JPS5843370B2 - メンエキガクテキカツセイブツシツノセイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫学的活性を有する物質に関し、且つまた
生きているトリパノソーム（Ｔｒｙｐａ−ｎｏｓｏｍｅ
）をその病原性を抑制しつつその免疫学的効力を維持
するためにフェナンスリジン誘導体で処理することによ
り前記のような物質を製造する方法に関する。

化学的弱毒化といわれるこの方法により人間への投与さ
えも可能なワクチンの開発が可能である。

更に本発明は、弱毒化されたトリパノソームを含有する
ワクチンに関する。

シャガス（Ｃｈａｇａｓ ）病は南米および中米におけ
る大きな健康問題の一つとして考えられている。

この疾病はクルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏ
ｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ）の感染によって引き起こされ
る。

現実に感染したこの亜大陸の住民数については種々の説
があるが、１９６０年に世界保健機構（ＷＨＯ）はこの
感染者数を約７００万人また感染の危険にさらされてい
る人の数を約３５００万人と推定している。

この感染の阻止には各種の方法がとられているが、最も
重要な方法はおそらく人々の居住区における疾病担体（
トリアトーマ属に属すコーンーノーズドバッグ（ｃｏｎ
ｅ−ｎｏｓｅｄ ｂｕｇ ） ）の撲滅、人々の保健教
育および居住施設の衛生に努力することであろう。

ＷＨＯの支援の下にこの方法はすでに多くの国々におい
て実施され大きな成功をおさめている。

シャガス病の阻止におけるもう一つの成功は、人間に対
して高活性を有する病因剤である化学療法剤Ｌａｍｐｉ
ｔ（西ドイツ国フアルペンファブリーク・バイエル社商
品名）の市場化である。

しかしながら化学療法剤に伴なう問題は感染によって例
えば心臓およびその他の空洞臓器などに不可逆的病変を
ひきおこすのに、この病気の比較的後期におけるそれら
医薬の投与によっては該病変が治癒されないということ
であろう。

しかしながらビールス原性またはバクテリア原性の感染
症の処置に一般的に適用される予防手段すなわちワクチ
ンの投与は今日なお多くの危険をはらむものとされてい
る。

自然的に弱毒化した培養型のクルーズ・トリパノソーマ
はそれをマウスに注射しておくとそのマウスを病原性の
トリパノソーマの致死的感染に対して免疫化するという
ことは数多くの研究者グループ（例えばＫａｇａｎｓ
Ｍａｒｓｄｅｎ、 Ｎｕｓｓｅｎｚ−ｗｅｉｇ、 Ｍｅ
ｎｅｚｅｓ、 Ｈｕｎｇｅｒｅｒ等）の実証し得たとこ
ろであるが、この培養型の残留病原性が様様な程度に顕
現するという問題が依然として存在する。

１９５０年、Ｊ、Ｅｍｍｅｌｔはクルーズ・トリパノソ
ーマの病原性の抑制について報告した。

彼は依然高感染性の培養型をＸ線にさらす実験を行ない
そして１００，０００？’のＸ線への曝露がトリパノソ
ームは生きたままの状態に保ちつつその感染性を破壊す
ることを見出した。

しかしながらこれらＸ線にさらした培養型はもはや病原
性感染に対してマウスを免疫化しなかった（１９６８年
Ｃｈｉａｒｉの知見）。

ドイツ特許第１，２３４，９３０号明細書に報告された
トリパノソームの化学的変性（例えばホルマリン、ヒド
ロキシルアミン等）についての実験もワクチンとするま
でには到らなかった。

１９６５年にＦ ｅｒｎａｎｄｅｓ等は別の方法を報告
した。

彼等は培養型と血液型のトリパノソームをアクチノマイ
シンＤとインキュベートした。

該トリパノソームはその増殖能を失ったが免疫力は保持
した。

しかしながらアクチノマイシンＤは高毒性のためこのワ
クチンは人間には投与できない。

本発明は培養型の残留病原性の阻止により人に対する危
険を全く有せずしかもその免疫保護作用を保有するシャ
ガス病に対する免疫活性物質を見出すという課題を解決
したものである。

弱毒化に用いる物質は、ワクチンに用いる濃度において
人間に対して完全に無毒であるべきである。

駕くべきことにこの物質はフェナンスリジン群の中に見
出された。

フェナンスリジン類は既に１９３８年に合成されており
、またコンゴ・トリパノソーマ（Ｔｒｙ−ｐａｎｏｓｏ
ｍａ ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ ）及びビバックス０トリ
パノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｖｉｖａｘ ）
に関するその治療効率について試験されている。

