bestehen, wobei die erste und die siebte Aminosäure jeweils L-Cystein ist und deren Mercaptogruppen unter Bildung einer Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.

Das Polypeptid der Formel I enthält demgegenüber weder als erste noch als siebte Aminosäure L-Cystein, das L-Cystein ist vielmehr durch a-Aminokorksäure der Formel ch2-ch2-ch2-ch2

CHgCOOH H2N-CH-C00H

ersetzt.

Die co-Carboxylgruppe ist an die N-terminale Aminosäure unter Bildung einer Ringstruktur gebunden.

Das neue Polypeptid weist ein bedeutendes Ausmass an therapeutischer Wirkung auf. Die neue Verbindung kann verordnet werden, um den Serum-Calcium-Spiegel bei Krankheiten, wie beispielsweise Hypercalcämie, endogener Calcitonin-Mangelkrankheit, welche durch Dysthyroidismus oder Hyper-parathyroidismus verursacht wird, herabzusetzen.

Die neue Verbindung kann für eine Calcium benötigende Chiropraktik wie beispielsweise Osteoporose, Osteomalazie, Fraktur, Faser-Dysplasie des Knochens oder Rachitis, welche durch Corticosteron-Therapie oder eine Inaktivierung nach dem Klimakterium oder durch äussere Verletzung verursacht wird, verordnet werden, insbesondere kombiniert mit Calcium oder Phosphor. Die neue Verbindung kann auch zur Therapie der Pagetschen Krankheit verwendet werden. Ferner kann die neue Verbindung zur Therapie oder zur Verhinderung von Magengeschwüren verwendet werden. Die erfindungsgemässe Verbindung ist im Serum, in der Leber oder in der Niere stabiler als das bekannte Calcitonin und ausserdem stabiler bei Verfahren zu ihrer Reinigung und bei der Lagerung, und zwar infolge des Fehlens einer Disulfid-Brückenbindung. Die Aktivität der Art von Polypeptiden der Formel I ist im Vergleich mit dem bekannten Calcitonin gleich oder höher, wie Vergleichsversuche bei Ratten ergeben haben.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden erfin-dungsgemäss dadurch erhalten, dass man die entsprechenden Aminosäuren und/oder Peptide oder deren aktivierte Deri-

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vate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessen-den reaktiven funktionellen Gruppen unter Bildung von -CO—NH-Bindungen miteinander kondensiert, dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese ein die Sequenz der Formel

(CH2)sCOOR

H-Ai-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO-

enthaltendes Zwischenprodukt, worin R einen reaktiven Esterrest bedeutet, einer Ringschlussreaktion unterwirft und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amid-gruppe überführt und das erhaltene Polypeptid gegebenenfalls in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz überführt.

Die bei der Synthese der Ausgangsmaterialien oder der Zwischenprodukte verwendeten Schutzgruppen stellen für Peptidsynthesen übliche Schutzgruppen dar, die durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazino-lyse leicht entfernt werden können.

Beispielsweise wird die Aminogruppe in herkömmlicher Weise durch eine Acylgruppe, wie beispielsweise eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsufenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, eine Aralkylgruppe, wie beispielsweise eine Benzyl-, Diphe-nylmethyl- oder Triphenylmethylgruppe, geschützt. Diese Gruppen können gegebenenfalls durch eine Niederalkoxy-gruppe, wie beispielsweise eine o-Methoxy- oder p-Methoxy-gruppe, substituiert sein, eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie beispielsweise eine Benzyloxycarbonyl-, o-Brombenzyloxy-carbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxy-carbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxy-carbonyl-, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl- oder p-(p'-Meth-oxyphenylazo)-benzoylcarbonylgruppe, eine aliphatische Oxy-carbonylgruppe, wie beispielsweise eine Cyclopentyloxycar-bonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, tert.-Butoxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonyl-gruppe oder eine Aralkoxycarbonylgruppe, wie beispielsweise eine 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tosyl-isopropoxycarbo-nyl- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe geschützt sein. Die Aminogruppe kann auch durch Bildung eines En-amins durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie beispielsweise Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.

Die Carboxylgruppe kann durch Bildung ihres Amides oder ihres Hydrazides oder durch Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe kann eine 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)-methylgruppe aufweisen. Die Hy-drazidgruppe kann eine Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, tert.-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe aufweisen. Die Estergruppe kann mit einem Alkanol, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, tert.-Butanol oder Cyanomethylalkohol, einem Aralkanol, wie beispielsweise Benzylalkohol, p-Brombenzyl-alkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, Benz-hydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethyl-alkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, einem Phenol, wie beispielsweise 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Me-thansulfonylphenol, oder einem Thiophenol, wie beispielsweise Thiophenol, Thiolcresol oder p-Nitrothiophenol, erhalten werden. Die Hydroxygruppe in Serin, Threonin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Eine für den Schutz durch Veresterung verwendete Schutzgruppe ist beispielsweise eine Niederalkanoyl-gruppe, wie beispielsweise die Acetylgruppe, eine Aroylgruppe,

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wie beispielsweise die Benzoylgruppe oder eine Gruppe, die sich von Carbonyl ableitet, wie beispielsweise die Benzyloxycarbonyl- oder Äthoxycarbonylgruppe. Eine für den Schutz durch Verätherung verwendete Schutzgruppe ist beispielsweise die Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert.-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann auch durch die 2,2,2-Tri-fluor-l-tert.-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Tri-fluor-l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe erfolgen. Es ist jedoch nicht immer notwendig, diese Hydroxygruppe zu schützen. Die Aminogruppe oder Guanidinogruppen in Arginin kann durch die Nitro-, Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden, jedoch muss die Guanidinogruppe nicht unbedingt geschützt werden. Die Iminogruppe in Histidin kann durch die Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2,2,2-Trifluor- l-tert.-butyloxy-carbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonyl-aminoäthylgruppe geschützt werden jedoch muss diese Iminogruppe nicht unbedingt immer geschützt werden.

Für die Kondensation wird beispielsweise eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine geschützte a-Aminogruppe oder eine aktivierte endständige Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie a-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, umgesetzt. Anderseits wird eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine aktive a-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie endständige Carboxylgruppe und eine geschützte a-Aminogruppe enthält, umgesetzt.

Die oben angegebene Carboxylgruppe kann aktiviert werden, wie beispielsweise als Säureazid, Säureanhydrid, Säure-imidazolid oder einen aktiven Ester, wie beispielsweise durch Uberführung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thio-dylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Penta-chlorphenylester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxypi-peridinester oder N-Hydroxypiperidinester, oder ein Carbodi-imd, N,N'-Carbonyl-diimidazol oder Isoxazoliumsalz, wie beispielsweise Woodward-Reagenz.

Die Kondensationsreaktionen werden bevorzugt nach der Wünsch-Methode, Azid-Methode, aktive Ester-Methode oder Geiger-Methode durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion sollte eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden.

Die Ringschlussreaktion wird durch Kondensation der aktivierten cu-Carboxylgruppe der a-Aminokorksäure mit der freien Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure des Zwischenproduktes durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion wird die Hydroxylgruppe des Serins und Threonins vorzugsweise geschützt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungs-gemässen Verfahrens wird der Peptidring (mit wahlweise geschützten aktiven Gruppen), der die a-Aminokorksäure enthält, mit dem übrigbleibenden anderen grossen Peptidzwi-schenprodukt, das wahlweise geschützte aktive Gruppen besitzt, kondensiert. Das heisst, das N-terminale Bruchstück, das aus der ersten bis sechsten oder neunten Aminosäure besteht, wird mit dem restlichen Teil des Peptides mit der Gesamtsequenz der siebten bis zehnten oder einunddreissigsten Aminosäure kondensiert. Wegen der Reaktivität beider Fragmente und der Kondensation und um eine Racemisierung zu verhindern, wird Glycin vorzugsweise als C-terminale Aminosäure verwendet.

Vorzugsweise wird ein Peptid mit der aus der ersten bis neunten Aminosäure bestehenden Sequenz mit einem Peptid mit der aus der zehnten bis einunddreissigsten Aminosäure bestehenden Sequenz umgesetzt.

Die genannte Kondensationsreaktion kann, ausgehend von

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dem Peptid mit der freien terminalen Carboxylgruppe, nach der sogenannten Wünsch-Methode oder nach entsprechenden Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann sie mittels der Azid-Methode durchgeführt werden, ausgehend von einem Peptid mit einer terminalen Azid- oder Hydrazid-Gruppe, mittels der aktive-Ester-Methode oder mittels der gemischten Anhydrid-Methode.

