CH625706A5 - - Google Patents

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, lebende Trypanosomen in einer Weise mit geeigneten Reagentien zu behandeln, dass ihre Pathogenität bei gleichzeitiger vollständiger Aufrechterhaltung ihrer immunologischen Potenz ausgeschaltet wird, und so mit Hilfe eines Vorganges, der als chemische Attenuierung bezeichnet wird, eine Vakzine zu entwickeln, die auch am Menschen anwendbar ist und insbesondere zur Bekämpfung der Chagas-Krankheit verwendbar ist.

Die Chagas-Erkrankung gilt als eines der grossen Gesundheitsprobleme Süd- und Mittelamerikas. Sie wird hervorgeru-gen durch eine Infektion mit Trypanosoma cruzi. Die Zahl der echt Infizierten auf dem Subkontinent ist umstritten, doch schätzt die Weltgesundheitsorganisation (WHO) 1960 die Zahl der Infizierten auf etwa 7 Mio., die einer Infektionsgefahr Ausgesetzten auf etwa 35 Mio. Die zur Eindämmung der Infektion angewendeten Methoden sind vielgestaltig. An erster Stelle steht wohl die Arbeit an der Überträger-Ausrottung (Raubwanzen der Gattung Triatoma) in den Behausungen der Bevölkerung, Aufklärung der Bevölkerung und Sanierung der Wohnmöglichkeiten. Diese Methode wird — unterstützt von der WHO — in vielen Ländern bereits mit grossem Erfolg durchgeführt. Ein zweiter Erfolg bei der Bekämpfung der Chagas-Erkrankung war die Einführung des Chemotherapeutikums Lampit® (eingetragenes Warenzeichen der Farbenfabriken Bayer, Leverkusen), eines im Menschen hochwirksamen äthiologischen Agens. Die Problematik der Chemotherapie liegt jedoch im Auftreten irreversibler pathologischer

Veränderungen, z.B. an Herz und anderen Hohlorganen während der Infektion, die durch Verabreichung von Arzneimitteln in einer relativ späten Phase der Erkrankung nicht mehr behoben werden können. Eine jedoch in der Bekämpfung von Infektionen viraler oder bakterieller Genese allgemein angewendete prophylaktische Massnahme, die Applikation einer Vakzine, gilt bis heute noch als mit zu vielen Risiken verbunden.

In einer ganzen Reihe von Arbeitsgruppen (z.B. Kagan, Marsden, Nussenzweig, Menezes, Hungerer) konnte zwar gezeigt werden, dass natürlich attenuierte Kulturformen von T. cruzi nach Injektion in Mäuse diese gegen eine tödliche Infektion mit pathogenen Triypanosomen schützt. Die Problematik jedoch ist die im unterschiedlichen Masse nachweisbare Rest-pathogenität der Kulturformen.

Eine Unterdrückung der Pathogenität von T. cruzi beschrieb 1950 J. Emmett. Er bestrahlte noch hochinfektiöse Kulturformen mit Röntgenstrahlen und fand, dass eine Bestrahlung von 100 000 r die Tripanosomen zwar am Leben lässt, ihre Infektiosität aber zerstört. Solche bestrahlten Kulturformen immunisieren jedoch nicht mehr Mäuse gegen eine pathogene Infektion Chiari (1968).

Die in der Beschreibung der DE-AS 1 234 930 referierten Experimente zur chemischen Modifizierung (z. B. mit Formalin, Hydroxylamin u. a. ) von Trypanosomen führten ebenfalls nicht zu einem Impfstoff.

Ein anderer Weg wurde von Fernandes et al. 1965 beschrieben. Sie inkubierten Kultur- und Blutformen mit Acti-nomycin D. Dabei verloren die Trypanosomen ihre Fähigkeit, sich zu vermehren, ihre immunogene Potenz behielten sie jedoch bei. Einer Anwendung dieses Impfstoffes am Menschen steht jedoch von vorneherein die hohe Toxizität von Actino-mycin D im Wege.