１９４６年にはＢｒｏｗｎｉｎｇ等はマウスでクルーズ
・トリパノソーマに対する化学療法活性をも示した。

これに続いて多くの報告がなされ例えばＲｉ ｏｕ等は
クルーズ・トリパノソーマに対する３゜８−ジアミノ−
５−エチル−６−フエニルフニナンスリジニウムブロマ
イドの作用機作について報告している。

今般トリパノソームをフェナンスリジン誘導体とインキ
ュベートするとその活力および感染性が変化してかよう
に処理されたトリパノソームをマウスに注射した後は該
マウスは病原性感染をうけることなくしかも充分な免疫
を生じることを見出した。

すなわち、本発明は単相水性培地に懸濁したトリパノソ
ームをその病原性の失われるまでフェナンスリジン誘導
体とインキュベートし、かくして弱毒化したトリパノソ
ームを集めることからなる免疫学的活性を有する物質の
製造方法に関する。

本発明の他の目的は、この方法により化学的に弱毒化し
たトリパノソームおよびこれらを含有するワクチンであ
る。

本発明にいうフェナンスリジン誘導体としては、この群
に属すあらゆる生理学的に許容し得る化合物が適してい
る。

特に適しているのは、３−および８−位にアミノ基を６
位にフェニル基をそして５−位に低級アルキル基を有す
る誘導体であり、例えば３，８−ジアミノ−５−メチル
−６−フェニル−フェナンスリジン、イソメクミジンお
よび３゜ｓ−シアミ／ −５−エチル−６−フェニル−
フェナンスリジンなどが挙げられる。

これらフェナンスリジン誘導体は一般に水に難溶なので
、それらを本発明による水溶性塩の形で用いることが奨
められる。

この塩形成のための酸としては、生理学的に許容し得る
陰イオンを有し且つフェナンスリジン誘導体と水溶性塩
を形成するものであれば、あらゆる有機酸および特に無
機酸が適している。

特に適しているのはフェナンスリジン誘導体とハロゲン
化水素酸例えば塩酸または臭化水素酸との塩である。

適当な塩としては例えば３．８−ジアミノ−５−メチル
−６−フエニルーフニナンスリジニウムブＤフィト（商
品名Ｄｉｍｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄ）、イソメタミジウ
ムクロライド（商品名Ｓａｍｏｒｉｎ）、および特に３
，８−ジアミノ−５−エチル−６−フニナンスリジニウ
ムブロマイド（商品名Ｅｔｈｉ−ｄ１廂ｂｒｏｍｉｄ）
などが挙げられる。

フェナンスリジン誘導体およびその塩は、一方ではトリ
パノソームに対して所望の化学的弱毒化を行なうのに充
分高く、且つ一方では該トリパソームに対して持続的障
害を与える程は高くない濃度で用いられる。

０．５〜Ｉ Ｏ００ｒ／ｒｎ１．好ましくは５〜１００
ｒ／−の範囲の濃度が充分であることが判明した。

トリパノソームは、トリパノソーム１０３〜１０８個／
−有利にはトリパノソーム１〜５×１０７個／ｒ１１１
の濃度で、本発明に従って処理するのが有利である。

この濃度でトリパノソームを、これらの器官の代謝を充
分維持するのに適した液体培地に懸濁する。

培地としてはトリパノソームの培養に適したあらゆる培
地が適当であり、含有する抗原決定子が可及的に少ない
かまたは全くそれを含まないということが基準となる。

この条件は、なかんずく蛋白不含の培地によって満たさ
れる。

適当な培地としては例えば肝インフュージョントリプト
ース培地（１ｉｖｅｒ−ｉｎｆｕｓｉｏｎｔｒｙｐｔｏ
ｓｅ培地、略称Ｌ Ｉ Ｔ、 Ｃａｍａｒｇ。

（１９６４年）による〕、および例えばＭｏｒｇａｎ。

ＭｏｒｔｏｎおよびＰａｒｋｅｒ （１９５０年）、５
ａｌｋ。

ＹｏｕｎｇｅｒおよびＷａｒｄ （１９５４年）、また
はＰａｒｋｅｒ、 Ｃａ５ｔｏｒおよびＭｃ Ｃｕ ｌ
ｌ ｏｃｈ（１９５７年）により発表された蛋白不含
の化学的に規定された培地が挙げられる。