Die Synthese des N-terminalen Fragments, nämlich des Nonapeptids mit der aus der 1. bis 9. Aminosäure bestehenden Sequenz, wird nachstehend im einzelnen erläutert werden; das Hexapeptid 1-6, das Heptapeptid 1-7 bzw. das Oktapep-tid 1-8 kann jedoch ebenso mit Hilfe desselben Verfahrens hergestellt werden.

Die Nonapeptid-Sequenz kann durch Verknüpfen jeder Aminosäure mit einem niedrigen Peptid, das aus 2—4 Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz, ausgehend von der C-terminalen Aminosäure, besteht, hergestellt werden. Aminosäuren wie Glycin, Leucin, Valin, a-Aminokorksäure, Threonin, Methionin, Serin oder Asparagin, werden vorzugsweise mittels der aktive-Ester-Methode kondensiert. Die niederen Peptide, wie z.B. das Tripeptid aus den Aminosäuren 2-4, werden vorzugsweise mittels der Geiger- oder der Wünsch-Methode kondensiert.

Bei der Kondensationsreaktion nach dem Azid-, Aktivester- oder Säureanhydridverfahren muss die endständige Carboxylgruppe im Decapeptid nicht unbedingt geschützt werden. Die Carboxylgruppe kann auch durch Veresterung z.B. mit Methanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden. Die Estergruppe, beispielsweise der Methylester, kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung oder durch Überführung in ein Hydrazid entfernt werden, die Ben-zylestergruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Die Aminogruppe des Zwischenproduktes kann durch übliche Schutzgruppen wie beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-, Trityl-, tert.-Butoxycarbonyl- oder die 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe geschützt werden. Die Carboxylgruppe kann gewünschtenfalls durch herkömmliche Veresterung geschützt werden. Die Hydroxylgruppe in Serin und Threonin kann gewünschtenfalls durch Verätherung unter Verwendung von tert.-Butanol, Benzylalkohol oder eines anderen Alkohols geschützt werden.

Die oben genannten Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyl-ester- und Benzylestergruppen können durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladium/Kohle abgespalten werden. Die N-Tritylgruppe kann durch wässrige Essigsäure abgespalten werden und die tert.-Butoxycarbonylgruppe kann durch Trifluoressigsäure zersetzt werden. Die o-Nitrophenyl-sulfenylgruppe kann durch Chlorwasserstoff, Cyanwasserstoff oder schwefelige Säure in einem organischen Lösungsmittel abgespalten werden. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe kann durch ein Essigsäure/Ameisensäure-Wassergemisch (7:1:2) abgespalten werden. Der Methylester, Äthylester oder p-Nitrobenzylester kann unter Verwendung von Hydra-zinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Die Methylestergruppe kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung, der tert.-Butyl ester durch Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Ein C-terminalesPeptid mit der aus der 7—10. bzw. bis 31. Aminosäure bestehenden Sequenz, welches mit dem oben genannten N-terminalen Peptid kondensiert wird, wird vorzugsweise durch Verknüpfen der C-terminalen Aminosäure (Aminosäure Nr. 31) oder eines C-terminalen Zwischenproduktes, z. B. des Peptids mit der Sequenz der Aminosäuren 30 bis 31, 28 bis 31, 25 bis 31, 24 bis 31 oder 23 bis 31, mit jeder Aminosäure oder jedem niederen Peptid synthetisiert, das aus 2-4 Aminosäuren in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz besteht.

Beispielsweise kann ein C-terminales Teilstück mit der aus der 10.-31. Aminosäure bestehenden Sequenz hergestellt werden durch Kondensation von Aminosäuren und niederen Peptiden wie beispielsweise dem Dipeptid aus den Aminosäuren 28 bis 29, dem Dipeptid 26 bis 27, dem Tripeptid 20 bis 22, dem Tetrapeptid 15 bis 18 und dem Tripeptid 10 bis 12 in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz, und zwar ausgehend von der Seite mit der endständigen Carboxylgruppe nach der Aktivestermethode oder der Geiger-Methode. Als Schutzgruppen werden bevorzugt verwendet: Für die «-Aminogruppe die tert.-Butoxycarbonylgruppe; für die Sei-tenketten-Carboxylgruppe von Asparaginsäure und Glutaminsäure die Benzylestergruppe; für die e-Aminogruppe von Lysin die o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxy-carbonylgruppe; für die Hydroxylgruppe von Serin, Threonin und Tyrosin die Benzylgruppe; und für die Aminogruppe in der Guanidingruppe des Arginins und für die Iminogruppe des Histidins die Tosylgruppe.

Die Schutzgruppe des C-terminalen, aus den Aminosäuren 7 bis 10 bzw. bis 31 bestehenden Teilstücks, welche die a-Aminogruppe schützt, beispielsweise das aus der Sequenz der 10. bis 31. Aminosäure bestehende Dodecapeptidamid, kann nach irgendeinem geeigneten Verfahren entfernt werden. Die Tritylgruppe z.B. kann durch wässrige Essigsäure abgespalten, die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe und tert.-Butoxycarbonylgruppe durch ein Eisessig-Ameisensäure-Wasser-Gemisch, Hydrierung bzw. Trifluoressigsäure entfernt werden.

Auf diese Weise erhält man das Hentriacontapeptidamid mit einer geschützten a-Aminogruppe, einer geschützten f-Aminogruppe und wahlweise geschützter Carboxyl- und/ oder Hydroxylgruppe in der Seitenkette. Diese Schutzgruppen können mit Hilfe eines der oben beschriebenen Verfahren abgespalten werden, vorzugsweise mit einer Säure wie z.B. Fluorwasserstoff und schliesslich erhält man das Produkt der Formel I.

Im Falle der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens nach der Meryfiel-Festphasen-Peptidsyntheseme-thode kann die Hydroxygruppe in Serin, Threonin und Tyrosin durch beispielsweise eine Benzylgruppe geschützt werden; die Iminogruppe in Histidin kann beispielsweise durch die 1-Ben-zyloxycarbonylamino-2,2,2-trifluoräthylgruppe geschützt werden; die Guanidinogruppe in Arginin kann beispielsweise durch die Nitrogruppe geschützt werden; und die Seitenkette in der Glutaminsäure kann durch die Benzylestergruppe geschützt werden. Eine Schutzgruppe für die a-Aminogruppe ist beispielsweise die tert.-Butyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxy-carbonyl- oder o-Brombenzyloxycarbonylgruppe. Das geschützte Peptid kann sodann von dem Trägerharz entfernt, und die Schutzgruppe durch wasserfreien Fluorwasserstoff entfernt werden.

Eine einstufige Entfernung sämtlicher Schutzgruppen durch Hydrolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure kann erreicht werden, wenn die tert.-Butoxycarbonylgruppe für den Schutz der Aminogruppe, der tert.-Butylester für den Schutz der Seitenketten-Carboxylgruppe, tert.-Butyläther für den Schutz der Hydroxylgruppe in Serin, Threonin und Tyrosin und die 2,2,2-Trifluor-l-tert.-butoxycarbonylaminoäthyl-gruppe für den Schutz der Iminogruppe in Histidin verwendet werden.

Das neue Polypeptid der Formel I kann in Form der freien Base oder eines Säureadditions-Salzes erhalten werden. Die freie Base kann in üblicher Weise aus ihrem Salz hergestellt werden. Die freie Base kann in ein pharmakologisch verträgliches Salz übergeführt werden durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztrauben5

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säure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Benzoesäure, Benzolsulfonsäure oderToluolsul-fonsäure.

Das neue Polypeptid kann durch Zugabe einer anorganischen oder organischen Substanz in einen Komplex übergeführt werden. Der Komplex wird hergestellt, indem eine anorganische oder organische Substanz einem langkettigen Polypeptid zugesetzt wird; der genaue Aufbau dieses Komplexes ist nicht bekannt, er hat jedoch bei der Verabreichung eine lang anhaltende Wirksamkeit. Beispiele für diese komplexbildenden Substanzen sind anorganische Verbindungen, die von einem Metall, wie beispielsweise Calcium, Magnesium oder Zink, abgeleitet sind, insbesondere Phosphate, Pyrophosphate oder Polyphosphate dieser Metalle. Weitere Beispiele für komplexbildende Substanzen sind organische Verbindungen, wie beispielsweise nicht-antigene Gelatine, CMC, Polyglut-aminsäure oder dergleichen.