Es bestanden deshalb Bestrebungen, einen immunologisch wirksamen Stoff gegen die Chagas-Erkrankung zu finden, der durch Blockierung der Restpathogenität von Kulturformen für den Menschen ungefährlich ist, aber seine volle immunologische protektive Wirkung beibehält. Die zur Attenuierung verwendete Substanz selbst sollte in der in der Vakzine vorliegenden Konzentration für den Menschen völlig untoxisch sein. Diese Substanz wurde überraschenderweise in Vertretern der Klasse der Phenanthridine gefunden.

Phenanthridine wurden bereits 1938 synthetisiert und untersucht im Hinblick auf ihre therapeutische Wirksamkeit gegenüber Trypanosoma congolense und Trypanosoma vivax. 1946 zeigten Browning et al. auch eine chemotherapeutische Wirksamkeit gegenüber T. cruzi in Mäusen. Danach erschienen eine Reihe von Arbeiten, z.B. von Riou u. Mitarb., über den Wirkungsmechanismus des 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phe-nylphenanthridiniumbromids an T. cruzi.

Es wurde nun gefunden, dass eine Inkubation von Trypanosomen mit Phenanthridinen die Vitalität und Infektiosität derartig verändert, dass Mäuse, nachdem ihnen eine Injektion mit derart behandelten Trypanosomen verabreicht worden war, keine pathogene Infektion erleiden, aber einen vollständigen Immunschutz ausbilden.

Gegenstand der Erfindung ist daher das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren.

Als Phenanthridine im Sinne der Erfindung eignen sich alle physiologisch verträglichen Vertreter dieser Körperklasse. Besonders geeignet sind solche Phenanthridine, die in 3- und 8-Stellung mit Aminogruppen, in 6-Stellung mit einem Phenyl-rest und in 5-Stellung mit einer niederen Alkylgruppe substituiert sind. Als Beispiele solcher Verbindungen seien erwähnt das 3,8-Diamino-5-methyl-6-phenyl-phenanthridin, das Iso-metamidin und das 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthri-din. Da die Phenanthridine im allgemeinen in Wasser schlecht löslich sind, empfiehlt es sich, sie in Form ihrer wasserlöslichen

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Salze einzusetzen. Als Säuren für die Salzbildung eignen sich allgemein alle organischen und vor allem anorganischen Säuren, die physiologisch verträgliche Anionen besitzen und die mit Phenanthridinen wasserlösliche Salze bilden. Besonders geeignet sind hierfür Salze der Phenanthridine mit Halogenwasser- 5 stoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure. Beispiele für geeignete Salze sind u.a. 3,8-Diamino-5-methyl-6-phenyl-phenanthridinium-bromid (Dimidiumbro-mid), Isometamidiumchlorid (Samorin®) und insbesondere 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid (Ethi- 10 diumbromid®).

Die Phenanthridine bzw. deren Salze werden zweckmässigerweise in einer Konzentration eingesetzt, die einerseits gross genug ist, um beiden Trypanosomen die gewünschte chemische Attenuierung zu bewirken, und anderseits nicht so gross ist, 15 dass sie eine nachhaltige Schädigung der Trypanosomen hervorruft. Bewährt hat sich eine Konzentration von 0,5 bis 1000 y pro ml, vorzugsweise von 5 bis 100 y pro ml.

Die Trypanosomen werden vorteilhafterweise in einer Konzentration von IO3 bis 108 Trypanosomen pro ml einge- 20 setzt. Als besonders vorteilhaft hat sich eine Konzentration von 1 x 107 bis 5 x 107 Trypanosomen pro ml erwiesen. Die Trypanosomen werden zweckmässigerweise in dieser Konzentration in einem flüssigen Kulturmedium suspendiert, das geeignet ist, den Stoffwechsel dieser Organismen voll zu unter- 25 halten. Als Kulturmedium eignen sich alle für die Haltung von Trypanosomen geeigneten Medien. Das Kulturmedium sollte möglichst arm bzw. sogar frei von antigenen Determinanten sein. Diese Voraussetzung wird insbesondere von proteinfreien Medien erfüllt. Als Beispiele für geeignete Kulturmedien seien 30 das Leber-Infusion-Tryptose-Medium [LIT, nach Camargo (1964)] genannt, ferner proteinfreie, chemisch definierte Medien, wie sie beispielsweise von Morgan, Morton und Parker (1950), Salk, Younger und Ward (1954) oder Parker, Castor und McCulloch (1957) beschrieben wurden. 35