フェナンスリジン誘導体またはその塩による培地に懸濁
したトリパノソームの処理は約１〜１２０時間、好まし
くは２０〜４８時間行なう。

温度範囲は約１８〜３７℃、好ましくは２５〜３３℃で
ある。

一般的に知られている化学的通則に従って、処理時間の
長い程温度は低くてよい。

従って温度の高い程処理時間は短くてすみ、またその逆
もいえる。

処理後、トリパノソームを例えば傾瀉、濾過または有利
には遠心分離により培地から分離する。

ワクチンの製造を意図する場合には、そのようにして得
られたトリパノソームを生理学的に許容し得る溶液にワ
クチンに適した濃度となるように再懸濁してもよい。

以下に記載する実験は、本発明により処理されたトリパ
ノソームがその増殖能および病原性を失い、従ってシャ
ガス病に対するワクチンの製造に適していることを実証
するものである。

これらの実験に用いる培地および装置はすべて厳密な滅
菌条件下に取り扱わねばならない。

本発明の処理による増殖の不可逆的停止の証拠は例えば
次の方法で与えられる。

クルーズ・トリパノソーマ（ブラジル株）のエビマステ
ィゴツト（Ｅｐｉｍａｓｔｉｇｏｔ ）培養型を二相血
液寒天（５ｅｎｅｋｊ ｉｅによる変形）上で４〜５日
間２８℃で培養する。

トリパノソームを含有する液相を滅菌ガーゼを通して濾
過する。

その懸濁液を５，０００Ｘｒの速度で２０分間遠心分離
し、そして沈降物を生理学的食塩溶液で２度洗う。

そのトリパノソームをＰａｒｋｅｒ （１９５７年）に
よる希釈媒質にとり２ Ｘ １０７／−の濃度となるよ
うにする。

各２．５−からなる３個の試料に、３，８−ジアミノ−
５−エチル−６−フエニルーフニナンスリシニウムブロ
マイドを漸時量を増加（各々５ ｒ／ｄ。

１０１／砿 １０７’／ｍｇ）させて添加する。

３個の試料をＴｈ１ｏｃｉｄ（商品名）１：１０，００
０で処理すると、この濃度ではトリパノソームはその外
形を保ったまま死滅する。

また別の３個の試料を未処理のままにしておく。

これらの試料すべてを２４時間２８℃でインキュベート
し、次いで５．０ＯＯＸｆで２０分間遠心分離し、そし
て沈降物をＰａｒｋｅｒ （１９５７年）による１：１
０希釈媒質２．５ ｒｒｌｌにとる。

すべてのサンプルを放射性１４Ｃチミジン（０，２μＣ
）と混合しそして２４時間２８℃でインキュベートする
。

次いでそのトリパノソームを５ａｒｔｏｒｉｕｓフイル
ターにより分離しそして生理学的食塩溶液で３回洗う。

これら試料の放射能を定量する。

トリパノソームへの１４Ｃチミジンの取り込み阻害は増
殖能抑制の尺度である。

前掲の表は本発明により処理されたトリパノソームがそ
の増殖能を部分的または完全に失うことを示している。

３．８−ジアミノ−５−エチル−６−フエニルーフニナ
ンスリジニウムブロマイドでインキュベートした後に病
原性の失われることは次のようにして証明することもで
きる。

Ａ 心臓細胞培養 感染していない底体の同系交配したマウス（ＮＭＲＩ）
（体重は各々約２０？）から厳密な滅菌条件下に取り出
した３０個の心臓をｐｉ（７，４のホスフェート緩衝塩
化ナトリウム溶液（ＰＢ８７．４）５ｙにとり機械的に
破砕し、その際出血および結合組織の白色がかった小片
を除いた。

そのホモゲナイズした心臓物質をトリプシン処理用フラ
スコに移しそしてその上に２０〜３０ｄのＰ Ｂ Ｓ
７．４を加えた。

その懸濁液を磁気攪拌器により短時間激しく攪拌した。

短時間沈降させた後、その中に赤血球を共に含む上澄物
質を傾瀉除去し、そして残留物を２０ｄのトリプシン溶
液（９７７７２７１！のＰ Ｂ Ｓ ７．４．５饅重炭
酸ナトリウム３ｍｌおよび０，２５φのトリプシン）を
添加しながら１０分間３５°Ｃで攪拌した。

短時間その混合物を静置した後、上澄物質を傾瀉分離す
る。

その残留物を更に６〜７回トリプシン処理する。

傾瀉した上澄物質を遠心分離しく４００×１．１０分間
）、沈降物を次の溶液（これを以下Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ
培地と呼ぶことにする）７５−にとった。