Die hier verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

BOC: tert.-Butoxycarbonyl,

AOC: tert.-Amyloxycarbonyl,

DIP: Diisopropylmethoxycarbonyl,

Cbz: Benzyloxycarbonyl,

CICbz: o-Chlorbenzyloxycarbonyl,

Bzl: Benzyl,

HOSU: N-Hydroxysuccinimid,

Tos: Tosyl,

OÄt: Äthylester,

OBzl: Benzylester,

ONP: p-Nitrophenyl ester,

OSU: N-Hydroxysuccinimidester,

Phe: L-Phenylaianin,

Ser: L-Serin,

Asn: L-Asparagin,

Leu: L-Leucin,

Thr: L-Threonin,

Val: L-Valin,

Pro: L-Prolin,

Arg: L-Arginin,

Asp: L-Asparaginsäure,

Ala: L-Alanin,

TFA: Trifluoressigsäure,

TosOH: p-Toluolsulfonsäure,

CHA: Cyclohexylamin,

DCHA: Dicyclohexylamin,

THF: Tetrahydrofuran,

Gly: Glycin,

Lys: L-Lysin,

Gin: L-Glutamin,

Glu: L-Glutaminsäure,

His: L-Histidin,

Tyr: L-Tyrosin,

OBu: t-Butylester,

Met: L-Methionin,

Ile: L-Isoleucin,

DMF: Dimethylformamid,

AcOÄt: Äthylacetat,

DCC: Dicyclohexylcarbodiimid,

WSC: N-Äthyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid,

HOBT: 1-Hydroxybenzotriazol,

MeOH: Methanol,

ÄtOH: Äthanol,

AcOH: Essigsäure.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert.

Zunächst werden die Versuchsmethode zur Bestimmung der den Calciumspiegel im Serum senkenden Wirksamkeit, der

Träger und das Entwicklersystem für die Dünnschichtchromatographie sowie die Bedingungen für die Analyse beschrieben.

Versuchsmethode Die Probe wird mit einer 0,ln-Natriumacetat-0,l %-Albuminlösung in geeigneter Weise verdünnt. Jeweils 0,2 ml der Lösung werden durch intravenöse Injektion einzelnen männlichen Ratten verabreicht. Nach einer Stunde werden alle Ratten getötet, ihr Blut wird entnommen, und der Serum-Cal-cium-Wert jeder Blutprobe wird durch Atomabsorptionsspek-trophotometrie bestimmt. Anderseits wird eine Standard-Versuchsprobe B, welche einen aus Schweineschilddrüsen gewonnenen Extrakt darstellt, so verdünnt, dass Lösungen von 2,5, 5, 10 und 20 MRC mU/0,2 ml erhalten werden. Jeweils 0,2 ml dieser Lösungen werden durch intravenöse Injektion an männliche Ratten verabreicht. Der Serum-Calcium-Wert der Ratten wird nach demselben Verfahren wie oben beschrieben eine Stunde nach der Injektion bestimmt. Aus der Wirksamkeit der entsprechenden Standard-Versuchsprobe wird die Wirksamkeit des Calcitonins in der Probe bestimmt.

Dünnschichtchromatographie (DSC)

Träger: Silikagel G

Zellulose

Lösungsmittelsystem für den Entwickler:

1. CHCI3-MeOH-AcOH

95:5:3

2. CHCI3-MeOH-AcOH

85:15:5

3. CHCI3-MeOH-AcOH

85:10:5

4. CHCI3-MeOH-AcOH

80:25:2

5. CHCI3-ÄtOH-AcOÄt

5:2:5

6. CHCI3-MeOH-AcOH-H20

10:10:1:1

(untere Schicht)

7. Benzol —AcOÄt

2:1

8. n-BuOH — Pyridin - AcOH — H20

15:10:3:12

9. Methanol

Aminosäureanalyse Die Probe wird mit 6n-HCl (unter Zugabe einiger Tropfen Anisol) bei 110 °C 40-45 Stunden lang hydrolysiert, unter vermindertem Druck getrocknet und dann der Ämino-säureanalyse unterworfen.

Beispiel 1

Herstellung von:

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1-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-AIa-Gly-Thr-Pro-NH2 1 g (0,27 mMol)

BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg (Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 wurden in 10 ml TFA bei -5 °C unter vermindertem Druck gelöst und 1 ml 4n-HCl/Dioxan zugesetzt. Nach 40minutigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und mit Äther versetzt, bis sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde über Natriumhydroxid getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 5 ml DMF gelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von Triäthylamin unter Kühlung auf pH 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Wasser zur Bildung eines Niederschlags zugegeben. Der Niederschlag wurde über P2Os getrocknet, wonach die de-BOC-Verbindung als freie Base erhalten wurde.

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I (CH2)s 1

'-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-V al-Leu-Gly-OH wurden in 2 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit 90 mg HOSU und danach unter Kühlung mit 120 mg DCC versetzt und anschliessend über Nacht gerührt. Nach der Reaktion wurde ausgefallener Harnstoff abgetrennt, und die so erhaltene Lösung wurde mit der oben erhaltenen freien Base de-BOC und mit 5 mg DMF als Lösungsmittel versetzt. Nach drei Tagen wurde der Lösung Wasser zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, gründlich mit Essigester und Äther gewaschen und getrocknet, worauf 1,4 g

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>-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzl)-Val-GIy-AIa-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2

als Rohprodukt erhalten wurden. Diese 1,4 g des Rohprodukts wurden mit Fluorwasserstoff und 15 ml eines Phenol-Anisol (1:1)-Gemisches bei 0 °C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasserstoffs wurde der Rückstand mit Essigester und Benzol gewaschen, um das Produkt zu verfestigen, und anschliessend wurde in lm-Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1X1 (Acetatform)-Säule gegeben und Chromatographien. Das Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurden 870 mg pulverförmiges Produkt erhalten.

870 mg dieses Pulvers wurden durch Sephadex G-50 Gel-filtration, CM-Zellulose-Ionenchromatographie und Sephadex LH-20 Gelfiltration gereinigt, wonach 200 mg (3450 MRC U/mg) des Produkts erhalten wurden.

Rf = 0,71 (Träger: Merck-Zellulose; Entwickler: n-BuOH - Pyridin - AcOH - Wasser (15:10:3:12)).

Aminosäureanalyse: Lys 0,91 X 2, His 0,92, Arg 0,93, Asp 1,02 X 2, Thr 0,73 X 4, Ser 1,00 X 3, Glu 1,00 X 3, Pro 0,99 X 2, Gly 0,92 X 3, Ala 1,11, Val 0,90 X 2, Leu 0,78 X 5, Tyr 0,96, a-Aminokorksäure 0,97.

Das Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt: Darstellung der Teilsequenz der Aminosäuren 10—31 BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)~Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2

1. Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2

67,7 g BOC-Thr(Bzl)-OH, 33 g H-Pro-NH2-HCl und 296 g HOBT werden zu 220 ml THF hinzugefügt. Dazu gibt man 40 ml WSC unter Kühlen bei - 5 °C, rührt eine Stunde bei — 5 °C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit 800 ml Essigester versetzt, und anschliessend wird zweimal mit 400 ml ln-HCl, zweimal mit 300 ml 5 %iger Natriumbicar-bonatlösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Das ölige Material wird auf eine aus 450 g Silikagel bestehende Säule zwecks Chroma tographie aufgebracht. Es wird mit einer Mischung aus Ben-zol-Äthylacetat (1:1), Äthylacetat und Methanol in dieser Reihenfolge entwickelt, und die Fraktionen werden eluiert und durch Silikagel-Dünnschichtchromatographie untersucht. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und in 500 cm3 Äthylacetat gelöst, sodann zweimal mit 300 cm3 5 %iger wässe riger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit n-Hexan behandelt, wobei BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2 in Form eines weissen Pulvers erhalten wird. (54,5 g, Ausbeute: 61,4%). Rfj = 048 [a]u28=14,0° (c= 1, DMF).

Elementaranalyse (C21H31N03):

Gef.: C 62,04 H 8,01 N 9,90%

Ber.: C 62,20 H 7,71 N 10,30%

2. Herstellung von BOC-Ala-Gly-OBzl

94,6 g BOC-Ala-OH, 168,8 g H-Gly-OBzI TosOH und 67,6 g HOBT werden in 450 cm3 THF gelöst, und dazu werden 91,5 cm3 WSC hinzugefügt; nun wird eine Stunde bei 0 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in 800 cm3 Äthylacetat gelöst. Es werden 500 cm3 ln-HCl hinzugefügt, der Niederschlag wird abfiltriert, und die Äthylacetatschicht wird mit 400 cm3 ln-HCl, zweimal mit einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit n-Hexan behandelt, wobei 152,5 g rohes Material erhalten werden. Es wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 144 g BOC-Ala-Gly-OBzl erhalten werden. Ausbeute 85,7 %. Fp. 87-88,5 °C. DSC: 1 Fleck, RFi = 059.