Die Behandlung der in dem Kulturmedium suspendierten Trypanosomen mit einem Phenanthridin bzw. dessen Salz erstreckt sich allgemein über eine Zeit von 1 bis 120, vorzugsweise von 20 bis 48. Stunden. Die Temperatur beträgt zweckmässigerweise 18 bis 37 °C, vorzugsweise 25 bis 33 °C. Ent- 40 sprechend allgemein bekannten chemischen Gesetzen ist die Behandlungszeit um so länger auszudehnen, je niedriger die Temperatur ist. Demgemäss sind im Sinne des vorstehend Gesagten die kürzeren Behandlungsdauern der höheren Temperatur und die längeren Behandlungsdauern der tieferen Tem- 45 peratur zuzuordnen.

Nach der Behandlung werden die derart attenuierten Trypanosomen gewonnen, indem man sie von dem Kulturmedium abtrennt. Dies kann durch Dekantieren, Filtrieren oder zweckmässig durch Zentrifugieren geschehen. Falls die Her- 50 Stellung eines Impfstoffes angestrebt wird, können die so gewonnenen Trypanosomen in einer physiologisch verträglichen Lösung in der für einen Impfstoff geeigneten Konzentration wieder suspendiert werden.

In den im folgenden beschriebenen Versuchen soll aufge- 55 zeigt werden, dass die erfindungsgemäss behandelten Trypanosomen ihre Vermehrungsfähigkeit und ihre Pathogenität verlieren und demnach für die Herstellung einer Vakzine gegen die Chagas-Erkrankung geeignet sind.

Bei allen nachstehend angeführten Experimenten müssen 60 Medien und Geräte unter streng sterilen Bedingungen gehandhabt werden.

Der Nachweis des irreversiblen Vermehrungsstoppes durch die erfindungsgemässe Behandlung erfolgt beispielsweise nach folgender Methode: 65

Epimastigote Kulturformen von T. cruzi, Stamm Brasil, werden auf diphasischem Blutagar (modifiziert nach Senekjie) gezüchtet (4-5 Tage bie 28 °C). Die flüssige Phase mit den

Trypanosomen wird durch sterile Gaze filtriert. Die Suspension wird 20 Min. bei 5000 X g zentrifugiert und das Sediment zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Trypanosomen werden in einem verdünnten Medium nach Parker (1957) auf eine Dichte von 2 X 107/ml aufgenommen.

Jeweils 3 Proben à 2,5 ml werden mit steigenden Mengen 3,8 -Diamino-5 -äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid versetzt (je 5 y/ ml, 10 y!ml, 100 y Imi). 3 Proben werden mit Thiocid 1:10 000 behandelt, das die Trypanosomen in dieser Konzentration bei Erhalt der äusseren Form abtötet, und 3 Proben werden unbehandelt gelassen. Alle Ansätze werden 24 Stunden bei 28 °C inkubiert, dann 20 Min. bei 5000 x g zentrifugiert und das Sediment in 2,5 ml des 1:10 verdünnten Mediums nach Parker (1957) aufgenommen. Alle Proben werden mit radioaktivem 14C-Thymidin (0,2 /uC) versetzt und 24 Stunden bei 28 °C inkubiert. Danach werden die Trypanosomen über ein Sartorius-Filter abgetrennt und dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Radioaktivität der Proben wird quantitativ ausgewertet.

Die Hemmung des Einbaus des 14C-Thymidins in die Trypanosomen ist ein Mass für die Behinderung der Vermehrungsfähigkeit.

Ergebnis:

Hemmung des Einbaus von 14C-Thymidin

Thiocid-Kontrolle 100%

100 y/ml Ethidiumbromid 100 %

10 y!ml Ethidiumbromid 88 %

5 y!ml Ethidiumbromid 63 %

unbehandelt 0%

Wie die vorstehende Tabelle zeigt, haben die erfindungsgemäss behandelten Trypanosomen teilweise oder vollständig ihre Vermehrungsfähigkeit verloren.