２０優 胎生血清 １０ ％ Ｄｕ ｌ ｂ ｅ ｃ ｃ ｏ ｓ （
英国グラスゴー在Ｂｉｏｃｕｌｔ、 Ｌａｂ、製） ７饅 重炭酸ナトリウム ２饅 グルタミン ０．５多 ペニシリン／ストレプトマイシン残余量（１
００％とする量）再蒸留水 心臓細胞組織の懸濁液各々３ｒｎｌを管（いわゆるＬｅ
ｉｇｈｔｏｎ慟（カバーガラス付、大きさ１３×５４ｗ
１ｌ）に導入した。

シリコーン栓で密封した管を３７℃でインキュベートし
た。

２４時間後に単層の細胞層が形成された。

約１２日前に、クルーズ・トリパノソーマ（ブラジル株
）で皮下感染させた同系交配ＮＭＲＩマウスから、血液
を採りそしてくえん酸塩緩衝溶液に集めた。

これをＤｕｌｂｅｃｃｏｓ培地で希釈して最終濃度をト
リパノソーム１．５×１０６個／ｍｌとした。

そのトリパノソーム懸濁液を二分し、その一方を３，８
−ジアミノ−５−エチル−６−フエニルーフニナンスリ
シニウ※※ ムブロマイドで１０ｒ／−に希釈した。

次いで両半分を２４時間２８℃でインキュベートした。

次いでトリパノソームを遠心分離により分離１゜そして
新鮮なりｕｌｂｅｃｃｏｓ培地にとった（１．５Ｘ １
０６／ｒｒｌｌ）。

細胞培養液から培地を除去後、各々３ｒｎｌのトリパノ
ソーム懸濁液（合計４．５Ｘ１０６）をＬｅｉｇｈｔｏ
ｎ管に移しそして３３℃で７２時間インキュベートした
。

次いで前記培地を除いて捨て、同量の新しい培地を前記
管に加えてインキュベーションを４８時間続けた。

Ｌｅ ｉ ｇｈ ｔｏｎ管内に入れたカバーガラス上の
単層細胞層を次いでギムザ染色した。

その結果、未処理トリパノソームと共にインキュベート
した細胞のうち４０〜７０％が感染した（顕微鏡像の示
すところによる）。

しかしながら、３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フ
エニルーフニナンスリジニウムブロマイドで前処理した
トリパノソームと共にインキュベートした細胞は感染し
なかった。

Ｂ マウス 約１０日前に、ブラジル株のトリパノソーム約５Ｘ１０
’／マウスで感染させたＮＭＲＩマウスから厳密な滅菌
条件下にヘパリンの存在下に採血した（平均濃度５０〜
２００Ｘ１０６メー）。

その懸濁液をＰａｒｋｅｒ （１９５７）の培地で２Ｘ
１０６／７７２７！に希釈しそして二分した。

その二分したものの一方を３，８−ジアミノ−５−エチ
ル−６−フエニルーフニナンスリジニウムブロマイド（
最終濃度１０γ／−）と組み合わせた。

それら２種の懸濁液を３７℃で２４時間インキュベート
した。

このようにインキュベートした懸濁液をマウス（体重１
２〜１４１）へ皮下投与した（０．５ｒＩｌｌ／匹＝ト
リパノソーム１×１０６個／匹）。

疲病経過をマウスの体重、寄生虫血症および生死につい
て調査した。

結果を次表に示す。

本発明により処理されたトリパノソームは以下に証明す
るように、 免疫化特性を有している。

免痩化の証拠は次のようにして与えることができる。

２群のマウスにトリパノソーム（Ｅｐ ｉｍａｓ ｔ
ｉ−ｇｏｔ型）を接種した。

マウス１０匹から成るＡ群には０．５ ｙｄの培養型を
皮下投与しく５×１０７個／匹）、マウス１０匹から成
るＢ群には実施例におけるように処理した培養型を投与
しく５×１０７個／匹）、またマウス１０四から成るＣ
群には塩化ナトリウム０．５ ｙｄを投与した。

２１日後にすべてのマウスを病原性のブラジル株のトリ
パノソームに感染させた（１×１０５個／匹、皮下）。

その結果、Ａ群およびＢ群のマウスは１００φ。

注射後世なくとも１００日は生存したのに対し、Ｃ群の
対照動物は注射後１０〜１５日以内に死亡した。

このことは、本発明により弱毒化したトリパノソームを
非経口的に投与することによってトリパノソームの致死
的な感染に対して免疫化できることを実証するものであ
る。

すなわち本発明のもう一つの目的は、シャガス病に対し
て有効であって且つ本発明により弱毒化されたトリパノ
ソームを含有するワクチンの製造である。

生理学的に許容し得る水性媒質中の本発明によるトリパ
ノソームの懸濁液を活性成分として含有するワクチンは
当業者に周知の方法により調製できるが、その場合その
トリパノソームを保護コロイド例えばアルブメンのよう
な蛋白またはポリサッカライドなどで安定化するのが好
ましい。