3. Herstellung von BOC-AIa-Gly-OH

101 g BOC-Ala-Gly-OBzl werden in 500 cm3 THF gelöst und unter Zugabe von 7 g 5% Palladium/Kohle hydriert. Nach 6 Stunden wird der Katalysator entfernt, es wird eingeengt und in 800 cm3 THF gelöst. Nun wird wiederum unter Zugabe von 5 % Palladium/Kohle hydriert. Nach 4 Stunden wird der Katalysator entfernt, und es wird im Vakuum eingeengt; der Rückstand wird durch Behandlung mit n-Hexan verfestigt. Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat-THF-n-Hexan erhält man 72 g BOC-Ala-Gly-OH, Ausbeute: 97,4%, Fp. 129 bis 132 °C. DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 3). [a]D28 = -8,87° (c=l, DMF).

Elementaranalyse (C10Hi8N2Os):

Gef.: C 48,80 H 7,41 N 11,29%

Ber.: C 48,77 H 7,37 N 11,38%

4. Herstellung von BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 10,0 g BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden zu 30 cm3 TFA bei — 5 °C gegeben, es wird 30 Minuten gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, filtriert und über Natrium getrocknet, wobei H-Thr(Bzl)-Pro-NH-TFA erhalten wird.

6,08 g des in (3) erhaltenen BOC-Ala-Gly-OH und 3,34 g HOBT werden zu 100 cm3 THF hinzugefügt, wozu 4,5 cm3 WSC bei - 5 °C (pH 4,0) hinzugefügt werden. Nach einstündigem Rühren bei — 5 °C und siebenstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Mischung auf - 5 °C gekühlt, 0,8 cm3 WSC werden hinzugefügt und der pH-Wert wird auf 4,0 eingestellt; nun wird eine Stunde bei — 5 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 400 cm3 Äthylacetat gelöst, mit gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 100 cm3 5 %iger wässeriger Natriumbicarbonatlösung, mit 100 cm3 ln-HCl, welches mit NaCl gesättigt ist, und 50 cm3 Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, welches zweimal mit Wasser gewaschen und sodann mit der Äthylacetatschicht vereinigt wird. Die organische Schicht wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird unter Verwendung von 150 g Silikagel chromatographiert. Durch die Säule wird Äthylacetat und

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Methanol geleitet. Das Methanol-Eluat wird im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird n-Hexan hinzugefügt, um das BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 auszukristallisieren. Fp.: 106-116 °C, 11,5 g. Ausbeute: 87,3%, DSC: 1 Heck, Rf4 = 0,29, Rfs = 0,52.

5. BOC-Val-Gly-OÄt

219,2 g BOC-Val-OH-DCHA werden in 1 Liter Äthylacetat eingetragen. Die Lösung wird zweimal mit 600 cm3 ln-HCl und 500 cm3 Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand werden 100 cm3 THF und 400 cm3 Dichlormethan hinzugefügt, und dazu werden 69,8 g H-Gly-OÄt • HCl und 70 cm3 Triäthylamin gegeben. Nun werden 103,2 g DCC bei — 5 °C hinzugefügt, und es wird eine Stunde bei - 5 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch werden 10 cm3 Essigsäure hinzugefügt, es wird eine Stunde gerührt und filtriert. Das Filtrat wird zweimal mit 500 cm3 ln-HCl, zweimal mit 500 cm3 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird dreimal unter Verwendung von Äthyl-acetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 105,4 g BOC-Val-Gly-OÄt erhalten werden. Fp.: 95—96 °C. Ausbeute: 69,7%.

6. Herstellung von BOC-Val-Gly-OH

96,8 g BOC-Val-Gly-OÄt werden in 150 cm3 Methanol gelöst, und dazu werden 368 cm3 einer ln-NaOH-Lösung bei

- 5 °C hinzugefügt. Nach einstündigem Rühren wird der pH-Wert mit ln-HCl auf 8,0 eingestellt. Das Methanol wird durch Einengen im Vakuum entfernt, und die wässerige Schicht wird mit 100 cm3 Äthyläther gewaschen. Die wässerige Schicht wird durch Zugabe von ln-HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die wässerige Schicht wird mit 200 cm3 Äthylacetat viermal extrahiert. Der Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und daraufhin im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit n-Hexan behandelt und aus Äthyl-acetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 85,5 g BOC-Val-Gly-OH erhalten werden. Ausbeute: 97,4%. Fp.: 112—117 °C, (Zers.) DSC: 1 Fleck, Rfx = 0,35.

7. Herstellung von BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2

10,5 g BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden zu 35 cm3 TFA bei - 5 °C eingetragen. Nach 30 Minuten dauerndem Rühren wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt, das ausgefällte Material wird abfiltriert und im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet, wobei H-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 TFA erhalten wird. Dazu werden 100 cm3 THF hinzugefügt, und Triäthylamin wird bei

— 5 °C zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,0 einzustellen.

5,49 g BOC-Val-Gly-OH und 2,66 g HOBT werden eingetragen. Zu dieser Mischung gibt man tropfenweise 3,61 cm3 WSC bei — 5 °C und rührt eine Stunde bei - 5 °C und dann über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in 300 cm3 Chloroform gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 200 cm3 ln-HCl, welches mit NaCl gesättigt ist, zweimal mit 200 cm3 5 %iger Natriumbicarbonatlösung, welche mit NaCl gesättigt ist, und mit 75 cm3 gesättigter NaCl-Lösung in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Äthyläther erhält man 12,0 g BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2. Ausbeute: 88,3%. Fp. 121-135 °C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 6). [«]D28= 10,30° (c=l, DMF).

Elementaranalyse (C33H51N7O9 • V2 H20)

Gef.: C 56,67 H 7,43 N 13,90%

Ber.: C 56,72 H 7,50 N 14,03%

8. Herstellung von BOC-Asp(OBzl)-Val-GIy-Ala-Gly-

Thr(Bzl)-Pro-NH2 100 cm3 TFA werden zu 33,1 g BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 bei - 5 °C eingetragen, es wird 30 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird Äthyläther hinzugesetzt, und das ausgefällte Material wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 80 cm3 DMF und ferner Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 werden hinzugefügt. Nach Zugabe von 950 mg HOBT und 30,2 g BOC-Asp(OBzl)-OSU wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 eingestellt, und es wird zwei Tage gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin während des Rührens auf 7,5 eingestellt. Nun werden neuerlich 2,0 g BOC-Asp(OBzl)-OSU hinzugefügt, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, und es wird über Nacht gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird eine grosse Menge Wasser hinzugefügt, und die ausgefällte klebrige Substanz wird abdekantiert und durch Behandlung mit Äthyläther auskristallisiert. Die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, und der Extrakt wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei eine klebrige Substanz ausfällt. Die ausgefallene klebrige Substanz wird mit Äthyläther behandelt, um sie zu kristallisieren. Die Feststoffe werden vereinigt und viermal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert und sodann mit heissem Äthylacetat-Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei 34,2 g BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 erhalten werden. Ausbeute: 79,6%. Fp.: 195—199 °C. DSC: 1 Heck. Rfs = 0,46; [a]D28= 18,27° (c= 1, DMF). Elementaranalyse (C44H62N6012H20):

Gef.: C 58,08 H 6,90 N 12,47%

Ber.: C 57,88 H 7,07 N 12,27%

9. BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-AIa-GIy-Thr(Bzl)-

Pro-NH2

30 cm3 TFA werden zu 7,2 g BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 bei — 5 °C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt, und das ausgefallene Material wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 15 cm3 DMF werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 7,5 eingestellt. Nach der Zugabe von 100 mg HOBT und 4,0 g BOC-Thr(Bzl)-OSU wird der pH-Wert mittels N-Methylmorpholin eingestellt, und es wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Durch Zugabe von 3 cm3 DMF und N-Methylmorpholin wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt, worauf über Nacht gerührt wird.

Nachdem die Reaktion beendet ist, wird eine grosse Menge Wasser hinzugefügt, und das ausgefallene Material wird filtriert und dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert, wobei 6,7 g BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 erhalten werden. Ausbeute: 77,1%. Fp.: 172—188 °C. DSC: 1 Heck (Lösungsmittelsystem 3 und 6). [a]D28=-13,65 °C (c= 1, DMF).