Der Nachweis des Verlustes der Pathogenität nach Inkubation mit 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbro-mid kann beispielsweise wie folgt geführt werden:

A. In Herzzellkulturen 30 Herzen von nicht infizierten adulten Inzucht-Mäusen (Stamm NMRI), Gewicht einer Maus ungefähr 20 g, unter streng sterilen Bedingungen entnommen, werden in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS 7,4) aufgenommen und mechanisch zerkleinert, wobei blutige und weissliche Bindegewebsstücke verworfen werden. Das Herzhomogenat wird in einem Trypsinierkolben überführt und mit 20-30 ml PBS 7,4 aufgefüllt. Die Suspension wird kurz und kräftig auf dem Magnetrührer aufgewirbelt, nach kurzem Absitzen wird der Überstand mitsamt den darin befindlichen Erythrozyten abdekantiert. Der Rückstand wird unter Zusatz von 20 ml einer Trypsinlösung (97 ml PBS 7, 4, 3 ml 5 %iges Natriumbicar-bonat, 0,25 % Trypsin) bei 35 °C 10 Min. gerührt. Nach kurzem Absitzen wird der Überstand abdekantiert. Der Rückstand wird weitere 6-7 Male trypsiniert. Die abdekantierten Überstände werden zentrifugiert (400 x g, 10 Min.); die Sedimente werden in 75 ml folgender Lösung aufgenommen, die weiterhin als Dulbeccos Gebrauchsmedium bezeichnet wird: 20% fötales Kälberserum 10% Dulbeccos, Fa. Biocuit Lab., Glasgow

7 % Natriumbicarbonat

2% Glutamin

0,5 % Penicillin/Streptomycin auf 100% mit Aqua bidest. aufgefüllt.

Jeweils 3 ml der Suspension des Herzzellgewebes werden in Röhrchen, sogenannte Leighton-tubes, die mit einem Deck-

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gläschen 13 x 54 mm beschickt sind, überführt. Die mit Silikonstopfen verschlossenen Röhrchen werden bei 37 °C inkubiert. Nach 24 Stunden hat sich ein Zellrasen (Monolayer) ausgebildet.

Inzuchtmäuse vom Stamm NMRI, die etwa 12 Tage zuvor mit T. cruzi Stamm Brasil subkutan infiziert worden waren, werden steril entblutet und das Blut in Zitratpuffer gesammelt. Es wird mit Dulbeccos Gebrauchsmedium verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 1,5 x 106 Trypanosomen/ml entsteht. Die Trypanosomen-Suspension wird halbiert und die eine Hälfte mit 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridi-niumbromid auf 10 y!ml eingestellt. Die beiden Ansätze werden 24 Stunden bei 28 °C inkubiert. Danach werden die Trypanosomen abzentrifugiert und in frischem Dulbeccos Gebrauchsmedium (1,5 X 106/ml) aufgenommen.

Nach Entfernen des Mediums von den Zellkulturen gibt man jeweils 3 ml der Trypanosomen-Suspension (4,5 x 106 total) in die Leighton-tubes und inkubiert bei 33 °C 72 Stunden. Danach wird das Medium gewechselt und weitere 48 Stunden inkubiert.

Die in den Leighton-tubes befindlichen, mit Zellrasen bewachsenen Deckgläschen werden nach Giemsa angefärbt.

Ergebnis:

Die Zellen, die mit unbehandelten Trypanosomen inkubiert wurden, sind - wie das mikroskopische Bild zeigt - zwischen 40—70% infiziert. Die Zellen, die jedoch mit Trypanosomen inkubiert wurden, die mit 3,8-Diamino~5-äthyl-6-phe-nylphenanthridiniumbromid vorbehandelt waren, sind nicht infiziert.