次に本発明を実施例によって説明する。

実施例 本例は３，８−ジアミノ−５−エチル−６−フエニルー
フニナンスリジニウムブロマイドによる培養型のクルー
ズ・トリパノソーマの処理を示す。

使用したすべての装置および培地は厳密な滅菌条件下に
取り扱った。

出発材料は、血液寒天培地の液相中クルーズ・トリパノ
ソーマの懸濁液とした。

５日間培養液を滅菌ガーゼを通してメスシリンダー中へ
傾瀉し、そしてトリパノソームの濃度を出発懸濁液内で
トー” （Ｔｈｏｍａ ）チェンバーにより測定した。

計数は７５−中にトリパノソーム２５Ｘ１０６個／ｒＩ
ｌｌであり、これは全数としては１．８ Ｘ １０’に
相当する。

その懸濁液をねじ蓋付き２５０ｙｄ遠心用ビーカー（５
ｏｒｖａｌｌ ＵＳＡ％ ＲｏｔｏｒＵ Ｓ Ａ、ポリ
カーボネート製フラスコ、Ｏリング付きプラスチック製
密閉蓋）に入れそして５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−２−Ｂ内
で４５００ｒｐＩｎ（＝３３ｏｏｘｒ）の回転速度にて
２０分間４℃で遠心分離した。

上澄物質と検温除去した。沈降物を再び生理学的ＮａＣ
１１００ｍｅｌｔこ懸濁し、もう一度同一条件の下に遠
心分離する。

上澄物質を傾瀉し、そして沈降物を次の組成を有する培
地へ遠心用ビーカー内で懸濁させる。

更にこの培地は次のような無機塩および他の成分をも含
有しており、 モしてｐＨは７．２である。

８５ｒｒＬｌの前記の培地（以後「培地」と呼ぶ）およ
び培地中に３．８−ジアミノ−５−エチル−６−フエニ
ルーフニナンスリジニウムブロマイド０．９■を溶解し
た溶液５−（最終濃度は９０ｒＩＩｌ中に１０ｒ／−）
（これらは滅菌条件下にミリポアフィルタ−（孔径０．
２μ）を通して濾過しておいた）を添加してトリパノソ
ーム２Ｘ１０７個／−の懸濁液を得た。

この懸濁液をインキュベーター内で２４時間２８℃にお
いてインキュベートとした。

２４時間後それを再び４５００ｒｌ）Ｉｆで４℃におい
て５ｏｒｖａｌｌ遠心分離器を用いて遠心分離した。

上澄物質を除き、そして沈降物を１８−の接地にとる。

得られたトリパノソームＩ Ｘ １０８個／ｒｒＬｌと
いう最終濃度は例えばマウスの免疫化に適している。

以下に本発明により開示された新規な技術的事項を要約
して示す。

１、単相水性液体培地に懸濁したトリパノソームをその
病原性が失われるまでフェナンスリジン誘導体とインキ
ュベートし、次いでこのようにして弱毒化したトリパノ
ソームを集めることを特徴とする免疫学的活性を有する
物質の製造方法。

２、使用するフェナンスリジン誘導体が３，８−ジアミ
ノ−５−エチル−６−フニニルーフエナンスリジニウム
ブロマイド 法。

３、培地が蛋白を含有しない前記第１項の方法。

４、懸濁液中のトリパノソームの濃度が１０３〜１ ０
８／ｒｒｌｌである前記第１項の方法。

５ｏ フェナンスリジン誘導体を０．５〜１０００ｒ
／ｍｌの濃度で用いる前記第１項の方法。

６、インキュベーションを１８〜３７℃で１〜１２０時
間実施する前記第１項の方法。

２ 懸濁液中のトリパノソームの濃度範囲が１×１０７
〜５ Ｘ １０７／ｒＩｌｌである前記第１項の方法。

８、フェナンスリジン誘導体を５〜１００ ｒ／ｄ！の
濃度で用いる前記第１項の方法。

９、インキュベーションを２５〜３３℃で２０〜４８時
間実施する前記第１項の方法。

１０、前記第１〜９項により得られる化学的に弱毒化し
たトリパノソーム。

１１、前記第１０項の弱毒化したトリパノソームを活性
成分として含有するシャガス病に対し有効なワクチン。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 単相水性液体培地に懸濁したトリパノソームをその
   病原性が失われるまでフェナンスリジン誘導体またはそ
   の塩とインキュベートし、次いでこのようにして弱毒化
   したトリパノソームを集めることを特徴とする免疫学的
   活性を有する物質の製造方法。