Elementaranalyse (C55H75N9Oi4 • V2 H20):

Gef.: C 60,31 H 6,92 N 11,58%

Ber.: C 60,31 H 7,00 N 11,51%

10. Herstellung von AOC-Arg(TOS)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-

Val-GIy-AIa-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 20 cm3 TFA werden bei - 5 °C zu 6,52 g BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äthyläther behandelt, und

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die ausgefallene Substanz wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 25 cm3 DMF werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei - 5 °C auf 5,0 eingestellt. Es werden 972 mg HOBT und 3,2 g AOC-Arg(Tos)-OH hinzugefügt, worauf 1,3 cm3 WSC tropfenweise unter Kühlung bei - 5 °C hinzugefügt werden; daraufhin wird eine Stunde bei - 5 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.

Zu dem Reaktionsgemisch wird Äthylacetat hinzugefügt, und der Niederschlag wird mit heissem Methanol (400 cm3)-Äthyläther (50 cm3) behandelt und daraufhin mit heissem Methanol (300 cm3)-Äthyläther (100 cm3) behandelt, wobei 7,0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 erhalten werden. Ausbeute: 82,7 %. Fp.: 187-193 °C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5) Rf3 = 0,42.

Elementaranalyse (C69H95N13017S H20):

Gef.: C 57,97 H 6,88 N 12,76 S 2,26%

Ber.: C 58,01 H 6,84 N 12,75 S 2,24%

Aminosäurezusammensetzung: NH3 1,28, Arg 0,95 (1), Asp 1,04 (1), Thr 1,50 (2), Pro 0,98 (1), Gly 1,84 (2), Ala 1,00(1), Val 1,01 (1).

11. Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl

37,6 g BOC-Tyr(Bzl) • OH • CHA werden mit 300 cm3 Äthylacetat und 120 cm3 ln-HCl gemischt; die Schichten werden getrennt, und die Äthylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt, und der ölige Rückstand wird in 80 cm3 Dichloräthan gelöst. Dazu werden 19,3 g H-Pro-OBzl HCl hinzugefügt. In die Mischung werden 14,6 cm3 WSC bei - 5 °C eingetragen, worauf eine Stunde bei - 5 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird.

Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit 800 cm3 Äthylacetat und 400 cm3 ln-HCl ausgeschüttelt. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt. Die organische Schicht wird zweimal mit 300 cm3 ln-HCl, zweimal mit 300 cm3 Wasser, dreimal mit 300 cm3 5%iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 300 cm3 Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die organische Schicht wird über Natriumcarbonat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 400 g Silikagel untersucht. Durch die Säule wird eine Chloroform-Äthylacetat-(4:1)-Mischung geleitet, und die Eluate werden mittels Dünn-schichtchromatographie unter Verwendung des Lösungsmittelsystems 1 untersucht, wobei öliges BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl (43 g), Rf i = 0,88, erhalten wird.

12. Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl

50 cm3 TFA werden unter Kühlung auf — 5 °C in 20 g

BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl eingetragen, es wird 10 Minuten bei - 5 °C und 50 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über NaOH über Nacht getrocknet; daraufhin werden 30 cm3 DMF hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei - 5 °C auf 7,5 eingestellt. 470 mg HOBT und

14,2 g BOC-Thr(Bzl)-OSU werden hinzugefügt, und es wird eine Stunde bei - 5 °C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von N-Methylmorpholin bei einem pH-Wert von 7 gehalten. Nach zwei Tagen wird 1 cm3 Dimethylamino-propylamin hinzugefügt, und es wird weitere zwei Stunden gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit 500 cm3 Wasser und 500 cm3 Äthylacetat geschüttelt; worauf die Äthylacetatschicht abgetrennt wird. Die wässerige Schicht wird neuerlich mit 200 cm3 Äthylacetat extrahiert.

Die Äthylacetatschichten werden vereinigt, dreimal mit ln-HCl, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 19,6 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird aus dem gleichen Lösungsmittel umkristallisiert, wobei 14,4 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl erhalten werden. Ausbeute: 54,9%. Rf2 = 0,67.

13. Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH 14,2 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzI werden in 30 cm3 THF gelöst, und es werden 23 cm3 ln-NaOH-Lösung tropfenweise während 15 Minuten bei - 5 °C hinzugefügt.

Nach vierstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von ln-HCl auf 7 eingestellt, worauf im Vakuum zur Entfernung von THF eingeengt wird. Zu der wässerigen Schicht wird Wasser hinzugefügt, und nach dem Waschen mit Äthyläther wird der pH-Wert der wässerigen Schicht durch Zugabe von ln-HCl auf 2 eingestellt. Nun wird zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, worauf im Vakuum eingeengt wird. Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 12 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird in Äthylacetat gelöst, Äthyläther wird hinzugefügt und die Lösung wird beiseite gestellt, wobei durch allmähliche Zugabe von n-Hexan 10,5 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH auskristallisieren. Ausbeute: 84%. Fp. 136-138 °C. DSC: 1 Fleck, Rfj = 0,68, Rfs = 0,63.

Elementaranalyse: (C37H4sN308):

Gef.: C 67,33 H 6,85 N 6,40%

Ber.: C 67,35 H 6,88 N 6,37%

14. Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-Tos-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 6,0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden zu 20 cm3 TFA bei - 5 °C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt und im Vakuum über NaOH getrocknet. 20 cm3 DMF werden hinzugefügt, und nach dem Einstellen des pH-Wertes mit Triäthylamin bei — 5 °C auf 4,5 werden 851 mg HOBT und 4,2 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH hinzugefügt; sodann werden 1,2 cm3 WSC tropfenweise bei — 5 °C hinzugegeben. Das Rühren wird eine Stunde bei — 5 °C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt. 300 cm3 Methanol und 100 cm3 Äthyläther werden in das Reaktionsgemisch eingetragen, und das ausgefällte Material wird abfiltriert, welches dreimal aus Methanol-Äthyläther, DMF-Äthyläther und Methanol-Äthyläther in dieser Reihenfolge umkristallisiert wird, wobei 5,8 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 erhalten werden. Ausbeute: 71,3%. Fp.: 186,5—190 °C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsysteme 3 und 6). [a]D28 = -15,86° (c= 1, DMF). Elementaranalyse (C10oH128N16022S • V2 H20):

Gef.: C 61,44 H 6,63 N 11,55 S 1,73% Ber.: C 61,68 H 6,68 N 11,51 S 1,65% Aminosäureanalyse: NH3 1,60, Arg 0,92 (1), Asp 1,04 (1), Thr 2,1 (3), Pro 2,08 (2), Gly 1,86 (2), Val 1,00 (1), Tyr 0,91 (1).

15. Herstellung von BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 5,4 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzi)-VaI-GIy-AIa-GIy-Thr(BzI)-Pro-NH2 werden zu

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20 cm3 TFA bei — 5 °C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt und über NaOH im Vakuum getrocknet. Es werden 18 cm3 DMF hinzugefügt, worauf Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 sowie 100 mg HOBT und 1,54 g BOC-Gln-ONP zugesetzt werden; sodann wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 gehalten. Ferner werden 0,2 g BOC-Gln-ONP zugesetzt, und der pH-Wert wird unter Rühren über Nacht auf 7,0 eingestellt. Nach der Reaktion wird eine grosse Menge Wasser zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um das Produkt auszufällen, welches dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert wird. Man erhält so 4,8 g BOC-Gln-Thr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2. Ausbeute: 82,9%. Fp. 178-182°. Rf=0,67,[a]D28 = 15,19° (c=l, DMF).

Elementaranalyse (Ci05Hi36Ni8O24S • 2H20):

Gef.: C 59,92 H 6,56 N 12,05 S 1,47% Ber.: C 59,98 H 6,71 N 11,99 S 1,53%

16. Herstellung von BOC-Lys (ClCbz)-Leu-OÄt 7,32 g BOC-Lys(CICbz)-OHtert.Butylamin-salz, welches in Äthylacetat suspendiert ist, werden dreimal mit 100 cm3 ln-HCl und 100 cm3 Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird das Äthylacetat abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 60 cm3 Dichlorme-than, 2,93 g H-Leu-OÄt • HCl und 2,0 g HOBT, ferner 2,75 cm3 WSC bei — 5 °C und rührt eine Stunde. Es wird nun über Nacht bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Dichlormethan im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 150 cm3 Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit ln-HCl, 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und anschliessendem Einengen im Vakuum wird der Rückstand aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 6,4 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OÄt erhalten werden. Ausbeute: 76,6%. Fp.: 76—79 °C.

17. Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH

Zu einer Lösung von 6,13 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OÄt in 20 cm3 Äthylacetat werden 12,1 cm3 ln-NaOH bei 0 °C hinzugefügt, und es wird zwei Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Fernerwerden 1,1 cm3 ln-NaOH zugesetzt, und nach 1 Stunde dauerndem Rühren wird der pH-Wert auf 7 eingestellt, und es wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther gewaschen, die wässerige Schicht wird auf den pH-Wert von 3 eingestellt, und es wird dreimal mit 100 cm3 Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen der Äthylacetatschicht mit 100 cm3 Wasser und Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 cm3 Äthyläther gelöst, unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet, wobei BOC-Lys-(ClCbz)-Leu-OH in Form eines Pulvers erhalten werden. Fp.: >46-60°C. [a]D19=-10,68° (c=l,DMF). Elementaranalyse C2sH38N307C1 • V3 H20:

Gef.: C 56,25 H 7,35 N 8,00%

Ber.: C 56,21 H 7,31 N 7,87%

18. Herstellung von BOC-Leu-His-OH

3,83 g H-His-OH • HCl werden unter Erhitzen in 25 cm3 Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur werden 1,84 g Natriumbicarbonat und sodann 270 mg HOBT, 8,53 g BOC-Leu-OSU und 55 cm3 THF hinzugefügt. 10 cm3 Wasser werden zugesetzt, und es wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von wässerigem Natriumbicarbonat auf 7 eingestellt, worauf 1,3 g BOC-Leu-OSU zugesetzt werden und gerührt wird. Nach 6 Stunden werden weitere 1,3 g BOC-Leu-OSU hinzugegeben, und das Rühren wird über Nacht fortgesetzt. Nachdem das Ende der Reaktion durch Prüfung mittels Dünnschichtchromatographie festgestellt worden war, wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung von organischem Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, und die übrigbleibende wässerige Schicht wird mit Äthylacetat gewaschen. Die wässerige Schicht wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und auf den Kopf einer mit HP-20 (2,3 x 18 cm) gefüllten Säule gegossen; nun wird mit Wasser gewaschen, bis das Wascheluat eine negative Ninhydrin-Reaktion aufweist. Sodann wird mit Methanol eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt, und zu dem Rückstand wird Äthyläther hinzugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit Methanol/Äthyläther umgefällt, wobei 3,94 g getrocknetes Pulver erhalten werden. Ausbeute: 53,5%. Fp.: 178-180 °C [a]D19 = -0,19 (c=l, DMF).

Elementaranalyse (Ci7H28N4Os • 2/3 H20):

Gef.: C 53,39 H 7,65 N 14,71%

Ber.: C 53,65 H 7,79 N 14,73%

19. Herstellung von BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH 11,7 g H-Ser(Bzl)-OH werden in 50 cm3 Wasser gelöst, und 10,1 g Natriumbicarbonat und 10 cm3 Dioxan werden hinzugefügt. Nun setzt man 16,4 g BOC-Leu-OSU in 15 cm3 Dioxan und 5 cm3 DMF hinzu. Nach dem Rühren über Nacht wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 7 eingestellt, und es wird zur Entfernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum eingeengt. Die wässerige Schicht wird mit 100 cm3 Äthylacetat geschüttelt, und die organische Schicht wird zweimal mit ln-HCl und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 16,1 g BOC-Leu-Ser-(Bzl)-OH erhalten werden. Ausbeute: 78,8%. Fp.: 82—86 °C.

20. Herstellung von Boc-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH 4,1 g (10 mMol) des BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH werden in 25 cm3 auf—5 °C gekühltes TFA eingetragen, es wird 25 Minuten gerührt und daraufhin im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird Äthyläther zugesetzt, wobei das Material ausfällt, welches über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die Kristalle werden in 8 cm3 DMF gelöst, und es werden 8 g BOC-Lys(ClCbz)-ONP und 270 mg HOBT zugesetzt, der pH-Wert wird mit N-Methylmorpholin auf 8 eingestellt, worauf über Nacht bei Zimmertemperatur gekühlt wird. Man gibt ln-HCl hinzu und löst den Niederschlag in Chloroform, welches dreimal mit ln-HCl, dreimal mit 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen wird. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die Chloroformschicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird dreimal aus Äthylacetat-n-Hexan umgefällt, ferner dreimal wiederholt aus Äthyläther-n-Hexan umgefällt und sodann durch eine Säule aus 180 g Silikagel geleitet. Diese wird mit Äthylacetat-Benzol (2:1) gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Methanoleluat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 5,25 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH erhalten werden. Ausbeute: 74,5%. Fp.: 84-100 °C (Zers.). DSC: 1 Fleck. Aminosäurezusammensetzung: Lys 0,98 (1), Leu: 1,00 (1), Ser: 0,82 (1).

21. Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-GIn-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-

Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 7,65 g des BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden in 35 cm3 TFA bei - 5 °C gelöst, 30 Minuten gerührt

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und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Diäthyl-äther behandelt, und das ausgefallene Material wird über NaOH im Vakuum getrocknet. Daraufhin wird es in 25 cm3 DMF gelöst, und 600 mg HOBT, 2,35 g des in (2) erhaltenen BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH sowie 0,69 cm3 WSC bei - 5 °C werden hinzugesetzt, worauf eine Stunde bei — 5 °C und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird. Zu dem Reaktionsgemisch wird ln-HCl hinzugesetzt, wobei das Material ausfällt, welches zweimal aus Methanol-Äthyläther umgefällt und getrocknet wird, wobei 8,0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,3%. Fp.: > 164 °C (Zers.). [a]D15 = - 18,65 (c= 1, DMF).

Elementaranalyse (C125H164N21028SC1 HCl):

Gef.: C 59,63 H 6,67 N 11,78%

Ber.: C 59,75 H 6,62 N 11,71%

22. Herstellung von BOC-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzl)-

V al-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 7,68 g des BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(BzI)-Tyr-(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden in 40 cm3 TFA bei — 5 °C gelöst, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 20 cm3 DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 5 eingestellt, worauf 430 mg HOSU, 1,37 g BOC-Leu-His-OH und 58 cm3 WSCO bei — 5 °C hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde — 5 °C gerührt und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird ln-HCl hinzugefügt, und das ausgefallene Material wird aus Methanol-Äthyläther umgefällt und ferner aus DMF-Äthyläther wiederholt umgefällt. Beim Trocknen erhält man 8,30 g des Produktes. Ausbeute: 98,2%. Fp.: 167-175 °C; [a]Dls=- 17,45 (c= 1, DMF).

Elementaranalyse (C137H182N25O30SCl - HCl -4H20): Gef.: C 58,19 H 6,71 N 12,42%

Ber.: C 58,04 H 6,79 N 12,35%

23. Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys-(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 7,64 g des BOC-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden in 35 ml TFA bei — 5 °C gelöst, es wird 40 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 30 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, worauf 70 mg HOBT und 1,82 g BOC-Glu(OBzl)-OSU hinzugefügt werden. Der pH-Wert wird erneut mit N-Methyl-morpholin auf 7 eingestellt, und es wird 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man ln-HCl, und der gebildete Niederschlag wird zweimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert. Nach dem Trocknen wrden 7,55 g des Produktes erhalten. Ausbeute: 92,5%. Fp.: 161 bis 169 °C (Zers.).

Aminosäurezusammensetzung: Lys: 0,94, His: 0,83 (1), Arg: 1,05 (1), Asp: 1,08 (1), Thr: 2,52 (3), Glu: 2,06 (2), Pro: 2,16 (2), Gly: 2,00 (2), Ala: 1,06 (1), Val: 1,10 (1), Leu: 1,82 (2), Tyr: 0,73 (1).

24. Herstellung von BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 7,29 g des BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden in 30 ml TFA bei - 5 °C gelöst, es wird 45 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, worauf 100 mg HOBT und 1,4 g BOC-Gln-ONP hinzugefügt werden. Nun wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man ln-HCl, sammelt den Niederschlag und wäscht ihn mit Wasser. Es wird dreimal wiederholt umgefällt, wobei 7,0 g des getrockneten Produktes erhalten werden. Ausbeute: 91,5%. Fp.: 171-175 °C (Zers.).

25. Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-

Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 6,70 g des BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 werden in 30 ml TFA bei — 5 °C gelöst, 2,2 ml 4n-HCl/Dioxan werden hinzugefügt, und es wird 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und Äthyläther wird hinzugefügt, wobei das Material ausfällt, welches gründlich mit Äthyläther gewaschen und über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die so erhaltene Substanz wird in 15 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 5,5 bis 6 eingestellt, worauf 360 mg HOBT, 1,86 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH und 540 mg DCC, gelöst in 5 ml DMF, hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde gerührt und anschliessend über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. ln-HCl wird hinzugefügt, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert. Der in Äthanol unlösliche Teil des Niederschlages und das ausgefallene Material, welches durch Zugabe von Äthyläther zum Filtrat erhalten wurde, werden vereinigt. Man fügt Methanol-Diäthyläther hinzu und kristallisiert den Niederschlag wiederholt aus Methanol-Äthyläther um, wobei 7,0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,6%. Fp.: 171—177°C (Zers.). [a]Dls=-18,45 (c= 1, DMF). Elementaranalyse (Ci84H242N32041SCI2 • HCl • V2 H20): Gef.: C 58,43 H 6,65 N 11,83 Cl 2,64 S 0,94% Ber.: C 58,21 H 6,74 N 11,81 Cl 2,80 S 0,84% Aminosäurezusammensetzung: Lys: 1,86 (2), His: 0,74 (1), Arg: 0,97 (1), Asp: 1,04 (1), Thr: 2,55 (3), Ser: 0,53 (3), Glu: 2,85 (3), Pro: 2,08 (2), Gly: 2,00 (2), Ala: 1,04 (1), Val: 1,04 (1), Leu: 2,67 (3), Tyr: 0,67 (1).

Die Sequenz der Aminosäuren Nr. 1—9:

| (CH2)5 1

CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH

wird wie folgt hergestellt:

(CH2)5COOH

26. Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-HN-CH-COOCH3 (CH2)5COOH

56 g Cbz-HNCH-COOCH3 (öl) wurden in 300 ml Methanol und 150 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung wurde Aktivkohle gegeben, und nach einstündigem Rühren wurde Palla-dium-Kohle zugefügt und 10 Stunden lang hydriert. Nachdem vom Katalysator abgetrennt war, wurde im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Hierzu wurden 200 ml Dioxan, 21 ml Triäthylamin unter Kühlen und 80 g BOC-Thr(Bzl)-OSU zugegeben. Nach 3tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin zugesetzt, 3 Stunden lang gerührt, anschliessend auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und mit Essigester extrahiert.

Die Essigesterschicht wurde mit ln-HCl und Wasser gewaschen und im Vakuum abgezogen. Das so erhaltene ölige Pro

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dukt wurde in Äther gelöst und in eine 5 %ige Natriumbicarbonatlösung eingetragen. Nach sorgfältigem Waschen der wässerigen Schicht mit Äther wurde erneut mit Essigester extrahiert, anschliessend mit Wasser, ln-HCl und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und der Essigester wurde abgezogen, wonach 57 g eines öligen Produktes erhalten wurden.

27. Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-(CH2)5COOH

HNCHCOOCH3 ■ CHA (CH2)5COOH

50 g BOC-Thr(Bzl)-HNCHCOOCH3 wurden in 150 ml TFA zunächst unter Kühlen, nach 30 Minuten bei Raumtemperatur, gelöst. TFA wurde unter vermindertem Druck abgezogen, der ölige Rückstand über NaOH im Vakuum eine Nacht lang getrocknet. Das ölige Material wurde in 100 ml DMF gelöst und der pH-Wert auf 6 durch Zugabe von 40 ml Triäthylamin unter Kühlen eingestellt. 5 g HOBT und 50 g BOC-Ser(Bzl)-OSU wurden zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 6 durch Zugabe von N-Methylmorpholin eingestellt und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin zugegeben und schliesslich mit Essigester extrahiert. Der Extrakt wurde mit ln-HCl, Wasser, 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde abgezogen und der Rückstand in 300 ml Äther gelöst und dann erneut mit 5 %iger Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die wässerige Schicht wurde mit HCl angesäuert, mit Essigester extrahiert, die Essigesterschicht mit 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und anschliessend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem der Essigesterschicht eine gleiche Menge Cyclohexylamin zugegeben worden war, wurde das Gemisch unter vermindertem Druck destilliert, wobei ein öliges Produkt erhalten wurde, das durch Zugabe von Äther und n-Hexan verfestigt wurde. Ausbeute: 41 g. Fp.: 70—73 °C. Md20= + 4,° (c = 2,7, DMF).

28. Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNH2

15 g (27,2 mMol) BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-OÄt wurden in 100 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ml 80 %-H2N—NH2 • H20 zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Um den ausfallenden Niederschlag zu vervollständigen, wurde Äther hinzugefügt, der Niederschlag anschliessend mit Äther gewaschen und aus Methanol-Essigester-Äther umkristallisiert, wonach 13,5 g des Produktes erhalten wurden. Ausbeute: 92,5 %. Fp.: 207 bis 209 °C (Zers.). [a]D20=- 17,4° (c = 0,77, DMF).

29. Herstellung von

(CH2)5COOH

BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCOOH

(CH2)5COOH

10,0 g BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCH-COOCH3 • CHA wurden mit ln-HCl in Essigester zur Herstellung der freien Säure behandelt, anschliessend wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. 30 ml TFA wurden dem öligen Rückstand unter Kühlen zugesetzt. Nach 30minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde TFA unter vermindertem Druck abgezogen. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. 8,5 g BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNH2 wurden in 30 ml DMF gelöst und zu 14 ml Dioxan, das ln-HCl und 3,1 ml Isoamylnitrit enthielt, zugefügt,

worauf man das Gemisch 20 Minuten lang zur Bildung des Azids reagieren Hess.

Das vorstehend beschriebene getrockente TFA-Salz wurde in 10 ml DMF gelöst, mit Triäthylamin neutralisiert und anschliessend langsam einer Lösung unterhalb von — 40 °C zugefügt, die die Azid-Verbindung enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7 durch Zusatz von Triäthylamin eingestellt, und das Gemisch wurde 3 Tage lang bei 5 °C umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch wurde bei - 5 °C langsam in 300 ml 0,5n-HCl eingetragen. Der abfiltrierte Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und mit 500 ml Chloroform extrahiert. Nach dem Waschen der Chloroformschicht mit ln-HCl und wässeriger NaCl-Lösung wurde das Chloroform unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand durch Zusatz von Chloroform-n-Hexan ausgefällt. Ausbeute: 11,8 g (84,3%). Fp.: 183-185 °C (Zers.). [a]D20=-5,5° (c = 0,72, DMF).

Aminosäurenanalyse: Asp 1,00 (1), Thr 0,82 (1), Ser 1,62 (2), Leu 0,91 (1), a-Aminokorksäure 1,05 (1).

30. Herstellung von

I (CH2)s 1

LCO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCONHNH2:

3,2 g (3 mMol) BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-(CH2)sCOO

Thr(Bzl)-HNCHCOCH3 wurden in 30 ml trockenem Pyridin gelöst, zu 5 g TFA-ONP zugefügt und 3 Stunden bei 45 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und anschliessend mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und getrocknet, wonach 2,9 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden. 20 ml TFA wurden diesem Pulver unter Kühlen zugesetzt, anschliessend wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt und schliesslich die TFA entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde bei 45 °C in 2,5 1 trockenes Pyridin unter Rühren innerhalb von 30 Minuten eingetropft. Bei 50 °C wurde noch 7 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, in 21 Chloroform gelöst und mit gesättigter wässeriger Kochsalzlösung, ln-HCl und fünfmal mit wässeriger Kochsalzlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, und schliesslich wurde die Chloroformschicht bis auf ein Volumen von 10 ml im Vakuum eingeengt. Anschliessend wurden 500 ml n-Hexan zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 2,0 g (72%). Fp.: 165 °C (Zers.).

3,9 g dieser Verbindung wurden in 10 ml DMF und 50 ml Methanol gelöst, und die Lösung wurde 30 ml 80%-H2N—NH2 • H20 zugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde Wasser zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen, mit 100 ml Methanol versetzt und unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, der Niederschlag abfiltriert, worauf 1,4 g des Produkts erhalten wurden. [«]d20=_ 8,6° (c = 0,8, DMF).

Aminosäurenanalyse: Asp 1,10 (1), Thr 1,00 (1),

Ser 1,64 (2), Leu 1,00 (1), a-Aminokorksäure 1,08 (1).