B. An der Maus

NMRI-Mäuse, die etwa 10 Tage zuvor mit etwa 5 x 104 Trypanosomen vom Stamm Brasil pro Maus infiziert waren, werden unter streng sterilen Bedingungen in Gegenwart von Heparin entblutet (Durchschnittskonzentration 50—200 x 106/ml). Die Suspension wird mit dem Medium nach Parker (1957) auf 2 x 106/ml eingestellt und halbiert. Die eine Hälfte wird mit 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridi-niumbromid versetzt (Endkonzentration 10 y!ml). Beide Suspensionen werden bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert. Die so inkubierten Suspensionen werden (0,5 ml pro Tier = 1 x 106 Trypanosomen pro Tier) den Mäusen (12-14 g) subkutan appliziert. Der Verlauf der Erkrankung wird anhand der Gewichte, der Parasitämie und dem Tod der Tiere verfolgt.

Ergebnis:

Erreger Behandlung Gewicht Parasitämie Tote/

Gesamtzahl

T. cruzi 10 y/ml* zu- 0 bis nehmend extrem niedrig 0/10 T. cruzi — ab- hoch nehmend 10/10

* 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenyIphenanthridiniumbromid

Die erfindungsgemäss behandelten Trypanosomen haben - wie nachstehend bewiesen wird — immunisierende Eigenschaften.

Der Nachweis der Ausbildung einer schützenden Immuni-5 tät kann beispielsweise wie folgt geführt werden:

2 Gruppen von Mäusen werden mit Trypanosomen (epi-mastigote Form) inokuliert. Gruppe A, 10 Mäuse, erhalten je 0,5 ml subkutan Kulturformen (5 x 107 pro Tier), Gruppe B, 10 Mäuse, Kulturformen, die erfindungsgemäss laut Beispiel io behandelt worden sind (5 x 107 pro Tier), Gruppe C, 10 Mäuse, 0,5 ml Kochsalz. Nach 21 Tagen werden alle Tiere infiziert mit pathogenen Trypanosomen Stamm Brasil (1 x 105 pro Tier subkutan).

15 Ergebnis:

Die Tiere der Gruppe A und B überleben zu 100% mindestens 100 Tage nach Infektion, die Kontrolltiere der Gruppe C sterben alle innerhalb der Tage 10 bis 15 nach Infektion.

Damit ist gezeigt, dass eine parenterale Verabreichung von 2o erfindungsgemäss attenuierten Trypanosomen gegen eine tödliche Infektion von Trypanosomen zu schützen vermag.

Die mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens attenuierten Trypanosomen können dementsprechend mit Erfolg zur Herstellung einer Vakzine gegen die Chagas-Erkrankung ver-25 wendet werden.

Die Herstellung einer Vakzine, die als Wirkprinzip eine Suspension der erfindungsgemäss attenuierten Trypanosomen in einem physiologisch verträglichen wässrigen Medium enthält, lässt sich auf die dem Fachmann bekannte Weise bewerk-30 stelligen, vorzugsweise unter Stabilisierung der Trypanosomen mit Schutzkolloiden, beispielsweise mit Proteinen, wie Albumin, oder Polysacchariden, wie Dextran.

Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden:

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Beispiel

Behandlung von Kulturformen von T. cruzi mit 3,8-Diami-no-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid.

Alle Geräte und Medien müssen unter streng sterilen Be-40 dingungen gehandhabt werden.

Ausgangsmaterial ist die Suspension von T. cruzi in der flüssigen Phase einer Blutagar-Kultur. Die 5 Tage alte Kultur wird durch sterile Gaze in einen Messzylinder dekantiert und in einer Thomakammer die Konzentration der Trypanosomen 45 in der Ausgangssuspension bestimmt. Im Beispiel sind es 25 x 106 Trypanosomen/ml in 75 ml, was einer Totalmenge von 1 • 8 x 109 entspricht. Die Suspension wird in einen 250-ml-Zentrifugenbecher mit Schraubverschluss (Sorvall USA, Rotor GSA, Polycarbonatflaschen, Plastikdichtungsdeckel mit O-50 Ringen) überführt und 20 Min. bei 4 °C in einer Sorvall RC-2-B bei 4500 RPM (= 3300 x g) zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert. Das Sediment wird in 100 ml physiologischer NaCl resuspendiert und erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert 55 und das Sediment in einem Medium folgender Zusammensetzung im Zentrifugenbecher suspendiert:

Aminosäuren ml/1

Vitamine mg/1

Alanin HCl 25,0

Arginin 70,0

Asparaginsäure 30,0

Cystein HCl • H20 260,0

Cystin 20,0

Glutaminsäure 75,0

Glutamin 100,0

Glycin 50,0

Aminobenzoesäure

0,050

Ascorbinsäure

50,000

D-Biotin

0,010

D-Ca-Pantothenat

0,010

Cholinchlorid

0,500

Cocarboxylase

1,000

Folsäure

0,010

Inosit

0,500

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Aminosäuren ml/1

Histidin HCl • H20 20,0

Hydroxypyrolin 10,0

Isoleucin 20,0

Leucin 60,0

Lysin HCl 70,0

Methionin 15,0

Phenylalanin 25,0

Prolin 40,0

Serin 25,0

Threonin 30,0

Tryptophan 10,0

Tyrosin 40,0 Valin ferner anorganische Salze Tween 80 Cholesterin Coenzym A Deoxyadenosin Deoxycytidin CHI Deoxyguanosin Diphosphopyridin -Nucleotid -Tetrahydrat -(DPN, 4H20)

Flavin Adenine

-Dinucleotid (FAD) L-Glutathion

NaH2P04H20 NaHC03

im folgenden «Medium» genannt.

Durch Zugabe von 85 ml Medium und 5 ml einer durch ein Millipore-Filter (0,2 fi Porengrösse) steril filtrierten Lösung von 0,9 mg 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridinium-bromid in Medium (Endkonzentration 10 y/ml in 901) entsteht eine Suspension von 2 x 107 Trypanosomen/ml. Diese Suspension wird 24 Stunden bei 28 °C in einem Brutschrank

Vitamine mg/1

Nicotinamid 0,025

Nicotinsäure 0,025

Pyridoxal HCl 0,025

Pyridoxin HCl 0,025

Riboflavin 0,010

ThiaminHCl 0,010

Natrium-Acetat 3H20 83,0

Natrium Glucuronat 4,8

Thymidin 10,0 Triphosphopyridin -Nucleotid -Mononatrium

-Salz (TPN) 1,0 Uridin-5 ' -triphosphat -Tetranatrium

-Tetrahydrat (UTP) 1,0

NaCl 6800

KCl 400

MgS04,7H20 200

CaCl2 (anhyd.) 200

Glucose 1000

Phenol rot 17

inkubiert. Nach 24 Stunden wird erneut bei 4500 RPM in der 40 Sorvall-Zentrifuge bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Sediment in 18 ml Medium aufgenommen.

Die erhaltene Endkonzentration von 1 x 108 Trypanosomen/ml ist beispielsweise geeignet zur Immunisation von Mäusen.

und andere Bestandteile: 5,0 0,2 2,5 10,0 10,0 10,0

7,0

1,0 10,0

140 2200

pH 7,2

Claims (10)

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1. Verfahren zur Herstellung eines Stoffes mit immunologischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem einphasigen wässrigen flüssigen Kulturmedium suspendierte Trypanosomen mit einem physiologisch verträglichen substituierten Phenanthridin bis zum Verlust ihrer Pathogenität inkubiert und die auf diese Weise attenuierten Trypanosomen anschliessend gewinnt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Phenanthridin 3,8-Diamino-5-äthyl-6-phenylphenanthridiniumbromid verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kulturmedium verwendet, welches proteinfrei ist.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension verwendet, in der die Trypanosomen in einer Konzentration von IO3 bis 108 Trypanosomen pro ml vorliegen.

5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension verwendet, in der die Trypanosomen in einer Konzentration von 1 x 107 bis 5 x 107 Trypanosomen pro ml vorliegen.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Konzentration des Phenanthridins auf 0,5 bis 1000 y!ml einstellt.

7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Konzentration des Phenanthridins auf 5 bis 100 y/ml einstellt.

8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation während 1 bis 120 Stunden bei 18 bis 37 °C durchführt.

9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation während 20 bis 48 Stunden bei 25 bis 33 °C durchführt.

10. Chemisch attenuierte Trypanosomen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.