31. Herstellung von BOC-Leu-Gly-OBzl

Eine Lösung aus 34 g WSC in 50 ml Methylenchlorid wurde unter Rühren bei — 5 °C während einer Stunde in eine Suspension aus 46,2 g BOC-Leu-OH, 1 g HOBT und 74 g H-Gly-OBzl TosOH in 100 ml DMF und 200 ml Methylenchlorid eingetropft. Nach einer Stunde wurde die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, um das Methylenchlorid zu entfernen. Die DMF-Schicht wurde mit Wasser versetzt und mit

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11 Essigester und anschliessend nochmals mit 500 ml desselben Lösungsmittels extrahiert. Die Essigesterschicht wurde mit ln-HCl, Wasser, 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, worauf 82 g öliges BOC-Leu-Gly-OBzl erhalten wurden. Rf=0,68.

32. Herstellung von BOC-Val-Leu-Gly-OBzl 70 ml TFA wurden bei - 5 °C 76 g BOC-Leu-Gly-OBzl zugesetzt, anschliessend wurde 30 Minuten lang gerührt und im Vakuum eipgeengt. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. Hierzu wurden 200 ml DMF gegeben und der pH-Wert auf 6,5 durch Zugabe von etwa 50 ml Triäthylamin bei — 5 °C eingestellt. Hierzu wurden 19 g BOC-Val-OSU und 2 g HOBT zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 eingestellt und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Während des Rührens wurde der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 6 gehalten. Schliesslich wurde eine grosse Menge Wasser zugegeben und mit Essigester extrahiert, der Extrakt mit 1 ml N,N-Dimethylamino-l,3-pro-pandiamin versetzt und das Gemisch 30 Minuten lang gerührt. Der Extrakt wurde mit Wasser, ln-HCl, 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde abgezogen und das Produkt aus n-Hexan umkristallisiert. Es wurden 90 g BOC-Val-Leu-Gly-OBzl erhalten. Ausbeute: 94%. Fp.: 119-121 °C.

Elementaranalyse (C25H39N306):

Gef.: C 62,73 H 8,34 N 8,85%

Ber.: C 62,86 H 8,25 N 8,80%

33. Herstellung von

| (CH2)s 1

•-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCH-CO-Val-Leu-Gly-OH

| (CH2)5

1,36 g (1,42 mMol) ^-CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-

Thr(Bzl)-HN(^HCONHNH2 wurden in 5 ml DMF suspendiert. Diese Suspension wurde mit 2 ml Dioxan, das 4n-HCl enthielt, bei — 5 °C versetzt und bei 10 °C vollständig gelöst. Bei - 5 bis -10 °C wurden 0,3 ml Isoamylnitrit zugegeben, und es wurde 20 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurden bei — 50 °C 1,2 g H-Val-Leu-Gly-OH zugegeben, der pH-Wert durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt und anschliessend 2 Tage lang im Eisbad gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Kühlen langsam in 200 ml 0,5n-HCl eingetragen. Der Niederschlag wurde mit 0,5n-HCl und Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,5 g des Produktes erhalten. Fp.: 240 °C (Zers.). Ausbeute: 84,3%. [a]D20 = -18,4° (c = 0,7, DMF).

Beispiel 2

Herstellung von:

| (CH2)5 j

'-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-GIy-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

500 mg (0,130 mMol) BOC-Lys(DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asn-Thr(Bzl)-GIy-Ser(Bzl)-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 wurden in 5 ml TFA und 0,5 ml 4n-HCl/Dioxan bei -5 °C gelöst. Nach 40minutigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und durch Zusatz von Äther wurde ein Niederschlag ausgefällt. Der Niederschlag wurde über NaOH getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 3 ml DMF gelöst, und 2,3 ml (entsprechend 100 //Mol) dieser Lösung wurden auf ein Volumen von 1 ml eingeengt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Triäthylamin unter Kühlen auf 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 23 mg HOSU, 90 mg (90 mMol)

| (CH2)s 1

t-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH und 41 mg DCC gegeben, und das Gemisch wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurden zum Ausfällen des Produktes 150 ml Im-AcOH zugegeben, und der so gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 520 mg des Produktes. Diese 520 mg des pulverförmigen Produktes wurden mit 50 ml Fluorwasserstoff und 2 ml Phe-nol/Anisol (1:1) bei 0 °C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasserstoffs wurde der Rückstand in Im-AcOH gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1X2 (Acetatform)-Säule gegeben, das Eluat wurde gefriergetrocknet, wobei 341 mg eines Pulvers erhalten wurden. 341 mg dieses Pulvers wurden in 0,01m wässeriger Ammoniumacetatlö-sung gelöst, und die Lösung wurde auf eine CM-Zellulose (2,3 X 50 cm)-Säule gegeben, mit 0,01m wässeriger Ammo-niumacetatlösung (pH 4,5, 700 ml) gewaschen und mit 0,01 bis 0,1m Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) bei linearem Elu-tionsgradienten eluiert. Es wurden jeweils Fraktionen von 10 g gesammelt; die aktiven Fraktionen (Fraktionen Nr. 80 bis 111) wurden gesammelt und zu einem aktiven Pulver gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in 0,1m AcOH gelöst" und über eine Sephadex G-50 (2,2 X 105 cm)-Säule chro-matographiert, wobei mit 0,1m AcOH mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h eluiert wurde. Das Eluat (5 g) wurde fraktioniert, die aktiven Fraktionen (Nr. 55-63) wurden gesammelt und zu 22 mg eines aktiven Pulvers lyophilisiert.

22 mg des aktiven Pulvers wurden in 0,01m wässeriger Ammoniumacetatlösung gelöst und über eine CM-Zellulose (2,3 X 25 cm)-Säule chromatographiert und mit 600 ml 0,01m bis 600 ml 0,1m Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) mit einem Gradienten eluiert. Es wurden Fraktionen von jeweils 8 g gesammelt und die aktiven Fraktionen Nr. 109-119 wurden gefriergetrocknet. Das so erhaltene Pulver wurde in einer geringen Menge 0,lm-Essigsäure gelöst und die Lösung über eine Sephadex LH-20 (2,3 X 135 cm)-Säule chromatographiert, wobei mit 0,lm-Essigsäure eluiert wurde; Fraktionen von jeweils 6 g des Eluats wurden gesammelt, die aktiven Fraktionen Nr. 31—34 wurden zu einem aktiven Pulver gefriergetrocknet. Rf=0,61 (Merck Zellulose; n-BuOH : Pyridin : AcOH : Wasser (15:10:3:12)).

Aktivität: 3025 MRC Einheiten/mg.

Aminosäurenanalyse: Ly 1,82 (2), His 0,97 (1), Arg 0,98 (1), Asp 1,96 (2), Thr 4,35 (5), Ser 2,88 (4), Glu 3,00 (3), Pro 2,16 (2), Gly 2,85 (3), Val 1,12 (1), Leu 4,20 (5), Tyr 1,01 (1), a-Aminokorksäure 0,99 (1).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

S

Claims

624 660

1. Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide der allgemeinen Formel I

(CH2)s 1

-CO-A1-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-A7-Leu-Gly-A10-A1i-A12-Gln-Ai4-A15-Ai6-Lys-A:i8-Ai9-Thr-A2i-Pro-A23-Thr-A25-A26-Gly-A28-Gly-A30-Pro-NH2 (I)

worin A j Ser oder Gly, A7 Val oder Met, A10 Lys oder Thr, An Leu oder Tyr, A12 Ser oder Thr, Aî4 Glu oder Asp, A1S Leu oder Phe, A16 His oder Asn, AiS Leu oder Phe, A ig Gin oder His, A2i Tyr oder Phe, A23 Arg oder Gin, A25 Asp, Asn oder Ala, A26 Val, Thr oder Ile, A2s Ala, Ser oder Val, und A30 Thr, Val oder Ala bedeuten, sowie dessen verträgliche Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren und/oder Peptide oder deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen unter Bildung von -CO-NH-Bindungen miteinander kondensiert, dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese ein die Sequenz der Formel II

(CH2)5COOR

H-Aj-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO- (II)

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminosäure und ein Peptid aus mindestens zwei Aminosäuren oder deren aktivierte Derivate als Ausgangsverbindungen verwendet und dass man das Zwischenprodukt während der Bildung der Verbindung, welche die a-Aminokorksäureeinheiten enthält, einer Ringschlussreaktion unterwirft.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung eines Polypeptides der Formel

| (CH2)6 1

•-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung des Polypeptides der Formel j- (CH2)5 1

KTO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung des Polypeptides der Formel j (CH2)5 j i-CO-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-GIn-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2.